Summary
在这里, 我们提出了一个方案, 研究质子在单个脂质体脂质膜上的分子转移机制, 以细胞色素b3 为例。结合电化学和荧光显微镜, 可以单独检测和分析含有单一或多种酶的单囊腔内的 ph 值变化。
Abstract
电子转移链的质子泵送酶将氧化还原反应与质子在膜上的移位结合在一起, 形成用于 atp 生产的质子动力。膜蛋白的两亲性需要特别注意它们的处理, 在研究质子转移等膜转运过程时, 重组到天然脂质环境是不可或缺的。在这里, 我们详细介绍了一种方法, 已被用于研究细胞色素博3的膜氧化还原酶的质子泵送机制 , 并以大肠杆菌的细胞色素 b3 为例。电化学和荧光显微镜的结合用于控制奎宁池的氧化还原状态, 并监测腔内的 ph 值变化。由于荧光显微镜的空间分辨率, 可以同时测量数百种脂质体, 而酶含量可以缩小为单个酶或每个脂质体的转运体。相应的单酶分析可以揭示酶功能动力学中的模式, 否则可能会被整个群体的行为所隐藏。我们包括用于自动图像分析的脚本的描述。
Introduction
有关酶机制和动力学的信息通常是在集合或宏观水平上获得的, 其中酶种群在数千到数百万个分子中, 其中的测量值代表一个统计平均值。然而, 众所周知, 复杂的大分子, 如酶, 可能表现出异质性, 在他们的行为和分子机制观察到的合奏水平不一定是有效的每一个分子。这种在单个分子尺度上的偏差已经通过对单一酶的研究得到了广泛的证实, 在过去 20年中出现了各种方法1。值得注意的是, 荧光检测的单个酶活性已被用来调查酶活性2,3的异质性或发现所谓的记忆效应 (高酶活性的时期, 成功的低时期活动, 反之亦然)4,5。
许多单一的酶研究要求酶固定在表面或空间固定在另一种方式, 以保持足够长的时间在视野中进行连续观测。酶封装到脂质体已被证明能够使酶固定化, 同时防止任何负面影响, 由于表面酶或蛋白质相互作用6,7。此外, 脂质体提供了一个独特的可能性, 研究单膜蛋白在其天然脂质双层环境8,9,10.
一类膜蛋白, 转运体, 在细胞膜上运动物质的定向移位, 这种行为只有在蛋白质重组成脂质双层 (如脂质体)时才能被研究 11, 12,13。例如, 原核和真核电子转运链的几种酶所表现出的质子移位, 通过产生用于 atp 合成的质子动力, 在细胞呼吸中起着重要作用。在这种情况下, 质子泵送活动与电子转移耦合, 尽管这一过程的详细机制往往仍然难以捉摸。
最近, 我们证明了将荧光检测与电化学结合起来研究大肠杆菌末端泛醇氧化酶的质子泵作用的可能性 (细胞色素 b3)重组在脂质体14。这是通过将一种 ph 敏感的膜不透性荧光染料封装到由 e 制备的脂质体腔中来实现的.大肠杆菌极性脂质 (图 1a)。对蛋白质量进行了优化, 使大多数脂质体要么没有或只含有一个重组酶分子 (根据泊松分布)。在脂质体和溶液中的 (环境) 氧中加入泛喹酮, 提供了细胞色素 b3 的两个底物。然后, 脂质体被稀疏地吸附在半透明的超光滑金电极上, 上面覆盖着一个自组装的 6-硫代己醇单层。最后, 电极安装在一个简单的光谱电化学电池的底部 (图 1b)。对奎宁池氧化还原状态的电化学控制允许人们在任何时候灵活触发或停止酶反应, 而 ph 敏感染料则用于监测脂质体腔内的 ph 值变化, 其原因是质子通过酶。利用第二种脂质结合荧光染料的荧光强度, 可以确定单个脂质体的大小和体积, 从而定量酶质子的抽运活性。使用这种技术, 我们发现细胞色素 b3 分子能够 进入自发泄漏状态, 迅速耗散质子的动力。本文的目的是详细介绍单脂质体测量技术。
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Protocol
1. 利皮/uq-10/fdll 混合物的制备
注: 用于脂质体制备的大肠杆菌脂质应在重建。
- 使用玻璃注射器, 将来自大肠杆菌 (25 mg/ml) 的脂质极性提取物的氯仿库存200μl 转移到玻璃瓶中, 制成5毫克的脂肪。
- 在脂类中加入50μml 泛素-10 (uq-10; 氯仿), 使 uq-10 的最终比例为 1:100 (1% ww)。
- 在脂肪/uq-10 混合物中加入波长荧光染色脂质 (fdll) 的 20μl (0.4% w w)。
- 通过短涡流使氯仿溶液同质化, 并在温和的氮气或氩流下蒸发大部分氯仿。在真空下进一步蒸发至少 1小时, 完全去除氯仿的痕迹。
注: 脂质脂肪可以在-20°c 的惰性气氛下储存数月。
2. 细胞色素的重建3
注: 对于从大肠杆菌中纯化细胞色素b3 , 请遵循 rumbley等人的规程。15为确保自交折叠酶样品的高纯度, 在 rumbley 等人描述的亲和力纯化步骤后添加大小排除色谱.15
- 加入312μμl 的 40 mm mops-koh2 k 2 so 4, ph7.4, 加入一个名利克/uq-101/fdll 干混物 (5 毫克, 步骤 1.4), 与涡流混合, 直到脂膜完全重新悬浮, 然后在超声波浴中进行2分钟的治疗。
- 加入125μl 的 25 mm 8-羟基烯-1, 3, 6-三硫基酸 (hpts), 这是一种 ph 敏感的荧光染料, 需要封装在脂质体内。
- 加入 250 mm 正辛 tyβ-d-葡聚糖表面活性剂 137.5μl, 在超声波水浴中混合 10分钟, 以确保所有脂类溶解到表面活性剂胶束中。将分散体转移到 1.5 ml 塑料管中。
注: 与表面活性剂增溶后, 脂质的多云悬浮液应变得透明。 - 添加所需数量的细胞色素b3 (见下面的说明), 并添加超纯水, 使总体积为 50μl (细胞色素 b3 溶液加 水)。在4°c 下, 在滚子搅拌机上孵化10分钟。
注: 单酶条件的典型含量为 0.1-0.2% (蛋白质对脂质,即5-10μg 蛋白质), 但如果目标是观察电化学活性, 则可增加至 1-2% (50-100 微克蛋白质) (见下文)。作为一种负对照, 可以制备没有细胞色素 b3的 脂质体。 - 将 2x 50 毫克和2x100 毫克的聚苯乙烯微珠称量四个 1.5 ml 管盖, 并用石蜡膜关闭, 以防止干燥。
注: 使用前, 聚苯乙烯微珠应按照制造商的手册用甲醇、水清洗并储存在水中。
注: 如果使用水/微珠混合物, 聚苯乙烯微珠可以方便地转移到瓶盖上, 使用的微移液器具有宽尖端。然后, 可以使用薄尖端的微移液器从微珠中取出水。 - 将 1,50 毫克聚苯乙烯微珠添加到重组混合物 (步骤 2.4) 中, 将带有聚苯乙烯微珠的瓶盖放在带有分散的 1.5 ml-塑料管上, 并进行短暂的旋转几秒钟。在4°c 的聚苯乙烯微珠辊式搅拌机上进行培养, 以吸附表面活性剂30分钟。
- 重复添加聚苯乙烯微珠和孵育, 如下所示: 添加50 毫克微珠,孵育 60分钟;在60分钟的孵育过程中加入100 毫克的微珠;在120分钟的孵育中加入100 毫克的微珠。
注: 在步骤2.6 中, 当蛋白质脂质体形成时, 固定微珠上方的溶液会变成半透明。
- 重复添加聚苯乙烯微珠和孵育, 如下所示: 添加50 毫克微珠,孵育 60分钟;在60分钟的孵育过程中加入100 毫克的微珠;在120分钟的孵育中加入100 毫克的微珠。
- 使用薄尖端的微移液器将蛋白脂体溶液与聚苯乙烯微珠分离。稀释 20 mm mops-koh/2 so 4 的 90 ml 中的分散体, ph 7.4 (mops 缓冲液),并在 ti45 超离心管中转移。
- 超离心器使用 125, 000 x g (在 r 最大值) 的45型钛转子进行分散 1小时, 以颗粒蛋白脂质体。
注: 可以使用较小的离心管, 尽管在大缓冲量中的稀释有助于降低在最终悬浮液中的非封装 hpts 的浓度。 - 丢弃上清液, 用 20 mm mops-kohmaw. 30 mmk 2so 4, ph 7.4 缓冲液 (不重新悬浮颗粒) 冲洗颗粒。丢弃漂洗缓冲液后, 用薄尖头微移液器来回移液, 在500μl 的 mops 缓冲液中重新悬浮蛋白质脂质体。然后转移到 1.5 ml 塑料管。
- 以 12, 000 x 克的速度离心悬浮液 5分钟, 以去除碎屑。将上清液 (重组后的蛋白质脂质体) 转移到一个新的小瓶中。
- 将重组后的蛋白脂质体分散体储存在4°c 过夜, 并在2天内使用。
3. 半透明金电极的制备
注: 光滑的金表面是通过一个模板剥离方法获得 30 nm 厚的层99.99 的黄金从原子光滑的硅片。金层的小厚度是重要的, 因为它必须是半透明的, 以允许荧光观察。黄金蒸发的细节 (物理气相沉积, pvd) 可以在其他地方找到 16, 只有剥落在这里。或者, 超光滑的黄金芯片可以在其他地方购买 (见材料表)。
- 使用双组分低荧光环氧树脂将高达9个玻璃盖滑块 (0.17 mm 厚) 粘附到蒸发的金表面上。将胶水在80°c 下固化4小时。
- 就在用自组装单层 (步骤 4) 进行修改之前, 用刀片将玻璃盖从硅片上拆下。由于盖板的薄, 在分离盖板时要小心, 不要使玻璃滑块裂开或破裂。
4. 用自组装单层 (sam) 对金表面进行改性
- 制备 1 mL 6-氨基己醇 (6mh) 的水溶液5毫升。
- 浸入新分离的镀金盖板 (步骤 3.1) 进入6mh 溶液, 并在 20–25°c (gt;16 h) 下过夜离开, 形成 sam。
注: 硫醇溶液有难闻的气味, 所以在孵化镀金盖滑时, 应使用封闭的容器。 - 第二天, 从6mh 溶液中取出镀金盖板, 用清水或甲醇进行短暂清洗, 然后使用异丙醇。在温和的气流下干燥。
5. 蛋白脂质体活性的电化学检测
注: 酶的电化学活性首先在紧密包装的脂质体层 (步骤 5) 上进行验证, 在单囊泡实验中使用较低的囊泡覆盖物来测量脂质体腔中的 ph 值变化 (第6步)。
- 将镀金盖板滑块组装在光谱电化学电池中 (参见图 1)。在橡胶 o 形圈定义的区域外, 用扁线与黄金接触。
- 加入2毫升的电解质缓冲液, 并将参考电极和辅助电极放置在电池中。
注: 如讨论部分进一步讨论, 在电化学过程中, 最好使用不含氯化物的参考电极, 以防止 au (i) cl 的形成。在这里, 一个 hg/hg2so4 (坐着)。使用k2so-4) 参考电极, 并给出电位与标准氢电极 (she) 使用 0.6 58 v 与 she 的 Hg/Hg. hg. his2so 4 (坐.k2so4)。 - 在开放细胞电位 (ocp) 上运行电化学阻抗谱 (0.1 hz–100 khz), 以评估 sam 的质量。将阻抗值转换为导纳, 除以 2, 以绘制一个柯尔-科尔图, 其中是频率 (有关转换和解释阻抗的详细信息, 请参见以下参考资料16、17、18光谱)。
注: 6mh 的紧凑型和致密 sam 应给出接近半圆的 cole-col 图,并给出 2.5-3.0μfcm 2 范围内的电容值 (图 2a)。如果获得与半圆形状或超出范围的电容值的明显偏差, 请更换电极。 - 运行空白循环伏安图 (cv), 扫描速率为100和 10 mv, 潜在区域为 0.3–0.8 v。典型的 cv 显示在 (图 2b, 虚线) 上。
注: 这应该证明几乎纯电容行为和没有明显的法拉第电流, 即使在环境氧气条件下, 在这里使用。 - 在电化学细胞中加入蛋白质脂质体 (0.5 mgml 最终脂质浓度, 细胞色素b3与脂质的 1-2% (w/w) 之比), 并与移液器稍微混合。等待, 直到蛋白质脂质体在电极表面的吸附完成 (在室温下 30-60)。
注: 在蛋白质脂质体吸附过程中, 可以运行 10 mv 的循环伏安图 (cv)。当连续的 cv 停止变化时, 吸附就完成了。有关简历技术的信息可在以下教科书中找到。19,20 - 通过至少10次更换缓冲液来清洗电池, 但避免使电极表面完全干燥。
- 在 ocp 上运行电化学阻抗谱 (图 2a, 蓝线), 以确认金电极上的 sam 保持不变, 扫描速率为10和 100 mv 的 cv 可观察细胞色素催化泛醇氧化 (和氧还原)博3在电化学奎宁的起始电位减少约 0 v 与 she) (图 2b)。
6. 荧光显微镜检测酶质子泵的
- 按照步骤5中的步骤修改金电极, 但与步骤 5.5 (即5μgml) 相比, 使用的蛋白质脂质体少100x。对于单酶研究, 将细胞色素b3与脂质的比率降低到 0.1-0.2% (w/w)。
注: 脂质体会稀疏地吸附在电极表面, 通过荧光显微镜进行单囊监测。在这些单酶条件下, 固定在电极表面的酶量不足以观察催化电流。 - 将电化学电池放在倒置荧光显微镜的油目标 (60x) 上, 并滴浸入油。使用适当的滤光片进行 fdll 荧光, 聚焦在电极表面。单个脂质体应在显微镜/目标的衍射极限上显示为亮点。取 fdll 荧光的图像。
- 切换到显微镜上的 hpts 荧光滤光片集, 以验证 hpts 荧光是否清晰可见, 并可与背景区分开来 (在选定的曝光时间, 请参见步骤 6.4)。如果不是这样, 增加光强。
- 通过交替使用两个 hpts 过滤器集 (菜单应用程序), 对显微镜软件进行定时图像采集编程已确定运行 nd采集)。至少设置图像获取之间的延迟。在这个实验中, 使用1秒的曝光和0.3秒的延迟 (由于炮塔运动)。
注: 这两个通道的荧光强度之间的比率将在每个时间点转换为脂质体内的 ph 值。采集的持续时间可根据预期的 ph 变化率而变化;本文中使用5分钟。 - 调整电位器的设置, 以改变图像采集过程中的电位。例如, 在本实验中, 使用以下顺序: 0–60秒: 不应用电位 (即ocp);60–180秒:-0.2 v (与 she);18–300秒: 0.4 v (vs she)。在这种情况下, 只有在第二阶段 (-0.2 v 与 she) 中的应用潜力足以有效地减少奎宁池。
- 通过手动同时启动这两个测量, 同时运行定时图像采集 (显微镜) 和电位序列 (电位器)。
注: 通过将显微镜阶段移动到表面的不同区域, 可以在同一电极上重复多次实验。采集之间的延迟应至少为 5-10, 以确保表面脂质体的 ph 值完全平衡。不同的持续时间和潜在模式可根据需要应用, 但成像时间因 hpts 在采集过程中的光漂白而受到限制。
7. 荧光图像分析
注: 典型的实验为两个通道中的每个通道生成一组具有时间步长 (例如 2.6 s) 的图像,即(持续时间 * 2/2.6) 图像。在单个酶实验中记录的这种图像集的一个例子可以通过研究数据利兹存储库21访问。图像处理包括使用斐济 (imagej) 和高级数学分析编程语言软件 (以下简称脚本软件, 详见材料表) 的几个步骤.
- 使用斐济来分隔延时文件, 对齐图像, 并将其另存为单独的通道和时间范围。
- 使用斐济境内提供的 bi态导入程序的打开时间间隔文件 (宏命令: 运行 ("bio-for光证进口商")。
- 使用插件 stackreg 将每个帧对齐到第一个帧, 以考虑在采集过程中可能发生的阶段移动或热漂移 (宏命令: 运行 ("stackreg"、"转换 = 翻译")。
- 将每个通道的单独未压缩图像文件和每个时间步骤以 tiff 格式保存到一个文件夹中。
- 从延时文件元数据中提取每个帧的确切时间戳, 并将它们另存为与图像相同的文件夹中的 csv 文件。或者, 使用采集软件提取时间戳, 并使用电子表格软件手动保存到 csv 文件中。
注: 包含图像和时间戳的文件夹现在已准备好由脚本软件进行分析。7.1.1 的步骤。-7.1.4。可以使用斐济脚本 (提供了用 python 编写的用于批量处理延时文件的脚本, 使用 "ctrl-shift-n" (在 windows 中), 然后使用文件打开以加载脚本)。
- 使用脚本软件对图像进行自动化处理。将提供的代码加载到软件, 然后单击 "运行结束"。出现提示时, 选择包含步骤7.1 中的图像的文件夹。
注: 分析脚本作为 mlx 格式的实时脚本提供, 并带有大量注释, 用于识别单个脂质体, 使其适合 2D-Gaussian siss 函数, 对其进行筛选, 并在每个时间点量化 ph 值。脚本会自动执行以下子步骤。- 将单个实验的所有时间帧图像加载到内存中。
- 平均单个通道的所有图像 (选择荧光强度最高的通道), 并使用平均图像来标识可能对应于单个脂质体的所有最大值。
- 将平均图像上标识的最大值拟合到 2d-高斯函数, 并保存每个脂质体的结果拟合参数 (有关拟合脂质体的示例, 请参见图 4 a )。
- 根据预期的单个脂质体标准 (如大小、循环和强度) 筛选最大值。拒绝由于噪声信号低、与脂肪体密切相关或与图像边缘过于接近而安装不当的脂质体。
- 从外部文件加载时间戳, 并将每个过滤后的脂质体分别拟合到每个时间帧图像上的 2d-高斯函数。
注: 使用并行编程和多核 cpu 可以显著提高此阶段的计算速度。 - 根据步骤中7.2.4 的类似标准再次筛选脂质体, 但适用于每个时间范围。
- 在每个时间步长上, 将脂质体的荧光强度比定义为在两个通道上由拟合的2d-高斯函数所包围的体积比。根据两个 hpts 通道确定的强度之比和校准曲线 (步骤 8) 计算 ph 值。绘制脂肪体的 ph 时间曲线, 并观察其在应用电位时的 ph 值变化。
8. 执行 hpts 荧光的校准曲线
注: 要将 hpts 荧光比转换为脑内 ph 值, 必须首先建立一个校准曲线, 该曲线将考虑到特定的实验条件, 如黄金透射率、过滤器质量等。此步骤只需执行一次或两次, 只要设置和测量参数在步骤6中保持不变, 就可以使用校准数据。
- 准备一个电极与稀疏吸附脂质体 (没有细胞色素 b3 如步骤 5 和6.1 中所述)。
- 在乙醇中加入 2μl 0.1 mgml gramicidin 溶液, 加入2毫升的缓冲液, 形成浓度 100 ng/ml。
- 捕获两个 hpts 通道的两个荧光图像。
- 通过添加 1 m hcl 或 1 m h2so4的小等价物来改变细胞的 ph 值。使用标准 ph 计测量缓冲液的 ph 值, 并捕获两个 hpts 通道的两个荧光图像。
- 对 ph 值范围为6至 9, 重复步骤8.4。
- 利用7.2 的算法, 拟合、筛选和计算各脂质体在每个 ph 值下的平均 hpts 荧光比。以所有脂质体的 hpts 比率平均值为例。
- 将生成的 ph 比率依赖于以下公式:
, 其中pka、 ra 和rb是拟合参数。 - 使用pka、 ra 和rb 在7.2.7 中转换单个脂质体的 hpts 比率。到 ph 值。
, 其中pka、 ra 和rb是拟合参数。Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
在每次电化学阻抗谱实验之前, 对 sam 为6mh 的镀金盖板滑移 (电极) 的质量进行了检验。图 2a显示了在吸附脂质体前后使用电化学阻抗光谱测量的具有代表性的 cole-col 图。如果 sam 的质量是足够的, 阻抗光谱应该证明一个几乎纯粹的电容行为, 导致一个半圆的科尔-科尔图。cole-cole 图形中的半圆直径等于电极表面的双层电容, 该电容应在 2.5-3.0μfcm-2范围内。请注意, 在脂质体吸附时, 电容不应发生显著变化, 但在低脂质体的吸附时可能会观察到电容的轻微增加 (脂质体覆盖率较高,图 2 a, 底部) 或阻抗的轻微变化频率 (低脂质体覆盖物,图 2 a, 上图)。
电化学可用于测试蛋白质脂质体中细胞色素 bo3 的催化活性, 用循环伏安法测量的催化电流反映了泛醇-氧氧化还原酶的活性。然而, 只有在大量吸附的蛋白质脂质体下才能检测到大量的催化电流, 需要在黄金改性盖滑中紧密包装的蛋白质脂质体层。图 2b显示了脂质体吸附前后电极具有代表性的循环伏安图 (cv), 脂质体覆盖率较低或较高。由于裸金电极的氧还原被 sam 阻断, 因此在空白 cv 上没有观察到法拉达电流。当表面饱和的脂质体具有高细胞色素bo3 含量 (在这种情况下为 1.3% (w/w)) 时, 由于氧还原而产生的明显催化波被观察到, 其发病潜力为 0 v,即泛喹酮的潜在值(图 2b, 蓝线)。泛喹酮池既是酶的天然底物, 也是电子介质, 将电子从酶转移到电极表面。我们注意到, 在高脂质体覆盖下, 没有可能通过显微镜区分单个囊泡, 单脂质体研究需要较低的覆盖。在脂质体覆盖率低 (但蛋白质与脂质比率高) 时, 催化电流显著降低, 与背景难以区分 (图 2b, 红线)。请注意, 在单个酶条件下 (低蛋白质与脂质的比率), 催化电流更低, 无法可靠地测量。
图 3显示了在三种不同覆盖范围内吸附在电极上的脂质体的荧光图像。所有图像都是在相同的光线和曝光条件下拍摄的, 其亮度得到了同等的调整, 以便进行直接比较。在图像中可以看到含染料脂质体的亮点。图像的中心部分被光浸出了几分钟, 以揭示背景荧光水平 (我们注意到, fdll 是相对光稳定的, 在图 3中不是完全光光的)。两个 hpts 通道上的图像是可叠加的, 其中两个通道之间的比率 (410/535 和 470/535) 对应于本实验中使用的 ph 7.4。fdll 通道可以看到更多的脂质体, 这表明存在没有封装 hpts 的脂质体。hpts 和 fdll 通道之间的差异在较高的覆盖范围下更为明显, 可能是因为在高脂质体覆盖范围下, 脂质体更有可能在表面破裂或融合。
图像分析需要使用 imagej, 插件 stackreg 对齐帧 (针对第一帧)。在大多数情况下, 对齐是必不可少的, 因为样品的轻微热漂移通常发生在实验的时间刻度内, 从而改变脂质体坐标。所有进一步的分析都是使用脚本软件代码执行的。此代码执行自动脂质体识别。由于脂质体的大小低于 abbe 衍射极限, 它们的荧光被视为比实际脂质体直径大得多的点扩散函数 (图 4 a)。该代码将两个通道上每个囊泡的荧光强度与 2d-高斯函数 (图 4a) 相匹配, 并计算它们的体积强度比, 该比率可通过校准曲线转换为 ph 值。通过在所有时间范围内执行这些操作, 在实验的时间刻度内, 每个囊泡内都能获得 ph 值 (电影 1)。图 4b显示了当细胞色素 b3 含量为1.3% 时, 单个图像中所有囊泡ph 值变化的中间值。当应用-0.1 至-0.3 v 之间的电位时, ph 值 (质子泵送) 的增加是显而易见的, 但对于 0 v 则不可见, 因为后者不足以减少五值池。当细胞色素bo3 含量低很多 (蛋白质与脂质比率为 0.1%,图 4c) 时, 中位曲线与空脂质体的中位曲线几乎无法区分 (图 4C)。当考虑随机脂质体的个别 ph 特性时, 差异变得很明显 (图5、6和 7)。虽然没有细胞色素b3 的脂质体在噪声方面没有明显的 ph 值变化 (图 7), 但在应用活性物质的电位时, 脂质体的选择显示 ph 值增加 (主要是) 或下降(图 6, 灰色地带). 脂质体之间 ph-轨迹的明显差异与低蛋白质与脂质比一致, 其中细胞色素b3 只 存在于脂质体活性的一小部分中。ph 值增加而不是减少的流行率是由有利于酶分子 "向外" 取向的重组方法 (约75%) 解释的。当细胞色素 b3 与脂质比较高时, 显示 ph 值变化的脂 质体比例会增加 (图 5)。还要注意的是, 一些脂质体停止质子泵送, 并进入质子耗散模式之前的潜在应用结束。我们将这种行为归因于进入 "泄漏状态" 的细胞色素 b3 分子, 这种泄漏状态允许质子回流到脂质体流腔 14.
对 ph 值痕迹的进一步分析, 包括其拟合和质子泵漏率的测定, 可以使用我们之前第14、22 出版的脚本进行, 并可从研究数据利兹存储库中获得23,24岁
图 1: 该方法的原理.(a) 单酶活性监测原理和 (b) 本工作中使用的实验装置方案, 用一个立方来证明细胞的内部部分。请点击这里查看此图的较大版本.
图 2: 脂质体的电化学反应.(a) 在脂质体 (1.3% w/w？细胞色素 bo 3) 之前和之后在 ocp (0.22 v vs she; 黑色平方线) 测量的 cole-col 地块从浓度为 5μgml (红圆线) 和 500μg/ml (蓝圆线) 的溶液中吸附.(b) 在约翰·萨姆 (黑色虚线) 的 100 mv/(左面板) 和 10 mv (右面板) 的循环伏安图. 在浓度为 5μgml (红线) 和 500μgml (蓝线) 的溶液中吸附。请点击这里查看此图的较大版本.
图 3: 脂质体的荧光显微镜.不同表面覆盖物的脂质体荧光图像: 用 5μg/ml (顶行)、20μgml (中间行) 和 500μgml (下行) 的脂质体溶液孵育30分钟的表面。左柱对应于 470/535 nm 发射过滤装置 (1. 1 hpts 通道);中柱-410/535 nm (第2和hnts 通道);右列-560/645 nm (fdll 通道)。这些图像是以放大倍率 90x (60x 为客观和1.5倍的放大倍率由相机前的显微镜), 1 的曝光和类似的光强。刻度条对应于 50μm. 请点击这里查看这个数字的更大版本.
图 4: 脂质体鉴定和 ph 值变化.(a) 包含典型单一脂质体的部分荧光图像的三维视图。它的荧光强度被看作是一个点传播函数 (颜色表面), 适合于2d-高斯函数 (黑网)。(b-d) ph 值, 显示为在不同应用电位的单个图像区域 (通常为几百个) 内所有囊泡的中值。从 0-60, 不应用电位 (ocp)。应用了 60至180秒 (灰色地带) 不同的电位: 0 v (黑色)、-0.1 v (红色)、-0.2 v (绿色)、-0.3 v (蓝色)。180到300秒, 0.4 v vs。她被申请了细胞色素 b3与 脂质比率为 (b) 1.3%, (c) 0.1%, (d) 为0%。为清楚起见, 将对轨迹进行偏移。请点击这里查看此图的较大版本.
图 5: 含有1.3% 酶的脂质体的 ph 值痕迹.在一次实验中, 随机抽取72个单脂质体的 ph 值变化轨迹, 其中含有细胞色素b3 (1.3% w)。从 0-60, 不应用电位 (ocp);60秒之间 (灰色地带)-0.2 v vs。她;在180至300秒之间, 0.4 v vs。她被申请了请点击这里查看此图的较大版本.
图6:酶含量0.1% 的脂质体的 ph 值痕迹.在一次实验中测量和分析了72个单脂质体的 ph 变化轨迹, 随机选择, 含有细胞色素b3 (0.1% ww)。从 0-60, 不应用电位 (ocp);60秒之间 (灰色地带)-0.2 v vs。她;在180至300秒之间, 0.4 v vs。她被申请了请点击这里查看此图的较大版本.
图 7: 没有酶的脂质体的 ph 值痕迹.在一次实验中, 随机选择72个单脂质体的 ph 值变化轨迹, 不测量 和分析细胞色素 b3。从0-60 秒: 不应用电位 (ocp);60秒之间 (灰色地带)-0.2 v vs。她;在180至300秒之间, 0.4 v vs。她被申请了请点击这里查看此图的较大版本.
电影 1: 单个脂质体 ph 值变化的动画.(顶部面板)在300秒的实验中, 两个 hpts 通道上的脂质体荧光变化 (如相应区域的三维曲面图)。在 60至180秒 (底板) 之间应用了两个 hpts 通道与时间的体积强度比相对应的图图。还原电位应用区域为灰色阴影。请点击这里观看此视频。(右键单击下载.
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Discussion
该方法适用于研究呼吸膜蛋白的质子泵送, 这些蛋白质可以重组为脂质体, 并能与奎宁池交换电子。质子泵送活性可以在单酶水平上监测使用的 ph 敏感 (比例) 染料封装在脂质体腔 (图 1a)。
该方法依赖于泛喹酮 (或其他奎宁) 的能力, 纳入脂质双层, 交换电子与电极修改与 sam18。用 sam 修饰的金电极的性能非常具体。脂质体需要吸附在 sam 上, sam 需要足够薄, 以便能够快速进行电化学氧化, 并减少脂质体中的奎宁池。重要的是, 电极和脂质体之间的相互作用需要足够弱, 而不会损害脂质膜的完整性。此外, 根据实验系统的细节, 如果 sam 能防止黄金催化的副反应, 如氧还原, 则是可取的。最后, sam 需要在所使用的潜在窗口内保持稳定。使用采用6mh 的高质量 sam 修饰的超扁平金电极, 在细胞色素b3的情况下满足了这些要求。从原子扁平的硅片中剥离金电极可创建一个超光滑的金表面, 其接近理想的 sam, 阻抗谱显示了这一点。请注意, 我们在水中形成6mh 的 sam。我们以前报告了异丙醇16中6mh 的 sam, 但这些 sam 表现出更高的双层电容值和阻抗谱, 表明具有更低电阻的异构表面 (即更多缺陷)。此外, 当从水溶液中制备6mh 的 sam 时, 与乙醇/异丙醇溶液形成的 sam 相比, 背景氧还原 (由于黄金催化的氧还原) 较少。所有这些观察表明, 6mh 在水溶液中的 sam 质量较高, 缺陷较少。高质量 sam 也可以由烷烃链较长的硫醇化合物 (例如, 1-羟基-十二烷-硫醇) 形成, 但随着 sam 厚度的增加, 电子转移动力学变得较慢。
在 (光谱) 电化学过程中, 应避免在缓冲液中使用氯离子, 因为它们可能会在金表面高电位上进行化学作用, 从而可能降低 sam 质量。出于同样的原因, 应首选无氯参考电极。
另一个重要的一点是脂质体对质子的背景渗透性, 这应该是足够低的, 允许质子积累的结果, 由于酶质子的易位在实验的时间尺度上。确切的脂质组成可能会影响这种渗透性。在我们的工作中, 我们使用极性大肠杆菌脂提取物补充泛素10。质子渗透性已被证明在很大程度上依赖于脂肪酸链长度25, 尽管这在具有更复杂的脂质成分26的研究中与之相矛盾。有趣的是, 泛喹酮最近被证明可以增强膜的稳定性27。最后, 蛋白质重组过程中的残留洗涤剂会影响质子泄漏, 因此, 使用疏水聚苯乙烯微珠, 稀释后再离心和在表面吸附蛋白质脂质体后, 对电化学细胞进行彻底冲洗。如果怀疑, 脂质体渗透性可以通过跟踪管腔 ph 值变化 (通过 hpts) 来应对外部 ph 值跃迁28来验证.
单个酶测量需要单侧脂质体和较小的脂质体预计会显示更快或更高的 ph 值变化, 随着腔的体积的减少。为了实现这一目标, 聚苯乙烯微珠逐渐少量添加, 导致脂质体形成速度缓慢。在这种情况下, 在我们的案例14中, 均匀大小的小脂质体形成平均直径为70纳米, 多分散指数为 0.24.hpts 还吸附在聚苯乙烯微珠上, 降低了聚苯乙烯微珠吸附洗涤剂的能力。因此, 应添加多余的聚苯乙烯微珠, 以弥补其损失。观察到聚苯乙烯微珠的处理可使脂蛋白悬浮液中的 hpts 浓度降低约四分之一 (从 5 mm 减少到 3-4 mm)。然而, 脂质体腔内的实际 hpts 浓度可能较高, 因为脂质体是在聚苯乙烯微珠处理初期形成的。可以使用其他 ph 敏感染料, 而不是 hpts。然而, 重要的是染料是膜不透水和比例。后者避免了由于光漂白和不同数量的封装染料而产生的实验误差。
可以进行简单的计算, 以估计, 随机, 大多数非空脂质体是否包含一个酶分子。假设脂质体直径平均为70纳米, 脂质分子量为 750 da, 脂质面积为 0.65 nm2 , 使我们脂质体质量为 5.2 x10-17 g ,即每制剂 9.6x1013 脂质体 (5 毫克脂质)。在0.1% 的细胞色素 bo ( mw = 144 kda), 2x1013 酶分子存在, 对应于0.2 蛋白: 脂质体比率。使用泊松分布, 人们可以进一步计算找到一个酶分子的概率 (17%)每个脂质体比发现一个以上分子的概率高出十倍 (1.7%)。如果考虑到根据相应的检测确定的重组过程中酶和脂质的损失, 可以进行更精确的计算。后者可以通过蛋白质测定和测定制备的脂质体的 fdll 荧光来估计。
一旦建立了协议, 记录了单一的酶痕迹, 根据目的对方法进行进一步修改是可行的。人们可能会考虑在系统中加入或引入酶体。应注意验证用于制备电离体或抑制剂库存的溶剂的添加不会影响 sam 的状态或脂质体的渗透性。
这里所描述的技术仅限于一组特定的酶, 它们既是膜质子转运体, 也是喹诺酮。对这里使用的设备和实验条件进行了优化, 以适应细胞色素b3的酶活性。在这里, 时间分辨率为 2-3秒, 由曝光时间和炮塔更换过滤器所需的时间决定。实验时间受荧光染料光漂白的限制, 从而受到光强的限制。我们之前已经发现, 使用这种技术, 细胞色素 b3 的平均质子移位 率为73±2.2 质子, 虽然检测到活动低至20质子。要将这些技术用于活性或多或少的酶, 需要调整图像采集参数 (即光强、曝光时间和实验持续时间)。在未来, 该方法可以推广到其他电子传输驱动质子泵浦酶, 一个例子是线粒体复合物 i。其他酶可能需要不同的重组协议, 这需要针对每个不同的运输者进行优化。质子泵不是喹喹奎酮酶, 也可以进行研究,例如atp 驱动的29, 虽然在这种情况下质子移位不能通过电化学方式触发, 但需要添加引发剂 (例如 atp )。在后一种情况下, 没有必要使用黄金修改后的盖板单。此外, 只要使用合适的膜不透水和离子敏感荧光染料, 这种方法可以推广到其他离子泵,如钠和钾。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
提交人感谢 bbsrc (bbp 00545") 提供的财政支助。nh 由 vilum 基金会青年调查员方案资助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6-Mercapto-1-hexanol (6MH) | Sigma | 451088 | 97% |
| 8-hydroxypyrene-1,3,6-trisulphonic acid (HPTS) | BioChemika | 56360 | |
| Aluminium holder (Electrochemical cell) | Custom-made | 30x30x7 mm; inner diameter: 26 mm; hole diameter: 15 mm | |
| Auxiliary electrode | platinum wire | ||
| Chloroform | VWR Chemicals | 83627 | |
| E.coli polar lipids | Avanti | 100600C | 25 mg/mL in chloroform |
| Epoxy | EPO-TEK | 301-2FL | low fluorescence epoxy |
| Fiji (ImageJ 1.52d) | Required plugins: StackReg and TurboReg (http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg/) | ||
| Filter cube ("ATTO633") | Chroma Technology Corporation | Ex: 620/60 nm; DM: 660 nm; Em: 700/75 nm | |
| Filter cube ("HPTS1") | Chroma Technology Corporation | Ex: 470/20 nm; DM: 500 nm; Em: 535/48 nm | |
| Filter cube ("HPTS2") | Chroma Technology Corporation | Ex: 410/300 nm; DM: 500 nm; Em: 535/48 nm | |
| Filter cube ("Texas Red") | Chroma Technology Corporation | Ex: 560/55 nm; DM: 595 nm; Em: 645/75 nm | |
| Fluorescent dye-labelled lipids (FDLL) | ThermoFisher Scientific | T1395MP | TexasRed-DHPC was used in this work (λexc 595 nm; λem 615 nm) |
| Fluorescent dye-labelled lipids (FDLL) (alternative) | ATTO-TEC | AD 633-161 | ATTO633-DOPE can be used as alternative (λexc 630 nm; λem 651 nm) |
| Gel filtration column | GE Healthcare | 28-9893-33 | HiLoad 16/600 Superdex 75 pg, for additional protein purification |
| Glass coverslips | VWR International | 631-0172 | No 1.5 |
| Glass syringe | Hamilton | 1725 RNR | 250 µL |
| Glass vials | Scientific Glass Laboratories Ltd | T101/V1 | 1.75 mL capacity |
| Gold | GoodFellow | 99.99% | |
| Gramacidin | Sigma | G5002 | |
| Mercury sulfate reference electrode | Radiometer (Hash) | E21M012 | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | Minispin NL040 | |
| Microscope | Nikon | Eclipse Ti | |
| Microscope Camera | Andor | Zyla 5.5 sCMOS | |
| Microscope Lamp | Nikon | Intensilight C-HGFI | |
| NIS-Elements AR 5.0.2 | Nikon | Microscope acquisition software | |
| n-Octyl β-D-glucopyranoside | Melford Laboratories | B2007 | |
| Nova 1.10 | Metrohm | Potentiostat control software | |
| Objective | Nikon | Plan Apo λ 60x/1.4 oil | |
| OriginPro 2017 | OriginLab | Plotting software | |
| O-ring (Electrochemical cell) | Orinoko | Inner diameter: 16 mm; cross section: 1.5 mm | |
| Plastic tubes | Eppendorf | 3810X | 1.5 mL |
| Polystyrene microbeads | Bio-RAD | 152-3920 | Biobeads, 20-50 mesh |
| Potentiostat | Metrohm Autolab | PGSTAT 128N | |
| Potentiostat | CH Instruments | CHI604C | |
| Scripting software | Matlab | R2017a | Required toolboxes: 'Image Processing Toolbox', 'Parallel Computing Toolbox', 'Curve Fitting Toolbox', 'System Identification Toolbox', 'Optimization Toolbox' |
| Silicon wafers | IDB Technologies LTD | Si-C2 (N<100>P) | Ø 25 mm, 525 um thick |
| Teflon cell (Electrochemical cell) | Custom-made | Outer diameter: 26 mm; inner diameter: 13.5 mm | |
| Temple-Stripped Ultra-Flat Gold Surfaces | Platypus Technologies | AU.1000.SWTSG | Alternative ready-to-use ultra-flat gold surfaces (Thickness below 100 nm on demand) |
| Thin micropipette tips | Sarstedt | 70.1190.100 | or similar gelloader tips 200 µL |
| Ubiquinone-10 | Sigma | C-9538 | |
| Ultracentrifuge | Beckman-Coulter | L-80XP | with Ti 45 rotor |
| Ultrasonic bath | Fisher Scientific | FB15063 |
References
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