单个脂质体测量用于研究质子泵膜酶的电化学与荧光显微技术

摘要

本文以细胞色素 bo₃ 为例，介绍一种研究质子跨单个脂质体脂质膜转运分子机制的实验方案。通过结合电化学与荧光显微镜技术，可对含有单个或多个酶的单个囊泡腔内的pH变化进行独立检测与分析。

摘要

电子传递链中的质子泵酶将氧化还原反应与跨膜的质子转运相偶联，从而产生用于ATP合成的质子驱动力。由于膜蛋白具有两亲性，其操作需特别注意，而在研究质子转运等膜运输过程时，将膜蛋白重建到天然脂质环境中是不可或缺的。本文以大肠杆菌（Escherichia coli）的细胞色素 bo₃ 为例，详细介绍了一种用于研究膜结合氧化还原酶质子泵机制的方法。该方法结合电化学与荧光显微技术，用于调控醌池的氧化还原状态并监测腔内pH的变化。由于荧光显微镜具有空间分辨率，可同时测量数百个脂质体，且酶含量可低至每个脂质体仅含单个酶或转运蛋白。这种单酶分析能够揭示酶功能动态中的规律，而这些规律可能在群体行为中被掩盖。文中还包括用于自动化图像分析的脚本说明。

引言

有关酶作用机制和动力学的信息通常在系综或宏观尺度上获得，所研究的酶分子数量从数千到数百万不等，测量结果代表统计平均值。然而已知，酶等复杂的生物大分子在行为上可能表现出异质性，因此在系综水平上观察到的分子机制未必适用于每一个单独的酶分子。过去二十年中，随着多种新技术的发展，通过单分子酶学研究已广泛证实了单个分子水平上的此类偏差。¹值得注意的是，单个酶活性的荧光检测已被用于研究酶活性的异质性^2,3 或发现所谓的记忆效应（酶活性高的时期之后跟随酶活性低的时期） 反之亦然^4,5.

许多单酶研究要求将酶固定在表面或以其他方式实现空间固定，以便在视野中停留足够长时间，从而进行连续观察。将酶封装到脂质体中已被证明能够实现酶的固定，同时避免因酶与表面或蛋白质-蛋白质相互作用带来的不利影响^6,7。此外，脂质体提供了一种独特的机会，可在其天然的脂双层环境中研究单个膜蛋白^8,9

方案

1. 脂质/UQ-10/FDLL 混合物的制备

注意：在重组之前，用于制备脂质体的大肠杆菌（E. coli）脂质应分装，并与泛醌-10（酶底物）及长波长荧光染料标记的脂质（用于测定脂质体大小）充分混合。

1. 使用玻璃注射器将200 µL来自大肠杆菌（Escherichia coli）的氯仿储存液形式的极性脂质提取物（25 mg/mL）转移至玻璃小瓶中，制成每份5 mg的分装样品。
2. 向脂质中加入50 µL泛醌-10（UQ-10；溶于氯仿，1 mg/mL），使UQ-10与脂质的最终比例为1:100（质量比1%）。
3. 向脂质/UQ-10混合物中加入20 µL长波长荧光染料标记的脂质（FDLL，1 mg/mL，即0.4% w/w）。
4. 通过短暂涡旋混合氯仿溶液，然后在温和的氮气或氩气流下蒸发大部分氯仿。再于真空条件下继续蒸发至少1小时，彻底去除残留的氯仿。
   注意：脂质分装样品可在惰性气氛保护下于-20 °C保存数月。

2. 细胞色素 bo₃ 的重组

注意：用于细胞色素纯化的 bo₃ 从 E. coli，遵循 Rumbley 的实验....

结果

每次实验前，均需通过电化学阻抗谱检测经6MH自组装单分子膜（SAM）修饰的金膜盖玻片（电极）的质量。图2A展示了脂质体吸附前后测得的典型Cole-Cole图。若SAM质量良好，电化学阻抗谱应呈现近乎纯电容性的行为，表现为Cole-Cole图为半圆形。Cole-Cole图中半圆的直径对应电极表面双电层电容，其值应在2.5–3.0 µF/cm²范围内。需注意，脂质体吸附后电容不应发生显著变化，尽管在脂质体覆盖度较高时（图2A，底部）可能观察到电容轻微增加，或在低覆盖度时（图2A，顶部）在低频区域出现阻抗的轻微偏移。

电化学可用于检测细胞色素的催化活性 bo₃ 在蛋白脂质体中，通过循环伏安法测得的催化电流反映了泛醇-氧氧.......

讨论

所述方法适用于研究可重建入脂质体并能够与醌池进行电子交换的呼吸膜蛋白的质子泵功能。通过将pH敏感型（比率型）染料包裹在脂质体腔内，可在单酶水平上监测质子泵活性（图1A）。

该方法依赖于泛醌（或其他醌类）嵌入脂质双分子层后，能够与经自组装单分子膜（SAM）修饰的电极进行电子交换的能力。¹⁸金电极经自组装单分子层（SAM）修饰后具有非常特定的性质。脂质体需要能够吸附到SAM上，同时SAM必须足够薄，以实现脂质体中醌池的快速电化学氧化与还原。重要的是，电极与脂质体之间的相互作用必须足够弱，以免破坏脂质膜的完整性。此外，根据实验系统的具体情况，理想情况下SAM还应能抑制金催化引起的副反应，例如氧气还原反应。最后，SAM必须在所用的电势窗口内保持稳定。在细胞色素实验中，使用经高质量6MH自组装单分子层修饰的超平坦金电极可满足上述所有要求。 bo₃从原子级平整的硅晶圆上剥离金电极可获得超光滑的金表面，并形成接近理想的自组装单分子膜（SAM），这由阻.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
6-巯基-1-己醇（6MH）	Sigma	451088	97%
8-羟基芘-1,3,6-三磺酸（HPTS）	BioChemika	56360
铝制支架（电化学池）	定制		30x30x7 毫米；内径：26 毫米；孔径：15 毫米
辅助电极			铂丝
氯仿	VWR Chemicals	83627
大肠杆菌极性脂质	Avanti	100600C	25 mg/mL，溶于氯仿
环氧树脂	EPO-TEK	301-2FL	低荧光环氧树脂
Fiji（ImageJ 1.52d）			所需插件：StackReg 和 TurboReg（http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg/）
滤光片组（"ATTO633")	Chroma Technology Corporation		Ex: 620/60 nm；DM: 660 nm；Em: 700/75 nm
滤光片组（"HPTS1")	Chroma Technology Corporation		激发：470/20 纳米；二向色镜：500 纳米；发射：535/48 纳米
滤光片组（"HPTS2")	Chroma Technology Corporation		激发：410/300 纳米；二向色镜：500 纳米；发射：535/48 纳米
滤光片组（"德克萨斯红")	Chroma Technology Corporation		激发：560/55 nm；分光镜：595 nm；发射：645/75 nm
荧光染料标记的脂质（FDLL）	赛默飞世尔科技	T1395MP	本研究中使用了TexasRed-DHPC（λ激发波长 595 nm； λem 615 nm
荧光染料标记的脂质（FDLL）（替代方法）	ATTO-TEC	AD 633-161	ATTO633-DOPE 可作为替代品使用（λ激发波长 630 nm； λem 651 nm
凝胶过滤柱	GE Healthcare	28-9893-33	HiLoad 16/600 Superdex 75 pg，用于进一步蛋白质纯化
玻璃盖玻片	VWR International	631-0172	1.5号
玻璃注射器	Hamilton	1725 RNR	250 µL
玻璃瓶	科学玻璃实验室有限公司	T101/V1	1.75 mL 容量
金	GoodFellow		99.99%
Gramacidin	Sigma	G5002
硫酸汞参比电极	辐射计（Hash）	E21M012
微型离心机	Eppendorf	Minispin NL040
显微镜	尼康	Eclipse Ti
显微镜相机	Andor	Zyla 5.5 sCMOS
显微镜灯	尼康	Intensilight C-HGFI
NIS-Elements AR 5.0.2	尼康		显微镜图像采集软件
正辛基 β-D-吡喃葡萄糖苷	Melford Laboratories	B2007
Nova 1.10	Metrohm		恒电位仪控制软件
目标	尼康	Plan Apo λ 60x/1.4 油镜
OriginPro 2017	OriginLab		绘图软件
O形环（电化学池）	奥里诺科		内径：16 mm；横截面：1.5 mm
塑料管	Eppendorf	3810X	1.5 mL
聚苯乙烯微珠	伯乐（Bio-RAD）	152-3920	Biobeads，20-50目
恒电位仪	Metrohm Autolab	PGSTAT 128N
恒电位仪	CH Instruments	CHI604C
脚本编写软件	Matlab	R2017a	所需工具箱：“图像处理工具箱”、“并行计算工具箱”、“曲线拟合工具箱”、“系统辨识工具箱”、“优化工具箱”
硅片	IDB Technologies LTD	Si-C2 (N<100>P)	Ø 25 毫米，525 微米厚
特氟龙电化学池（电化学池）	定制		外径：26 mm；内径：13.5 mm
去膜超平整金表面	Platypus Technologies	AU.1000.SWTSG	替代的即用型超平整金表面（可根据需求提供厚度低于100 nm的版本）
细口径微量移液器吸头	Sarstedt	70.1190.100	或类似的凝胶上样枪头 200 µL
辅酶Q10	Sigma	C-9538
超速离心机	贝克曼库尔特	L-80XP	使用 Ti 45 转子
超声波清洗机	Fisher Scientific	FB15063