Summary
Här presenterar vi ett protokoll för att studera den molekylära mekanismen av proton flyttning över lipid membran av enda liposomer, med cytokrom bo3 som exempel. Att kombinera elektrokemi och fluorescensmikroskopi, pH-förändringar i lumen av enstaka blåsor, som innehåller enstaka eller flera enzym, kan identifieras och analyseras individuellt.
Abstract
Proton-pumpa enzymer av elektron överföra kedjor par redoxreaktioner till proton flyttning över membranet, skapa en proton-drivkraft som används för produktion av ATP. Membranproteiner amfifila kräver särskild uppmärksamhet åt deras hantering och beredning i naturliga lipid miljön är oumbärlig när man studerar processer för membran som proton translokation. Här, detalj vi en metod som har använts för utredning av proton-pumpning mekanismen av membran redox enzymer, tar cytokrom bo3 från Escherichia coli som ett exempel. En kombination av elektrokemi och fluorescence mikroskopi används för att kontrollera redox staten quinone pool och övervaka pH förändringar i lumen. På grund av den rumsliga upplösningen i fluorescerande mikroskopi, kan hundratals liposomer mätas samtidigt medan halten enzym kan skalas till en enda enzym eller transportören per Liposom. Respektive enda enzym analys kan avslöja mönster i enzymet funktionella dynamik som annars kan vara dolda av beteendet hos hela befolkningen. Vi inkluderar en beskrivning av ett skript för automatiserad bildanalys.
Introduction
Information om enzymet mekanismer och kinetik erhålls vanligtvis på ensemble eller macroscale nivå med enzym befolkning i tusentals till miljontals molekyler, där mätningar utgör ett statistiskt genomsnitt. Det är dock känt att komplexa makromolekyler som enzymer kan påvisa heterogenitet i sitt beteende och molekylära mekanismer som observerats på ensemble-nivå är inte nödvändigtvis giltiga för varje molekyl. Sådana avvikelser på individuell molekyl skalan har bekräftats i stor utsträckning genom studier av enstaka enzymer med en mängd metoder som växer fram under de senaste två decennierna1. Särskilt, har fluorescens identifiering av enskilda enzymaktivitet använts för att undersöka heterogenitet enzymer aktivitet2,3 eller upptäck den s.k. minneseffekt (perioder av hög enzymer aktivitet efterträddes av perioder av låg aktivitet och vice versa)4,5.
Många enda enzym studierna kräver att enzymer är orörlig på ytan eller rumsligt fast på ett annat sätt att förbli tillräckligt lång i synfältet för kontinuerlig observation. Enzymet inkapsling i liposomer har visat att enzymet immobilisering samtidigt förhindra negativa följder på grund ytan-enzym eller protein-protein interaktioner6,7. Liposomer erbjuder dessutom en unik möjlighet att studera enstaka membranproteiner i deras naturliga lipid lipidens miljö8,9,10.
En klass av membranproteiner, transportörer, utövar en riktad flyttning av ämnen över cellmembranet, ett beteende som kan endast studeras proteiner är rekonstituerade i lipid lipidmonolager (e.g., liposomer)11, 12,13. Till exempel spelar proton translokation, visades av flera enzymer av prokaryota och eukaryota elektrontransport kedjor, en viktig roll i cellandningen genom att skapa en proton-drivkraft som används för ATP syntes. I det här fallet är protonen pumpning aktivitet kopplat till elektronöverföring, även om detaljerade mekanismen av denna process ofta förblir svårfångade.
Nyligen har visat vi möjligheten att par fluorescerande upptäckt med elektrokemi att studera proton pumpning aktiviteten av enda enzymer av den terminal ubiquinol oxidasen av Escherichia coli (cytokrom bo3) Ombildade i liposomer14. Detta uppnåddes genom inkapsling av pH-känsliga membran-impermeable fluorescerande färgämne in i lumen av liposomer beredd från E. coli polära lipider (figur 1A). Mängden protein var optimerad så att de flesta liposomer innehöll antingen ingen eller endast en färdigberedd enzym molekyl (enligt poissonfördelning). De två substratesna för cytokrom bo3 tillhandahölls genom att lägga till ubikinon lipid mixen som bildade liposomer och (ambient) syre i lösning. Liposomer är sedan glest adsorberat på en halvtransparent ultramjuk guld elektrod, täckt med en själv monterade enskiktslager av 6-mercaptohexanol. Slutligen, elektroden är monterad på undersidan av en enkel spektroelektrokemisk cell (figur 1B). Elektrokemiska quinone pool redox statens kontroll tillåter en att flexibelt utlösa eller stoppa enzymatisk reaktion när som helst, medan pH-känsliga färgämnet används för att övervaka pH-förändringar inuti lumen av liposomer till följd av proton translokation av den enzymer. Med hjälp av fluorescensintensiteten hos en andra, lipid-bundna fluorescerande färg, storlek och volym av enskilda liposomer kan bestämmas och således kvantifiering av enzymet proton pumpning aktivitet. Med denna teknik, upptäckte vi särskilt att cytokrom bo3 molekyler ska kunna gå in i en spontan läcka tillstånd som snabbt avleder den proton drivkraft. Målet med denna artikel är att införa tekniken med enda Liposom mätningar i detalj.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. beredning av en Lipid/UQ-10/FDLL Mix
Obs: E. coli lipider används för liposomer beredning bör vara aliquoted och grundligt blandas med ubikinon-10 (enzym substrat) och lång våglängd fluorescerande färgämne-märkt lipider (för liposomer storleksbestämning) före den beredning.
- Använda en spruta av glas, överföring 200 µL av kloroform lager av lipid polar extrahera från Escherichia coli (25 mg/mL) till att göra 5 mg alikvoter injektionsflaskor av glas.
- Tillsätt 50 µL av 1 mg/mL ubikinon-10 (UQ-10; i kloroform) till de lipider att göra slutliga förhållandet mellan UQ-10: lipider 1: 100 (1% w/w).
- Tillsätt 20 µL av 1 mg/mL (0,4% w/w) av en lång våglängd fluorescerande färgämne-märkt lipid (FDLL) till lipider/UQ-10 mixen.
- Homogenisera kloroform lösningen genom korta vortexa och avdunsta de flesta av kloroform under en skonsam kväve eller argon flöde. Ta bort kloroform spår helt genom ytterligare avdunstning under vakuum för minst 1 h.
Obs: Lipid alikvoter kan lagras under en inert atmosfär vid-20 ° C under flera månader.
2. beredning av cytokrom bo3
Obs: För rening av cytokrom bo3 från E. coli, följa protokollet från Rumbley et al. 15 för att säkerställa hög renhet av inföding-viks enzym prover, lägga till storlek-utslagning kromatografi efter affinitet rening steget beskrivs av Rumbley et al. 15
- Lägg till 312,5 µL av 40 mM moppar-KOH/60 mM K2så4, pH 7,4, till en alikvot av lipider/UQ-10/FDLL torr blanda (5 mg, steg 1.4) och blanda med vortex tills lipid filmen är fullt resuspended, följt av 2 min behandling i ett ultraljudsbad.
- Tillsätt 125 µL av 25 mM 8-hydroxypyrene-1,3,6-trisulphonic syra (HPTS), ett pH-känsliga fluorescerande färgämne som behöver vara inkapslade inuti liposomer.
- Lägga till 137,5 µL 250 mM n-octyl β-D-glukopyranosid (OGP) tensid, blanda med vortex och sonikera i en Ultraljuds vattenbad i ca 10 min att säkerställa alla lipider är solubilized till tensiden miceller. Överföra spridning i ett 1,5 mL plaströr.
Obs: Grumlig suspension av lipider bör bli transparent efter lösbarhet med tensid. - Mängd som behövs av cytokrom bo3 (se kommentaren nedan) och tillsätt ultrarent vatten för att göra en total volym på 50 µL (cytokrom bo3 lösning plus vatten). Inkubera vid 4 ° C under 10 minuter på en rulle mixer.
Obs: Typiska belopp för enda enzym villkor är 0,1 – 0,2% (w/w protein-till-lipid, dvs. 5 – 10 µg av protein), men den kan ökas till 1 – 2% (50 – 100 µg av protein) om målet är att observera endast den elektrokemiska aktiviteten (se nedan). Som en negativ kontroll, kan liposomer utan cytokrom bo3 förberedas. - Väg upp 2 x 50 och 2 x 100 mg av polystyren Mikrokulor i fyra 1,5 mL-tub caps och stäng med paraffin film för att förhindra uttorkning.
Obs: Före användning, polystyren Mikrokulor ska tvättas med metanol, vatten och lagras i vatten enligt tillverkarens bruksanvisning.
Obs: Om en vatten/microbead blandning används polystyren Mikrokulor kan bekvämt överföras till den gemensamma jordbrukspolitiken med en mikropipett med bred spets. Vatten kan sedan tas bort från den Mikrokulor som med hjälp av en mikropipett med en tunn spets. - Tillsätt en 1st50 mg av polystyren Mikrokulor i beredning blandningen (steg 2,4) genom att sätta locket med polystyren Mikrokulor på 1,5 mL-plast röret med spridning och utför en kort tur för ett par sekunder. Inkubera vid 4 ° C på en rulle mixer för polystyren Mikrokulor att adsorbera tensiden i 30 min.
- Upprepa tillägg av polystyren Mikrokulor och inkubationer enligt följande: lägga till 50 mg Mikrokulor för 60 min inkubering; lägga till 100 mg Mikrokulor för 60 min inkubering; och lägga till 100 mg Mikrokulor för 120 min inkubering.
Obs: Lösningen ovan den kvittade Mikrokulor aktiverar genomskinlig under steg 2,6 proteoliposomes bildas.
- Upprepa tillägg av polystyren Mikrokulor och inkubationer enligt följande: lägga till 50 mg Mikrokulor för 60 min inkubering; lägga till 100 mg Mikrokulor för 60 min inkubering; och lägga till 100 mg Mikrokulor för 120 min inkubering.
- Separat proteoliposome lösningen från den polystyren Mikrokulor som med hjälp av en mikropipett med en tunn spets. Späd spridningen i 90 mL 20 mm moppar-KOH/30 mM K2så4, pH 7,4 (moppar buffert) och överföring i ett Ti45 ultracentrifugen rör.
- Ultracentrifugen spridning med typ 45 Ti rotor vid 125 000 x g (vid rmax) för 1 h till pellet i proteoliposomes.
Obs: Mindre centrifugrör kan användas även om utspädning i stor buffert volym hjälper till att minska koncentrationen av det icke-inkapslat HPTS i sista avstängning. - Tag bort supernatanten, skölj pellets med 20 mM moppar-KOH/30 mM K2så4, pH 7,4 buffert (utan omblandning pelleten). Efter kasta skölja bufferten, återsuspendering det proteoliposomes i 500 µL moppar buffert av pipettering det fram och tillbaka med tunn spets mikropipett. Sedan överföra till ett 1,5 mL plaströr.
- Centrifugera suspensionen för 5 min vid 12 000 x g att ta bort skräpet. Över supernatanten (ombildade proteoliposomes) till en ny injektionsflaska.
- Lagra den ombildade proteoliposomes dispersionen vid 4 ° C över natten och används inom 2 dagar.
3. tillverkning av semi-transparent guld elektroder
Obs: Slät guld ytan erhålls genom en stripp mallmetoden en 30 nm-tjockt lager av 99,99% guld från en atomically mjuk silicon wafer. Liten tjocklek av lagrets guld är viktigt eftersom det måste vara semi-transparent att tillåta fluorescens observation. Detaljer av guld avdunstning (fysisk förångningsdeposition, PVD) kan vara hitta någon annanstans16 och enda mall-strippning täcks här. Alternativt, ultramjuk gold chips kan köpas på annat håll (se Tabell för material).
- Limma upp till 9 glas täckglas (0.17 mm tjock) på avdunstat guld ytan med hjälp av bi-komponent låg-fluorescens epoxi. Bota limmet vid 80 ° C i 4 h.
- Strax före modifiering med en själv monterade enskiktslager (steg 4), lossa glas täckglas från kiselskivor med blad. På grund av tunnhet av täckglas, var försiktig när du lossar de täckglas för att inte spricka eller gå sönder på objektglas.
4. ändring av guld ytan med själv monterade enskiktslager (SAM)
- Förbereda 5 mL vatten till 1 mM 6-mercaptohexanol (6MH).
- Doppa färska fristående guld-belagd täckglas (steg 3.1) i 6MH lösning och lämna vid 20 – 25 ° C över natten (> 16 h) att bilda SAM.
Obs: Thiol lösningar har en obehaglig lukt, så ett stängt fartyg bör användas när ruvar det guld-belagd täckglaset. - Nästa dag, ta bort det guld-belagd täckglaset från den 6MH lösningen, tvätta snabbt med vatten eller metanol och sedan med isopropanol. Torrt under en skonsam gasflödet.
5. elektrokemisk testning av Proteoliposomes aktivitet
Obs: Elektrokemisk aktiviteten av enzymet kontrolleras först på ett hoppackade liposomer lager (steg 5) och lägre vesikler omfattningar används i enstaka blåsor experiment för att mäta pH-förändringar i lumen av liposomer (steg 6).
- Montera det guld-belagd täckglaset i en spectro-Elektrokemisk cell (se figur 1). Se kontakt för guld med en platt tråd utanför ett område som definieras av en gummi O-ring.
- Tillsätt 2 mL av buffertlösningen elektrolyt och placera av referens- och extra elektroder i cellen.
Obs: Som närmare diskuteras i avsnittet diskussion, föredras referenser elektroder utan klorid att förhindra bildandet av Au (I) Cl under elektrokemi. Här, en Hg/Hg2SO4 (lör. K2SO4) referenselektrod används och potentialer ges kontra Standard väte elektrod (hon) använder 0.658 V vs hon för Hg/Hg2SO4 (lör. K2så4). - Kör elektroimpedansspektroskopi (0,1 Hz-100 kHz) vid öppen cell potentiella (OCP) potential att bedöma kvaliteten på SAM. Konvertera impedans värden till entré och dividera med 2πω att rita en Cole-Cole tomt, där ω är frekvensen (se följande referenser16,17,18 för mer information om konvertering och tolka impedans Spectra).
Obs: Kompakt och tät SAMs av 6MH bör ge en nära till halvcirkel Cole-Cole tomt och ge kapacitans värden i intervallet 2,5-3,0 µF/cm2 (figur 2A). Om betydande avvikelser från halvcirkel form eller out-of-range kapacitans värden erhålls, ändra elektroden. - Kör Tom cykliska voltamogrammen (CVs) med scan priser 100 och 10 mV/s i regionen potentiella -0,3 – 0,8 V. En typisk CV visas (figur 2B, streckad linje).
Obs: Detta bör Visa nästan ren kapacitiv beteende och en avsaknad av betydande faradaic ström, även under omgivande syreförhållandena som används här. - Lägga till proteoliposomes (slutliga lipider koncentration 0,5 mg/mL, 1-2% (w/w) förhållandet cytokrom bo3 till lipid) i den elektrokemiska cellen och blanda lite med en pipett. Vänta tills adsorption av proteoliposomes på elektrod ytan är färdiga (30-60 min i rumstemperatur).
Obs: Cykliska voltamogrammen (CVs) på 10 mV/s kan köras under proteoliposomes adsorption att följa processen. Adsorption är klar när på varandra följande CVs sluta ändra. Information om CV tekniker kan hittas i följande läroböckerna. 19 , 20 - Tvätta cellen genom att ändra buffertlösningen minst 10 gånger men Undvik att lämna elektrod ytan helt torr.
- Kör elektroimpedansspektroskopi på OCP (figur 2A, blå linje) att bekräfta SAM på guld elektroden är oförändrad och CVs med Skanna priser 10 och 100 mV/s att iaktta katalytisk ubiquinol oxidation (och syre reduktion) av cytokrom bo 3 på debut potentialer av elektrokemiska quinone minskning om 0 V vs hon) (figur 2B).
6. identifiering av enzymatisk Proton pumpning av fluorescensmikroskopi
- Ändra guld elektroden som i steg 5 men använder 100 x mindre proteoliposomes jämfört med steg 5,5 (dvs, 5 µg/mL). För enda enzym studier, minska de cytokrom bo3 -lipid förhållande till 0,1-0,2% (w/w).
Obs: Liposomer kommer glest adsorberas på elektrod ytan aktivera enstaka vesikel övervakning av fluorescensmikroskopi. Villkor dessa singel-enzym räcker mängden enzym orörlig på elektrod ytan för observationen av en katalytisk ström. - Placera den elektrokemiska cellen på syftet olja (X 60) med en inverterad fluorescens Mikroskop med en droppe nedsänkning olja. Med hjälp av lämpliga filter för FDLL fluorescens, fokusera på elektrod ytan. Enda liposomer ska visas som ljusa fläckar på diffraktionsgränsen av Mikroskop/målet. Ta en bild av FDLL fluorescens.
- Växla till en av HPTS fluorescens filteruppsättningar på mikroskopet kontrollera att HPTS fluorescens är klart synliga och kan särskiljas från bakgrunden (på valda exponeringstid, se steg 6,4). Öka ljusintensiteten om det inte är fallet.
- Programmera den Mikroskop programvaran för att utföra en tidsinställd bild förvärvandet av omväxlande två HPTS filteruppsättningar (menyn program | Define/Run ND förvärv). Ange fördröjning mellan bild förvärv på minimum. I detta experiment Använd en 1 s exponering och 0,3 s fördröjning (pga torn rörelsen).
Obs: Förhållandet mellan fluorescens intensitet på dessa två kanaler och omvandlas senare till pH inuti liposomer vid varje tidpunkt. Varaktigheten av förvärvet kan variera enligt den förvänta pH förändring gäller; 5 min används i denna artikel. - Justera inställningarna för potentiostaten ändra potential under bild förvärv. Till exempel i detta experiment, använda följande sekvens: 0 – 60 s: ingen potential tillämpas (dvs OCP); 60 – 180 s: -0,2 V (vs hon); 180 – 300 s: 0,4 V (vs hon). I detta fall, endast tillämpad potentialen i den andra fasen (-0,2 V vs hon) är tillräcklig för att effektivt reducera quinone poolen.
- Köras samtidigt bildserier förvärvet (Mikroskop) och potentiella sekvensen (potentiostat) genom att manuellt starta båda mätningarna på samma gång.
Obs: Experimentet kan upprepas på samma elektroden flera tid genom att flytta Mikroskop scenen till ett annat område på ytan. Fördröjningen mellan förvärven bör vara minst 5-10 min att försäkra fullständig pH Jämviktstiden liposomer på ytan. Olika löptider och potentiella mönster kan användas beroende på behovet, även om imaging tid är begränsad på grund av fotoblekning av HPTS under förvärv.
7. analys av fluorescens bilder
Obs: En typisk experiment producerar en uppsättning bilder med en tidssteg (t.ex. 2.6 s) för var och en av de två kanalerna, dvs (varaktighet * 2 / 2.6) bilder. Ett exempel på sådan bild in inspelade under ett enda enzym experiment kan nås via den forskning Data Leeds repository21. En bild behandling består av flera steg med hjälp av Fiji (ImageJ) och hög nivå matematisk analys programmering språk programvara (hädanefter som avses som skript programvara, se Tabell för material för detaljer).
- Använd Fiji att separera time lapse fil, anpassa bilder och spara som separata kanaler och tidsramar.
- Öppen tid förflutit filen med Bioformats importören inom Fiji (makrokommandot: kör (”Bio-format importör”)).
- Använda plugin StackReg för att justera varje bildruta till den första att ta hänsyn till möjliga skede rörelser eller termisk drift under förvärvet (makrokommandot: kör (”StackReg” ”, transformation = översättning”)).
- Spara separat okomprimerade filer för varje kanal och varje tidssteg i TIFF-format i en mapp.
- Extrahera de exakta tidstämplarna för varje bildruta från time lapse filmetadata och spara dem som en CSV-fil i samma mapp som bilderna. Alternativt, extrahera tidsstämplar med programvaran förvärvet och spara manuellt till en CSV-fil med ett kalkylprogram.
Obs: Mappen med bilder och tidsstämplar är nu redo att analyseras av programvaran skript. Steg 7.1.1. – 7.1.4. kan vara automatiserat med hjälp av Fiji skript (ett skript skrivet i Python för batch-bearbetning av time lapse filer ges, Använd ”Ctrl-Shift-N” (i Windows), sedan fil | Öppna att ladda skriptet).
- Använda skript programvara för automatiserade bearbetning av bilderna. Läsa in koden till programvaran och klicka på kör till slutet. Vid uppmaning väljer du den mapp som innehåller bilder från steg 7,1.
Obs: Ett skript för analys tillhandahålls mlx-format live skript, med omfattande kommentarer, att identifiera enstaka liposomer, anpassa dem till 2D-Gaussisk funktion, filtrera dem och kvantifiera de pH-värdena vid varje tidpunkt. De följande delsteg körs automatiskt av skriptet.- Läsa in alla tidsramar bilder för en enda experiment i minnet.
- Genomsnitt alla bilder för en enda kanal (Välj kanalen med högsta fluorescensintensiteten) och använder i genomsnitt bilden för att identifiera alla maxvärden som kan motsvara de enda liposomer.
- Passar de identifierade maxkapacitet på i genomsnitt bilden till den 2D-Gaussian funktion och spara den resulterade passar parametrar för varje Liposom (se figur 4A monterade Liposom t.ex).
- Filtrera den maximala storleken enligt beräknade enda liposomer kriterier, som storlek, loopkontroll och intensitet. Avvisa liposomer som är dåligt monterade på grund av låg signal till brus, nära angränsande Liposom eller att vara alltför nära bild kanten.
- Ladda tidsstämplar från den externa filen och passa varje filtrerad Liposom till 2D-Gaussisk funktion på varje tidsram bild separat.
Obs: Användning av parallell programmering och flerkärniga CPU kan avsevärt förbättra beräkningshastigheten i detta skede. - Filtrera liposomer igen enligt liknande kriterier som i steg 7.2.4 men tillämpad till varje tidsram.
- På varje tidssteg, definiera förhållandet fluorescens intensitet av en Liposom som förhållandet mellan volymer omges av monterade 2D-Gaussisk funktion på två kanaler. Beräkna pH-värdena från förhållandet mellan stödnivåer bestäms från två HPTS kanaler och med hjälp av kalibreringskurvan (steg 8). Rita resulterande pH-tid kurvor för liposomer och observera deras pH ändra när potentialen tillämpas.
8. utför en kalibreringskurva HPTS fluorescens
Obs: För att konvertera HPTS fluorescens förhållande till en intravesicular pH, en kalibreringskurva först upprättas som skulle ta hänsyn till särskilda förhållanden experiment såsom guld transmittans, filter kvalitet, etc. Det här steget måste utföras endast en gång eller två gånger och kalibreringsdata kan användas så länge parametrarna för inställning och mätning är detsamma i steg 6.
- Förbereda en elektrod med glest adsorberade liposomer (utan cytokrom bo3 som beskrivs i steg 5 och 6.1).
- Tillsätt 2 µL 0,1 mg/mL gramicidin lösning i etanol till 2 mL buffert till skapa den koncentration 100 ng/mL.
- Ta två fluorescens bilder för två HPTS kanaler.
- Ändra pH-värdet i cellen genom tillsats av små delprover av 1 M HCl eller 1 M H2så4. Mäta pH-värdet i bufferten med standard pH-mätare och ta två fluorescens bilder för två HPTS kanaler.
- Upprepa steg 8,4 för det pH-området 6 till 9.
- Med hjälp av algoritmen från 7,2, passa, filtrera och beräkna genomsnittliga HPTS fluorescens förhållandet mellan enskilda liposomer vid varje pH. Ta förhållandet HPTS genomsnitt över alla liposomer.
- Passa det resulterande pH-ratio beroendet till följande ekvation:
, där pKen, Ren och Rbpassande parametrar. - Använda pKen, Ren och Rbatt konvertera HPTS förhållandet mellan enskilda liposomer i steg 7.2.7. till pH-värden.
, där pKen, Ren och Rbpassande parametrar.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Kvaliteten på det guld-modifierade täckglaset (elektroden) med en SAM av 6MH kontrolleras före varje experiment med elektroimpedansspektroskopi. Figur 2A visar representativa Cole-Cole tomter mätt med elektroimpedansspektroskopi före och efter liposomer adsorberas. Om kvaliteten på SAM är tillräcklig, bör impedans spektroskopi Visa en nästan ren kapacitiv beteende vilket resulterar i en halvcirkel Cole-Cole tomt. Diametern på halvcirkeln i en komplott, Cole-Cole är lika med den dubbla lager kapacitansen av elektrod ytan, som bör vara i intervallet 2,5-3,0 µF/cm2 . Observera att kapacitansen inte bör förändras avsevärt vid liposomer adsorption, trots en liten ökning i kapacitans kan observeras (hög liposomer täckning, figur 2A, nederst) eller en viss förskjutning i impedans kan observeras vid låga frekvenser (låg Liposom täckningar, figur 2A, överst).
Elektrokemi kan användas för att testa den katalytiska aktiviteten av cytokrom bo3 i proteoliposomes, där katalytisk strömmar mäts med cyklisk voltametri avspeglar aktiviteten ubiquinol-syre mitokondriskt. Dock betydande katalytisk strömmar kan endast upptäckas vid höga mängder av adsorberat proteoliposomes och ett tätt packade lager av proteoliposomes på det guld-modifierade täckglaset behövs. Figur 2B visar representativa cykliska voltamogrammen (CVs) av elektroden före och efter liposomer adsorption med antingen låga eller höga Liposom täckning. Ingen faradaic aktuell observeras på den tomma CV eftersom syre minskning av kala guld elektroden blockeras av SAM. När ytan är mättad med liposomer med hög cytokrom bo3 innehåll (1,3% (w/w) i detta fall), en tydlig katalytisk våg på grund av syre minskning observeras med en debut potential på 0 V, dvs potential ubikinon minskning (figur 2B, blå linjen). Ubikinon poolen fungerar både som naturliga substratet för enzymet och en elektron medlare, överföra elektroner från enzymet till elektrod ytan. Vi noterar att under hög Liposom täckning, ingen skillnad av enskilda blåsor är möjligt genom Mikroskopi och lägre täckning behövs för enda Liposom studier. Vid låg Liposom täckning (men proteinrik lipid-förhållande) minskas den katalytiska nuvarande avsevärt, knappt urskiljbar från bakgrund (figur 2B, röd linje). Observera att katalytisk nuvarande enda enzym villkor (låg protein-lipid-förhållande), är ännu lägre och kan inte mätas på ett tillförlitligt sätt.
Figur 3 visar fluorescens bilder av liposomer adsorberat på elektroderna på tre olika omfattningar. Alla bilder är tagna i identiska ljus och exponering villkor och deras ljusstyrka justerades lika aktivera direkt jämförelse. Dye-innehållande-liposomer syns på bilderna som ljusa fläckar. Den centrala delen av bilden var photobleached för ett par minuter att avslöja fluorescens bakgrundsnivån (vi Observera att FDLL är relativt fotostabilt och är inte photobleached helt i figur 3). Bilderna på två HPTS kanaler är överlagringsbara, där förhållandet mellan de två kanalerna (410/535 och 470/535) motsvarar pH 7,4 används i detta experiment. Ett större antal liposomer är synliga med FDLL kanalen, vilket indikerar förekomst av liposomer som har ingen HPTS inkapslade. Skillnaden mellan HPTS och FDLL kanaler är mer uttalad på högre täckningar, möjligen eftersom vid hög Liposom täckning, liposomer är mer benägna att brista eller säkring på ytan.
Bildanalys kräver anpassning av ramar (mot den första bildrutan) använder ImageJ, plugin StackReg. Anpassningen är nödvändig i de flesta situationer eftersom en liten termisk drift av provet uppstår oftast inom tidsramen av experimentet, ändra Liposom koordinaterna. Alla ytterligare analys utförs med hjälp av en programvara skriptkod. Denna kod utför automatisk Liposom identifiering. Eftersom storleken på liposomer under Abbe diffraktionsgränsen, ses deras fluorescens som en punkt sprida funktion mycket större än den faktiska Liposom diametern (figur 4A). Koden passar fluorescensintensiteten hos varje vesikler på två kanaler till en 2D-Gaussisk funktion (figur 4A) och beräknar sin volymetriska intensitet baserat som kan omvandlas till pH med hjälp av kalibreringskurvan. Genom att utföra dessa åtgärder på alla tidsramar, erhålls pH inuti varje vesikler inom tidsramen av experiment (film 1). Figur 4B visar medianer av alla vesikler pH-förändringar inom en enda bild när cytokrom bo3 innehåll är 1,3%. En ökning av pH (proton pumpning) syns tydligt när en potential mellan -0,1 och -0,3 V tillämpas, men inte för 0 V sedan den senare inte är tillräcklig för att reducera quinone poolen. När cytokrom bo3 innehåll är mycket lägre (protein-till-lipid förhållandet mellan 0,1%, figur 4 c), medianvärdet kurvorna blir nästan omöjlig att skilja från de tomma liposomer (figur 4 d). Skillnaden blir tydlig när man överväger enskilda pH spår av slumpmässiga liposomer (figur 5, 6 och 7). Medan liposomer utan cytokrom bo3 Visa inga betydande pH-förändringar med avseende på buller (figur 7), ett urval av liposomer visar en ökning (dominant) eller en minskning av pH när en potential är tillämpas de actives cytokrom bo3 (figur 6, grå zon). Den uppenbara skillnaden i pH-spår mellan liposomer är förenligt med låg protein-till-lipid förhållandet, där cytokrom bo3 förekommer endast i en liten delmängd av liposomer aktivitet. Prevalensen av en pH-ökning över minskningen förklaras av metoden beredning som gynnar en ”passiv” orientering av enzymet molekyler (ca 75%). Fraktionen av liposomer som visar en pH förändring ökar när de cytokrom bo3 -lipid-förhållande är högre (figur 5). Observera också att vissa liposomer sluta proton pumpa och komma till proton skingrande läget före utgången av potentiella tillämpningen. Vi tillskriver detta beteende till cytokrom bo3 molekylerna att ange ett ”läcka tillstånd”, som tillåter protoner att strömma tillbaka in Liposom lumen14.
Ytterligare analys av pH spår inklusive montering och bestämning av proton pumpning/läckande priser kan göras med hjälp av ett skript vi har publicerats tidigare14,22 och kan erhållas från det forskning Patientdataarkivet Leeds 23 , 24.
Figur 1: principen för metoden. (A) principen om enda enzym aktivitetsövervakning och (B) systemet av experimentella installationen används i detta arbete med en cutaway för att demonstrera en inre del av cellen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: elektrokemisk reaktion av liposomer. (A) Cole-Cole tomter värderade OCP (0.22 V vs hon; svart kvadrat linje) före och efter liposomer (1,3% w/w cytokrom bo3) adsorption från lösningar i koncentrationer på 5 µg/mL (röd cirkel linje) och 500 µg/mL (blå cirkel linje). (B) cyklisk voltamogrammen på 100 mV/s (till vänster) och 10 mV/s (höger panel) Au-Sam (svart streckad linje) före och efter liposomer (1,3% w/w cytokrom bo3) adsorption från lösningar vid koncentrationer på 5 µg/mL (röda linjen) och 500 µg/mL (blå linje). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: fluorescensmikroskopi av liposomer. Fluorescens bilder av liposomer på olika surface omfattningar: ytor inkuberas i 30 min med en liposomer lösning 5 µg/mL (översta raden), 20 µg/mL (mellersta raden) och 500 µg/mL (nedersta raden). Vänstra kolumnen motsvarar 470/535 nm excitation/utsläpp filtret setup (1st HPTS kanal); mittenkolumnen - 410/535 nm (2nd HPTS kanal); högra kolumnen - 560/645 nm (FDLL kanal). Bilderna togs på förstoring 90 X (60 X mål och 1,5 X förstoring av mikroskopet innan kameran), 1 s exponering och liknande ljusintensitet. Skala barer motsvarar 50 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 4: Liposom identifiering och pH ändra. (A) 3D-vy av en del av fluorescens bild som innehåller en typisk enda Liposom. Dess fluorescensintensitet ses som en punkt sprida funktion (färg yta) som monteras på en 2D-Gaussisk funktion (svart nät). (B-D) pH, visas som medianen av alla blåsor inom enskild bildområde (vanligtvis flera hundra) på olika tillämpad potentialer. Från 0-60 s, ingen potential tillämpas (OCP). Mellan 60 och 180 s (grå zon) olika potentialer tillämpades: 0 V (svart), V (röd), -0,1 -0,2 V (grön), -0,3 V (blå). Mellan 180 och 300 s, 0,4 V vs. Hon tillämpades. De cytokrom bo3 till lipid nyckeltal var (B) 1,3%, (C) 0,1%, (D) 0%. Spåren är förskjutna för tydlighet. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: pH spår av liposomer innehållande 1,3% av enzym. Spår av pH ändra av 72 enda liposomer, slumpmässigt utvalda, innehållande cytokrom bo3 (1,3% w/w) mäts och analyseras under ett experiment. Från 0-60 s, ingen potential är tillämpas (OCP); mellan 60 och 180 s (grå zon) -0,2 V vs. HON; mellan 180 och 300 s, 0,4 V vs. Hon tillämpades. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6: pH spår av liposomer innehållande 0,1% av enzym. Spår av pH ändra av 72 enda liposomer, slumpmässigt utvalda, innehållande cytokrom bo3 (0,1% w/w) mäts och analyseras under ett experiment. Från 0-60 s, ingen potential är tillämpas (OCP); mellan 60 och 180 s (grå zon) -0,2 V vs. HON; mellan 180 och 300 s, 0,4 V vs. Hon tillämpades. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 7: pH spår av liposomer utan enzym. Spår av pH förändring av 72 enda liposomer, slumpmässigt utvalda, utan cytokrom bo3 mäts och analyseras under ett experiment. Från 0-60 s: Ingen potential är tillämpas (OCP); mellan 60 och 180 s (grå zon) -0,2 V vs. HON; mellan 180 och 300 s, 0,4 V vs. Hon tillämpades. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Film 1: animering av enda Liposom pH förändring. (övre panelen) Förändring av en Liposom fluorescens på två HPTS kanaler (visas som 3D-yta tomt på motsvarande område) under 300 s av experimentet. Reduktiv potential tillämpades mellan 60 s och 180 s. (nedre panelen) motsvarande tomt på volymetriska intensitet förhållandet mellan två HPTS kanaler mot tiden. Zonen för reduktiv potentiella tillämpningen är skuggade i grått. Vänligen klicka här för att se denna video. (Högerklicka för att ladda ner.)
Tilläggsfilerna. Vänligen klicka här för att ladda ner filerna.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den beskrivna metoden är lämplig att studera proton pumpning av respiratoriska membranproteiner som kan beredas i liposomer och kan utbyta elektroner med quinone poolen. Proton pumpning aktivitet kan övervakas på singel-enzym nivå använda pH-känsliga (proportionerlig) färgämnen inkapslade i Liposom lumen (figur 1A).
Metoden bygger på ubikinon (eller andra kinoner), införlivas i lipid lipidens, förmåga att utbyta elektroner med elektroder modifierad med en SAM-18. Egenskaperna för guld elektroden, modifierad med en SAM, är mycket specifika. Liposomer behöver adsorberas på SAM och SAM måste vara tunt nog att möjliggöra snabb elektrokemisk oxidation och reduktion av quinone poolen i liposomer. Ännu viktigare, måste samspelet mellan elektrod och Liposom vara tillräckligt svag för att inte försämra lipid membranet. Dessutom beroende på detaljerna för det experimentella systemet är det önskvärt om SAM förhindrar guld-katalyseras sidoreaktioner, exempelvis syre reduktion. Slutligen, SAM måste vara stabil inom fönstret potentiella används. Användningen av Ultra platt guld elektroder modifierad med hög kvalitet SAM av 6MH uppfyller dessa krav när det gäller cytokrom bo3. Strippar guld elektroder från atomically-platt kiselskivor skapar en ultramjuk guld yta med en nära perfekt SAM indikerat av impedans spektra. Observera att vi bildar SAM från 6MH i vatten. Tidigare rapporterade vi om SAMs med 6MH i isopropanol16, men dessa SAMs uppvisar högre dubbla lager kapacitans värden och impedans spektra som indikerar en mer heterogen yta (dvs., fler defekter) med ett lägre motstånd. Dessutom när SAMs från 6MH är beredda från en vattenlösning, mindre bakgrund syre minskning (på grund av guld katalyseras syre minskning) observeras jämfört med SAMs bildas från en etanol/isopropanol lösning. Alla dessa observationer visar att SAMs från 6MH i vattenlösningar har en högre kvalitet med mindre defekter. Högre kvalitet SAMs kan också bildas från thiol-föreningar med längre alkane kedjor (t.ex. 1-hydroxy-dekan-tiol), men elektron överföring kinetiken blir långsammare eftersom SAM tjockleken ökar.
Under (spectro) elektrokemi, bör kloridjoner undvikas i buffertlösningen eftersom de kan chemosorb på guld ytan på högpotentiella, möjligen försämras SAM kvaliteten. Av samma anledning att en referenselektrod av klorid-gratis föredra.
En annan viktig punkt är bakgrunden genomträngligheten av liposomer till protoner, vilket bör vara tillräckligt låg för att tillåta proton ackumulering till följd av enzymatisk proton flyttning på tidsskalan av experiment. Exakta lipid sammansättning kan påverka denna permeabilitet. I vårt arbete, vi använder polar E. coli lipid extrakt kompletterat med ubikinon-10. Proton permeabilitet har visat sig beror starkt på de fettsyror kedja längd25, även om detta har blivit motsagd i studier med mer komplexa lipid kompositioner26. Intressant, har ubikinon nyligen visat att förbättra membran stabilitet27. Slutligen, resterande tvättmedel från förfarandet protein beredning kan påverka proton läckage och därmed är det viktigt att ta bort rengöringsmedel så fullständigt som möjligt använda hydrofoba polystyren Mikrokulor, utspädning följt av centrifugering och grundlig sköljning av den elektrokemiska cellen efter proteoliposomes adsorberas på ytan. Om tveksamt, kan Liposom permeabilitet kontrolleras genom att följa de lumen pH förändringen (via HPTS) i ett svar till en extern pH hoppa28.
Enda enzym mätning kräver unilamelar liposomer och mindre liposomer förväntas Visa snabbare eller högre pH-förändringar som lumen's volym minskar. För att uppnå detta, läggs polystyren Mikrokulor gradvis i små mängder leder till långsamma liposomer bildandet. Under sådana förhållanden bildas små liposomer av homogen storlek med en genomsnittlig diameter av 70 nm och en polydispertion index av 0,24 i våra mål14. HPTS adsorberas också på den polystyren Mikrokulor, att minska polystyren Mikrokulor kapacitet att adsorbera tvättmedel. Därför överskott polystyren Mikrokulor bör läggas till kompensera för dess förlust. Behandling med polystyren Mikrokulor observerades för att minska HPTS koncentrationen i lipid-protein avstängning av ungefär en fjärdedel (från 5 till 3-4 mM). Den faktiska HPTS koncentrationen i den Liposom lumen kan dock vara högre eftersom liposomer bildas tidigt på behandlingen med polystyren Mikrokulor. Istället för HPTS, kan andra pH-känsliga färgämnen användas. Det är dock viktigt att färgen är membran-impermeable och proportionerlig. Den senare undviker experimentella fel på grund av fotoblekning och varierande mängder av inkapslade färgämne.
Enkla beräkningar kan göras för att uppskatta huruvida stochastically, de flesta av icke-tomma liposomer innehåller bara ett enzym molekyl. Antar att en genomsnittlig Liposom diameter 70 nm, en lipid molekylvikt av 750 Da och en lipid området 0,65 nm2 ger oss en Liposom massa av 5.2x10-17 g, dvs 9.6x1013 liposomer per förberedelse (5 mg av lipid). På 0,1% av cytokrom bo3 (MW = 144 kDa), 2 x 1013 enzym molekyler är närvarande, motsvarar förhållandet 0.2 protein: Liposom. Använder en Poisson-fördelningen, en ytterligare beräkna som sannolikheten att hitta en enzym molekyl (17%) per Liposom är tio gånger högre än sannolikheten att hitta mer än en molekyl (1,7%). Noggrannare beräkningar kan göras om förlusterna av enzym och lipider under beredning utifrån motsvarande analyser beaktas. Den senare kan uppskattas från en protein-analysen och genom att mäta FDLL fluorescens av beredda liposomer.
När protokollet är etablerad och enda enzym spår är inspelade, ytterligare ändringar av metoden är genomförbart beroende på syftet. Man kan tycka om en enzym-hämmare tillägg eller införandet av en jonofor i systemet. Vara noga med att kontrollera att tillsats av lösningsmedel används för att förbereda jonofor eller hämmare lager påverkar inte tillståndet för SAM eller genomtränglighet av liposomer.
Tekniken som beskrivs här är begränsad till en viss grupp av enzymer som är både membran proton transportörer och quinone-konvertera. Utrustning och experimentella förhållanden var som används här optimerad för den enzymatiska aktiviteten av cytokrom bo3. Här är gången resolutionen 2-3 sekunder, bestäms av exponeringstiden och den tid det tar för tornet att byta filter. Varaktigheten av experimentet är begränsad av fotoblekning fluorescerande färgämne och således av ljusintensiteten. Vi har tidigare funnit genomsnittliga proton flyttning hastigheten av cytokrom bo3 vara 73 ± 2,2 protoner/s med denna teknik, även om aktiviteter ned till 20 protoner/s upptäcktes. För att använda dessa tekniker för enzymer med antingen mer eller mindre aktivitet, bild förvärv parametrar måste anpassas (dvs., ljus intensitet, exponeringstid och varaktighet av experiment). I framtiden kommer kan denna metod förlängas mot andra elektrontransport kör proton pumpa enzymer, ett exempel är mitokondriell komplex jag. Andra enzymer kan kräva olika beredning protokoll, och detta skulle behöva optimeras för varje annan transportör. Proton pumpar som inte är quinone-konvertera enzymer kan även studeras, exempelvis ATP-driven29, även i detta fall proton translokation kan inte utlösas elektrokemiskt, men tillägg av en initierare (t.ex. ATP) krävs. I det senare fallet finns det ingen anledning att använda en guld-modifierade täckglas. Under förutsättning att en lämplig membran-impermeable och ion-känsliga fluorescerande färgämne används, kan denna metod dessutom utvidgas till andra joniska pumpar, t.ex. natrium och kalium.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Författarna erkänner BBSRC (BB/P005454/1) för ekonomiskt stöd. NH finansierades av programmet VILLUM Foundation Young Investigator.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6-Mercapto-1-hexanol (6MH) | Sigma | 451088 | 97% |
| 8-hydroxypyrene-1,3,6-trisulphonic acid (HPTS) | BioChemika | 56360 | |
| Aluminium holder (Electrochemical cell) | Custom-made | 30x30x7 mm; inner diameter: 26 mm; hole diameter: 15 mm | |
| Auxiliary electrode | platinum wire | ||
| Chloroform | VWR Chemicals | 83627 | |
| E.coli polar lipids | Avanti | 100600C | 25 mg/mL in chloroform |
| Epoxy | EPO-TEK | 301-2FL | low fluorescence epoxy |
| Fiji (ImageJ 1.52d) | Required plugins: StackReg and TurboReg (http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg/) | ||
| Filter cube ("ATTO633") | Chroma Technology Corporation | Ex: 620/60 nm; DM: 660 nm; Em: 700/75 nm | |
| Filter cube ("HPTS1") | Chroma Technology Corporation | Ex: 470/20 nm; DM: 500 nm; Em: 535/48 nm | |
| Filter cube ("HPTS2") | Chroma Technology Corporation | Ex: 410/300 nm; DM: 500 nm; Em: 535/48 nm | |
| Filter cube ("Texas Red") | Chroma Technology Corporation | Ex: 560/55 nm; DM: 595 nm; Em: 645/75 nm | |
| Fluorescent dye-labelled lipids (FDLL) | ThermoFisher Scientific | T1395MP | TexasRed-DHPC was used in this work (λexc 595 nm; λem 615 nm) |
| Fluorescent dye-labelled lipids (FDLL) (alternative) | ATTO-TEC | AD 633-161 | ATTO633-DOPE can be used as alternative (λexc 630 nm; λem 651 nm) |
| Gel filtration column | GE Healthcare | 28-9893-33 | HiLoad 16/600 Superdex 75 pg, for additional protein purification |
| Glass coverslips | VWR International | 631-0172 | No 1.5 |
| Glass syringe | Hamilton | 1725 RNR | 250 µL |
| Glass vials | Scientific Glass Laboratories Ltd | T101/V1 | 1.75 mL capacity |
| Gold | GoodFellow | 99.99% | |
| Gramacidin | Sigma | G5002 | |
| Mercury sulfate reference electrode | Radiometer (Hash) | E21M012 | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | Minispin NL040 | |
| Microscope | Nikon | Eclipse Ti | |
| Microscope Camera | Andor | Zyla 5.5 sCMOS | |
| Microscope Lamp | Nikon | Intensilight C-HGFI | |
| NIS-Elements AR 5.0.2 | Nikon | Microscope acquisition software | |
| n-Octyl β-D-glucopyranoside | Melford Laboratories | B2007 | |
| Nova 1.10 | Metrohm | Potentiostat control software | |
| Objective | Nikon | Plan Apo λ 60x/1.4 oil | |
| OriginPro 2017 | OriginLab | Plotting software | |
| O-ring (Electrochemical cell) | Orinoko | Inner diameter: 16 mm; cross section: 1.5 mm | |
| Plastic tubes | Eppendorf | 3810X | 1.5 mL |
| Polystyrene microbeads | Bio-RAD | 152-3920 | Biobeads, 20-50 mesh |
| Potentiostat | Metrohm Autolab | PGSTAT 128N | |
| Potentiostat | CH Instruments | CHI604C | |
| Scripting software | Matlab | R2017a | Required toolboxes: 'Image Processing Toolbox', 'Parallel Computing Toolbox', 'Curve Fitting Toolbox', 'System Identification Toolbox', 'Optimization Toolbox' |
| Silicon wafers | IDB Technologies LTD | Si-C2 (N<100>P) | Ø 25 mm, 525 um thick |
| Teflon cell (Electrochemical cell) | Custom-made | Outer diameter: 26 mm; inner diameter: 13.5 mm | |
| Temple-Stripped Ultra-Flat Gold Surfaces | Platypus Technologies | AU.1000.SWTSG | Alternative ready-to-use ultra-flat gold surfaces (Thickness below 100 nm on demand) |
| Thin micropipette tips | Sarstedt | 70.1190.100 | or similar gelloader tips 200 µL |
| Ubiquinone-10 | Sigma | C-9538 | |
| Ultracentrifuge | Beckman-Coulter | L-80XP | with Ti 45 rotor |
| Ultrasonic bath | Fisher Scientific | FB15063 |
References
- Claessen, V. I., et al. Single-Biomolecule Kinetics: The Art of Studying a Single Enzyme. Annual Review of Analytical Chemistry. 3 (1), 319-340 (2010).
- Rojek, M. J., Walt, D. R. Observing Single Enzyme Molecules Interconvert between Activity States upon Heating. PLoS ONE. 9 (1), e86224 (2014).
- Velonia, K., et al.
- Lu, H. P., Xun, L., Xie, X. S. Single-molecule enzymatic dynamics. 282 (5395), Science. New York, N.Y. 1877-1882 (1998).
- Engelkamp, H., Hatzakis, N. S., Hofkens, J., De Schryver, F. C., Nolte, R. J. M., Rowan, A. E. Do enzymes sleep and work? Chemical Communications. 9 (9), 935-940 (2006).
- Boukobza, E., Sonnenfeld, A., Haran, G. Immobilization in Surface-Tethered Lipid Vesicles as a New Tool for Single Biomolecule Spectroscopy. The Journal of Physical Chemistry B. 105 (48), 12165-12170 (2001).
- Hsin, T. -M., Yeung, E. S.
- García-Sáez, A. J., Schwille, P. Single molecule techniques for the study of membrane proteins. Applied Microbiology and Biotechnology. 76 (2), 257-266 (2007).
- Onoue, Y., et al. A giant liposome for single-molecule observation of conformational changes in membrane proteins. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1788 (6), 1332-1340 (2009).
- Jefferson, R. E., Min, D., Corin, K., Wang, J. Y., Bowie, J. U. Applications of Single-Molecule Methods to Membrane Protein Folding Studies. Journal of Molecular Biology. 430 (4), 424-437 (2018).
- Rigaud, J. L., Pitard, B., Levy, D. Reconstitution of membrane proteins into liposomes: application to energy-transducing membrane proteins. BBA - Bioenergetics. 1231 (3), 223-246 (1995).
- Jesorka, A., Orwar, O. Liposomes: Technologies and Analytical Applications. Annual Review of Analytical Chemistry. 1 (1), 801-832 (2008).
- Seddon, A. M., Curnow, P., Booth, P. J. Membrane proteins, lipids and detergents: Not just a soap opera. Biochimica et Biophysica Acta - Biomembranes. 1666 (1-2), 105-117 (2004).
- Li, M., et al. Single Enzyme Experiments Reveal a Long-Lifetime Proton Leak State in a Heme-Copper Oxidase. Journal of the American Chemical Society. 137 (51), 16055-16063 (2015).
- Rumbley, J. N., Furlong Nickels, E., Gennis, R. B. One-step purification of histidine-tagged cytochrome bo3 from Escherichia coli and demonstration that associated quinone is not required for the structural integrity of the oxidase. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Protein Structure and Molecular Enzymology. 1340 (1), 131-142 (1997).
- Jeuken, L. J. C., et al. Phase separation in mixed self-assembled monolayers and its effect on biomimetic membranes. Sensors and Actuators, B: Chemical. 124 (2), 501-509 (2007).
- Barsoukov, E., Macdonald, J. R. Impedance Spectroscopy Theory, Experiment, and Applications. , John Wiley & Sons. Chapters 1-2 (2005).
- Jeuken, L. J. C., Connell, S. D., Henderson, P. J. F., Gennis, R. B., Evans, S. D., Bushby, R. J.
- Compton, R. G., Banks, C. E. Chapter 4. Understanding voltammetry. , World Scientific Publishing Europe Ltd. Singapore. (2018).
- Girault, H. H. Chapter 10. Analytical and Physical Electrochemistry. , EPFL Press. Lausanne. (2004).
- Mazurenko, I., Jeuken, L. J. C. Timelapse (movie) of single vesicles fluorescence change upon potential application. , (2018).
- Li, M., Khan, S., Rong, H., Tuma, R., Hatzakis, N. S., Jeuken, L. J. C. Effects of membrane curvature and pH on proton pumping activity of single cytochrome bo3enzymes. Biochimica et Biophysica Acta - Bioenergetics. 1858 (9), 763-770 (2017).
- Li, M., Tuma, R., Jeuken, L. J. C. MATLAB code for the analysis of proton transport activity in single liposomes. , (2017).
- Li, M., Tuma, R., Jeuken, L. J. C. Time-resolved fluorescence microscopic data (traces) of individual lipid vesicles with proton transport activity. , (2017).
- Paula, S., Volkov, A. G., Van Hoek, A. N., Haines, T. H., Deamer, D. W. Permeation of protons, potassium ions, and small polar molecules through phospholipid bilayers as a function of membrane thickness. Biophysical Journal. 70 (1), 339-348 (1996).
- Brookes, P. S., Hulbert, A. J., Brand, M. D. The proton permeability of liposomes made from mitochondria) inner membrane phospholipids: No effect of fatty acid composition. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1330 (2), 157-164 (1997).
- Eriksson, E. K., Agmo Hernández, V., Edwards, K. Effect of ubiquinone-10 on the stability of biomimetic membranes of relevance for the inner mitochondrial membrane. Biochimica et Biophysica Acta - Biomembranes. 1860 (5), 1205-1215 (2018).
- Seneviratne, R., et al. A reconstitution method for integral membrane proteins in hybrid lipid-polymer vesicles for enhanced functional durability. Methods. , 1-8 (2018).
- Veshaguri, S., et al. Direct observation of proton pumping by a eukaryote P-type ATPase. Science. 351 (6280), 1-6 (2016).
