Summary
Aquí, presentamos un protocolo para estudiar el mecanismo molecular de la translocación de protones a través de membranas lipídica de liposomas sola, usando citocromo bo3 como ejemplo. Combinación electroquímica y microscopia de fluorescencia, cambios en el pH en el lumen de las vesículas individuales, contienen solo o múltiples enzimas, puede ser detectado y analizado individualmente.
Abstract
Enzimas bombas de protones, de electrones de transferencia cadenas par redox las reacciones de translocación de protón a través de la membrana, creando una fuerza protón-motriz utilizada para la producción de ATP. La naturaleza anfifílicas de proteínas de membrana requiere especial atención para su manejo y reconstitución en el medio lipídico natural es indispensable en el estudio de procesos de transporte de membrana como la translocación de protones. Aquí detallamos un método que se ha utilizado para la investigación del mecanismo de bombeo de protones de las enzimas redox de membrana, teniendo citocromo bo3 de Escherichia coli como ejemplo. Una combinación de microscopía electroquímica y de fluorescencia se utiliza para controlar el estado redox de las quinona piscina y monitorear cambios en el pH en el lumen. Debido a la resolución espacial de la microscopia fluorescente, cientos de liposomas se pueden medir simultáneamente mientras que el contenido de la enzima puede ser reducido a una sola enzima o transportador por liposomas. El análisis de la respectiva enzima solo puede revelar patrones en la dinámica funcional de enzimas que puede estar ocultos si no por el comportamiento de toda la población. Incluimos una descripción de una secuencia de comandos para el análisis de imagen automatizado.
Introduction
Información sobre mecanismos de enzimas y cinética se obtiene generalmente en el nivel de conjunto o de macroescala con población de enzima en los miles de millones de moléculas, donde las mediciones representan un promedio estadístico. Se sabe, sin embargo, que macromoléculas complejas como las enzimas pueden demostrar heterogeneidad en su comportamiento y mecanismos moleculares observados a nivel de conjunto no son necesariamente válidos para cada molécula. Tales desviaciones en la escala de la molécula individual han sido ampliamente confirmados por estudios de enzimas individuales con una variedad de métodos emergentes durante el último dos décadas1. En particular, detección de la fluorescencia de la actividad enzimática individuales se ha utilizado para investigar la heterogeneidad de la actividad de enzimas2,3 o descubrir el efecto de memoria supuesto (períodos de actividad de las enzimas altas por periodos de baja actividad y viceversa)4,5.
Muchos estudios de la enzima solo requieren que las enzimas son inmovilizadas sobre la superficie o espacial fija de otra manera permanecer suficientemente largo en el campo de visión para la observación continua. Encapsulación de enzima en liposomas se ha demostrado para permitir la inmovilización de la enzima al tiempo que evita cualquier impacto negativo por la superficie enzimas o proteínas interacciones6,7. Además, liposomas ofrecen una posibilidad única para el estudio de proteínas de la membrana solo en sus lípidos naturales bicapa entorno8,9,10.
Una clase de proteínas de membrana, transportadores, ejerce un desplazamiento direccional de sustancias a través de la membrana celular, un comportamiento que sólo puede ser estudiada cuando las proteínas se reconstituyen en el lípido bicapas (por ejemplo, liposomas)11, 12,13. Por ejemplo, translocación de protones, expuesto por varias enzimas de cadenas de transporte del electrón de prokaryotic y eukaryotic, desempeña un papel importante en la respiración celular, mediante la creación de una fuerza protón-motriz utilizada para la síntesis de ATP. En este caso, la actividad de bombeo de protones está acoplado a la transferencia de electrones, aunque el mecanismo detallado de este proceso a menudo sigue siendo elusivo.
Recientemente, hemos demostrado la posibilidad de detección fluorescente par con electroquímica para el estudio de actividad de las enzimas individuales de la oxidasa terminal ubiquinol de Escherichia coli (citocromo bo3) de bombeo de protones reconstituida en liposomas14. Esto se logró mediante la encapsulación de un colorante fluorescente impermeable membrana sensible al pH en el lumen de liposomas preparados a partir de E. coli lípidos polares (figura 1A). La cantidad de proteína fue optimizada para que liposomas mayoría tampoco contienen ninguna o solamente una molécula de enzima reconstituido (según la distribución de Poisson). Los dos sustratos de citocromo bo3 fueron proporcionados mediante la adición de ubiquinona a la mezcla de lípidos que forman los liposomas y el oxígeno (ambiente) en solución. Los liposomas son entonces escasamente fijado por adsorción en un electrodo de oro ultra suave semitransparente, cubierto con una monocapa uno mismo-montado de 6-mercaptohexanol. Finalmente, el electrodo se monta en la parte inferior de una celda electroquímicas simple (figura 1B). Control electroquímico del estado redox quinona piscina permite una flexible activar o detener la reacción enzimática en cualquier momento, mientras que el tinte pH-sensible se utiliza para monitorear cambios en el pH dentro del lumen de los liposomas como resultado de la translocación de protones por el enzimas. Por utilizar que se puede determinar la intensidad de fluorescencia de un colorante fluorescente en segundo lugar, enlazados a lípidos, el tamaño y el volumen de los liposomas y la cuantificación de protones enzima actividad de bombeo. Usando esta técnica, en particular encontramos que citocromo bo3 moléculas son capaces de entrar en un estado de escape espontáneo que rápidamente se disipa la fuerza motriz protónica. El objetivo de este artículo es presentar la técnica de mediciones solo liposomas en detalle.
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Protocol
1. preparación de una mezcla de lípidos/UQ-10/FDLL
Nota: E. coli lípidos utilizados para la preparación de los liposomas deben ser alícuotas y muy bien mezclada con la ubiquinona-10 (sustrato de la enzima) y onda larga fluorescentes tinte etiquetado lípidos (para determinación del tamaño de liposomas) antes del reconstitución.
- Utilizando una jeringuilla de cristal, extracto de transferencia 200 μL del stock de cloroformo de lípidos polares de Escherichia coli (25 mg/mL) en viales de vidrio para hacer alícuotas de 5 mg.
- Añadir 50 μl de 1 mg/mL ubiquinona-10 (UQ-10; en cloroformo) a los lípidos para hacer la relación final de UQ 10: lípidos 1: 100 (1% w/w).
- Añadir 20 μl de 1 mg/mL (0,4% w/w) de una longitud de onda larga teñir-etiquetados lípidos fluorescentes (FDLL) a la mezcla de lípidos/UQ-10.
- Homogeneizar la solución de cloroformo con un vórtex corto y se evaporan más de cloroformo en un flujo suave de nitrógeno o argón. Eliminar los rastros de cloroformo por más evaporación bajo vacío durante al menos 1 h.
Nota: Alícuotas de lípidos pueden almacenarse bajo una atmósfera inerte a-20 ° C durante varios meses.
2. reconstitución de citocromo bo3
Nota: Para la purificación de citocromo bo3 de e. coli, seguir el protocolo de Rumbley et al. 15 para asegurar la alta pureza de las muestras de la enzima nativa plegada, añadir cromatografía por exclusión de tamaño después del paso de purificación de la afinidad descrito por Rumbley et al. 15
- Añadir 312.5 μl de 40 mM MOPS-KOH/60 mM K24, pH 7,4, a una alícuota de lípidos/UQ-10/FDLL seca (5 mg, paso 1.4) de la mezcla y mezclar con vortex hasta la película lipídica es totalmente suspendida, seguido de 2 minutos de tratamiento en un baño ultrasónico.
- Añadir 125 μl de ácido 8-hidroxipireno-1,3,6-trisulphonic de 25 mM (HPTS), un colorante fluorescente sensible al pH que debe ser encapsulado dentro de los liposomas.
- Añadir 137.5 μl de surfactante de 250 mM n-octilo β-D-glucopyranoside (OGP), mezclar con vortex y someter a ultrasonidos en un baño ultrasónico durante 10 min garantizar que todos los lípidos son solubilizados en micelas de surfactante. Transferencia de la dispersión en un tubo de plástico de 1,5 mL.
Nota: Suspensión turbia de lípidos debería ser transparente después de la solubilización con surfactante. - Añada la cantidad necesaria de citocromo bo3 (véase la nota de abajo) y añadir agua ultrapura para un volumen total de 50 μl (citocromo bo3 solución con agua). Incubar a 4 ° C durante 10 minutos en un mezclador de rodillos.
Nota: Una cantidad típica para las condiciones de la enzima solo es 0.1 – 0.2% (w/w proteína de lípidos, es decir. 5-10 μg de proteína), aunque puede aumentarse hasta 1 – 2% (50 – 100 μg de proteína), si el objetivo es observar sólo la actividad electroquímica (véase abajo). Como control negativo, se pueden preparar liposomas sin citocromo bo3 . - Pesan 2 x 50 y 2 x 100 mg de microesferas de poliestireno en casquillos de cuatro 1.5 mL-tubo y cerrar con la película de parafina para prevenir la resequedad.
Nota: Antes de usar, microbeads del poliestireno debe ser lavado con metanol, agua y almacenados en agua según el manual del fabricante.
Nota: Si se utiliza una mezcla de agua/del microbead, microbeads del poliestireno puede convenientemente ser transferida a la tapa con una micropipeta con punta ancha. Agua puede quitarse de los microbeads utilizando una micropipeta con punta fina. - Añadir la 1st50 mg de microbeads del poliestireno en la mezcla de reconstitución (paso 2.4) colocando la tapa con microbeads del poliestireno en tubo 1,5 mL-plástico con dispersión y realizar un exprimido de corta duración para un par de segundos. Incubar a 4 ° C en un mezclador de rodillos para microbeads del poliestireno para el tensioactivo durante 30 minutos.
- Repetir las adiciones de microbeads del poliestireno e incubaciones como sigue: agregar 50 mg de microesferas por 60 min de incubación; Añadir 100 mg de microesferas por 60 min de incubación; y añadir 100 mg de microesferas por 120 min de incubación.
Nota: La solución por encima de los microbeads colocado volverá translúcida en el paso 2.6 como se forman proteoliposomes.
- Repetir las adiciones de microbeads del poliestireno e incubaciones como sigue: agregar 50 mg de microesferas por 60 min de incubación; Añadir 100 mg de microesferas por 60 min de incubación; y añadir 100 mg de microesferas por 120 min de incubación.
- Separar la solución de proteoliposome de los microbeads del poliestireno utilizando una micropipeta con punta fina. Diluir por lo tanto la dispersión en 90 mL de 20 mM MOPS-KOH/30 mM K24, pH 7,4 (tampón MOPS) y la transferencia en un tubo de ultracentrífuga Ti45.
- Ultracentrífuga la dispersión usando tipo 45 Ti rotor a 125.000 x g (en el rmáximo) durante 1 h a la proteoliposomes de la pelotilla.
Nota: Pequeños tubos de centrífuga pueden utilizarse aunque la dilución en volumen de almacenador intermediario grande ayuda a reducir la concentración de los HPTS no encapsulado en la suspensión definitiva. - Eliminar el sobrenadante, enjuague las pelotillas con MOPS-KOH/30 mM K2de 20 mM para4, pH 7,4 buffer (sin resuspender el pellet). Después de desechar el tampón de lavado, vuelva a suspender el proteoliposomes en 500 μl de tampón MOPS transfiriendo hacia adelante y hacia atrás con una micropipeta de punta fina. A continuación, transfiéralo a un tubo de plástico de 1,5 mL.
- Centrifugue la suspensión durante 5 minutos a 12.000 x g para eliminar los desechos. Transferir el sobrenadante (reconstituido proteoliposomes) en un frasco nuevo.
- Almacenar la dispersión proteoliposomes reconstituido durante la noche a 4 ° C y usar dentro de 2 días.
3. fabricación de electrodos de oro semi transparentes
Nota: La superficie lisa de oro se obtiene por un método de desmontaje de plantilla de una capa de nm de espesor 30 de 99.99% oro de una oblea de silicio atómico liso. El pequeño espesor de la capa de oro es importante ya que debe ser semi transparente para permitir la observación de la fluorescencia. Detalles de oro evaporación (deposición física de vapor, PVD) se puede encontrar en otros lugares16 y extracción de plantilla sólo se cubre aquí. Alternativamente, ultra suaves oro chips se pueden comprar en otros lugares (véase Tabla de materiales).
- Hasta 9 vidrio cubreobjetos (0,17 mm de espesor) sobre la superficie de oro evaporada con resina de baja fluorescencia bi-componente del pegamento. Curar el pegamento a 80 ° C durante 4 horas.
- Justo antes de la modificación con una monocapa auto ensamblada (paso 4), quitar el cubreobjetos de vidrio de las obleas de silicio con una cuchilla. Debido a la delgadez de los cubreobjetos, tenga cuidado al desmontar el cubreobjetos para no agrieten o se rompan los portaobjetos de vidrio.
4. modificación de la superficie de oro con uno mismo-montado monocapa (SAM)
- Preparar 5 mL de solución de agua de 1 mM 6-mercaptohexanol (6MH).
- Sumerja la recién independiente revestido de oro cubreobjetos (paso 3.1) en solución 6MH y deja a 20 – 25 ° C durante la noche (> 16 h) para formar el SAM.
Nota: Las soluciones tiol tienen un olor desagradable, por lo que debe utilizarse un recipiente de tapa cerrada cuando incuba el cubreobjetos recubierto de oro. - Al día siguiente, quitar el cubreobjetos recubierto de oro de la solución de 6MH, lavar brevemente con agua o metanol y luego con isopropanol. Seca bajo una corriente suave de gas.
5. prueba electroquímica de Proteoliposomes actividad
Nota: La actividad electroquímica de enzima se verifica primero en una capa de liposomas de cerca embalado (paso 5) y baja cobertura de vesícula se utilizan en vesículas solo experimento para medir los cambios de pH en el lumen de los liposomas (paso 6).
- Montar el cubreobjetos recubierto de oro en una celda electroquímica de spectro (ver figura 1). Hacer contacto con el oro con un alambre plano fuera de un área definida por un anillo o de goma.
- Añadir 2 mL de la solución tampón de electrolito y la referencia y electrodos auxiliares en la célula.
Nota: Como se discutió en la sección discusión, electrodos de referencias sin cloruro se prefieren para evitar la formación de Au (I) Cl en electroquímica. Aquí, una Hg/Hg2SO4 (sáb. K2SO4) se utiliza el electrodo de referencia y potenciales reciben versus el electrodo estándar de hidrógeno (SHE) usando 0,658 V vs para el Hg/Hg2SO4 (sat. K2por4). - Ejecute espectroscopia de impedancia electroquímica (0,1 Hz-100 kHz) en la celda abierta potenciales (OCP) potencial para evaluar la calidad de SAM. Convertir valores de impedancia admitancia y dividir por 2πω para trazar un diagrama de Cole Cole, donde ω es la frecuencia (véase las siguientes referencias16,17,18 para obtener más información acerca de conversión e interpretación de la impedancia espectros).
Nota: Sam compacto y denso de 6MH debe dar un cierre a semicírculo diagrama de Cole Cole y dar valores de capacitancia en la gama de 2.5-3.0 μF/cm2 (figura 2A). Si se obtiene significativa desviación de forma de semicírculo o valores fuera de rango de capacitancia, cambiar el electrodo. - Ejecutar en blanco voltagramas cíclicos (CVs) con exploración tasas de 100 y 10 mV/s en la región de potencial -0,3 – 0,8 V. Un curriculum típico se muestra en la (figura 2B, línea discontinua).
Nota: Esto debe demostrar casi puro comportamiento capacitivo y una ausencia de la importante corriente faradaic, incluso bajo condiciones de oxígeno ambiente según lo utilizado aquí. - Añadir proteoliposomes (concentración de lípidos final de 0,5 mg/mL, 1-2% (w/w) relación de citocromo bo3 lípidos) a la celda electroquímica y mezclar ligeramente con una pipeta. Espere a que la adsorción de proteoliposomes en la superficie del electrodo está terminado (30-60 min a temperatura ambiente).
Nota: Los voltamperogramas cíclicos (CVs) a 10 mV/s se pueden ejecutar durante la adsorción de proteoliposomes seguir el proceso. La adsorción se acaba cuando CVs consecutivos deja de cambiar. Puede encontrar información sobre técnicas de CV en los siguientes libros de texto. 19 , 20 - Lave la celda cambiando el tampón por lo menos 10 veces pero no dejar totalmente seca la superficie del electrodo.
- La espectroscopia de impedancia electroquímica a OCP (figura 2A, línea azul) para confirmar que el SAM en el electrodo de oro permanece inalterado y CVs con analizar las tasas de 10 y 100 mV/s observar oxidación catalítica ubiquinol (y la reducción de oxígeno) por el citocromo Bo 3 potenciales de inicio de la reducción de quinona electroquímico sobre 0 vs V) (figura 2B).
6. detección enzimática protón bombeo por microscopía de fluorescencia
- Modificar el electrodo de oro como en el paso 5 pero utilizando 100 x menos proteoliposomes en comparación con paso 5.5 (es decir, 5 μg/mL). Para estudios de la enzima solo, reducir el citocromo bo3 proporción de lípidos a 0.1-0.2% (w/w).
Nota: Liposomas escasamente se adsorben en la superficie de electrodo permitiendo vesícula solo monitoreo por microscopía de fluorescencia. En estas condiciones solo enzima, la cantidad de enzima inmovilizada en la superficie del electrodo es insuficiente para la observación de una catalizador corriente. - Coloque la celda electroquímica en el objetivo de aceite (60 X) de un microscopio de fluorescencia invertido con una gota de aceite de inmersión. Usar filtros adecuados para fluorescencia FDLL, centrarse en la superficie del electrodo. Liposomas solo deben aparecer como puntos luminosos en el límite de difracción del microscopio/objetivo. Tomar una imagen de fluorescencia FDLL.
- Cambiar a uno de HPTS conjuntos de filtro de la fluorescencia en el microscopio para comprobar que la fluorescencia HPTS es claramente visible y distinguible del fondo (en el tiempo de exposición elegido, vea paso 6.4). Aumentar la intensidad de la luz si no es el caso.
- El software del microscopio para realizar una adquisición de imágenes programada por la alternancia de dos conjuntos de filtro HPTS del programa (menú aplicaciones | Define/Run ND adquisición). Establecer el retardo entre adquisiciones de imagen mínimo. En este experimento, use una 1 exposición y 0,3 de s de retardo (debido al movimiento de la torreta).
Nota: La relación entre intensidad de fluorescencia en estos dos canales se más tarde convertirá a pH dentro de los liposomas en cada momento. La duración de la adquisición puede variar según el tipo de cambio de pH esperado; 5 min se utiliza en este artículo. - Ajuste el potenciostato para cambiar el potencial en la adquisición de la imagen. Por ejemplo, en este experimento, utilice la siguiente secuencia: 0 – 60 s: ningún potencial aplicado (es decir, OPC); 60 – s: 180 -0.2 V (vs); 180 – s: 300 0.4 V (vs). En este caso, sólo el potencial aplicado en la segunda fase (-0.2 V vs) es suficiente para reducir eficientemente la piscina de la quinona.
- Simultáneamente por manualmente a partir de ambas mediciones al mismo tiempo la adquisición de imágenes programada (microscopio) y de la potencial secuencia (potenciostato).
Nota: El experimento se puede repetir en el mismo electrodo vario tiempo al mover la platina del microscopio a un área diferente en la superficie. El retraso entre las adquisiciones debe ser al menos 5-10 minutos para asegurar la completa pH equilibrado de liposomas en la superficie. Diferentes duraciones y patrones potenciales pueden aplicarse dependiendo de la necesidad, aunque tiempo de imagen es limitada debido a fotoblanqueo de HPTS durante la adquisición.
7. Análisis de imágenes de fluorescencia
Nota: Un experimento típico produce un conjunto de imágenes con un paso de tiempo (p. ej., 2.6 s) para cada uno de los dos canales, es decir, (duración * 2 / 2,6) imágenes. Un ejemplo de tal imagen set grabado durante un experimento de enzima solo puede acceder mediante el repositorio de investigación datos Leeds21. Un tratamiento de imagen consiste en varios pasos mediante el uso de Fiji (ImageJ) y alto nivel análisis matemático, programación de software de la lengua (en adelante referido como scripting software, ver la Tabla de materiales para más detalles).
- Uso de Fiji para separar archivo de lapso de tiempo, alinear imágenes y guardar como canales separados y plazos.
- Archivo de lapso de tiempo utilizando el importador de Bioformats en Fiji (comando de macro: ejecutar ("Bio-formatos importador")).
- Utilizar el plugin StackReg para alinear cada fotograma al primero para tener en cuenta los movimientos posibles de la etapa, o deriva termal se produjo durante la adquisición (comando de macro: ejecutar ("StackReg", "transformación = traducción")).
- Guardar archivos de imagen sin comprimir independientes para cada canal y cada paso de tiempo en formato TIFF en una sola carpeta.
- Extraer la fecha y hora exacta para cada fotograma de los metadatos de archivo de lapso de tiempo y guardarlos como un archivo CSV en la misma carpeta que las imágenes. También puede extraer fecha y hora mediante el software de adquisición y guardar manualmente en un archivo CSV mediante un software de hoja de cálculo.
Nota: La carpeta con imágenes y sellos de tiempo está ahora lista para ser analizado por el software de scripting. 7.1.1 los pasos. – 7.1.4. puede automatizarse utilizando un script de Fiji (un script escrito en Python para procesamiento por lotes de archivos de lapso de tiempo, es usar "Ctrl-Mayús-N" (en Windows), luego archivo | Abierto para cargar el script).
- Utilizar secuencias de comandos de software para el procesamiento automatizado de las imágenes. Carga el código proporcionado para el software y haga clic en ejecutar al final. Cuando se le pida, seleccione la carpeta que contiene las imágenes del paso 7.1.
Nota: Un guión para el análisis se ofrece como script en mlx-formato, con comentarios, identificar solo liposomas, ajuste a función Gaussian 2D, filtrarlos y cuantificar los valores de pH en cada punto de tiempo. Los subpasos siguientes son ejecutados automáticamente por el script.- Cargar todas las imágenes de marcos de tiempo para un experimento único en la memoria.
- Promedio de todas las imágenes para un solo canal (seleccionar el canal con la mayor intensidad de fluorescencia) y utilizar la imagen promedio para identificar todos los máximos que podrían corresponder a los liposomas solo.
- Ajuste los máximos identificados en la imagen promedio para el 2D-Gaussian función y guardar el resultado ajustar parámetros para cada liposoma (ver Figura 4A por ejemplo liposomas equipada).
- Los máximos criterios de liposomas único esperado, como el tamaño, la circularidad y la intensidad del filtro. Rechazar liposomas que mal equipadas debido a la baja de la señal a ruido, estrechamente conexos liposomas o ser demasiado cerca del borde de la imagen.
- Fecha y hora de la carga del archivo externo y ajuste cada liposoma filtrada a la función de 2D-gauss en cada imagen de marco de tiempo por separado.
Nota: El uso de la programación paralela y CPU multicore puede mejorar considerablemente la velocidad de cálculo en esta etapa. - Filtro de los liposomas otra vez según los criterios similares como en el paso 7.2.4 pero aplicada a cada plazo.
- En cada paso de tiempo, defina la relación de intensidad de fluorescencia de un liposoma como el cociente de volúmenes rodeada de armarios 2D-Gaussian función en dos canales. Calcular los valores de pH la relación de intensidades determinado a partir de los dos canales HPTS y utilizando una curva de calibración (paso 8). Trazar curvas de tiempo de pH resultantes de los liposomas y observar el cambio cuando se aplica el potencial de su pH.
8. realizar una curva de calibración de fluorescencia HPTS
Nota: Para convertir la relación de fluorescencia HPTS a un pH intravesicular, una curva de calibración debe primero establecerse que tengan en cuenta las condiciones particulares de experimentos tales como transmitancia de oro, calidad de filtros, etcetera. Este paso debe realizarse sólo una vez o dos veces y los datos de calibración se pueden utilizar como los parámetros de configuración y medición se mantienen en el paso 6.
- Preparar un electrodo con liposomas escasamente adsorbidas (sin citocromo bo3 como se describe en los pasos 5 y 6.1).
- Añadir 2 μl de solución de 0,1 mg/mL gramicidina en etanol, 2 ml de buffer para crear los 100 ng/mL de concentración.
- Captura de dos imágenes de fluorescencia para los dos canales HPTS.
- Cambiar el pH de la célula por la adición de pequeñas alícuotas de 1 M HCl 1 M H2hasta4. Medir el pH del buffer con un medidor de pH estándar y captura dos imágenes de fluorescencia para los dos canales HPTS.
- Repita los pasos 8.4 para el rango de pH 6 a 9.
- Utilizando el algoritmo de 7.2, ajuste, filtro y calcular la razón promedio de fluorescencia HPTS de liposomas individuales a cada pH. Asumir la relación HPTS promedio los liposomas.
- Forma la dependencia de pH-cociente resultante a la siguiente ecuación:
, donde pKa, Ra y Rbson montaje de parámetros. - Uso de pKa, Ra y Rbpara convertir la relación HPTS de liposomas individuales en el paso 7.2.7. a valores de pH.
, donde pKa, Ra y Rbson montaje de parámetros.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
La calidad de la hoja cubierta oro modificado (el electrodo) con un SAM de 6MH se comprueba antes de cada experimento con espectroscopía de impedancia electroquímica. Figura 2A muestra representativas parcelas de Cole-Cole medidas usando la espectroscopia de impedancia electroquímica antes y después de liposomas son adsorbidos. Si la calidad de SAM es suficiente, espectroscopía de impedancia debe demostrar un comportamiento capacitivo casi puro dando por resultado un diagrama de Cole Cole del semicírculo. El diámetro del semicírculo en un diagrama de Cole Cole es igual a la capacitancia de doble capa de la superficie del electrodo, que debe estar en el rango de 2.5-3.0 μF/cm2 . Tenga en cuenta que la capacitancia no debería cambiar significativamente sobre adsorción de liposomas, aunque un ligero aumento en la capacitancia puede observarse (fondo de cobertura, figura 2A, liposomas alta) o se observa un leve cambio en la impedancia en baja frecuencias (arriba de coberturas, figura 2A, liposomas baja).
Electroquímica puede utilizarse para probar la actividad catalítica del citocromo bo3 en proteoliposomes, donde corrientes catalíticas con voltametría cíclica reflejan la actividad de oxidoreductasa de ubiquinol-oxígeno. Sin embargo, importantes corrientes catalíticas pueden detectarse sólo en altas cantidades de proteoliposomes fijado por adsorción y se necesita una capa de cerca embalada de proteoliposomes en la hoja de cubierta de oro modificado. Figura 2B muestra representativa voltagramas cíclicos (CVs) del electrodo antes y después de adsorción de liposomas con cualquier cobertura de liposomas baja o alta. Ninguna corriente faradaic se observa en el CV en blanco debido a la reducción de oxígeno por el electrodo de oro desnudo es bloqueada por el SAM. Cuando la superficie está saturada con liposomas con alta citocromo bo3 contenido (1.3% (w/w) en este caso), una onda clara catalítica debido a la reducción de oxígeno se observa con un potencial de aparición de 0 V, es decir, el potencial de la ubiquinona reducción (figura 2B, línea azul). La piscina del ubiquinone actúa como sustrato para la enzima natural y como un mediador de la electrónica, transferencia de electrones de la enzima a la superficie del electrodo. Observamos que bajo la cobertura de la liposoma alta, distinción de vesículas individuales no es posible por microscopia y baja cobertura es necesario estudios de liposomas solo. En liposomas baja cobertura (sino proteína alta proporción de lípidos), la corriente catalizadora se reduce significativamente, apenas distinguible del fondo (figura 2B, línea roja). Tenga en cuenta que bajo condiciones de una enzima (proteína baja proporción de lípidos), la corriente catalizadora es aún menor y no puede ser medida con fiabilidad.
La figura 3 muestra imágenes de fluorescencia de liposomas adsorbidos en los electrodos en tres coberturas diferentes. Todas las imágenes fueron tomadas en idénticas condiciones de luz y la exposición y su brillo se ajustó igualmente para permitir la comparación directa. Liposomas que contienen colorante son visibles en las imágenes como puntos brillantes. La parte central de la imagen fue photobleached por un par de minutos para revelar el nivel de fluorescencia de fondo (nota que FDLL es relativamente Fotoestables y no se photobleached completamente en la figura 3). Las imágenes en dos canales HPTS son superponibles, donde la relación entre los dos canales (410/535 y 470/535) corresponde a pH 7.4 utilizado en este experimento. Un mayor número de liposomas es visible con el canal FDLL, que indica la presencia de liposomas que no tienen HPTS encapsulado. La diferencia entre los canales HPTS y FDLL es más pronunciada en las coberturas más altas, posiblemente porque en la cobertura del liposoma alta, son más propensos a reventar o fusible en la superficie de liposomas.
El análisis de imagen requiere el alineamiento de marcos (contra el marco de la primera) con el ImageJ, plugin StackReg. La alineación es indispensable en la mayoría de las situaciones desde una ligera deriva térmica de la muestra ocurre generalmente dentro de la escala de tiempo del experimento, cambia las coordenadas de la liposoma. Todo análisis se realizan utilizando un código de software de scripting. Este código realiza identificación automática del liposoma. Como el tamaño de los liposomas por debajo del límite de difracción de Abbe, su fluorescencia es visto como un punto de función mucho más grande que el diámetro real liposomas (Figura 4A). El código ajusta la intensidad de fluorescencia de cada vesícula en dos canales a una función de Gauss 2D (Figura 4A) y calcula su cociente del intensidad volumétrica que se puede convertir en pH utilizando una curva de calibración. Al realizar estas acciones en todos los marcos de tiempo, se obtiene el pH dentro de cada vesícula en plazo del experimento (película 1). Figura 4B muestra las medianas de todos los cambios de pH vesícula dentro de una imagen cuando el contenido de citocromo bo3 1,3%. Un aumento en el pH (bombeo de protones) es claramente visible cuando un potencial de entre -0,1 y -0,3 V se aplica, pero no para 0 V desde este último no es suficiente para reducir la piscina de la quinona. Cuando el contenido de citocromo bo3 es mucho más bajo (cociente proteína-lípido de 0.1%, figura 4), las curvas de la mediana se convierten casi indistinguibles de las de liposomas vacíos (figura 4). La diferencia se hace evidente cuando se consideran trazas pH individual de liposomas al azar (figura 5, 6 y 7). Mientras que los liposomas sin citocromo bo3 no mostrar ningún cambio significativo del pH con respecto al ruido (figura 7), una selección de liposomas muestran un incremento (dominante) o una disminución del pH cuando es un potencial aplicado activos citocromo bo3 (figuras 6, zona gris). La obvia diferencia en pH-rastros entre liposomas es consistente con la baja proporción de proteína-lípido, donde sólo está presente en un pequeño subconjunto de la actividad de liposomas citocromo bo3 . La prevalencia de un aumento del pH sobre la disminución se explica por el método de reconstitución que favorece una orientación "hacia afuera" de moléculas de enzima (aprox. 75%). La fracción de liposomas que muestran un cambio de pH se incrementa cuando el citocromo bo3 proporción de lípidos es mayor (figura 5). Tenga en cuenta también que algunos liposomas parar de bombear protones y entrar en modo de disipación protón antes del final de la aplicación. Nos atribuyen este comportamiento a las moléculas de citocromo bo3 entrar en un "estado de fuga", que permite protones al flujo hacia el lumen de liposomas14.
El análisis posterior de los rastros de pH incluyendo su montaje y determinación de protón bombeo/fugas las tasas se puede hacer mediante un script que han publicado anteriormente14,22 y puede obtenerse desde el repositorio de Leeds de datos de investigación 23 , 24.
Figura 1: principio del método. (A) principio de monitoreo de la actividad de una enzima y b el esquema de la instalación experimental utilizada en este trabajo con un cutaway para demostrar una parte interna de la célula. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: respuesta electroquímica de liposomas. (A) Cole Cole parcelas medición de OCP (0,22 V vs; línea cuadrada negra) antes y después de liposomas (citocromo de 1.3% w/w bo3) adsorción de soluciones a concentraciones de 5 μg/mL (línea del círculo rojo) y 500 μg/mL (línea del círculo azul). (B) cíclico voltamperogramas a 100 mV/s (panel izquierdo) y 10 mV/s (panel derecho) de Au-SAM (línea negra discontinua) antes y después de liposomas (citocromo de 1.3% w/w bo3) adsorción de soluciones a concentraciones de 5 μg/mL (línea roja) y 500 μg/mL (línea azul). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: microscopía de fluorescencia de liposomas. Imágenes de fluorescencia de liposomas en diferentes coberturas de superficie: las superficies se incubaron durante 30 min con una solución de liposomas de 5 μg/mL (fila superior), 20 μg/mL (fila media) y 500 μg/mL (fila inferior). Columna de la izquierda corresponde a la configuración de filtro de excitación/emisión 470/535 nm (1 canal HPTS dest ); columna media - 410/535 nm (canal HPTS de 2nd ); columna de la derecha - 560/645 nm (canal FDLL). Las imágenes fueron tomadas en ampliación 90 X (60 X objetivo y 1,5 aumentos por el microscopio antes de la cámara), 1 exposición y la intensidad de luz similar. Barras de escala corresponden a 50 μm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: identificación de liposomas y cambio de pH. (A) vista 3D de una parte de la imagen de fluorescencia que contiene un liposoma solo típico. Su intensidad de fluorescencia es visto como un punto de función (superficie del color) que se incorpora a una función 2D-Gaussian (malla negra). PH (B-D), muestran como la media de todas las vesículas dentro de área de imagen (por lo general varios cientos) a diferentes potenciales aplicados. De 0-60 s, no se aplica potencial (OCP). Entre 60 y 180 s (zona gris) se aplicaron diferentes potenciales: 0 V (negro), -0.1 V (rojo), -0.2 V (verde), -0,3 V (azul). Entre 180 y 300 s, 0,4 V vs. ELLA se aplicó. Los citocromo bo3 proporción de lípidos fueron (B) 1,3%, (C) 0.1%, (D) 0%. Los rastros se compensan para mayor claridad. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: trazas pH de liposomas que contienen 1,3% de la enzima. Rastros de pH cambian de liposomas solo 72, seleccionadas al azar, que contiene citocromo bo3 (1,3% w/w) medido y analizado durante un experimento. De 0-60 s, no potencial es aplicado (OCP); entre 60 y 180 s (zona gris) -0.2 V vs. ELLA; entre 180 y 300 s, 0,4 V vs. ELLA se aplicó. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6: trazas pH de liposomas que contienen 0.1% de la enzima. Rastros de pH cambian de liposomas solo 72, seleccionadas al azar, que contiene citocromo bo3 (0,1% w/w) medido y analizado durante un experimento. De 0-60 s, no potencial es aplicado (OCP); entre 60 y 180 s (zona gris) -0.2 V vs. ELLA; entre 180 y 300 s, 0,4 V vs. ELLA se aplicó. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 7: trazas pH de liposomas sin enzima. Rastros del cambio de pH de liposomas solo 72, seleccionadas al azar, sin citocromo bo3 medido y analizado durante un experimento. De 0-60 s: No potencial es aplicado (OCP); entre 60 y 180 s (zona gris) -0.2 V vs. ELLA; entre 180 y 300 s, 0,4 V vs. ELLA se aplicó. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
1 de la película: animación de cambio de pH de liposomas solo. (panel superior) Cambio de la fluorescencia de un liposoma en dos canales HPTS (mostrado como trama de superficie 3D de la zona correspondiente) durante 300 s del experimento. El potencial reductor se aplicó entre 60 s y 180 s. parcela correspondiente (panel inferior) cociente de intensidad volumétrica de dos canales HPTS versus tiempo. La zona de aplicación potencial reductivo es sombreada en gris. Por favor haga clic aquí para ver este video. (Clic derecho para descargar)
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Discussion
El método descrito es adecuado para el estudio de las proteínas de la membrana respiratoria que pueden ser reconstituidas en liposomas de bombeo de protones y son capaces de intercambiar electrones con la piscina de la quinona. Actividad de bombeo del protón puede controlarse a nivel individual-enzima con colorantes sensibles al pH (proporcionales) encapsulados en el lumen del liposoma (figura 1A).
El método se basa en la capacidad de ubiquinona (u otras quinonas), incorporado en la bicapa lipídica, de intercambiar electrones con electrodos modificados con un SAM18. Las propiedades del electrodo de oro modificado con un SAM, son muy específicas. Liposomas que deba absorber el SAM y el SAM debe ser lo suficientemente delgados como para permitir la oxidación electroquímica rápida y reducción de la piscina de la quinona en los liposomas. Lo importante, la interacción entre el electrodo y liposomas debe ser suficientemente débil no a afectar la integridad de la membrana lipídica. Además, dependiendo de los detalles del sistema experimental, es deseable si el SAM previene reacciones catalizadas por el oro lado, como la reducción del oxígeno. Por último, el SAM debe ser estable dentro de la ventana de potencial utilizada. El uso de electrodos de oro Ultra planos modificada con alta calidad SAM de 6MH cumple estos requisitos en el caso del citocromo bo3. Extracción de electrodos de oro de obleas de silicio atómicamente plana crea una superficie ultra lisa de oro con un cercano SAM ideal según lo indicado por los espectros de impedancia. Tenga en cuenta que formamos el SAM de 6MH en agua. Hemos divulgado previamente en SAMs con 6MH en isopropanol16, pero estos SAMs exhiben espectros de impedancia que indican una superficie más heterogénea y más altos valores de capacitancia de doble capa (es decir., defectos más) con una resistencia más baja. Además, cuando SAM de 6MH se prepara a partir de una solución de agua, menor reducción de oxígeno del fondo (debido a la reducción de oxígeno catalizado oro) se observa frente a SAMs formado a partir de una solución de etanol/isopropanol. Todas estas observaciones indican que SAMs de 6MH en soluciones de agua tienen una mayor calidad con menos defectos. SAMs de mayor calidad también pueden ser formadas de tiol-compuestos con cadenas de alcanos más largas (por ejemplo, 1-hidroxi-Decano-tiol), pero la cinética de transferencia de electrones se convierten en más lento a medida que aumenta el espesor de SAM.
Durante electroquímica (spectro), deben evitarse iones cloruro en la solución tampón ya que puede chemosorb en la superficie de oro en el alto potencial, posible deterioro de la calidad de SAM. Por la misma razón, se debe preferir un electrodo de referencia de cloruro-libre.
Otro punto importante es la permeabilidad del fondo de los liposomas a protones, que deben ser lo suficientemente bajos como para permitir la acumulación de protones como resultado de la translocación de protones enzimática en la escala de tiempo del experimento. Esta permeabilidad puede influir en la composición exacta del lípido. En nuestro trabajo, utilizamos polar e. coli extractos lípidos con ubiquinona-10. Permeabilidad de protones ha demostrado dependen fuertemente de la longitud de cadena de ácidos grasos25, aunque esto se contradiga en estudios con más complejos lípidos composiciones26. Curiosamente, ubiquinona se ha demostrado recientemente para mejorar la estabilidad de la membrana27. Por último, detergentes residual por el procedimiento de reconstitución de la proteína pueden influir en la salida de protones y por lo tanto es importante eliminar detergentes tan completamente como sea posible utilizando microesferas de poliestireno hidrofóbico, dilución seguido de centrifugación y un enjuague a fondo de la celda electroquímica después de que el proteoliposomes se fijan por adsorción en la superficie. Si dudoso, permeabilidad del liposoma puede verificarse siguiendo el cambio de pH de lumen (vía HPTS) en respuesta a un salto de pH externos28.
Medición de la enzima solo requieren unilamelar liposomas y pequeños liposomas se espera que muestren cambios en el pH más rápido o más como disminuciones de volumen de la luz. Para lograr esto, microbeads del poliestireno se agregan poco a poco en pequeñas cantidades a ritmo lento de la formación de liposomas. En esas condiciones, se forman pequeños liposomas de tamaño homogéneo con un diámetro promedio de 70 nm y un índice de polidispersidad de 0.24 en nuestro caso14. HPTS también adsorbe en los microbeads del poliestireno, reduciendo la capacidad de los microbeads del poliestireno para detergente. Por lo tanto, debería agregarse exceso microbeads del poliestireno para compensar su pérdida. Tratamiento con microesferas de poliestireno fue observado para disminuir la concentración de HPTS en la suspensión de lípidos y proteínas por alrededor de un cuarto (de 5 mM a 3-4 mM). Sin embargo, la concentración real de HPTS en lumen de liposomas podría ser mayor ya que los liposomas se forman temprano en el tratamiento con microesferas de poliestireno. En lugar de HPTS, pueden utilizarse otros colorantes sensibles al pH. Sin embargo, es importante que el tinte es la membrana impermeable y radiométrica. Este último evita errores experimentales debido al fotoblanqueo y cantidades variables de tinta encapsulada.
Cálculos simples es posible estimar si, estocástico, la mayoría de los liposomas vacíos no contienen sólo una molécula de enzima. Asumiendo un diámetro promedio de liposomas de 70 nm, un peso molecular de lípidos da 750 y un lípido de 0,65 nm2 nos dan una masa de liposomas de 5.2x10-17 g, es decir, 9.6x1013 liposomas por preparación (5 mg de lípidos). En el 0,1% del citocromo bo3 (MW = 144 kDa), 2 x 1013 moléculas de enzima están presentes, correspondientes a una proporción de 0.2 proteína: liposomas. Usando una distribución de Poisson, se puede además calcular que la probabilidad de encontrar una molécula de enzima (17%) por liposomas es diez veces mayor que la probabilidad de encontrar más de una molécula (1.7%). Cálculos más precisos se pueden hacer si las pérdidas de enzimas y lípidos durante la reconstitución se determina a partir de los análisis correspondientes se toman en cuenta. Este último puede estimarse de un análisis de proteína y midiendo la fluorescencia FDLL de liposomas preparados.
Una vez que se establece el protocolo y rastros de la enzima solo se registran, más modificaciones del método es factible según el objetivo. Uno podría pensar en una adición de inhibidor de la enzima o la introducción de un ionóforo en el sistema. Debe tener cuidado de verificar que la adición de solventes utilizados para preparar ionóforo o acción inhibidor no influyen en el estado de SAM o permeabilidad de los liposomas.
La técnica como se describe aquí se limita a un determinado grupo de enzimas que son transportadores de protones de la membrana y la conversión de quinona. El equipo y las condiciones experimentales como aquí fueron optimizadas para la actividad enzimática del citocromo bo3. Aquí, la resolución del tiempo es 2-3 segundos, determinados por el tiempo de exposición y el tiempo que tarda la torreta de cambio de filtros. La duración del experimento está limitada por photobleaching de colorante fluorescente y, así, por la intensidad de la luz. Previamente hemos encontrado tasa de translocación de protón promedio de citocromo bo3 a 73 ± 2.2 protones/s usando esta técnica, aunque se detectaron actividades hasta 20 protones/s. Para utilizar estas técnicas para enzimas con cualquier actividad más o menos, necesitan adaptar parámetros de adquisición de imagen (es decir., intensidad de luz, tiempo de exposición y duración del experimento). En el futuro, este método se puede extender hacia otros medios de transporte de electrones conducción protón bombeo enzimas, un ejemplo es el complejo mitocondrial I. Otras enzimas pueden requerir protocolos diferentes de reconstitución, y esto tendría que ser optimizado para cada transportador diferentes. Bombas de protones que no son conversión de quinona enzimas también pueden ser estudiado, por ejemplo, impulsado por ATP29, aunque en este caso no se activará electroquímicamente translocación de protones, pero se requiere adición del iniciador (e.g., ATP). En este último caso, no hay utilizar un cubreobjetos oro modificado. Por otra parte, siempre que se utiliza un colorante fluorescente membrana impermeable y sensible al ion adecuado, este método puede ampliarse a otras bombas iónicas, por ejemplo, sodio y potasio.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Los autores reconocen la BBSRC (BB/P005454/1) para apoyo financiero. NH fue financiado por el programa de VILLUM Fundación joven investigador.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6-Mercapto-1-hexanol (6MH) | Sigma | 451088 | 97% |
| 8-hydroxypyrene-1,3,6-trisulphonic acid (HPTS) | BioChemika | 56360 | |
| Aluminium holder (Electrochemical cell) | Custom-made | 30x30x7 mm; inner diameter: 26 mm; hole diameter: 15 mm | |
| Auxiliary electrode | platinum wire | ||
| Chloroform | VWR Chemicals | 83627 | |
| E.coli polar lipids | Avanti | 100600C | 25 mg/mL in chloroform |
| Epoxy | EPO-TEK | 301-2FL | low fluorescence epoxy |
| Fiji (ImageJ 1.52d) | Required plugins: StackReg and TurboReg (http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg/) | ||
| Filter cube ("ATTO633") | Chroma Technology Corporation | Ex: 620/60 nm; DM: 660 nm; Em: 700/75 nm | |
| Filter cube ("HPTS1") | Chroma Technology Corporation | Ex: 470/20 nm; DM: 500 nm; Em: 535/48 nm | |
| Filter cube ("HPTS2") | Chroma Technology Corporation | Ex: 410/300 nm; DM: 500 nm; Em: 535/48 nm | |
| Filter cube ("Texas Red") | Chroma Technology Corporation | Ex: 560/55 nm; DM: 595 nm; Em: 645/75 nm | |
| Fluorescent dye-labelled lipids (FDLL) | ThermoFisher Scientific | T1395MP | TexasRed-DHPC was used in this work (λexc 595 nm; λem 615 nm) |
| Fluorescent dye-labelled lipids (FDLL) (alternative) | ATTO-TEC | AD 633-161 | ATTO633-DOPE can be used as alternative (λexc 630 nm; λem 651 nm) |
| Gel filtration column | GE Healthcare | 28-9893-33 | HiLoad 16/600 Superdex 75 pg, for additional protein purification |
| Glass coverslips | VWR International | 631-0172 | No 1.5 |
| Glass syringe | Hamilton | 1725 RNR | 250 µL |
| Glass vials | Scientific Glass Laboratories Ltd | T101/V1 | 1.75 mL capacity |
| Gold | GoodFellow | 99.99% | |
| Gramacidin | Sigma | G5002 | |
| Mercury sulfate reference electrode | Radiometer (Hash) | E21M012 | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | Minispin NL040 | |
| Microscope | Nikon | Eclipse Ti | |
| Microscope Camera | Andor | Zyla 5.5 sCMOS | |
| Microscope Lamp | Nikon | Intensilight C-HGFI | |
| NIS-Elements AR 5.0.2 | Nikon | Microscope acquisition software | |
| n-Octyl β-D-glucopyranoside | Melford Laboratories | B2007 | |
| Nova 1.10 | Metrohm | Potentiostat control software | |
| Objective | Nikon | Plan Apo λ 60x/1.4 oil | |
| OriginPro 2017 | OriginLab | Plotting software | |
| O-ring (Electrochemical cell) | Orinoko | Inner diameter: 16 mm; cross section: 1.5 mm | |
| Plastic tubes | Eppendorf | 3810X | 1.5 mL |
| Polystyrene microbeads | Bio-RAD | 152-3920 | Biobeads, 20-50 mesh |
| Potentiostat | Metrohm Autolab | PGSTAT 128N | |
| Potentiostat | CH Instruments | CHI604C | |
| Scripting software | Matlab | R2017a | Required toolboxes: 'Image Processing Toolbox', 'Parallel Computing Toolbox', 'Curve Fitting Toolbox', 'System Identification Toolbox', 'Optimization Toolbox' |
| Silicon wafers | IDB Technologies LTD | Si-C2 (N<100>P) | Ø 25 mm, 525 um thick |
| Teflon cell (Electrochemical cell) | Custom-made | Outer diameter: 26 mm; inner diameter: 13.5 mm | |
| Temple-Stripped Ultra-Flat Gold Surfaces | Platypus Technologies | AU.1000.SWTSG | Alternative ready-to-use ultra-flat gold surfaces (Thickness below 100 nm on demand) |
| Thin micropipette tips | Sarstedt | 70.1190.100 | or similar gelloader tips 200 µL |
| Ubiquinone-10 | Sigma | C-9538 | |
| Ultracentrifuge | Beckman-Coulter | L-80XP | with Ti 45 rotor |
| Ultrasonic bath | Fisher Scientific | FB15063 |
References
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