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Biochemistry

Einzelne Liposomen Messungen für das Studium der Protonen-Pumpen Membran Enzyme mit Elektrochemie und Fluoreszenz-Mikroskopie

Published: February 21, 2019 doi: 10.3791/58896
Automatic Translation
1, 2, 1
1School of Biomedical Sciences & the Astbury Centre for Structural Molecular Biology, University of Leeds, 2Department of Chemistry and Nano-Science Center, University of Copenhagen

Summary

Hier präsentieren wir ein Protokoll, um den molekularen Mechanismus der Protonen-Translokation über Lipidmembranen der einzelnen Liposomen, studieren mit Cytochrom Bo3 als Beispiel. Kombination von Elektrochemie und Fluoreszenz-Mikroskopie, pH-Änderungen in das Lumen der einzelne Vesikel, mit einzelnen oder mehreren Enzym können individuell erkannt und analysiert werden.

Abstract

Protonen-Pumpen Enzyme des Elektrons übertragen Ketten paar Redoxreaktionen an Protonen-Translokation durch die Membran, erstellen eine Proton-treibende Kraft für die ATP-Produktion verwendet. Der amphiphilen Charakter der Membranproteine erfordert besonderes Augenmerk auf deren Handhabung und Rekonstitution in die natürliche Lipid-Umwelt ist unverzichtbar, wenn Transport Membranverfahren wie Protonen-Translokation zu studieren. Hier zeigen wir eine Methode, die für die Untersuchung des Protonen-Pumpen-Mechanismus der Membran Redox Enzyme verwendet worden ist, Cytochrom Bo3 aus Escherichia coli als Vorbild nehmen. Eine Kombination der Elektrochemie und Fluoreszenz-Mikroskopie dient zur Steuerung der Redox-Status des Quinone Pool und Monitor pH-Wert ändert sich in das Lumen. Durch die räumliche Auflösung der Fluoreszenz-Mikroskopie können Hunderte von Liposomen gleichzeitig gemessen werden, während die Enzym-Inhalt auf ein einziges Enzym oder Transporter pro Liposomen verkleinert werden kann. Die jeweiligen einziges Enzym Analyse kann Muster in der Enzym-funktionale Dynamik zeigen, die sonst durch das Verhalten der gesamten Bevölkerung verborgen sein könnte. Wir fügen Sie eine Beschreibung eines Skripts zur automatischen Bildanalyse.

Introduction

Informationen über Enzym Mechanismen und Kinetik ist in der Regel auf das Ensemble oder makroskopischen Ebene mit Enzym Bevölkerung in die Tausende bis Millionen von Molekülen, erhalten wo Messungen einen statistischen Durchschnitt darstellen. Es ist jedoch bekannt, dass komplexe Makromoleküle wie Enzyme Heterogenität in ihrem Verhalten zeigen können und molekulare Mechanismen beobachtet auf der Ensemble-Ebene nicht unbedingt für jedes Molekül gelten. Solche Abweichungen der einzelnen Molekül-Skala wurden weitgehend durch Studien der einzelnen Enzyme mit einer Vielzahl von Methoden, die in den letzten zwei Jahrzehnten1bestätigt. Vor allem, wurde Fluoreszenz-Detektion von einzelnen Enzymaktivität zur Heterogenität der Enzyme Aktivität2,3 zu untersuchen oder entdecken den sogenannten Memory-Effekt (Perioden der hohen Enzyme Tätigkeit ist es gelungen, durch Zeiten der niedrigen Aktivität und umgekehrt)4,5.

Viele einzelne Enzymstudien erfordern, dass die Enzyme auf der Oberfläche oder räumlich feste auf andere Weise ausreichend lange in das Sichtfeld für kontinuierliche Beobachtung bleiben immobilisiert sind. Enzym-Kapselung in Liposomen nachweislich Enzym Immobilisierung und verhindern, dass mögliche negative Auswirkungen aufgrund der Oberfläche-Enzym oder Protein-Protein Interaktionen6,7zu aktivieren. Darüber hinaus bieten die Liposomen eine einzigartige Möglichkeit einzelne Membranproteine in ihrer natürlichen Lipid Bilayer Umwelt8,9,10zu studieren.

Eine Klasse von Membranproteinen, Transporter, übt eine direktionale Translokation von Stoffen über die Zellmembran, ein Verhalten, das nur untersucht werden kann, wenn Proteine in der Lipid Bilayer (z.B. Liposome)11wieder hergestellt werden, 12,13. Zum Beispiel spielt Protonen-Translokation, ausgestellt durch mehrere Enzyme von prokaryotischen und eukaryotischen Elektronentransport Ketten, eine wichtige Rolle in der Zellatmung durch die Schaffung einer Proton-treibende Kraft für die ATP-Synthese verwendet. In diesem Fall ist das Proton Pumpen Aktivität an den Elektronentransfer gekoppelt, obwohl der genaue Mechanismus dieses Prozesses oft schwer fassbar bleibt.

Vor kurzem haben wir die Möglichkeit, paar Fluoreszenz-Detektion mit Elektrochemie, Proton, die Aktivität der einzelnen Enzyme von der Klemme Ubiquinol-Oxidase von Escherichia coli (Cytochrom Bo3) Pumpen zu studieren die Liposomen14wieder hergestellt. Dies wurde erreicht durch Verkapselung von einer pH-Sensitive Membran undurchlässig Leuchtstofffärbung in das Lumen der Liposome aus E. vorbereitet coli polaren Lipide (Abbildung 1A). Die Protein-Menge wurde optimiert, so dass die meisten Liposomen entweder keinen oder nur einen rekonstituierte Enzym-Molekül (nach Poisson-Verteilung) enthalten. Die beiden Substrate von Cytochrom Bo3 wurden zur Verfügung gestellt, indem Sie die Lipid-Mischung, die die Liposomen und (ambient) Sauerstoff in Lösung gebildet Ubiquinon hinzufügen. Die Liposomen sind dann dünn auf einer halbtransparenten ultrasanfte gold Elektrode, bedeckt mit einer selbst-zusammengebauten monomolekularen Film des 6-Mercaptohexanol adsorbiert. Zu guter Letzt wird die Elektrode an der Unterseite einer einfachen Spectroelectrochemical Zelle (Abbildung 1 b) montiert. Elektrochemische Quinone Pool Redox staatlicher Kontrolle erlaubt es flexibel auslösen oder die enzymatische Reaktion jederzeit zu stoppen, während der pH-Sensitive Farbstoff zur pH-Wert-Änderungen in das Lumen der Liposomen durch Protonen-Translokation durch Überwachung dient der Enzyme. Durch die Verwendung der Fluoreszenzintensität von einem zweiten und Lipid gebundener Fluoreszenzfarbstoff, die Größe und das Volumen der einzelnen Liposomen kann ermittelt werden und somit die Quantifizierung des Enzyms Proton Pumpen Aktivität. Mit dieser Technik fanden wir vor allem, dass Cytochrom Bo3 Moleküle in der Lage sind, einen spontanen Leck Zustand zu schließen, die schnell verflüchtigt sich die Protonen treibende Kraft. Das Ziel dieses Artikels ist es, die Technik der einzelnen Liposomen Messungen im Detail vorstellen.

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Protocol

1. Vorbereitung der Lipid/UQ-10/FDLL Mischung

Hinweis: E. coli Lipide die Liposomen Vorbereitung soll regelmÄÑig und gründlich gemischt mit Ubichinon-10 (Enzym-Substrat) und langwellige fluoreszierenden Farbstoff-markierten Lipide (für Liposomen Größenbestimmung) vor der Rekonstitution.

  1. Mit einer Glasspritze, Transfer 200 µL Chloroform Bestand an Lipid polar extrahiert aus Escherichia coli (25 mg/mL) in Glasfläschchen, 5 mg Aliquote zu machen.
  2. Fügen Sie 50 µL von 1 mg/mL Ubichinon-10 (UQ-10; in Chloroform) zu den Lipiden zu endgültigen Verhältnis UQ-10: Lipide 1: 100 (1 % w/w).
  3. Die Lipide/UQ-10 Mischung 20 µL von 1 mg/mL (0,4 % w/w) eine langwellige fluoreszierenden Farbstoff-markierten Lipid (FDLL) hinzufügen.
  4. Homogenisieren Sie die Chloroform-Lösung von kurz aufschütteln zu und verdampfen Sie die meisten Chloroform durch eine sanfte Stickstoff oder Argon fließen. Entfernen Sie die Chloroform Spuren ganz durch weitere Verdampfung unter Vakuum für mindestens 1 h.
    Hinweis: Lipid Aliquote können unter inerter Atmosphäre bei-20 ° C für mehrere Monate gespeichert werden.

2. Wiederherstellung der Cytochrom Bo3

Hinweis: Für die Reinigung von Cytochrom Bo3 aus E. Coli, führen Sie das Protokoll von Rumbley Et Al. Fügen Sie 15 um hohe Reinheit des nativ gefaltet Enzym Proben zu gewährleisten, Größe-Ausschluss Chromatographie nach der Affinität Reinigungsschritt von Rumbley Et Al. beschrieben 15

  1. Fügen Sie 312.5 µL 40 mm MOPS-KOH/60 mM K2SO4, pH 7,4, bis ein Aliquot der Lipide/UQ-10/FDLL trocken (5 mg, Schritt 1.4) mischen und mit Vortex mischen, bis die Lipid-Film vollständig Nukleinsäuretablette ist, gefolgt von 2 min Behandlung in ein Ultraschallbad.
  2. Fügen Sie 125 µL 25 mM 8-Hydroxypyren-1,3,6-Trisulphonic Säure (HPTS), einem pH-sensitiven Fluoreszenzfarbstoff, die in Liposomen verkapselt werden muss.
  3. 137,5 µL 250 mM n-Octyl β-D-Glucopyranoside (OGP) Tensid, mischen mit Wirbel und in ein Ultraschall-Wasserbad für 10 min um sicherzustellen, dass alle Lipide in Tensid Micellen solubilisiert werden beschallen. Übertragen Sie die Dispersion in einem 1,5 mL Plastikrohr.
    Hinweis: Trübe Suspension von Lipiden sollte nach der Solubilisierung mit Tensid durchsichtig.
  4. Fügen Sie die erforderliche Menge an Cytochrom Bo3 (siehe Hinweis unten) und Reinstwasser zu einem Gesamtvolumen von 50 µL (Cytochrom Bo3 Lösung plus Wasser) hinzufügen. Bei 4 ° C für 10 min auf einem Roller-Mixer inkubieren.
    Hinweis: Typisch für einzelne Enzym Bedingungen beträgt 0,1-0,2 % (w/w Protein-Lipid, dh. 5 – 10 µg Protein), obwohl es bis zu 1 – 2 % (50 – 100 µg Protein) erhöht werden kann, wenn das Ziel ist es, nur die elektrochemische Aktivität (siehe unten) zu beobachten. Als Negativkontrolle können Liposomen ohne Cytochrom Bo3 vorbereitet werden.
  5. 2 x 50 mg und 2 x 100 mg Polystyrol Microbeads in vier 1,5 mL-Tube Kappen wiegen und schließen mit Paraffin Film um Austrocknen zu verhindern.
    Hinweis: Vor Gebrauch, Polystyrol Microbeads mit Methanol gewaschen werden, Wasser und im Wasser nach Anleitung des Herstellers gespeichert.
    Hinweis: Wenn ein Wasser/Microbead-Gemisch verwendet wird, kann Polystyrol Microbeads bequem an der Kappe mit einer Mikropipette mit einer breiten Spitze übertragen. Wasser kann dann aus der Microbeads mit einer Mikropipette mit einer dünnen Spitze entfernt werden.
  6. Fügen Sie 1St50 mg Polystyrol Microbeads in die Rekonstitution Mischung (Schritt 2.4), indem man die Kappe mit Polystyrol Microbeads auf 1,5 mL-Kunststoff-Tube mit Dispersion und eine kurze Spritztour für ein paar Sekunden durchführen. Bei 4 ° C auf einem Roller-Mixer für Polystyrol Microbeads zu adsorbieren, das Tensid für 30 mininkubieren.
    1. Wiederholen Sie die Ergänzungen von Polystyrol Microbeads und Inkubationen wie folgt: Fügen Sie 50 mg von Microbeads für 60 min Inkubation; Hinzufügen von 100 mg Microbeads für 60 min Inkubation; und 100 mg Microbeads für 120 min Inkubation hinzufügen.
      Hinweis: Die Lösung über die abgerechneten Microbeads transluzente während Schritt 2.6 schaltet wie Proteoliposomes gebildet werden.
  7. Trennen Sie die Proteoliposome-Lösung von der Polystyrol Microbeads mit einer Mikropipette mit einer dünnen Spitze. Verdünnen Sie die Dispersion in 90 mL 20 mm MOPS-KOH/30 mM K2SO4, pH 7.4 (MOPS-Puffer) und Transfer in ein Ti45 Ultrazentrifuge Rohr.
  8. Ultrazentrifuge die Dispersion mit Typ 45 Ti Rotor bei 125.000 x g (bei rmax) für 1 h nach der Proteoliposomes pellet.
    Hinweis: Kleinere Zentrifuge Röhren können verwendet werden, obwohl die Verdünnung in großen Puffervolumen hilft, um die Konzentration der gossene HPTS zur endgültigen Sperrung zu reduzieren.
  9. Entsorgen Sie den Überstand, spülen Sie die Pellets mit 20 mM MOPS-KOH/30 mM K2SO4, pH-Wert 7,4 gepuffert (ohne resuspending das Pellet). Nach der Spülung Puffer verwerfen, wieder aussetzen Sie die Proteoliposomes in 500 µL MOPS-Puffer durch pipettieren sie hin und her mit dünnen Spitze Mikropipette. Anschliessend transfer zum 1,5 mL-Kunststoff-Rohr.
  10. Zentrifugieren Sie die Suspension für 5 min bei 12.000 x g, die Ablagerungen zu entfernen. Den überstand (rekonstituierten Proteoliposomes) in ein neues Fläschchen zu übertragen.
  11. Speichern Sie die wiederhergestellten Proteoliposomes Dispersion bei 4 ° C über Nacht und innerhalb von 2 Tagen aufbrauchen.

3. Herstellung von semi-transparenten Gold-Elektroden

Hinweis: Die glatte Oberfläche gold erhält man durch eine Template-stripping-Methode aus einer 30 nm dicke Schicht von 99,99 % Gold aus einem atomar glatte Silizium-Wafer. Die geringen Dicke der Goldschicht ist wichtig, da es halbtransparent, um Fluoreszenz Beobachtung erlaubt sein muss. Details zu gold Verdunstung (physische Aufdampfen, PVD) finden an anderer Stelle16 und einzige Vorlage-stripping wird hier behandelt. Alternativ können ultra-glatte gold Chips anderswo erworben werden (siehe Tabelle der Materialien).

  1. Kleben Sie bis zu 9 Glas Deckel rutscht (0,17 mm dick) auf die verdampfte Goldoberfläche mit Bi-Komponenten Low-Fluoreszenz Epoxy ein. Den Klebstoff bei 80 ° C für 4 h zu heilen.
  2. Kurz vor Modifikation mit einem selbst-zusammengebauten monomolekularen Film (Schritt 4) trennen Sie das Glas Deckel rutscht aus der Silizium-Wafer mit einer Klinge. Durch die dünne Abdeckung rutscht Vorsicht beim Abnehmen des Abdeckung rutscht um nicht knacken oder brechen die Glas-Folien.

4. Änderung der Goldoberfläche mit selbst-zusammengebauten Monolayer (SAM)

  1. 5 mL Wasser-Lösung von 1 mM 6-Mercaptohexanol (6MH) vorzubereiten.
  2. 6MH Lösung frisch freistehende Gold-beschichteter Deckel rutscht (Schritt 3.1) eintauchen und lassen Sie über Nacht bei 20 – 25 ° C (> 16 h), die SAM zu bilden.
    Hinweis: Thiol-Lösungen haben einen unangenehmen Geruch, einem geschlossenen Gefäß sollte verwendet werden, wenn das Gold-beschichteter Deckglas zu bebrüten.
  3. Am nächsten Tag entfernen Sie das Gold-beschichteter Deckglas aus der 6MH-Projektmappe, kurz waschen Sie, mit Wasser oder Methanol und Isopropanol. Unter einem sanften Gasstrom trocken.

5. elektrochemische Prüfung der Proteoliposomes-Aktivität

Hinweis: Die elektrochemische Aktivität des Enzyms wird zunächst auf einer dicht gepackten Liposomen-Schicht (Schritt 5) überprüft und unteren Vesikel Deckungen dienen in einzelne Vesikel Experiment zur Messung pH-Veränderungen in das Lumen der Liposome (Schritt 6).

  1. Montieren Sie das Gold-beschichteter Deckglas in einer Spectro-elektrochemische Zelle (siehe Abbildung 1). Stellen Kontakt zu Gold mit einem flachen Draht außerhalb einer Fläche definiert ein Gummi o-Ring.
  2. Fügen Sie 2 mL der Pufferlösung Elektrolyt hinzu und platzieren Sie der Referenz- und zusätzliche Elektroden in der Zelle.
    Hinweis: Weitere im Diskussion Abschnitt diskutiert, werden Referenzen Elektroden ohne Chlorid bevorzugt verhindert Bildung von Au (I) Cl während der Elektrochemie. Hier, eine Hg/Hg2SO4 (SA. K2SO4) Bezugselektrode dient und Potenziale erhalten im Vergleich zu Standard-Wasserstoff-Elektrode (SHE) mit 0,658 V Vs SHE für Hg/Hg2SO4 (sat. K2SO4).
  3. Laufen Sie elektrochemische Impedanz Spektroskopie (0,1 Hz – 100 kHz) bei open-Cell potenzielle (OCP) Potenzial zur Bewertung der Qualität von SAM. Eintritt Impedanzwerte umwandeln und teilen Sie durch 2πω zu einen Cole-Cole-Plot, Plotten, wo ω die Frequenz ist (siehe die folgenden Referenzen16,17,18 Einzelheiten zu konvertieren und Interpretation der Impedanz Spektren).
    Hinweis: Sollte kompakt und dicht SAMs von 6MH Halbkreis Cole-Cole-Plot eine enge verleihen und geben Werte der Kapazität im Bereich von 2,5 bis 3,0 µF/cm2 (Abbildung 2A). Wenn signifikante Abweichung von Halbkreis Form oder Out-of-Range-Kapazität Werte erhalten werden, ändern Sie die Elektrode.
  4. Führen Sie leere zyklische Voltammograms (CVs) mit Scan Rate 100 und 10 mV/s in der potenziellen Region -0,3-0,8 V. Ein typischer Lebenslauf zeigt (Abb. 2 b, gestrichelten Linie).
    Hinweis: Dies sollte fast reine kapazitives Verhalten und das Fehlen von erheblichen faradaic Strom, auch unter ambient Sauerstoffbedingungen demonstrieren, wie hier verwendet.
  5. Die elektrochemische Zelle Proteoliposomes (0,5 mg/mL letzte Lipide Konzentration, 1-2 % (w/w) Verhältnis von Cytochrom Bo3 , Lipid) hinzu und mischen Sie leicht mit einer Pipette. Warten Sie, bis die Adsorption von Proteoliposomes auf der Elektrodenoberfläche ist fertig (30-60 min bei Raumtemperatur).
    Hinweis: Zyklische Voltammograms (CVs) bei 10 mV/s führen während der Proteoliposomes-Adsorption, den Prozess zu folgen. Die Adsorption ist beendet, wenn aufeinander folgende CVs nicht mehr ändern. Informationen über CV-Techniken finden Sie in den folgenden Lehrbüchern. 19 , 20
  6. Waschen Sie die Zelle durch eine Änderung der Pufferlösung mindestens 10 Mal aber zu vermeiden Sie, so dass der Elektrodenoberfläche komplett trocken.
  7. Führen Sie die elektrochemische Impedanz Spektroskopie am OCP (Abb. 2A, blaue Linie) zu bestätigen, dass SAM auf die Elektrode gold unverändert bleibt und CVs mit scan Preise 10 und 100 mV/s Ubiquinol katalytische Oxidation (und Sauerstoffreduktion) von Cytochrom beobachten Bo 3 Beginn Potenziale der elektrochemischen Quinone Reduktion über 0 V Vs SHE) (Abb. 2 b).

6. Nachweis von enzymatischen Proton Pumpen durch Fluoreszenz-Mikroskopie

  1. Ändern Sie die gold-Elektrode wie in Schritt 5, aber mit 100 x weniger Proteoliposomes im Vergleich zu Schritt 5.5 (d.h. 5 µg/mL). Für einzelne Enzymstudien, reduzieren die Cytochrom Bo3 Lipid-Verhältnis auf 0,1-0,2 % (w/w).
    Hinweis: Liposomen werden dünn auf der Elektrodenoberfläche eine einzelne Vesikel Überwachung durch Fluoreszenzmikroskopie ermöglichen adsorbieren. Unter diesen Single-Enzym ist die Menge des Enzyms immobilisiert auf der Elektrodenoberfläche unzureichend für die Beobachtung eines katalytischen Stroms.
  2. Legen Sie die elektrochemische Zelle auf das Öl Ziel (60 X) eine invertierte Fluoreszenzmikroskop mit einem Tropfen Immersionsöl. Mit entsprechenden Filtern für FDLL Fluoreszenz, konzentrieren Sie sich auf der Elektrodenoberfläche. Einzelne Liposomen sollte als helle Flecken an die Beugungsgrenze das Mikroskopobjektiv angezeigt werden. Nehmen Sie ein Bild der FDLL Fluoreszenz.
  3. Wechseln zu einem HPTS Fluoreszenz-Filter-Sets auf dem Mikroskop, ob HPTS Fluoreszenz sichtbar und deutlich vom Hintergrund zu unterscheiden ist (an die gewählte Belichtungszeit, siehe Punkt 6.4). Die Lichtintensität zu erhöhen, wenn es nicht der Fall ist.
  4. Programmieren die Mikroskop-Software eine zeitgesteuerte Bildaufnahme auszuführen, indem abwechselnd zwei HPTS Filtersätze (Menü Anwendungen | Define/Run ND Erwerb). Legen Sie die Verzögerung zwischen Bild Akquisitionen auf Minimum. Verwenden Sie in diesem Experiment ein 1 s-Exposition und 0,3 s Verzögerung (aufgrund der Revolver-Bewegung).
    Hinweis: Das Verhältnis zwischen Fluoreszenz-Intensitäten auf diese beiden Kanäle wird später in pH-Wert innerhalb der Liposomen zu jedem Zeitpunkt konvertiert werden. Die Dauer des Erwerbs variieren entsprechend der erwarteten pH-Wert Änderungsrate; 5 min in diesem Artikel verwendet.
  5. Passen Sie die Einstellungen von dem Potentiostaten um das Potential während der Bildaufnahme zu ändern. In diesem Experiment, z. B. die folgende Sequenz: 0 – 60 s: kein Potential angelegt (d.h. OCP); 60 – 180 s: -0,2 V (Vs SHE); 180 – 300 s: 0,4 V (Vs SHE). In diesem Fall nur das angewandte Potenzial in der zweiten Phase (-0,2 V Vs SHE) ist ausreichend, um effizient die Quinone Pool reduzieren.
  6. Führen Sie gleichzeitig den zeitgesteuerten Bilder Erwerb (Mikroskop) und die mögliche Abfolge (Potentiostaten) durch manuelles starten beide Messungen zur gleichen Zeit.
    Hinweis: Das Experiment kann auf die gleichen Elektrode mehrmals wiederholt werden durch verschieben den Mikroskoptisch in einen anderen Bereich auf der Oberfläche. Die Verzögerung zwischen den Akquisitionen sollte mindestens 5-10 min, komplette pH Gleichgewichtherstellung von Liposomen auf der Oberfläche zu versichern. Unterschiedlicher Dauer und mögliche Muster können je nach Bedarf, angewendet werden, obwohl imaging Zeit während der Akquisition durch Immunofluoreszenz HPTS begrenzt ist.

7. Analyse der Fluoreszenzbilder

Hinweis: Ein typisches Experiment erzeugt eine Reihe von Bildern mit einem Zeitschritt (z. B. 2,6 s) für jeden der beiden Kanäle, d. h. (Dauer * 2 / 2,6) Bilder. Ein Beispiel für solche Stellen Sie während ein einziges Enzym-Experiment aufgezeichneten Bild kann über die Forschung Daten Leeds Repository21zugegriffen werden. Eine Bild-Behandlung besteht aus mehreren Schritten mithilfe von Fidschi (ImageJ) und allgemeine mathematische Analyse Programmier-Sprache Software (im folgenden zur Tabelle der Materialien als scripting Software, Näheres siehe bezeichnet).

  1. Verwenden Sie Fidschi Zeit verfallen Datei zu trennen, Bilder ausrichten und speichern als separate Kanäle und Zeitrahmen.
    1. Offene Zeit verfallen Datei mithilfe des Bioformats-Importeurs innerhalb von Fidschi (Makro-Befehl: laufen ("Bio-Formate Importeur")).
    2. Verwenden Sie das Plugin StackReg um jeden Frame mit dem ersten Stadium Bewegungen berücksichtigen auszurichten oder Temperaturdrift ist aufgetreten beim Erwerb (Makro-Befehl: laufen ("StackReg", "Transformation = Übersetzung")).
    3. Speichern Sie separate unkomprimiertes Image-Dateien für jeden Kanal und jedem Zeitschritt im TIFF-Format in einem Ordner.
    4. Extrahieren Sie die genauen Zeitstempel für jeden Frame aus der Zeit verfallen Dateimetadaten und speichern Sie sie als CSV-Datei in demselben Ordner wie die Bilder. Alternativ extrahieren Sie Zeitstempel mit der Datenerfassungs-Software zu und speichern Sie manuell in eine CSV-Datei mit einem Tabellenkalkulationsprogramm.
      Hinweis: Der Ordner mit Bildern und Zeitstempel ist nun bereit, durch die scripting Software analysiert werden. 7.1.1 Schritte. – 7.1.4. mit einem Fidschi-Skript automatisiert werden kann (ein Skript in Python geschrieben, für Batch-Verarbeitung von Time Lapse Dateien vorgesehen ist, verwenden Sie "Strg-Shift-N" (in Windows), dann Datei | Offene , das Skript zu laden).
  2. Verwenden Sie scripting Software für die automatisierte Verarbeitung der Bilder. Laden Sie den bereitgestellten Code der Software und klicken Sie auf Run zu Ende. Wenn Sie aufgefordert werden, wählen Sie den Ordner mit den Bildern aus Schritt 7.1.
    Hinweis: Ein Skript für die Analyse wird als Mlx-Format live Skript mit ausführlichen Anmerkungen zu identifizieren einzelne Liposomen, passen sie auf 2D-Gauß-Funktion, Filtern und quantifizieren die pH-Werte zu jedem Zeitpunkt bereitgestellt. Die folgenden Teilschritte werden durch das Skript automatisch ausgeführt.
    1. Laden Sie alle Zeiträume Bilder für ein einzelnes Experiment in den Speicher.
    2. Im Durchschnitt alle Bilder für einen einzelnen Kanal (Wählen Sie den Kanal mit der höchsten Fluoreszenzintensität) und der gemittelte Bild verwenden, um alle Maxima zu identifizieren, die die einzelnen Liposomen entsprechen könnte.
    3. Passform der identifizierten Maxima auf das gemittelte Bild 2D-Gauß funktionieren und speichern das Ergebnis passt Parameter für jedes Liposomen (siehe Abbildung 4A z.B. ausgestattete Liposomen).
    4. Filtern Sie die Höchstwerte nach den erwarteten einzelne Liposomen Kriterien, wie Größe, Rundheit und Intensität. Ablehnen, Liposomen, die aufgrund der geringen Signal-Rausch schlecht ausgestattet sind, eng benachbarten Liposomen oder auch nahe an den Bildrand.
    5. Laden Sie Zeitstempel aus der externen Datei und passen Sie jedes gefilterte Liposomen der 2D-Gauß-Funktion auf jedem Zeitrahmen Bild separat.
      Hinweis: Die Verwendung der Parallelprogrammierung und multicore CPU kann erheblich verbessern die Rechengeschwindigkeit zu diesem Zeitpunkt.
    6. Filtern Sie die Liposomen wieder nach ähnlichen Kriterien wie in Schritt 7.2.4 aber angewendet auf jedem Zeitrahmen.
    7. Definieren Sie auf jedem Zeitschritt die Fluoreszenz Intensitätsverhältnis ein Liposom als das Verhältnis der Volumina ausgestattete 2D Gauß-Funktion in zwei Kanälen umgeben. Berechnen Sie die pH-Werte aus dem Verhältnis der Intensitäten ermittelt aus den beiden HPTS Kanälen und mit Hilfe einer Eichkurve (Schritt 8). Plot resultierende pH-Zeit-Verläufe für die Liposomen und beobachten Sie ihren pH-Wert ändern, wenn das Potential anliegt.

8. Durchführung einer Kalibrationskurve HPTS Fluoreszenz

Hinweis: HPTS Fluoreszenz-Verhältnis in einem intravesicular pH-Wert konvertieren möchten, muss eine Kalibrierungskurve zunächst festgestellt werden, dass die besondere Bedingungen der Experimente wie gold Transmission, Filter Qualität usw.berücksichtigen würde. Dieser Schritt muss nur einmal oder zweimal durchgeführt werden und die Kalibrierdaten können verwendet werden, solange die Parameter Setup und Messung in Schritt 6 unverändert.

  1. Bereiten Sie eine Elektrode mit dünn adsorbierten Liposomen (ohne Cytochrom Bo3 wie in den Schritten 5 und 6.1 beschrieben).
  2. 2 mL des Puffers erstelle ich die Konzentration 100 ng/mL fügen Sie 2 µL von 0,1 mg/mL Gramicidin Lösung in Ethanol hinzu.
  3. Zwei Fluoreszenzbilder für die beiden HPTS Kanäle zu erfassen.
  4. Ändern Sie den pH-Wert der Zelle durch Zugabe von kleinen Aliquote 1 M HCl oder 1 M H2SO4. Messen Sie den pH-Wert des Puffers mit einem standard-pH-Meter und erfassen Sie zwei Fluoreszenzbilder für die beiden HPTS Kanäle zu.
  5. Wiederholen Sie die Schritte 8,4 für den pH-Bereich 6 bis 9.
  6. Mit dem Algorithmus von 7,2, passen, zu filtern und die durchschnittliche HPTS Fluoreszenz Verhältnis zwischen einzelnen Liposomen bei jedem pH-Wert zu berechnen. Übernehmen Sie die HPTS Verhältnis durchschnittlich alle Liposomen.
  7. Passen Sie die resultierende pH-Verhältnis-Abhängigkeit, die folgende Gleichung:
    Equation, wo pKein, Rein und Rbsind passende Parameter.
  8. Verwenden Sie pKein, Rein und Rbdas HPTS Verhältnis der einzelnen Liposomen in Schritt 7.2.7 zu konvertieren. auf pH-Werte.

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Representative Results

Die Qualität des Gold-modifizierte Deckglases (Elektrode) mit einem SAM 6MH wird vor jedem Experiment mit elektrochemische Impedanz Spektroskopie überprüft. Abbildung 2A zeigt repräsentative Cole-Cole-Grundstücke mit elektrochemische Impedanz Spektroskopie vor und nach der Liposomen adsorbiert werden gemessen. Wenn die Qualität der SAM ausreicht, sollte Impedanz Spektroskopie ein fast reines kapazitives Verhalten, was zu einem Halbkreis Cole-Cole-Grundstück zeigen. Der Durchmesser des Halbkreises in einem Cole-Cole-Grundstück entspricht die double-Layer-Kapazität der Elektrodenoberfläche, die im Bereich von 2,5 bis 3,0 µF/cm2 sein sollte. Beachten Sie, dass die Kapazität nicht deutlich auf Liposomen Adsorption, obwohl eine leichte Zunahme der Kapazität sollte beobachtet werden kann (hohe Liposomen Abdeckung, Figur 2A, unten) oder eine leichte Verschiebung der Impedanz kann beobachtet werden, bei niedrigen Frequenzen (niedrige Liposomen Bedeckungen, Figur 2A, oben).

Elektrochemie kann verwendet werden, die katalytische Aktivität der Cytochrom Bo3 in die Proteoliposomes zu testen, wo katalytische Ströme gemessen mit zyklischer Voltammetrie reflektieren die Ubiquinol-Sauerstoffaktivität Oxidoreductase. Jedoch erhebliche katalytische Ströme können nur bei hohen Stückzahlen des adsorbierten Proteoliposomes erkannt werden und eine dicht Schicht von Proteoliposomes auf das Deckglas Gold geändert ist erforderlich. Abbildung 2 b zeigt repräsentative zyklische Voltammograms (CVs) der Elektrode vor und nach der Liposomen Adsorption mit entweder hoch oder niedrig Liposomen-Abdeckung. Kein faradaic Strom ist auf den leeren Lebenslauf beobachtet, weil Sauerstoffreduktion durch den bloßen gold Elektrode von der SAM blockiert wird. Wenn die Oberfläche gesättigt ist mit Liposomen mit hohen Cytochrom Bo3 Inhalt (1,3 % (w/w) in diesem Fall), eine klare katalytische Welle durch Sauerstoffreduktion ist mit einem Ausbruch Potential 0 V, d. h. das Potenzial von Ubiquinon beobachtet Reduktion (Abb. 2 b, blaue Linie). Ubiquinon Pool wirkt als das natürliche Substrat für das Enzym sowie ein Elektron-Vermittler, Übertragung von Elektronen vom Enzym auf der Elektrodenoberfläche. Wir beachten, dass unter hohen Liposomen Abdeckung, keine Unterscheidung der einzelnen Bläschen möglich durch Mikroskopie ist und niedrigere Abdeckung für einzelne Liposomen Studien benötigt wird. Bei niedrigen Liposomen Abdeckung (aber proteinreiche Lipid-Verhältnis) wird die katalytische aktuelle deutlich, kaum zu unterscheiden von Hintergrund (Abb. 2 b, rote Linie) reduziert. Beachten Sie, dass einzelne Enzym Bedingungen (eiweißarme Lipid-Verhältnis), die katalytische aktuelle sogar noch niedriger ist und nicht zuverlässig gemessen werden.

Abbildung 3 zeigt Fluoreszenzbilder von Liposomen adsorbiert an die Elektroden an drei verschiedenen Deckungen. Alle Bilder wurden unter denselben Bedingungen für Licht und Belichtung und ihre Helligkeit wurde ebenfalls angepasst, um direkten Vergleich zu ermöglichen. Der Farbstoff enthält Liposomen sind als helle Flecken auf den Bildern sichtbar. Der zentrale Teil des Bildes war Photobleached für ein paar Minuten Hintergrundkonzentration Fluoreszenz zeigen (wir beachten Sie, dass FDLL relativ photostabil und nicht Photobleached komplett in Abbildung 3 ist). Wo sind die Bilder auf zwei Kanälen HPTS deckungsgleichen, das Verhältnis zwischen den beiden Kanälen (410/535 und 470/535) entspricht pH 7.4 in diesem Experiment verwendet. Eine größere Anzahl von Liposomen sind sichtbar mit dem FDLL Kanal, kennzeichnet die Anwesenheit von Liposomen, die keine HPTS gekapselt. Der Unterschied zwischen den Kanälen HPTS und FDLL ist bei höheren Deckungen, möglicherweise ausgeprägter weil hohe Liposomen Berichterstattung in Liposomen sind eher platzen oder Sicherung auf der Oberfläche.

Die Bildanalyse erfordert die Ausrichtung des Frames (gegen den ersten Frame) mit ImageJ, Plugin StackReg. Die Ausrichtung ist in den meisten Fällen unerlässlich, da eine geringe Temperaturdrift der Probe in der Regel innerhalb der Frist des Experiments tritt, die Liposomen-Koordinaten ändern. Alle weiteren Analyse erfolgt mit Hilfe einer Software-Skriptcode. Dieser Code führt automatische Liposomen Identifikation. Da die Größe der Liposomen sind unterhalb der Beugungsgrenze Abbe, ist ihre Fluoreszenz gesehen, wie ein Punkt Funktion viel größer als der tatsächliche Liposomen-Durchmesser (Abbildung 4A) verteilt. Der Code passt der Fluoreszenzintensität von jedem Vesikel auf zwei Kanälen für eine 2D Gauß-Funktion (Abb. 4A) und berechnet ihre volumetrische Intensitätsverhältnis die pH mit einer Kalibrationskurve konvertiert werden können. Durch Ausführen dieser Aktionen auf allen Zeitrahmen, wird der pH-Wert im Inneren jedes Vesikel innerhalb des Experiments (Film 1) gewonnen. Abbildung 4 b zeigt die mediane aller Vesikel pH-Wert-Änderungen innerhalb eines einzigen Bildes Cytochrom Bo3 Inhalt 1,3 %. Eine Erhöhung des pH-Wertes (Protonen-Pumpen) ist deutlich sichtbar, wenn ein Potential zwischen -0,1 und -0,3 V anliegt, aber nicht für 0 V seit der letzteren ist nicht ausreichen, um den Pool Quinone zu verringern. Wenn der Cytochrom Bo3 Inhalt ist viel niedriger (Protein-Lipid-Verhältnis von 0,1 %, Abbildung 4), die mittlere Kurven werden kaum von denen der leere Liposomen (Abbildung 4). Der Unterschied wird deutlich, wenn man einzelne pH-Wert Spuren von zufälligen Liposomen (Abbildung 5, 6 und 7). Während Liposomen ohne Cytochrom Bo3 keine signifikanten pH-Änderungen in Bezug auf Lärm (Abbildung 7) angezeigt werden, zeigen eine Auswahl von Liposomen (dominant) eine Zunahme oder eine Abnahme des pH-Wertes wird ein Potential angewendet, dass Wirkstoffe Cytochrom Bo3 (Abbildungen 6, graue Zone). Der offensichtliche Unterschied in pH-Spuren zwischen Liposomen ist konsistent mit der niedrigen Protein-Lipid-Verhältnis, wo Cytochrom Bo3 nur in einer kleinen Teilmenge der Liposomen-Aktivität vorhanden. Die Prävalenz einer pH-Wert-Erhöhung über Abnahme wird durch die Rekonstitution Methode erklärt, die eine Orientierung "nach außen" Enzym-Moleküle (ca. 75 %) bevorzugt. Der Anteil der Liposomen, die eine pH-Wert-Änderung anzeigen steigt, wenn die Cytochrom- Bo3 Lipid-Verhältnis höher (Abbildung 5). Beachten Sie auch, dass einige Liposomen, Proton zu Pumpen aufhören und Proton Verlustleistung Modus vor dem Ende der möglichen Anwendung eingehen. Wir führen dieses Verhalten auf die Cytochrom Bo3 Moleküle in ein "Leck-Zustand", die Protonen fließen zurück in den Liposomen Lumen14ermöglicht.

Die weitere Analyse der pH-Wert Spuren sowie deren Montage und Bestimmung der Protonen Pumpen/undicht Preise lässt sich mithilfe eines Skripts, wir haben vorher14,22 veröffentlicht und erhalten Sie bei der Forschung Datenrepository für Leeds, 23 , 24.

Figure 1
Bild 1: Prinzip der Methode. (A) Grundsatz der einzigen Enzym Aktivitätsüberwachung und (B) die Regelung des experimentellen Aufbaus in diese Arbeit mit einem Cutaway verwendet, um einen inneren Teil der Zelle zu demonstrieren. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 2
Abbildung 2: elektrochemische Reaktion von Liposomen. (A) Cole-Cole-Grundstücke gemessen am OCP (0,22 V Vs SHE; schwarze quadratische Linie) vor und nach der Liposomen (1,3 % w/w Cytochrom Bo3) Adsorption von Lösungen bei Konzentrationen von 5 µg/mL (rote Kreislinie) und 500 µg/mL (blauer Kreis-Linie). (B) zyklischen Voltammograms bei 100 mV/s (links) und 10 mV/s (rechte Abbildung) von Au-SAM (schwarz gestrichelte Linie) vor und nach der Liposomen (1,3 % w/w Cytochrom Bo3) Adsorption von Lösungen bei Konzentrationen von 5 µg/mL (rote Linie) und 500 µg/mL (blaue Linie). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 3
Abbildung 3: Fluoreszenz-Mikroskopie von Liposomen. Fluoreszenzbilder von Liposomen in verschiedenen Flächendeckungen: Oberflächen für 30 min eine Liposomen-Lösung von 5 µg/mL (obere Reihe), 20 µg/mL (mittlere Reihe) und 500 µg/mL (untere Zeile) inkubiert. Linken Spalte entspricht 470/535 nm Anregung/Emission Filtereinstellungen (1St HPTS Kanal); Mittelsäule - 410/535 nm (2Nd HPTS Kanal); Rechte Spalte - 560/645 nm (FDLL Kanal). Die Bilder wurden bei Vergrößerung 90 X (60 X objektiven und 1,5 X Vergrößerung durch die Lupe vor der Kamera), 1 s Belichtung und ähnliche Lichtintensität. Maßstabsbalken entspricht 50 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 4
Abbildung 4: Liposomen-Identifikation und pH-Wert ändern. (A) 3D-Ansicht eines Teils der Fluoreszenzbild mit einer typischen einzelnen Liposomen. Die Fluoreszenzintensität gilt als ein Punkt Funktion (Farbfläche) verbreitet, der für eine 2D Gauß-Funktion (schwarz Mesh) ausgestattet ist. (B-D) pH-Wert, bei unterschiedlichen angewandten Potenziale als der Median aller Vesikel innerhalb einzelner Bildbereichs (in der Regel mehrere hundert) angezeigt. Von 0-60 s kein Potential anliegt (OCP). Zwischen 60 und 180 s (Grauzone) galten unterschiedliche Potenziale: 0 V (schwarz)-V (rot), 0,1 -0,2 V (grün) -0,3 V (blau). Zwischen 180 und 300 s, 0,4 V Vs. Sie wurde angewendet. Die Cytochrom- Bo3 Lipid-Verhältnisse waren (B) 1,3 %, (C) 0,1 %, (D) 0 %. Die Spuren sind aus Gründen der Übersichtlichkeit versetzt. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 5
Abbildung 5: pH-Spuren von Liposomen mit 1,3 % des Enzyms. Spuren der pH-Wert ändern 72 einzelne Liposomen, nach dem Zufallsprinzip ausgewählt, mit Cytochrom Bo3 (1,3 % w/w) gemessen und analysiert während eines Experiments. Von 0-60 s ist kein Potential angewendet (OCP); zwischen 60 und 180 s (Grauzone) -0,2 V Vs. SIE; zwischen 180 und 300 s, 0,4 V Vs. Sie wurde angewendet. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 6
Abbildung 6: pH Spuren von Liposomen, 0,1 % des Enzyms enthalten. Spuren der pH-Wert ändern 72 einzelne Liposomen, nach dem Zufallsprinzip ausgewählt, mit Cytochrom Bo3 (0,1 % w/w) gemessen und analysiert während eines Experiments. Von 0-60 s ist kein Potential angewendet (OCP); zwischen 60 und 180 s (Grauzone) -0,2 V Vs. SIE; zwischen 180 und 300 s, 0,4 V Vs. Sie wurde angewendet. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 7
Abbildung 7: pH Spuren von Liposomen ohne Enzym. Spuren der pH-Wert-Änderung der 72 einzelne Liposomen, nach dem Zufallsprinzip ausgewählt, ohne Cytochrom Bo3 gemessen und analysiert während eines Experiments. Von 0-60 s: Ist kein Potential angewendet (OCP); zwischen 60 und 180 s (Grauzone) -0,2 V Vs. SIE; zwischen 180 und 300 s, 0,4 V Vs. Sie wurde angewendet. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Movie 1
Movie 1: Animation der einzelnen Liposomen pH Veränderung. (Oberseite) Änderung der eine Liposomen-Fluoreszenz auf zwei HPTS Kanälen (dargestellt als 3D-Oberfläche Plot des entsprechenden Bereichs), während 300 s des Experiments. Das reduktive Potential galt zwischen 60 s und 180 s. (Bodenplatte) entsprechende Grundstück von volumetrischen Intensitätsverhältnis zweier HPTS Kanäle im Vergleich zur Zeit. Die Zone der reduktiven Anwendungsmöglichkeiten ist grau hinterlegt. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video anzusehen. (Rechtsklick zum download)

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Discussion

Die beschriebene Methode eignet sich studieren Proton Pumpen durch respiratorische Membranproteine, die in Liposomen wiederhergestellt werden können und sind in der Lage, Elektronen mit dem Quinone Pool austauschen. Protonen-Pumpen-Aktivität kann auf der Single-Enzym-Ebene mit pH-Sensitive (ratiometrischen) Farbstoffe in den Liposomen Lumen (Abbildung 1A) gekapselt überwacht werden.

Die Methode beruht auf der Fähigkeit von Ubichinon (oder andere Quinones), in der Lipid-Bilayer integriert zum Austausch von Elektronen mit Elektroden mit einem SAM-18geändert. Die Eigenschaften der gold Elektrode, modifiziert mit einem SAM sind sehr spezifisch. Liposomen müssen auf die SAM und SAM muss dünn genug, um schnelle elektrochemische Oxidation und Reduktion des Quinone Pools in den Liposomen ermöglichen adsorbieren. Wichtig ist, muss das Zusammenspiel zwischen der Elektrode und Liposomen schwach genug, nicht um die Integrität der Lipidmembran beeinträchtigen. Darüber hinaus abhängig von den Details des experimentellen Systems ist es wünschenswert, wenn die SAM Gold-katalysierte Nebenreaktionen wie Sauerstoffreduktion verhindert. Schließlich muss die SAM stabil innerhalb des potenziellen Fensters verwendet werden. Die Verwendung von ultra-flache gold-Elektroden mit qualitativ hochwertigen SAM der 6MH modifiziert erfüllt diese Anforderungen im Falle des Cytochrom Bo3. Abisolieren goldene-Elektroden aus atomar-Flat Siliciumwafern erstellt eine ultra-glatte Goldoberfläche mit ein ideal in der Nähe von SAM, wie durch die Impedanz-Spektren. Bitte beachten Sie, dass wir die SAM aus 6MH im Wasser bilden. Zuvor berichteten wir über SAMs mit 6MH in Isopropanol16, aber diese SAMs zeigen höhere Werte der Doppelschicht-Kapazität und Impedanz-Spektren, die angeben, eine heterogenere Oberfläche (i.e., weitere Mängel) mit einer geringeren Widerstand. Darüber hinaus Wenn SAMs aus 6MH aus einer Wasserlösung vorbereitet werden, weniger Hintergrund Sauerstoffreduktion (wegen gold katalysierten Sauerstoffreduktion) wird beobachtet im Vergleich zu SAMs gebildet von einem Ethanol/Isopropanol-Lösung. Diese Beobachtungen zeigen, dass SAMs aus 6MH in Wasserlösungen eine höhere Qualität mit weniger Fehlern. Hochwertigere SAMs können auch aus Thiol-Verbindungen mit längeren Alkans Ketten (z. B. 1-hydroxy-Decane-Thiol) gebildet werden, aber die Electron Transfer Kinetik langsamer wie die SAM-Dicke erhöht werden.

Während (Spectro) Elektrochemie sollte die Chlorid-Ionen in der Pufferlösung vermieden werden, da sie auf die Goldoberfläche auf high-Potentials, verschlechtert sich möglicherweise die SAM-Qualität chemosorb können. Aus dem gleichen Grund sollte frei von Chlorid Referenzelektrode bevorzugt werden.

Ein weiterer wichtiger Punkt ist die Hintergrund-Durchlässigkeit der Liposomen, Protonen, die niedrig genug, um Proton Akkumulation durch enzymatische Protonen-Translokation auf der Zeitskala des Experiments ermöglichen soll. Die genaue Lipidzusammensetzung beeinflussen diese Durchlässigkeit. In unserer Arbeit verwenden wir polar e.coli Lipid-Extrakten ergänzt mit Ubichinon-10. Proton Durchlässigkeit nachweislich stark abhängig von der Fettsäure-Kette Länge25, obwohl dies in Studien mit komplexeren Lipid Kompositionen26widersprochen worden. Interessanterweise, nachweislich Ubiquinon vor kurzem Membran Stabilität27zu verbessern. Zu guter Letzt Rest Waschmittel aus der Protein-Rekonstitution können Proton Leckage beeinflussen und daher ist es wichtig, möglichst vollständig mit hydrophoben Polystyrol Microbeads, Verdünnung, gefolgt durch Zentrifugation Reinigungsmittel zu entfernen und gründliches Spülen der elektrochemischen Zelle nach der Proteoliposomes auf Oberfläche adsorbiert werden. Wenn zweifelhaft ist, kann durch nach der Lumen-pH-Wert-Änderung (über HPTS) in einer Antwort auf eine externe pH-Sprung-28Liposomen Durchlässigkeit überprüft werden.

Einziges Enzym Messung erfordern Unilamelar Liposomen und kleinere Liposomen schneller oder höheren pH-Wert ändert sich, wenn das Lumen Volumen sinkt aufweisen dürften. Um dies zu erreichen, werden Polystyrol Microbeads allmählich in kleinen Mengen führt zu langsamen Liposomen Bildung hinzugefügt. Unter solchen Bedingungen bilden sich kleine Liposomen homogene Größe mit einem mittleren Durchmesser von 70 nm und eine Polydispersität Index von 0,24 in unserem Fall14. HPTS absorbiert auch auf Styropor Microbeads, Verringerung der Kapazität der Polystyrol Microbeads um Waschmittel zu adsorbieren. Daher sollten überschüssige Polystyrol Microbeads zum Ausgleich seiner hinzugefügt werden. Behandlung mit Polystyrol Microbeads wurde beobachtet, um die HPTS-Konzentration in der Lipid-Protein-Suspension von etwa einem Viertel (von 5 mM bis ca. 3-4 mM) reduzieren. Allerdings könnte die tatsächliche HPTS Konzentration in den Liposomen Lumen höher, da die Liposomen frühzeitig auf die Behandlung mit Polystyrol Microbeads gebildet werden. Anstelle HPTS können andere pH-Sensitive Farbstoffe verwendet werden. Es ist jedoch wichtig, dass der Farbstoff Membran undurchlässig ist und ratiometrischen. Letztere vermeidet experimentellen Fehler durch Immunofluoreszenz und unterschiedliche Mengen an gekapselten Farbstoff.

Einfache Berechnungen können einschätzen, ob stochastisch, die meisten nicht-leere Liposomen nur ein Enzym-Molekül enthalten durchgeführt werden. Unter der Annahme eines durchschnittlichen Liposomen-Durchmesser von 70 nm, ein Lipid Molekulargewicht von 750 Da und ein Lipid-Fläche von 0,65 nm2 gibt uns eine Liposomen-Masse von 5.2x10-17 g, d. h. 9.6x1013 Liposomen pro Vorbereitung (5 mg Lipid). Bei 0,1 % der Cytochrom Bo3 (MW = 144 kDa), 2 x 10-13 -Enzym-Moleküle vorhanden sind, entsprechend einer 0,2 Protein: Liposomen-Verhältnis. Mit Hilfe einer Poisson-Verteilung, kann man weiter berechnen, die die Wahrscheinlichkeit, ein Enzym-Molekül (17 %) zu finden pro Liposomen ist zehnmal höher als die Wahrscheinlichkeit, mehr als ein Molekül (1,7 %) zu finden. Genauere Berechnungen können erfolgen, wenn die Verluste von Enzym und Lipiden während der Rekonstitution von entsprechenden Assays bestimmt berücksichtigt werden. Letzteres kann aus einem Protein Assay und Messen FDLL Fluoreszenz von vorbereiteten Liposomen geschätzt werden.

Sobald das Protokoll ist eingerichtet und einziges Enzym Spuren aufgenommen, weitere Änderungen der Methode ist abhängig von dem Ziel machbar. Man denkt über ein Enzym-Hemmer zusätzlich oder Einführung einer Ionophore in das System. Darauf sollte geachtet werden, um sicherzustellen, dass die Zugabe von Lösungsmittel benutzt, um Ionophore vorzubereiten oder Inhibitor Lager haben keinen Einfluss auf den Zustand von SAM oder Durchlässigkeit der Liposomen.

Die Technik, wie hier beschrieben beschränkt sich auf eine bestimmte Gruppe von Enzymen, die Membran Proton Transporter und Quinone konvertieren sind. Die Ausrüstung und experimentellen Bedingungen waren wie hier verwendet für die enzymatische Aktivität der Cytochrom Bo3optimiert. Hier ist die zeitliche Auflösung ca. 2-3 Sekunden, bestimmt die Belichtungszeit und den Zeitaufwand für den Revolver, Filter zu ändern. Die Dauer des Experiments wird begrenzt durch Immunofluoreszenz Fluoreszenzfarbstoff und somit von der Lichtintensität. Wir haben bisher durchschnittliche Protonen Translokation Rate von Cytochrom Bo3 73 ± 2,2 Protonen/s mit dieser Technik zu sein, obwohl die Aktivitäten bis zu 20 Protonen/s entdeckt wurden gefunden. Um diese Techniken für Enzyme mit entweder mehr oder weniger Aktivität zu verwenden, müssen Erwerb Bildparameter angepasst werden (zB., leichte Intensität, Belichtungszeit und Dauer des Experiments). In der Zukunft kann diese Methode verlängert werden gegenüber anderen Elektronentransport Proton Pumpen Enzyme, z. B. mitochondrialen Komplex fahren ich. Andere Enzyme benötigen unterschiedliche Rekonstitution Protokolle, und dazu bedarf es für jede andere Transporter optimiert werden. Protonenpumpen, die nicht Quinone Umwandlung von Enzymen kann auch studiert, z.B. ATP-driven29, obwohl in diesem Fall nicht die Protonen-Translokation elektrochemisch ausgelöst werden, sondern zusätzlich ein Initiator (z. B. ATP) erforderlich ist. Im letzteren Fall gibt es keine Notwendigkeit, ein Gold-modifizierte Deckglas zu verwenden. Darüber hinaus unter der Voraussetzung, dass ein geeigneter Membran undurchlässig und Ionen-sensitiven Fluoreszenzfarbstoff verwendet wird, kann diese Methode zu anderen Ionischen Pumpen, z. B. Natrium und Kalium erweitert werden.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Acknowledgments

Die Autoren erkennen die BBSRC (BB/P005454/1) für die finanzielle Unterstützung. NH wurde durch VILLUM Foundation Young Investigator Programm finanziert.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
6-Mercapto-1-hexanol (6MH) Sigma 451088 97%
8-hydroxypyrene-1,3,6-trisulphonic acid (HPTS) BioChemika 56360
Aluminium holder (Electrochemical cell) Custom-made 30x30x7 mm; inner diameter: 26 mm; hole diameter: 15 mm
Auxiliary electrode platinum wire
Chloroform VWR Chemicals 83627
E.coli polar lipids Avanti 100600C 25 mg/mL in chloroform
Epoxy EPO-TEK 301-2FL low fluorescence epoxy
Fiji (ImageJ 1.52d) Required plugins: StackReg and TurboReg (http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg/)
Filter cube ("ATTO633") Chroma Technology Corporation Ex: 620/60 nm; DM: 660 nm; Em: 700/75 nm
Filter cube ("HPTS1") Chroma Technology Corporation Ex: 470/20 nm; DM: 500 nm; Em: 535/48 nm
Filter cube ("HPTS2") Chroma Technology Corporation Ex: 410/300 nm; DM: 500 nm; Em: 535/48 nm
Filter cube ("Texas Red") Chroma Technology Corporation Ex: 560/55 nm; DM: 595 nm; Em: 645/75 nm
Fluorescent dye-labelled lipids (FDLL) ThermoFisher Scientific T1395MP TexasRed-DHPC was used in this work (λexc 595 nm; λem 615 nm)
Fluorescent dye-labelled lipids (FDLL) (alternative) ATTO-TEC AD 633-161 ATTO633-DOPE can be used as alternative (λexc 630 nm; λem 651 nm)
Gel filtration column GE Healthcare 28-9893-33 HiLoad 16/600 Superdex 75 pg, for additional protein purification
Glass coverslips VWR International 631-0172 No 1.5
Glass syringe Hamilton 1725 RNR 250 µL
Glass vials Scientific Glass Laboratories Ltd T101/V1 1.75 mL capacity
Gold GoodFellow 99.99%
Gramacidin Sigma G5002
Mercury sulfate reference electrode Radiometer (Hash) E21M012
Microcentrifuge Eppendorf Minispin NL040
Microscope Nikon Eclipse Ti
Microscope Camera Andor Zyla 5.5 sCMOS
Microscope Lamp Nikon Intensilight C-HGFI
NIS-Elements AR 5.0.2 Nikon Microscope acquisition software
n-Octyl β-D-glucopyranoside Melford Laboratories B2007
Nova 1.10 Metrohm Potentiostat control software
Objective Nikon Plan Apo λ 60x/1.4 oil
OriginPro 2017 OriginLab Plotting software
O-ring (Electrochemical cell) Orinoko Inner diameter: 16 mm; cross section: 1.5 mm
Plastic tubes Eppendorf 3810X 1.5 mL
Polystyrene microbeads Bio-RAD 152-3920 Biobeads, 20-50 mesh
Potentiostat Metrohm Autolab PGSTAT 128N
Potentiostat CH Instruments CHI604C
Scripting software Matlab R2017a Required toolboxes: 'Image Processing Toolbox', 'Parallel Computing Toolbox', 'Curve Fitting Toolbox', 'System Identification Toolbox', 'Optimization Toolbox'
Silicon wafers IDB Technologies LTD Si-C2 (N<100>P) Ø 25 mm, 525 um thick
Teflon cell (Electrochemical cell) Custom-made Outer diameter: 26 mm; inner diameter: 13.5 mm
Temple-Stripped Ultra-Flat Gold Surfaces Platypus Technologies AU.1000.SWTSG Alternative ready-to-use ultra-flat gold surfaces (Thickness below 100 nm on demand)
Thin micropipette tips Sarstedt 70.1190.100 or similar gelloader tips 200 µL
Ubiquinone-10 Sigma C-9538
Ultracentrifuge Beckman-Coulter L-80XP with Ti 45 rotor
Ultrasonic bath Fisher Scientific FB15063

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References

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Einzelne Liposomen Messungen für das Studium der Protonen-Pumpen Membran Enzyme mit Elektrochemie und Fluoreszenz-Mikroskopie
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Mazurenko, I., Hatzakis, N. S., Jeuken, L. J. C. Single Liposome Measurements for the Study of Proton-Pumping Membrane Enzymes Using Electrochemistry and Fluorescent Microscopy. J. Vis. Exp. (144), e58896, doi:10.3791/58896 (2019).

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