Summary
Qui, presentiamo un protocollo per studiare il meccanismo molecolare della traslocazione di protoni attraverso le membrane del lipido di liposomi singoli, utilizzando citocromo bo3 come esempio. Combinando elettrochimica e microscopia a fluorescenza, le variazioni del pH in lumen del singole vescicole, contenenti singole o multiple enzima, possono essere rilevati e analizzati singolarmente.
Abstract
Protone-pompaggio enzimi dell'elettrone trasferimento reazioni di ossidoriduzione Coppia catene alla traslocazione di protoni attraverso la membrana, creando una Forza Protonomotrice utilizzata per la produzione di ATP. La natura anfifilica delle proteine di membrana richiede particolare attenzione al loro trattamento, e la ricostituzione nell'ambiente naturale del lipido è indispensabile quando si studia i processi di trasporto di membrana come protone traslocazione. Qui, abbiamo dettaglio un metodo che è stato utilizzato per l'indagine sul meccanismo di pompaggio di protoni di enzimi redox della membrana, prendendo citocromo bo3 da Escherichia coli come un esempio. Una combinazione di microscopia di fluorescenza ed elettrochimica viene utilizzata per controllare lo stato redox dei cambiamenti di pH piscina e monitor del chinone in lumen. A causa della risoluzione spaziale di microscopia fluorescente, centinaia di liposomi possa essere misurati simultaneamente mentre il contenuto degli enzimi può essere scalato verso il basso per un singolo enzima o trasportatore a liposoma. L'analisi di rispettivo singolo enzima può rivelare modelli nella dinamica funzionale degli enzimi che potrebbe altrimenti essere nascosti dal comportamento dell'intera popolazione. Includiamo una descrizione di uno script per l'analisi di immagine automatizzato.
Introduction
Informazioni sui meccanismi degli enzimi e cinetica sono ottenuti solitamente al livello ensemble o macroscala con popolazione di enzima in migliaia a milioni di molecole, dove misure rappresentano una media statistica. È noto, tuttavia, che le macromolecole complesse quali enzimi possono dimostrare eterogeneità nel loro comportamento e osservati a livello di insieme di meccanismi molecolari non sono necessariamente validi per ogni molecola. Tali deviazioni sulla scala singola molecola sono stati ampiamente confermati da studi di singoli enzimi con una varietà di metodi emergenti durante l'ultimo ventennio1. In particolare, rilevazione della fluorescenza di attività enzimatica individuale è stato utilizzato per indagare eterogeneità di enzimi attività2,3 o scoprire l'effetto della cosiddetta memoria (periodi di attività di enzimi elevati è riuscito da periodi di bassa attività e viceversa)4,5.
Molti studi di singolo enzima richiedono che gli enzimi sono immobilizzati sulla superficie o nello spazio fisso in un altro modo per rimanere sufficientemente lunga nel campo visivo per osservazione continua. Incapsulamento di enzima nei liposomi è stato indicato per attivare immobilizzazione degli enzimi, evitando qualsiasi impatto negativo dovuto la superficie-enzima o proteina-proteina, interazioni6,7. Inoltre, liposomi offrono una possibilità unica per lo studio di proteine di membrana singola nel loro naturale dei lipidi bilayer ambiente8,9,10.
Una classe di proteine di membrana, trasportatori, esercita uno spostamento direzionale di sostanze attraverso la membrana cellulare, un comportamento che può essere studiato solo quando proteine sono ricostituite in lipidi bilayer (ad es., liposomi)11, 12,13. Ad esempio, traslocazione protonica, esibito da parecchi enzimi delle catene di trasporto dell'elettrone procariote ed eucariote, svolge un ruolo importante nella respirazione cellulare, creando una Forza Protonomotrice utilizzata per la sintesi di ATP. In questo caso, il protone attività di pompaggio è accoppiato per il trasferimento di elettroni, anche se il meccanismo dettagliato di questo processo spesso resta sfuggente.
Recentemente, abbiamo dimostrato la possibilità di rilevazione fluorescente coppia con elettrochimica per studiare protone pompaggio attività di singoli enzimi dell'ossidasi terminale ubiquinol di Escherichia coli (citocromo bo3) ricostituiti nei liposomi14. Questo è stato ottenuto mediante incapsulamento di un colorante fluorescente membrana impermeabile pH sensibili nel lumen di liposomi preparato da E. coli lipidi polari (Figura 1A). La quantità di proteina è stata ottimizzata in modo che maggior parte dei liposomi o contenuto nessuna o solo una molecola di enzima ricostituito (secondo la distribuzione di Poisson). I due substrati del citocromo bo3 sono stati forniti da aggiungere alla miscela di lipidi che formavano i liposomi e ossigeno (ambientale) in soluzione ubichinone. I liposomi sono quindi scarsamente adsorbiti su elettrodo d'oro ultra-liscio semi-trasparente, coperto con un monostrato auto-assemblato di 6-mercaptohexanol. Infine, l'elettrodo è montato sulla parte inferiore di una cella di Spettroelettrochimica semplice (Figura 1B). Elettrochimico controllo dello stato redox chinone piscina permette uno per attivare in modo flessibile o per fermare la reazione enzimatica in qualsiasi momento, mentre la tintura di pH sensibili viene utilizzata per monitorare le variazioni del pH all'interno del lume dei liposomi come conseguenza di spostamento di protoni dalla enzimi. Utilizzando che l'intensità di fluorescenza di un colorante fluorescente in secondo luogo, associati a lipidi, la dimensione e il volume dei liposomi individuali può essere determinato e così la quantificazione del protone di enzima attività di pompaggio. Utilizzando questa tecnica, abbiamo trovato in particolare che il citocromo bo3 molecole sono in grado di entrare in uno stato di perdita spontanea che si dissolve rapidamente la forza motrice protonica. L'obiettivo di questo articolo è quello di introdurre la tecnica delle misurazioni singole liposoma in dettaglio.
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Protocol
1. preparazione di una miscela di lipidi/UQ-10/FDLL
Nota: E. coli lipidi utilizzati per la preparazione dei liposomi dovrebbero essere aliquotati e accuratamente miscelati con ubiquinone-10 (enzima-substrato) e di lunghezza d'onda fluorescenti ha tingere-contrassegnati i lipidi (per determinare la dimensione liposomi) prima dei ricostituzione.
- Usando una siringa di vetro, trasferimento 200 µ l di brodo di cloroformio di lipidi polari estrarre da Escherichia coli (25 mg/mL) in fiale di vetro per rendere aliquote di 5 mg.
- Aggiungere 50 µ l di 1 mg/mL ubiquinone-10 (UQ-10; in cloroformio) per i lipidi per rendere il rapporto finale di UQ-10: 1: 100 di lipidi (1% p/p).
- Aggiungere 20 µ l di 1 mg/mL (0,4% w/w) di un lunghezza d'onda fluorescenti tingere-contrassegnati lipidici (FDLL) per il mix di lipidi/UQ-10.
- Omogeneizzare la soluzione di cloroformio nel Vortex breve ed evaporare la maggior parte del cloroformio sotto un delicato flusso di azoto o argon. Rimuovere le tracce di cloroformio interamente da ulteriore evaporazione sotto vuoto per almeno 1 h.
Nota: Le aliquote dei lipidi possono essere memorizzate sotto atmosfera inerte a-20 ° C per diversi mesi.
2. ricostituzione del citocromo bo3
Nota: Per la purificazione di citocromo bo3 da e. coli, seguire il protocollo da Rumbley et al. 15 per garantire elevata purezza dei campioni di enzima nativo-piegato, aggiungere cromatografia di esclusione dimensionale dopo la fase di purificazione di affinità descritta da Rumbley et al. 15
- Aggiungere 312.5 µ l di 40 mM MOPS-KOH/60 mM K2modo4, pH 7.4, ad un'aliquota di lipidi/UQ-10/FDLL asciutto mix (5 mg, passo 1.4) e miscelare con vortice fino a quando il film lipidico è completamente risospeso, seguiti da 2 min di trattamento in un bagno ad ultrasuoni.
- Aggiungere 125 µ l di 25 mM 8-hydroxypyrene-1,3,6-trisulphonic acido (HPTS), una tintura fluorescente pH sensibili che deve essere incapsulato in liposomi.
- 137,5 µ l di tensioattivo di 250 mM n-ottile β-D-glucopyranoside (OGP), mescolare con vortex e Sonicare in un bagno d'acqua ad ultrasuoni per 10 min garantire che tutti i lipidi sono solubilizzati in micelle di tensioattivo. Trasferire la dispersione in un tubo di plastica da 1,5 mL.
Nota: Sospensione torbida di lipidi dovrebbe diventare trasparente dopo la solubilizzazione con surfattante. - Aggiungere la quantità necessaria di citocromo bo3 (vedere la nota qui sotto) e aggiungere acqua ultrapura per fare un volume totale di 50 µ l ( citocromo bo3 soluzione più acqua). Incubare a 4 ° C per 10 minuti in un mixer di rullo.
Nota: Quantità tipica per le condizioni di singolo enzima è 0,1 – 0,2% (w/w-a-lipidico, cioè. 5 – 10 µ g di proteine), anche se può essere aumentato fino a 1 – 2% (50 – 100 µ g di proteine) se l'obiettivo è quello di osservare solo l'attività elettrochimica (Vedi sotto). Come controllo negativo, liposomi senza citocromo bo3 possono essere preparati. - Pesare 2 x 50 mg e 2 x 100 mg di microsfere di polistirolo in quadrato quattro 1,5 mL-tubo e chiudere con la pellicola di paraffina per evitare l'essiccazione.
Nota: Prima dell'uso, microsfere di polistirolo devono essere lavati con metanolo, acqua e conservati in acqua secondo il manuale del produttore.
Nota: Se viene utilizzata una miscela di acqua/della microperla, microsfere di polistirolo può convenientemente essere trasferiti al tappo con una micropipetta con una punta larga. Acqua quindi può essere rimosso dalle microsfere utilizzando una micropipetta con una punta sottile. - Aggiungere l'1st50 mg di microsfere di polistirolo nella miscela di ricostituzione (punto 2.4) mettere il tappo con microsfere di polistirolo sul tubo 1,5 mL-plastica con dispersione ed eseguendo un breve giro per un paio di secondi. Incubare a 4 ° C su un mixer a rulli per microsfere di polistirolo adsorbire il tensioattivo per 30 min.
- Ripetere le aggiunte di microsfere di polistirolo e le incubazioni come segue: aggiungere 50 mg di microsfere per 60 min di incubazione; aggiungere 100 mg di microsfere per 60 min di incubazione; e aggiungere 100 mg di microsfere per 120 min di incubazione.
Nota: La soluzione sopra le microsfere si stabilirono diventerà traslucida durante passaggio 2.6 come proteoliposomi sono formati.
- Ripetere le aggiunte di microsfere di polistirolo e le incubazioni come segue: aggiungere 50 mg di microsfere per 60 min di incubazione; aggiungere 100 mg di microsfere per 60 min di incubazione; e aggiungere 100 mg di microsfere per 120 min di incubazione.
- Separare la soluzione proteoliposome da microsfere di polistirolo con una micropipetta con una punta sottile. Diluire la dispersione in 90 mL di 20mm MOPS-KOH/30 mM K2così4, pH 7,4 (tampone MOPS) e trasferimento in un tubo di Ti45 ultracentrifuga.
- Ultracentrifuga la dispersione utilizzando tipo 45 Ti rotore a 125.000 x g (a rmax) per 1 h a pellet il proteoliposomi.
Nota: Piccole provette da centrifuga possono essere utilizzati anche se la diluizione nel volume di buffer di grandi dimensioni consente di ridurre la concentrazione dei non-incapsulato HPTS la sospensione finale. - Eliminare il supernatante, sciacquare i pellet con 20 mM MOPS-KOH/30 mM K2modo4, pH 7.4 del buffer (senza risospendere il pellet). Dopo aver scartato il buffer di risciacquo, risospendere il proteoliposomi in 500 µ l di tampone MOPS pipettando avanti e indietro con una micropipetta punta sottile. Poi il trasferimento a un tubo di plastica da 1,5 mL.
- Centrifugare la sospensione per 5 min a 12.000 x g per rimuovere i detriti. Trasferire il surnatante (ricostituita proteoliposomi) in un nuovo flacone.
- Memorizzare la dispersione proteoliposomi ricostituiti a 4 ° C durante la notte e utilizzare entro 2 giorni.
3. fabbricazione di elettrodi d'oro semi-trasparenti
Nota: La superficie liscia di oro si ottiene un metodo di "stripping" modello di un 30 nm-spessore strato d'oro del 99,99% da un wafer di silicio atomicamente liscia. Il piccolo spessore dello strato d'oro è importante poiché esso deve essere semi-trasparente per consentire l'osservazione della fluorescenza. Dettagli di oro evaporazione (deposizione fisica da vapore, PVD) si possono trovare altrove16 e unico modello-stripping è coperto qui. In alternativa, ultra-lisce gettoni d'oro possono essere acquistati altrove (Vedi Tabella materiali).
- Colla fino a 9 vetro vetrini coprioggetto (0,17 mm di spessore) sulla superficie dell'oro evaporata utilizzando resina epossidica bi-componente basso-fluorescenza. Curare la colla a 80 ° C per 4 h.
- Appena prima di modifica con un monostrato auto-assemblato (passaggio 4), staccare il vetro vetrini coprioggetto dai wafer di silicio con una lama. A causa della magrezza di vetrini coprioggetto, prendersi cura prima di scollegare il coprioggetto per non crepa o rompere i vetrini.
4. modifica della superficie dell'oro con Self-Assembled Monolayer (SAM)
- Preparare 5 mL di soluzione acquosa di 1 mM 6-mercaptohexanol (6MH).
- Immergere appena staccato rivestito in oro vetrini coprioggetto (punto 3.1) nella soluzione 6MH e lasciare a 20 – 25 ° C durante la notte (> 16 h) per formare il SAM.
Nota: Tiolo soluzioni hanno un odore sgradevole, quindi un vaso chiuso deve essere utilizzato quando incubando il vetrino coprioggetto ricoperto in oro. - Il giorno successivo, rimuovere il vetrino coprioggetto ricoperto in oro dalla soluzione 6MH, lavare rapidamente con acqua o metanolo e poi con isopropanolo. A secco sotto un flusso di gas dolce.
5. test elettrochimica dei proteoliposomi attività
Nota: L'attività elettrochimica dell'enzima prima viene verificata su un livello molto attentamente imballate liposomi (passo 5) e i riempimenti di vescicola inferiori utilizzati in vescicole singolo esperimento per misurare le variazioni di pH nel lume dei liposomi (passaggio 6).
- Montare il vetrino coprioggetto ricoperto in oro in una cella elettrochimica spectro (Vedi Figura 1). Fare contatto all'oro con una piattina all'esterno di un'area definita da una guarnizione in gomma.
- Aggiungere 2 mL di soluzione tampone dell'elettrolito e posizionare il riferimento ed elettrodi ausiliari nella cella.
Nota: Come ulteriormente discusso nella sezione discussione, elettrodi di riferimenti senza cloruro sono preferiti per evitare formazione di Au (I) Cl durante elettrochimica. Qui, un Hg/Hg2SO4 (sab. K2SO4) elettrodo di riferimento è utilizzato e i potenziali sono dato contro elettrodo Standard di idrogeno (SHE) utilizzando 0,658 V vs lei per Hg/Hg2SO4 (sab. K2così4). - Eseguire spettroscopia di impedenza elettrochimica (0.1 Hz-100 kHz) al potenziale (OCP) potenziale della cellula aperta a valutare la qualità di SAM. Convertire i valori di impedenza in ingresso e dividere per 2πω per tracciare una trama di Cole-Cole, dove ω è la frequenza (vedere i seguenti riferimenti16,17,18 per ulteriori informazioni sulla conversione e interpretariato impedenza spettri).
Nota: SAMs compatta e densa di 6MH dovrebbe dare una stretta a semi-cerchio trama Cole-Cole e dare valori di capacità nell'intervallo 2.5-3.0 µF/cm2 (Figura 2A). Se si ottengono deviazione significativa dalla forma semicircolare o valori di capacitanza di out-of-range, cambiare l'elettrodo. - Eseguire vuoto voltammograms ciclico (CVs) con scansione tariffe 100 e 10 mV/s nella regione potenziale -0,3 – 0,8 V. Un CV tipico è mostrato su (Figura 2B, linea tratteggiata).
Nota: Questo dovrebbe dimostrare quasi puro comportamento capacitivo e un'assenza di significative corrente faradica, anche in condizioni di ossigeno ambientale come usato qui. - Aggiungere proteoliposomi (concentrazione di lipidi finale di 0,5 mg/mL, 1-2% (w/w) rapporto di citocromo bo3 al lipido) a cella elettrochimica e mescolare leggermente con una pipetta. Attendere che l'adsorbimento dei proteoliposomi sulla superficie dell'elettrodo è finito (30-60 min a temperatura ambiente).
Nota: Voltammograms ciclico (CVs) a 10 mV/s può essere eseguito durante l'adsorbimento proteoliposomi di seguire il processo. L'adsorbimento è finito quando consecutivi CVs smettere di cambiare. Informazioni sulle tecniche di CV possono essere trovati nei libri di testo seguente. 19 , 20 - Lavare la cella modificando la soluzione tampone almeno 10 volte, ma evitare di lasciare completamente asciutta la superficie dell'elettrodo.
- Eseguire la spettroscopia di impedenza elettrochimica a OCP (Figura 2A, linea blu) per confermare che il SAM sull'elettrodo d'oro rimane invariato e CVs con scansione Tariffe 10 e 100 mV/s per osservare l'ossidazione catalitica ubiquinol (e riduzione dell'ossigeno) dal citocromo Bo 3 a potenziali di insorgenza della riduzione elettrochimica chinone su 0 V vs SHE) (Figura 2B).
6. rilevazione del protone enzimatica di pompaggio mediante microscopia a fluorescenza
- Modificare l'elettrodo d'oro come nel passaggio 5, ma usando 100 x meno proteoliposomi rispetto al passaggio 5.5 (cioè, 5 µ g/mL). Per gli studi di singolo enzima, ridurre il citocromo bo3 al rapporto del lipido a 0,1-0,2% (w/w).
Nota: Liposomi saranno scarsamente adsorbono sulla superficie dell'elettrodo, l'attivazione del singola vescicola monitoraggio mediante microscopia a fluorescenza. In queste condizioni di singolo-enzima, la quantità di enzima immobilizzato sulla superficie dell'elettrodo è insufficiente per l'osservazione di una corrente catalitica. - Posizionare la cella elettrochimica sull'obiettivo di olio (60 X) di un microscopio a fluorescenza invertito con una goccia di olio per immersione. Utilizzando gli appositi filtri per fluorescenza FDLL, concentrarsi sulla superficie dell'elettrodo. Liposomi singoli dovrebbero apparire come punti luminosi al limite di diffrazione dell'obiettivo del microscopio. Prendere un'immagine di fluorescenza FDLL.
- Passare a quella di set di filtri di fluorescenza HPTS il microscopio per verificare che HPTS fluorescenza è chiaramente visibili e distinguibili dallo sfondo (presso il tempo di esposizione selezionate, vedi punto 6.4). Se non è il caso, aumentare l'intensità della luce.
- Programmare il software microscopio per eseguire un'acquisizione di immagini temporizzata alternando due set di filtri HPTS (menu applicazioni | Define/Run ND acquisizione). Impostare il ritardo tra acquisizioni di immagine al minimo. In questo esperimento, utilizzare un'esposizione di s 1 e 0,3 s ritardo (dovuto il movimento di torretta).
Nota: Il rapporto tra intensità di fluorescenza a questi due canali si più tardi convertirà al pH all'interno di liposomi in ogni momento. La durata dell'acquisizione può variare secondo il tasso di cambiamento di pH previsto; 5 min viene utilizzato in questo articolo. - Regolare le impostazioni del potenziostato per modificare il potenziale durante l'acquisizione dell'immagine. Ad esempio, in questo esperimento, utilizzare la seguente sequenza: 0 – 60 s: nessun potenziale applicato (cioè OCP); 60-s: 180 -0,2 V (vs SHE); 180 – 300 s: 0,4 V (vs SHE). In questo caso, solo il potenziale applicato nella seconda fase (-0,2 V vs SHE) è sufficiente a ridurre in modo efficiente la piscina di chinone.
- Eseguire contemporaneamente l'acquisizione di immagini programmate (microscopio) e la sequenza potenziale (potenziostato) avviando manualmente entrambe le misurazioni allo stesso tempo.
Nota: L'esperimento può essere ripetuto sull'elettrodo stesso tempo diversi spostando il tavolino del microscopio in un'area diversa sulla superficie. Il ritardo tra le acquisizioni deve essere almeno 5-10 min per assicurare l'equilibrio di pH completo di liposomi sulla superficie. Durate diverse e modelli potenziali possono essere applicati a seconda delle necessità, anche se tempo di imaging è limitato dovuto photobleaching di HPTS durante l'acquisizione.
7. analisi di fluorescenza immagini
Nota: Un tipico esperimento produce una serie di immagini con un punto di tempo (ad es., 2.6 s) per ciascuno dei due canali, vale a dire, (durata * 2 / 2.6) immagini. Un esempio di tale immagine impostato registrato durante un esperimento di singolo enzima sono accessibili tramite la repository di ricerca dati Leeds21. Un trattamento di immagine è costituito da diversi passaggi utilizzando Fiji (ImageJ) e l'analisi matematica di alto livello programmazione lingua software (d'ora in poi denominati come software di scripting, Vedi Tabella materiali per dettagli).
- Utilizzare Fiji per separare i file lasso di tempo, allineare le immagini e salvare come canali separati e le tempistiche.
- File di lasso di tempo aperto utilizzando l'importatore Bioformats fornito all'interno di Fiji (comando macro: eseguire ("Bio-Formats importatore")).
- Utilizzare il plugin StackReg per allineare ogni fotogramma al primo per contabilizzare i movimenti possibili fase o deriva termica si è verificato durante l'acquisizione (comando macro: eseguire ("StackReg", "trasformazione = traduzione")).
- Salvare il file di immagine non compresso separati per ogni canale e ogni passo in formato TIFF in un'unica cartella.
- Estrarre i francobolli di ora esatta per ogni fotogramma dai metadati del file lasso di tempo e salvarli come file CSV nella stessa cartella delle immagini. In alternativa, estrarre data e ora utilizzando il software di acquisizione e salvare manualmente in un file CSV utilizzando un software di foglio di calcolo.
Nota: La cartella con le immagini e i timestamp è ora pronta per essere analizzati dal software di scripting. A pochi passi 7.1.1. – 7.1.4. può essere automatizzato utilizzando uno script di Fiji (utilizzare uno script scritto in Python per l'elaborazione batch dei file lasso di tempo è fornito, "Ctrl-Shift-N" (in Windows), quindi File | Aperto per caricare lo script).
- Utilizzo software per l'elaborazione automatizzata delle immagini di scripting. Caricare il codice fornito per il software e fare clic su Esegui alla fine. Quando richiesto, selezionare la cartella contenente le immagini dal punto 7.1.
Nota: Uno script per l'analisi è fornito come script live mlx-formato, con una serie di commenti per identificare singoli liposomi, adattarle alle funzione 2D-gaussiana, filtrarli e quantificare i valori di pH in ogni momento. I seguenti sotto-fasi vengono eseguite automaticamente dallo script.- Caricare tutti i time frame immagini per un singolo esperimento nella memoria.
- Media di tutte le immagini per un singolo canale (selezionare il canale con la massima intensità di fluorescenza) e utilizzare l'immagine di una media per identificare tutti i valori massimi che possono corrispondere ai liposomi singoli.
- Parametri per ogni liposoma in forma fit i massimi individuati sull'immagine media per il 2D-gaussiana funzionano e salvare il risultato (per esempio componibile liposoma, vedere Figura 4A ).
- Filtrare i valori massimi in base ai criteri di liposomi singolo previsto, quali dimensioni, circolarità e intensità. Rifiutare di liposomi che vengono montati male a causa di basso segnale/rumore, strettamente vicine ai liposomi o essere troppo vicini al bordo immagine.
- Caricare il timestamp del file esterno e montare separatamente ogni liposoma filtrato alla funzione 2D-gaussiana su ogni immagine di lasso di tempo.
Nota: L'uso della programmazione parallela e CPU multicore consente di migliorare notevolmente la velocità di calcolo in questa fase. - Filtrare i liposomi nuovamente secondo i criteri simili come descritto al punto 7.2.4 ma applicata per ogni periodo di tempo.
- Su ogni passo, è possibile definire il rapporto di intensità di fluorescenza di un liposoma come il rapporto tra volumi racchiusi componibile 2D-Gaussiana funzione a due canali. Calcolare i valori di pH dal rapporto di intensità determinata dai due canali HPTS e utilizzando una curva di calibrazione (passaggio 8). Tracciare curve di pH-tempo risultante per i liposomi e osservare il loro pH cambia quando viene applicato il potenziale.
8. esecuzione di una curva di calibrazione della fluorescenza HPTS
Nota: Per convertire HPTS fluorescenza rapporto ad un pH di intravesicular, una curva di calibrazione è necessario prima stabilire che prenderebbe in considerazione di condizioni particolari di esperimenti come trasmittanza oro, filtri di qualità, ecc. Questo passaggio deve essere eseguita solo una volta o due volte e i dati di calibrazione possono essere utilizzati fino a quando i parametri di configurazione e misura rimangono invariati nel passaggio 6.
- Preparare un elettrodo con liposomi scarsamente adsorbiti (senza citocromo bo3 come descritto nei passaggi 5 e 6.1).
- Aggiungere 2 µ l di soluzione Gramicidina 0,1 mg/mL in etanolo a 2 mL di tampone per creare la concentrazione 100 ng/mL.
- Catturare due immagini di fluorescenza per i due canali HPTS.
- Modificare il pH della cellula tramite l'aggiunta di piccole aliquote di 1 M HCl o 1 M H2così4. Misurare il pH del buffer con un misuratore di pH standard e catturare due immagini di fluorescenza per i due canali HPTS.
- Ripetere i passaggi da 8,4 per l'intervallo di pH da 6 a 9.
- Utilizzando l'algoritmo da 7.2, adattarsi, filtrare e calcolare il rapporto medio di fluorescenza HPTS di liposomi individuali a ogni pH. Prendere il rapporto HPTS medio sopra tutti i liposomi.
- Adattare la dipendenza di pH-rapporto risultante per la seguente equazione:
, dove pKun, Ra e Rbsono raccordo parametri. - Utilizzare pKun, Ra e Rba convertire il rapporto HPTS di liposomi individuali nel passaggio 7.2.7. per valori di pH.
, dove pKun, Ra e Rbsono raccordo parametri.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
La qualità del coprioggetto oro-modificato (l'elettrodo) con una SAM di 6MH è controllata prima di ogni esperimento con la spettroscopia di impedenza elettrochimica. La Figura 2A Mostra rappresentative trame di Cole-Cole misurati mediante spettroscopia di impedenza elettrochimica prima e dopo i liposomi sono adsorbiti. Se la qualità di SAM è sufficiente, spettroscopia di impedenza dovrebbe dimostrare un comportamento capacitivo quasi puro risultante in una trama di Cole-Cole semi-cerchia. Il diametro del semicerchio in una trama di Cole-Cole è uguale la capacitanza di doppio strato di superficie dell'elettrodo, che dovrebbe essere compreso nell'intervallo 2.5-3.0 µF/cm2 . Nota che la capacità non dovrebbe cambiare in modo significativo all'adsorbimento di liposomi, nonostante un leggero aumento nella capacità potrebbe essere osservato (fondo di liposomi ad alta copertura, Figura 2A,) o un leggero spostamento di impedenza può essere osservato a bassa frequenze (alto a basso liposoma riempimenti, Figura 2A,).
Elettrochimica può essere utilizzato per verificare l'attività catalitica di citocromo bo3 nei proteoliposomi, dove catalitiche correnti misurate con voltammetria ciclica riflettono l'attività di ossidoriduttasi ubiquinol-ossigeno. Tuttavia, correnti catalitiche significative possono essere rilevate soltanto alle elevate quantità di proteoliposomi adsorbiti e uno strato molto attentamente imballato di proteoliposomi sul vetrino coprioggetto oro-modificato è necessario. Figura 2B dimostra rappresentante voltammograms ciclico (CVs) dell'elettrodo prima e dopo l'adsorbimento di liposomi con entrambi copertura liposoma bassa o alta. Nessuna corrente faradica è osservata sul CV vuoto perché la riduzione dell'ossigeno tramite l'elettrodo d'oro nudo è bloccato da SAM. Quando la superficie è saturo con liposomi con alta citocromo bo3 contenuto (1,3% (w/w) in questo caso), un'onda chiara catalitica a causa di riduzione dell'ossigeno è osservato con un potenziale di insorgenza di 0 V, cioè, il potenziale di ubiquinone riduzione (Figura 2B, linea blu). La piscina di ubichinone agisce sia come il substrato per l'enzima naturale che come mediatore dell'elettrone, trasferimento di elettroni da enzima alla superficie dell'elettrodo. Notiamo che sotto copertura alta liposoma, distinzione di vescicole individuali non è possibile da microscopia e copertura inferiore è necessario per gli studi singoli liposoma. A copertura del liposoma basso (ma ad alta percentuale proteica al rapporto del lipido), la corrente catalitica è notevolmente ridotta, a malapena distinguibili dallo sfondo (Figura 2B, linea rossa). Notare che in condizioni di singolo enzima (proteina di bassa rapporto di lipidi), la corrente catalitica è ancora più bassa e non può essere determinata attendibilmente.
La figura 3 Mostra immagini di fluorescenza di liposomi adsorbiti sugli elettrodi a tre diversi riempimenti. Tutte le immagini sono state scattate in identiche condizioni di luce e l'esposizione e la loro luminosità è stato altrettanto adeguata per consentire il confronto diretto. Tintura-contenente-liposomi sono visibili sulle immagini come punti luminosi. La parte centrale dell'immagine è stato photobleached per un paio di minuti per rivelare il livello di fluorescenza di fondo (notiamo che FDLL è relativamente fotostabili e non è photobleached completamente nella Figura 3). Le immagini su due canali HPTS sono sovrapponibili, dove il rapporto tra i due canali (410/535 e 470/535) corrisponde a pH 7,4 utilizzati in questo esperimento. Un numero maggiore di liposomi è visibile con il canale FDLL, che indica la presenza di liposomi che non hanno nessun HPTS incapsulato. La differenza tra i canali HPTS e FDLL è più pronunciata alle coperture superiori, forse perché alla copertura del liposoma alta, i liposomi sono più probabili scoppiare o fusibile sulla superficie.
L'analisi di immagine richiede l'allineamento dei telai (contro il primo fotogramma) usando ImageJ, plugin StackReg. L'allineamento è indispensabile nella maggior parte delle situazioni, poiché una leggera deriva termica del campione si presenta solitamente entro i tempi dell'esperimento, cambiando le coordinate del liposoma. Tutte le ulteriori analisi viene eseguita utilizzando un codice software script. Questo codice esegue l'identificazione automatica del liposoma. Come la dimensione dei liposomi sono di sotto del limite di diffrazione di Abbe, loro fluorescenza è visto come un punto di diffusione funzione molto più grande rispetto al diametro effettivo liposoma (Figura 4A). Il codice si inserisce l'intensità della fluorescenza di ogni vescicola su due canali a una funzione 2D-gaussiana (Figura 4A) e calcola il loro rapporto volumetrico intensità che può essere convertito a pH utilizzando una curva di calibrazione. Eseguendo queste operazioni su tutti i time frame, il pH è ottenuto all'interno di ogni vescicola all'interno della scala cronologica dell'esperimento (1 film). Figura 4B Mostra le mediane di tutte le variazioni di pH delle vescicole all'interno di una singola immagine quando il citocromo bo3 contenuto è 1,3%. Un aumento nel pH (pompa protonica) è chiaramente visibile quando un potenziale tra -0,1 e -0,3 V viene applicato, ma non per 0 V poiché quest'ultimo non è sufficiente a ridurre il pool di chinone. Quando il citocromo bo3 contenuto è molto più basso (rapporto di proteine-lipidi dello 0,1%, Figura 4), le curve mediana diventano quasi indistinguibili da quelle dei liposomi vuoti (Figura 4). La differenza diventa evidente quando si considera le tracce individuali pH dei liposomi casuale (Figura 5, 6 e 7). Mentre liposomi senza citocromo bo3 non visualizzare nessun cambiamenti di pH significativa rispetto al rumore (Figura 7), una selezione di liposomi mostrano un aumento (dominante) o una diminuzione del pH quando un potenziale è applicato quel actives citocromo bo3 (figure 6, zona grigia). La differenza evidente nelle tracce di pH tra liposomi è coerenza con il rapporto basso di proteine-lipidi, dove citocromo bo3 è presente solo in un piccolo sottoinsieme di attività di liposomi. La prevalenza di un aumento del pH sopra diminuzione si spiega con il metodo di ricostituzione che favorisce un orientamento "esteriore" di molecole di enzima (ca. 75%). La frazione di liposomi che visualizzano un cambiamento di pH aumenta quando il citocromo bo3 al rapporto del lipido è superiore (Figura 5). Si noti inoltre che alcuni liposomi smettere di pompare protoni ed entrare in modalità di dissipazione del protone prima della fine dell'applicazione potenziale. Noi attribuiamo questo comportamento per le molecole di citocromo bo3 entrando in uno stato"perdita", che permette di protoni di fluire nuovamente dentro il liposoma lumen14.
L'ulteriore analisi delle tracce pH compreso il loro montaggio e la determinazione del protone di pompaggio/tariffe di perdite può essere fatto utilizzando uno script ci sono pubblicati in precedenza14,22 e possono essere ottenuti dal Repository di Leeds di ricerca dati 23 , 24.
Figura 1: principio del metodo. (A) principio di monitoraggio attività di singolo enzima e (B) il regime dell'apparato sperimentale utilizzato in questo lavoro con un cutaway per illustrare una parte interna della cella. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: risposta elettrochimica dei liposomi. (A) Cole-Cole trame misurata a OCP (0,22 V contro lei; linea nera quadrata) prima e dopo i liposomi (citocromo di 1,3% w/w bo3) adsorbimento da soluzioni a concentrazioni di 5 µ g/mL (linea cerchio rosso) e 500 µ g/mL (cerchio blu linea). (B) ciclico voltammograms a 100 mV/s (pannello di sinistra) e 10 mV/s (pannello di destra) di Au-SAM (linea nera tratteggiata) prima e dopo i liposomi (citocromo di 1,3% w/w bo3) adsorbimento da soluzioni a concentrazioni di 5 µ g/mL (linea rossa) e 500 µ g/mL (linea blu). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: microscopia di fluorescenza di liposomi. Immagini di fluorescenza di liposomi presso diversi riempimenti di superficie: superfici incubate per 30 min con una soluzione di liposomi di 5 µ g/mL (riga superiore), 20 µ g/mL (riga centrale) e 500 µ g/mL (riga inferiore). Colonna di sinistra corrisponde all'installazione del filtro di eccitazione/emissione di 470/535 nm (1° canale HPTS); colonna centrale - 410/535 nm (2° canale HPTS); colonna destra - 560/645 nm (canale FDLL). Le immagini sono state scattate a ingrandimento 90 X (60 X 1,5 X ingrandimento dal microscopio prima la fotocamera e obiettivo), 1 s esposizione e intensità della luce simili. Barre della scala corrispondono a 50 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: identificazione dei liposomi e pH cambia. (A) 3D-vista di una parte dell'immagine di fluorescenza contenenti un tipico liposoma singolo. L'intensità di fluorescenza è visto come un punto di diffusione funzione (superficie di colore) che è montato su una funzione 2D-gaussiana (maglia nera). PH (B-D), visualizzato come la mediana delle tutte le vescicole all'interno area di singola immagine (in genere diverse centinaia) a diversi potenziali applicati. Da 0-60 s, non viene applicato potenziale (OCP). Tra 60 e 180 s (zona grigia) sono state applicate diverse potenzialità: 0 V (nero), -0.1 V (rosso), -0.2 V (verde), -0,3 V (blu). Tra 180 e 300 s, 0,4 V vs. Lei è stata applicata. Il citocromo bo3 ai rapporti del lipido erano (B) 1,3%, (C) 0,1%, (D) 0%. Le tracce sono compensate per chiarezza. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: tracce di pH di liposomi contenenti 1,3% dell'enzima. Tracce di pH cambia di 72 liposomi singoli, scelti a caso, contenenti citocromo bo3 (1,3% w/w) misurato e analizzato durante un esperimento. Da 0-60 s, nessun potenziale è applicato (OCP); tra 60 e 180 s (zona grigia) -0,2 V vs. LEI; tra 180 e 300 s, 0,4 V vs. Lei è stata applicata. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 6: tracce di pH dei liposomi contenenti 0,1% di enzima. Tracce di pH cambia di 72 liposomi singoli, scelti a caso, contenenti citocromo bo3 (0,1% p/p) misurato e analizzato durante un esperimento. Da 0-60 s, nessun potenziale è applicato (OCP); tra 60 e 180 s (zona grigia) -0,2 V vs. LEI; tra 180 e 300 s, 0,4 V vs. Lei è stata applicata. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 7: tracce di pH dei liposomi senza enzima. Tracce di cambiamento di pH dei liposomi singoli 72, selezionati in modo casuale, senza citocromo bo3 misurati e analizzati nel corso di un esperimento. Da 0-60 s: Nessun potenziale è applicato (OCP); tra 60 e 180 s (zona grigia) -0,2 V vs. LEI; tra 180 e 300 s, 0,4 V vs. Lei è stata applicata. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Movie 1: animazione di cambiamento di pH del singolo liposoma. (pannello superiore) Cambiamento di una fluorescenza liposoma su due canali HPTS (indicato come trama 3D-superficie della zona corrispondente) durante 300 s dell'esperimento. È stato applicato il potenziale riduttivo tra 60 s e 180 s. trama corrispondente (pannello inferiore) del rapporto di intensità volumetrica dei due canali HPTS rispetto al tempo. L'area dell'applicazione potenziale riduttivo è ombreggiato in grigio. Per favore clicca qui per vedere questo video. (Tasto destro per scaricare.)
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Discussion
Il metodo descritto è adatto per studiare protone pompaggio di proteine di membrana respiratoria che possono essere ricostituite in liposomi e sono in grado di scambiare elettroni con lo stagno del chinone. Protone attività di pompaggio può essere monitorato a livello di singolo-enzima utilizzando coloranti sensibili al pH (raziometrici) incapsulati nel lume liposoma (Figura 1A).
Il metodo si basa sulla capacità di ubiquinone (o altri chinoni), incorporato nel bilayer del lipido, per lo scambio di elettroni con elettrodi modificati con un SAM18. Le proprietà dell'elettrodo d'oro, modificato con una SAM, sono molto specifiche. Liposomi bisogno di essere assorbito il SAM e SAM deve essere sufficientemente sottile per consentire la rapida ossidazione elettrochimica e riduzione del pool chinone nei liposomi. D'importanza, l'interazione tra l'elettrodo e il liposoma deve essere abbastanza debole per non compromettere l'integrità della membrana del lipido. Inoltre, a seconda dei dettagli del sistema sperimentale, è auspicabile se il SAM impedisce reazioni collaterali oro-catalizzata, come riduzione dell'ossigeno. Infine, il SAM deve essere stabile all'interno della finestra potenziale utilizzata. L'uso di elettrodi d'oro ultrapiatti per volta con SAM di alta qualità di 6MH soddisfa tali requisiti nel caso del citocromo bo3. Stripping elettrodi d'oro da wafer di silicio atomicamente-piatto crea una superficie ultra-liscia oro con una vicino SAM ideale come indicato dagli spettri di impedenza. Siete pregati di notare che noi formiamo il SAM da 6MH in acqua. Precedentemente abbiamo segnalato il SAMs con 6MH in isopropanolo16, ma questi SAMs esibiscono più elevati valori di capacità di doppio strato e spettri di impedenza che indicano una superficie più eterogenea (cioè., difetti più) con una minore resistenza. Inoltre, quando SAMs da 6MH sono preparato da una soluzione di acqua, meno riduzione di ossigeno di sfondo (a causa della riduzione di ossigeno catalizzata oro) viene osservato rispetto al SAMs formata da una soluzione di etanolo/isopropanolo. Tutte queste osservazioni indicano che il SAMs da 6MH in soluzione acquosa hanno una qualità superiore con meno difetti. SAMs di qualità superiore può anche essere formata da composti del tiolo con catene più lunghe dell'alcano (ad es., 1-idrossi-decane-tiolo), ma la cinetica di trasferimento dell'elettrone più lentamente man mano che aumenta lo spessore di SAM.
Durante elettrochimica (spectro), gli ioni cloruro dovrebbero essere evitati nella soluzione tampone, poiché essi possono chemosorb sulla superficie dell'oro alle alti potenziali, possibilmente deteriorando la qualità di SAM. Per lo stesso motivo, è preferibile un elettrodo di riferimento esente da cloruri.
Un altro punto importante è la permeabilità di sfondo dei liposomi di protoni, che dovrebbero essere abbastanza bassi da consentire accumulo protone come conseguenza di spostamento enzimatica protone sulla scala cronologica dell'esperimento. La composizione esatta dei lipidi può influenzare questa permeabilità. Nel nostro lavoro, utilizziamo polar Escherichia coli estratti lipido completati con ubiquinone-10. Permeabilità del protone è stato indicato per dipendono fortemente acidi grassi catena lunghezza25, anche se questa è stata smentita in studi con più complesso lipidico composizioni26. È interessante notare che, ubiquinone recentemente è stato indicato per migliorare la stabilità di membrana27. Infine, detersivo residuo dalla procedura di ricostituzione di proteina possa influenzare la perdita del protone e quindi è importante rimuovere detergenti completamente come possibile utilizzando microsfere di polistirolo idrofobo, diluizione, seguita da centrifugazione e risciacquo della cella elettrochimica dopo i proteoliposomi sono adsorbiti sulla superficie. Se dubbioso, permeabilità liposoma può essere verificata seguendo il cambiamento di pH del lume (via HPTS) in risposta a un salto di pH esterno28.
Misura singolo enzima necessita di unilamelar liposomi e più piccoli liposomi sono tenuti a mostrare variazioni di pH più veloce o superiore come diminuisce di volume di lumen. Per raggiungere questo obiettivo, microsfere di polistirolo vengono aggiunti gradualmente in piccole quantità che conduce a lento tasso di formazione di liposomi. In tali condizioni, si formano piccoli liposomi di dimensioni omogenee con un diametro medio di 70 nm e un indice di polidispersione di 0,24 nel nostro caso14. HPTS adsorbe anche sulle microsfere di polistirolo, riducendo la capacità delle microsfere di polistirolo di adsorbire detergente. Quindi, microsfere di polistirolo in eccesso deve essere aggiunto per compensare la sua perdita. Trattamento con microsfere di polistirolo è stato osservato per ridurre la concentrazione di HPTS nella sospensione del lipido-proteina di circa un quarto (da 5 a 3-4 mM). Tuttavia, l'effettiva concentrazione di HPTS nel lume del liposoma potrebbe essere superiore poiché i liposomi sono formati presto sul trattamento con microsfere di polistirolo. Invece di HPTS, possono essere utilizzati altri coloranti sensibili al pH. Tuttavia, è importante che il colorante è membrana-impermeabile e raziometrici. Quest'ultimo evita errori sperimentali a causa di photobleaching e quantità variabili di tintura incapsulata.
Semplici calcoli possono essere fatto per valutare se, casualmente, la maggior parte dei liposomi non vuoto contiene soltanto una molecola di enzima. Supponendo un diametro medio liposoma di 70 nm, peso molecolare del lipido di Da 750 e una zona del lipido di 0.65 nm2 ci dà una massa di liposomi di 5.2x10-17 g, cioè, 9.6x1013 liposomi per preparazione (5 mg di lipidi). A 0,1% di citocromo bo3 (MW = 144 kDa), 2 x 1013 molecole di enzima sono presenti, corrispondente ad un rapporto di proteine 0,2: liposoma. Utilizzando una distribuzione di Poisson, ulteriormente si può calcolare che la probabilità di trovare una molecola di enzima (17%) a liposoma è dieci volte più probabilità di trovare più di una molecola (1,7%) superiore. Calcoli più precisi possono essere fatto se le perdite di enzima e di lipidi durante la ricostituzione determinato da saggi corrispondenti sono presi in considerazione. Quest'ultimo può essere stimato da un'analisi della proteina e misurando la fluorescenza FDLL di liposomi preparati.
Una volta che il protocollo è stabilito e vengono registrate le tracce singolo enzima, ulteriori modifiche del metodo è fattibile in base allo scopo. Uno potrebbe pensare di un enzima inibitore aggiunta o l'introduzione di un ionoforo nel sistema. Cura dovrebbe essere presa per verificare che l'aggiunta di solventi utilizzati per preparare ionoforo o stock di inibitore non influenzano lo stato di SAM o permeabilità dei liposomi.
La tecnica come descritto qui è limitata a un particolare gruppo di enzimi che sono entrambi i trasportatori di membrana del protone e chinone di conversione. Le attrezzature e le condizioni sperimentali come usato qui sono state ottimizzate per l'attività enzimatica del citocromo bo3. Qui, la risoluzione di tempo è 2-3 secondi, determinati dal tempo di esposizione e il tempo che necessario per la torretta di cambiare i filtri. La durata dell'esperimento è limitata per photobleaching di colorante fluorescente e, così, per l'intensità della luce. Precedentemente abbiamo trovato tasso di protone medio traslocazione del citocromo bo3 a 73 ± 2.2 protoni/s utilizzando questa tecnica, anche se sono state rilevate attività fino a 20 protoni/s. Per utilizzare queste tecniche per enzimi con entrambi più o meno attività, è necessario adattare i parametri di acquisizione immagine (i. e., luce, intensità, tempo di esposizione e la durata dell'esperimento). In futuro, questo metodo può essere esteso verso altri mezzi di trasporto dell'elettrone protone enzimi, un esempio può essere complesso mitocondriale di pompaggio di guida mi. Altri enzimi potrebbero richiedono ricostituzione diversi protocolli, e questo avrebbe bisogno di essere ottimizzato per ogni trasportatore diverso. Pompe del protone che non sono chinone-convertendo gli enzimi possono anche essere studiato, per esempio, ATP-driven29, anche se in questo caso la traslocazione di protoni non può essere attivato elettrochimicamente, ma aggiunta di un iniziatore (ad es., ATP) è richiesto. In quest'ultimo caso, non c'è nessuna necessità di usare un vetrino coprioggetto oro-modificato. Inoltre, purché sia utilizzato un colorante fluorescente con membrana impermeabile e ioni sensibili adatto, questo metodo può essere esteso ad altre pompe ioniche, ad es., sodio e potassio.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Acknowledgments
Gli autori riconoscono la BBSRC (BB/P005454/1) per il sostegno finanziario. NH è stato finanziato dal programma VILLUM Foundation Young Investigator.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6-Mercapto-1-hexanol (6MH) | Sigma | 451088 | 97% |
| 8-hydroxypyrene-1,3,6-trisulphonic acid (HPTS) | BioChemika | 56360 | |
| Aluminium holder (Electrochemical cell) | Custom-made | 30x30x7 mm; inner diameter: 26 mm; hole diameter: 15 mm | |
| Auxiliary electrode | platinum wire | ||
| Chloroform | VWR Chemicals | 83627 | |
| E.coli polar lipids | Avanti | 100600C | 25 mg/mL in chloroform |
| Epoxy | EPO-TEK | 301-2FL | low fluorescence epoxy |
| Fiji (ImageJ 1.52d) | Required plugins: StackReg and TurboReg (http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg/) | ||
| Filter cube ("ATTO633") | Chroma Technology Corporation | Ex: 620/60 nm; DM: 660 nm; Em: 700/75 nm | |
| Filter cube ("HPTS1") | Chroma Technology Corporation | Ex: 470/20 nm; DM: 500 nm; Em: 535/48 nm | |
| Filter cube ("HPTS2") | Chroma Technology Corporation | Ex: 410/300 nm; DM: 500 nm; Em: 535/48 nm | |
| Filter cube ("Texas Red") | Chroma Technology Corporation | Ex: 560/55 nm; DM: 595 nm; Em: 645/75 nm | |
| Fluorescent dye-labelled lipids (FDLL) | ThermoFisher Scientific | T1395MP | TexasRed-DHPC was used in this work (λexc 595 nm; λem 615 nm) |
| Fluorescent dye-labelled lipids (FDLL) (alternative) | ATTO-TEC | AD 633-161 | ATTO633-DOPE can be used as alternative (λexc 630 nm; λem 651 nm) |
| Gel filtration column | GE Healthcare | 28-9893-33 | HiLoad 16/600 Superdex 75 pg, for additional protein purification |
| Glass coverslips | VWR International | 631-0172 | No 1.5 |
| Glass syringe | Hamilton | 1725 RNR | 250 µL |
| Glass vials | Scientific Glass Laboratories Ltd | T101/V1 | 1.75 mL capacity |
| Gold | GoodFellow | 99.99% | |
| Gramacidin | Sigma | G5002 | |
| Mercury sulfate reference electrode | Radiometer (Hash) | E21M012 | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | Minispin NL040 | |
| Microscope | Nikon | Eclipse Ti | |
| Microscope Camera | Andor | Zyla 5.5 sCMOS | |
| Microscope Lamp | Nikon | Intensilight C-HGFI | |
| NIS-Elements AR 5.0.2 | Nikon | Microscope acquisition software | |
| n-Octyl β-D-glucopyranoside | Melford Laboratories | B2007 | |
| Nova 1.10 | Metrohm | Potentiostat control software | |
| Objective | Nikon | Plan Apo λ 60x/1.4 oil | |
| OriginPro 2017 | OriginLab | Plotting software | |
| O-ring (Electrochemical cell) | Orinoko | Inner diameter: 16 mm; cross section: 1.5 mm | |
| Plastic tubes | Eppendorf | 3810X | 1.5 mL |
| Polystyrene microbeads | Bio-RAD | 152-3920 | Biobeads, 20-50 mesh |
| Potentiostat | Metrohm Autolab | PGSTAT 128N | |
| Potentiostat | CH Instruments | CHI604C | |
| Scripting software | Matlab | R2017a | Required toolboxes: 'Image Processing Toolbox', 'Parallel Computing Toolbox', 'Curve Fitting Toolbox', 'System Identification Toolbox', 'Optimization Toolbox' |
| Silicon wafers | IDB Technologies LTD | Si-C2 (N<100>P) | Ø 25 mm, 525 um thick |
| Teflon cell (Electrochemical cell) | Custom-made | Outer diameter: 26 mm; inner diameter: 13.5 mm | |
| Temple-Stripped Ultra-Flat Gold Surfaces | Platypus Technologies | AU.1000.SWTSG | Alternative ready-to-use ultra-flat gold surfaces (Thickness below 100 nm on demand) |
| Thin micropipette tips | Sarstedt | 70.1190.100 | or similar gelloader tips 200 µL |
| Ubiquinone-10 | Sigma | C-9538 | |
| Ultracentrifuge | Beckman-Coulter | L-80XP | with Ti 45 rotor |
| Ultrasonic bath | Fisher Scientific | FB15063 |
References
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