Summary
ここでは、プロトコルを提案単一リポソームの脂質膜を渡るプロトン透過の分子機構の研究例としてシトクロムbo3を使用します。電気化学、蛍光顕微鏡、単一小胞、含む単一または複数の酵素のルーメン内の pH の変化を組み合わせることを検出および分析できる個別に。
Abstract
電子のプロトン ポンプの酵素は ATP の生産に使用されるプロトン動機力を作成する、膜プロトン透過経路にチェーン カップル酸化還元反応を転送します。両親媒性膜タンパク質性の取り扱いには特に注意が必要ですし、プロトン透過経路のような膜輸送プロセスを勉強するとき、天然脂質環境に再構築は不可欠であります。ここで、例として大腸菌由来シトクロムbo3を取って膜酸化還元酵素のプロトン ポンプ機構の調査のために使用されている方法は詳細します。内腔のキノン プールとモニターの pH 変化の酸化還元状態を制御するは、電気化学および蛍光顕微鏡に組み合わせてです。酵素のコンテンツは、単一の酵素やトランスポーター リポソームあたりにスケール ダウンすることができますしながら蛍光顕微鏡の空間分解能によるリポソームの何百も同時に測定できます。それぞれ単一の酵素分析は、それ以外の場合全体の人口の行動によって隠されるかもしれない酵素機能動態のパターンを明らかにできます。我々 は、自動画像解析用スクリプトの説明を含めます。
Introduction
酵素機構と反応速度論については、測定値が統計平均を表す酵素分子の数百万人に何千人もの人口を持つアンサンブルまたはマクロ レベルで通常取得されます。それは、ただし、酵素など複雑な高分子の行動における不均一性を発揮、アンサンブルのレベルで観察される分子メカニズムが必ずしも当てはまらないすべての分子のために知られています。最後の二十年の1中に新興の方法の様々 な個々 の分子スケールのような逸脱が広く単一酵素の研究によって確認されました。特に、個々 の酵素活動を蛍光検出は、酵素活動2,3の不均一性を調査したり、いわゆるメモリー効果 (低の期間によって成功した高い酵素活性の期間を発見に使用されています活動と逆)4,5。
多くの単一の酵素の研究は、酵素表面または空間的固定連続観測の視野で十分な長さのままに別の方法でに固定されている必要があります。酵素カプセル化リポソーム表面酵素または蛋白質蛋白質の相互作用の6,7による悪影響を防止しながら酵素固定化を有効にするのに示されています。また、リポソームは、その天然の脂質二分子膜環境の8,9,10で単一膜蛋白質を研究するユニークな可能性を提供しています。
膜タンパク質、トランスポーター、クラス蛋白質は脂質二重膜 (例えばリポソーム)11に再構成されたときにだけ勉強することができます動作、セル膜を渡る物質の方向転流を練習します。 12,13。たとえば、プロトン透過経路、原核生物と真核生物の電子輸送鎖のいくつかの酵素によって展示は ATP 合成に使用されるプロトン動機力を作成することによって細胞呼吸において重要な役割を果たしています。この場合、多くの場合このプロセスの詳細なメカニズムは、とらえどころのないままがプロトン ポンプ機能は電子伝達と結合されます。
最近では、プロトン ポンプの大腸菌(シトクロムbo3) ターミナル ユビキノール酸化酵素の単一の酵素の活性を研究する電気化学とカップル蛍光検出する可能性を示した14リポソームに再構成しました。これEからリポソームの内腔 pH 感応膜不浸透性蛍光色素のカプセル化によって達成されました。大腸菌極性脂質 (図 1 a)。タンパク質の量は、ほとんどリポソームは (ポアソン分布) によるとないまたは 1 つだけ溶解酵素の分子をも含んだに最適化されていました。シトクロムbo3の 2 枚の基板は、ユビキノンをソリューションでリポソームと (アンビエント) 酸素を形成脂質ミックスに追加することによって提供されました。リポソームは半透明な超滑らかな金電極、6 mercaptohexanol の自己組織化膜で覆われているまばら吸着します。最後に、電極は簡単な分光電気化学セル (図 1 b) の下部にマウントされています。キノン プールの酸化還元状態の電気化学的制御により、柔軟にトリガーしたり、または pH 感受性色素によってプロトン透過の結果としてリポソームのルーメン内の pH の変化を監視するために使用中にいつでもでも酵素反応を停止する 1 つ、酵素。使用して 2 番目、脂質バインド蛍光染料、サイズおよび個々 のリポソームのボリュームの蛍光強度を決定することができます、このように酵素のプロトン ポンプ機能の定量化。この手法を使用すると、特にわかったシトクロムbo3分子がプロトン動機力をすばやく消える自然リーク状態に入ることができます。この記事の目的は、詳細に単一リポソーム測定の手法を紹介します。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. 脂質/UQ-10/FDLL ミックスの準備
注: E. 大腸菌脂質リポソームの調製に使用は避けようとユビキノン 10 (酵素基質) と長波長蛍光色素標識脂質 (リポソーム サイズ決定) の前に徹底的に混合をする必要があります、再構成。
- ガラス製注射器を使用して、脂質極性のクロロホルム在庫転送 200 μ L を 5 mg 因数にガラスの瓶に大腸菌(25 mg/mL) から抽出します。
- 1 mg/mL ユビキノン 10 の 50 μ L を追加 (UQ 10; クロロホルム) UQ 10 の最終的な比率を確認する脂質に: 脂質 1: 100 (1%/w)。
- 脂質/UQ-10 ミックスに 1 mg/mL (0.4%/w) 長波長蛍光色素標識脂質 (FDLL) の 20 μ L を追加します。
- 短いボルテックスによってクロロホルム溶液を均質化し、ほとんどの穏やかな窒素またはアルゴンの流れの下でクロロホルムを蒸発させます。少なくとも 1 時間のための真空の下でそれ以上の蒸発によって完全クロロホルム痕跡を削除します。
注: 脂質因数は-20 ° C で不活性雰囲気下で数ヶ月保存できます。
2. シトクロムbo3の再構成
注: シトクロムbo3 エシェリヒア属大腸菌からの浄化、Rumbleyらからプロトコルに従ってください。15ネイティブに折り返されている酵素試料の高純度を確保するため、Rumbleyらによって記述されたアフィニティ精製ステップ後サイズ排除クロマトグラフィーを追加します。15
- 4、pH 7.4、脂質/UQ-10/FDLL 乾燥の 1 つの因数 (5 mg, 手順 1.4) をミックスし、脂質膜を完全に再停止、超音波浴治療の 2 分後まで渦を混ぜて 40 mm モップ-島/60 ミリメートル K2312.5 μ L を追加します。
- 25 mM 8-ヒドロキシピレン-1,3,6-trisulphonic 酸 (深海) リポソームの内部にカプセル化する必要があります pH 敏感な蛍光染料の 125 μ L を追加します。
- 250 mM n-オクチル-β-d-グルコピラノシド (OGP) 界面活性剤の 137.5 μ l 添加、ボルテックスを使用してミックスし、すべて脂質は界面活性剤ミセルに可溶化できるように 10 分間超音波水浴の超音波。1.5 mL プラスチック チューブに分散を転送します。
注: 脂質の曇った懸濁液界面活性剤で可溶化後透明になります。 - シトクロムbo3の必要な量を追加 (下のメモを参照) (シトクロムbo3ソリューション プラス水) 50 μ L の総ボリュームを作成する超高純度の水を加える。ローラー ミキサー上で 10 分間の 4 ° C で孵化させなさい。
注: 単一の酵素条件の典型的な量は 0.1 – 0.2% (w/w タンパク質-脂質すなわち。 タンパク質の 5-10 μ g) 目標が電気化学の活動 (下記参照) のみを観察する場合は 1-2% (蛋白質の 50-100 μ g) まで増やすことができますが。ネガティブ コントロールとしてシトクロムbo3なしリポソームを用意できます。 - 2 x 50 mg とポリスチレン ビーズの 2 x 100 mg 4 1.5 mL チューブのキャップに重量を量るし、乾燥を防ぐためにパラフィン フィルムを閉じます。
注意: 使用前にポリスチレン ビーズ メタノールで洗浄する必要があります、水、製造元の説明書に従って水に格納されています。
注: 水/ビーズの混合物を使用する場合ポリスチレン ビーズ便利な転送できます広い先端のピペットでキャップします。水は、細い先端にマイクロ ピペットを使用してビーズから削除できます。 - 分散 1.5 mL プラスチック チューブにポリスチレン ビーズとキャップを入れて、秒のカップルのため短いスピンを実行することによって溶解混合物 (ステップ 2.4) にポリスチレン ビーズの 1st50 mgを追加します。4 ° C で30 分の界面活性剤を吸着するポリスチレン ビーズ用ローラー ミキサーで孵化させなさい。
- ポリスチレン ビーズと孵化の追加を次のように繰り返します: マイクロ ビーズの孵化; の60 分の50 mgを追加60 分の孵化; のためのマイクロ ビーズの100 mgを追加します。120 分インキュベーションのためのマイクロ ビーズの100 mgを追加します。
注: プロテオリポソームが形成されて、解決されたマイクロ ビーズ上のソリューションに段階 2.6 半透明なります。
- ポリスチレン ビーズと孵化の追加を次のように繰り返します: マイクロ ビーズの孵化; の60 分の50 mgを追加60 分の孵化; のためのマイクロ ビーズの100 mgを追加します。120 分インキュベーションのためのマイクロ ビーズの100 mgを追加します。
- 細い先端にマイクロ ピペットを使用してポリスチレン ビーズからプロテオリポソーム ソリューションを分離します。だから 20 mM モップ-島/30 ミリメートル K2の 90 mL で分散を希釈4、pH 7.4 (モップ バッファー) と Ti45 の遠心管に移転。
- 遠心型 45 Ti を使用して分散、プロテオリポソームのペレットを 1 時間 (r最大) で 125,000 x g でローター。
注: 大規模なバッファー量の希釈が最終的な懸濁液中でカプセル化された深海の濃度を低減するのに役立ちますは、小さい遠沈管を使用できます。 - 上澄みを廃棄、4、pH 7.4 バッファー (ペレットを再) なし、20 mm モップ-島/30 ミリメートル K2ペレットをすすいでください。洗浄バッファーを破棄した後再薄い先端マイクロ ピペットで来たり、それをピペッティングによるモップ バッファーの 500 μ L で、プロテオリポソームは中止します。1.5 mL プラスチック チューブに転送します。
- 瓦礫の撤去に 12,000 × g で 5 分間懸濁液を遠心します。新しい瓶に上清 (再構成プロテオリポソーム) を転送します。
- 4 ° C で再構成プロテオリポソームの分散は一晩を保存し、2 日以内に使用します。
3. 半透明電極の作製
注: 金の滑らかな表面は平坦界面を有するシリコンウェハから 99.99% 金の 30 nm 厚層のテンプレート除去法によって得られます。半透明蛍光観察を許可することはする必要がありますので、金の層の小さい厚さは重要です。金蒸着 (PVD 物理蒸着法) の詳細見つけることができます他の場所で16とだけテンプレート除去はここで覆われています。また、超滑らかなゴールド チップ購入できます他の場所 (材料の表を参照してください)。
- 最大 9 ガラス カバー スリップ (厚さ 0.17 mm) bi コンポーネント低蛍光エポキシ樹脂を用いた蒸着金表面に接着します。4 h で 80 ° C で接着剤を治します。
- 自己組織化単分子膜 (ステップ 4) 変更の直前に刃を持つシリコン基板からガラス カバー スリップをデタッチします。カバー スリップの薄さのためには、割れていない、またはスライド ガラスを破るにカバー スリップを取り外す際に世話します。
4. 自己組織化単分子膜 (SAM) 金表面の改質
- 1 mM 6 mercaptohexanol (6MH) 水溶液 5 mL を準備します。
- 6MH ソリューションに新鮮な戸建ゴールド コーティング カバー スリップ (ステップ 3.1) を浸し、一晩 20-25 ° c を残す (> 16 h) SAM を形成します。
注: チオール ソリューション ゴールド コーティング カバー スリップをインキュベートするとき密閉容器を使用する必要がありますので、不快な臭いがあります。 - 次の日、ゴールド コーティング カバー スリップを 6MH ソリューションから削除、水やメタノールとし、イソプロパノールを簡単に洗います。穏やかな気流下で乾燥。
5. 電気化学プロテオリポソーム アクティビティのテスト
メモ: 酵素の電気化学の活動は密接に詰まったたくさんのリポソーム層 (手順 5) 検証最初、下の小胞のカバレッジは、リポソーム (手順 6) の内腔の pH 変化を測定する実験では単一の小胞使用されます。
- 分光電気化学セルのゴールド コーティング カバー スリップを組み立てる (図 1参照)。作るゴム o リングによって定義される領域外フラット ワイヤの金目たるへのお問い合わせ。
- 電解質緩衝液 2 mL を追加し、セルの参照と補助電極を配置します。
注: ディスカッション セクションとしてさらに説明されて、参照電極塩化せず Au (I) 電気化学の間に Cl の形成を防ぐことが推奨されます。ここでは、Hg/Hg2SO4 (土。K2SO4) 参照電極を用いるし、電位は標準水素電極 (SHE) 対使用する与え 0.658 V 対彼女 Hg/Hg2その4 (土。K24)。 - オープンセル潜在的な (OCP) 潜在的なサムの品質を評価するために電気化学インピー ダンス分光法 (0.1 Hz から 100 kHz) を実行します。インピー ダンス値をアドミタンスに変換、コール ・ コール プロット、ω は周波数をプロットする 2πω で割ります (以下の16,17,18変換やインピー ダンスの解釈の詳細については参照を参照してください。スペクトル)。
注: 6MH の小型・高密度の Sam が近くへ与えコール ・ コール プロットの半円形、範囲中のキャパシタンス値 2.5 3.0 μ F/cm2 (図 2 a)。半円形の形や範囲外の容量値からの重要な偏差が得られる場合は、電極を変更します。 - スキャン率 100 と 10 mV/s の潜在的な地域-0.3 – 空白サイクリックボルタモ (CVs) を実行 0.8 V。一般的な履歴書は、(図 2 b破線) に表示されます。
注: ここで使用されるには、ほぼ純粋な容量性挙動と周囲の酸素条件下においても、重要なファラデー電流の不在のこれも示す必要があります。 - 電気化学セルにプロテオリポソーム (0.5 mg/mL 最終脂質濃度、シトクロムbo3脂質の 1-2% (w/w) 比) を加え、ピペットで少し混ぜます。プロテオリポソーム電極表面上の吸着が完成 (室温で 30-60 分) まで待ちます。
注: 手順に従うプロテオリポソーム吸着時に 10 mV/s でサイクリックボルタモ (CVs) を実行できます。吸着は、連続した CVs の変更を停止すると終了します。履歴書のテクニックに関する情報は、次の教科書で見つけることが。19,20 - 10 回以上の緩衝液を変更することによりセルを洗う、電極表面を完全に乾燥に放置しないでください。
- OCP (図 2 aブルーライン) 金電極上の SAM は変更されませんを確認するために電気化学インピー ダンス分光法を実行し、履歴書とスキャン レート 10 と 100 mV/s シトクロムによる触媒ユビキノール酸化 (と酸素還元) を観察するにはボー3発症電位 0 V 対彼女について電気化学的キノン還元) (図 2 b)。
6 酵素のプロトン蛍光顕微鏡によるポンプの検出
- 手順 5 がステップ 5.5 (すなわち、5 μ G/ml) と比較して少ないプロテオリポソーム x 100 を使用してのように金電極を変更します。単一の酵素研究脂質比率 0.1 から 0.2 にシトクロムbo3で下げ % (w/w)。
注: リポソームまばら蛍光顕微鏡による単一の小胞の監視を有効にする電極表面吸着されます。これらの単一酵素条件下で電極表面に固定化した酵素の量は触媒電流の観測のために十分ではありません。 - イマージョン オイルのドロップで倒立蛍光顕微鏡の石油目的 (60 X) に電気化学セルを配置します。FDLL 蛍光性のための適切なフィルターを使用して、電極表面に焦点を当てます。単一リポソームは、対物/レンズの回折限界で明るいスポットとして表示されます。FDLL 蛍光性のイメージを取る。
- 深海蛍光がはっきりと見えるように、背景から区別可能であることを確認するための顕微鏡の深海蛍光フィルター セットのいずれかに切り替える (選択した露光時に手順 6.4 を参照)。場合ではない場合は、光の強度を高めます。
- 深海フィルタ セットの 2 つを交互に時限画像集録を実行する顕微鏡のソフトウェア プログラム (メニューアプリケーション |Define/Run ND 獲得)。最低限画像買収の間の遅延を設定します。この実験では、1 秒露出と 0.3 秒遅れ (砲塔の動き) を使用します。
注: これらの 2 つのチャネルでの蛍光強度比が後に各時点でのリポソーム内 pH に変換されます。買収の期間、予想される pH 変化率によって異なります5 分は、この資料で使用されます。 - 画像の取得中に可能性を変更する、ポテンシオスタットの設定を調整します。たとえば、この実験では、次の順序を使用: 0-60 s: 潜在的な適用されません (すなわちOCP);60-180 s:-0.2 V (対彼女);180-300 s: 0.4 V (対彼女)。この場合は、2 番目のフェーズでのみ適用される可能性 (-0.2 V 対彼女) キノン プールを効率的に削減するだけで十分です。
- 同時に両方の測定を手動で開始して時限画像集録 (顕微鏡) および潜在的なシーケンス (ポテンシオスタット) を同時に実行します。
注: 実験繰り返すことができます同じ電極にいくつかの時間表面に顕微鏡ステージを別の領域に移動します。買収の間の遅延は、リポソーム表面に完全な pH 平衡を保証するために、少なくとも 5-10 分をする必要があります。取得中に深海のフォトブリーチングによる限られたがイメージングの時間、期間が異なると潜在的なパターンを必要に応じて適用できます。
7. 蛍光画像の解析
注: 典型的な実験は 2 つのチャネル、すなわち、それぞれの時間ステップ (例えば2.6 秒) 画像のセットを生成 (期間 * 2/2.6) の画像。設定が記録される単一の酵素の実験中にこのような画像の例は、研究データ リーズ リポジトリ21を介してアクセスできます。画像処理は、フィジー (ImageJ) とプログラミング言語ソフトウェア (ソフトウェアをスクリプトとして詳細については材料の表を参照するくださいと今後は呼ばれる) 高度な数学的分析を使用していくつかの手順で構成されます。
- フィジーを使用して、別の時間の経過ファイル、イメージを合わせ、別々 のチャンネルと時間枠として保存します。
- フィジーの内で提供される Bioformats インポーターを使用して開いている時間の経過ファイル (マクロ コマンド: 実行 (「バイオ フォーマット インポーター」)).
- StackReg プラグインを使用して可能な段階の動きを考慮して最初の 1 つに各フレームを配置するまたは買収時に発生した熱のドリフト (マクロ コマンド: 実行 ("StackReg"、"変換翻訳を ="))。
- 各チャンネル、時間ステップごとの個別の非圧縮画像ファイルを TIFF 形式で 1 つのフォルダーに保存します。
- 時間経過ファイル メタデータから各フレームの正確なタイムスタンプを抽出し、画像と同じフォルダーに CSV ファイルとして保存します。また、タイムスタンプ取得ソフトウェアを使用してを抽出し、表計算ソフトを使用して CSV ファイルを手動で保存します。
注: イメージとタイムスタンプを持つフォルダーはスクリプトのソフトウェアで分析する準備ができました。7.1.1 の手順を実行します。-7.1.4。フィジーのスクリプトを使用して自動化することができます (時間経過ファイルのバッチ処理を提供するために、Python で書かれたスクリプト"Ctrl-shift キー-N"(Windows) で、ファイルを使用して、|開いているスクリプトをロードする)。
- 画像の自動化処理のためのスクリプティングのソフトウェアを使用します。ソフトウェアに用意されているコードを読み込むし、最後に実行] をクリックします。プロンプトが表示されたら、手順 7.1 から画像を含むフォルダーを選択します。
注: 解析用のスクリプトは、単一リポソームを識別、それらを合わせて 2D ガウス関数、それらをフィルタ リング、時間の各ポイントで pH 値を定量化するための広範なコメント、mlx 形式ライブ スクリプトとして提供されます。次のサブ手順は、スクリプトによって自動的に実行されます。- 単一の実験のすべてのタイム フレームの画像をメモリに読み込みます。
- 単一チャネル (選択最高の蛍光強度のチャネル) のすべての画像を平均し、単一リポソームに対応するすべての最大値を識別するために平均化されたイメージを使用します。
- フィット 2D ガウス平均画像を特定の最大値機能し、保存、結果に合わせて各リポソームのパラメーター (装備リポソームたとえば図 4 aを参照してください)。
- サイズ、真円度や強度など、予想される単一リポソームの基準の最大値をフィルター処理します。低信号対雑音のため装着が不十分なリポソームを拒否、密接に隣接するリポソームまたはあまりにも画像のエッジに近い。
- タイムスタンプを外部ファイルから読み込むし、各時間枠のイメージに 2D ガウス関数に各フィルターが適用されたリポソームを個別に適合。
注: 並列プログラミング、マルチコア CPU の使用は大きく、この段階で計算速度を向上できます。 - 各時間枠に適用されて手順 7.2.4 と同様の基準に従って再びリポソームをフィルター処理します。
- 時間ステップごとに 2 つのチャンネルを装備の 2D ガウス関数で囲まれたボリュームの比率としてリポソームの蛍光強度比を定義します。2 つの深海チャネルから決定され、校正曲線 (手順 8) の強度の比から pH 値を計算します。リポソームの結果 pH-時間曲線をプロットし、変更可能性が適用されるときの pH を観察します。
8. 深海蛍光の検量線を実行します。
注: 深海蛍光比を小 pH に変換するには、検量線確立されなければならない最初金透過率、フィルター品質など実験の特定の条件を考慮とします。この手順は一回実行される、セットアップと測定パラメーターは手順 6 でそのまま限り校正データを使用できます。
- (シトクロムbo3手順 5 および 6.1 で説明したよう) なしまばらに吸着したリポソームと電極を準備します。
- 濃度 100 ng/mL を作成するバッファーの 2 mL にエタノールで 0.1 mg/mL グラミシジン溶液 2 μ L を追加します。
- 2 つの深海チャネルの 2 つの蛍光画像をキャプチャします。
- 1 M HCl または 1 M H2の小さい因数の添加による細胞の pH を変更するので4。標準的な pH メーターとバッファーの pH を測定し、2 つの深海チャネルの 2 つの蛍光イメージをキャプチャします。
- Ph 6 に 9 の 8.4 の手順を繰り返します。
- 7.2 からアルゴリズムを使用して、フィット、フィルターおよびすべての pH で個々 のリポソームの平均深海蛍光比を計算します。すべてリポソーム上深海比の平均を取る。
- 次のように結果の pH 比依存性に合います。
、、 pKを、 R、とRbがフィッティングします。 - PKは RとRb7.2.7 の手順で個々 のリポソームの深海比を変換に使用します。pH 値。
、、 pKを、 R、とRbがフィッティングします。Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
6MH のサムと金変更カバー スリップ (電極) の品質は、電気化学インピー ダンス分光法による各実験の前にチェックされます。図 2 aは、リポソームが吸着した前後に電気化学インピー ダンス分光法を用いて代表的なコール ・ コール プロットを示しています。サムの品質で十分な場合、インピー ダンス分光法は半円形のコール ・ コール プロットの結果ほぼ純粋な容量性動作を示す必要があります。コール ・ コール プロットで半円の直径 2.5 3.0 μ F/cm2の範囲にあるべき電極表面の二重層容量に等しくなります。容量変更しないでください大幅リポソーム吸着容量のわずかな増加が注意した (高リポソーム カバレッジ、図 2 a下) または低インピー ダンスでのわずかなシフトを観測できます。周波数 (低リポソーム カバレッジ、図 2 a上)。
電気化学は、サイクリックボルタンメトリー測定触媒電流がユビキノール酸素酸化還元酵素活性を反映して、プロテオリポソームのシトクロムbo3の触媒活性をテストする使用できます。しかし、重要な触媒電流は吸着プロテオリポソームの高い量にしか検出されません、金変更カバー スリップ上プロテオリポソームの密接に詰まったたくさんの層が必要です。図 2 bは前に、と後のいずれかの低または高のリポソーム報道リポソーム吸着電極の代表的なサイクリックボルタモ (CVs) を示します。裸の金電極の酸素還元が SAM によって妨げられるので空白の履歴書ファラデー電流をられなかった。ユビキノンの電位 0 V、すなわちの発症可能性で観測リポソーム高いシトクロムbo3コンテンツ (この場合は 1.3% (w/w))、による酸素還元触媒クリア波の表面の飽和時(図 2 bブルーライン) の削減。ユビキノンのプールは、酵素の自然な基質と酵素から電子を電極表面に転送する電子調停として機能します。我々 は高リポソームの適用範囲の下顕微鏡による個々 の小胞の区別はできず、単一リポソーム研究の下位のカバレッジが必要です注意してください。低リポソーム カバレッジ (しかし高蛋白質と脂質の比率) で触媒電流は大幅に低下 (図 2 b, 赤い線) の背景からほとんど区別。単一の酵素の条件 (低蛋白質と脂質の比率) の下で現在の触媒はさらに低いと信頼性をもって測定することはできませんに注意してください。
図 3は、3 つの異なるカバレッジで電極上に吸着したリポソームの蛍光画像を示しています。すべての画像は、同一の光と露出条件で撮影された、その明るさは直接比較を有効にする同様に調整されました。色素含有リポソームは、明るいスポットとして画像に表示されます。イメージの中央部分は、バック グラウンド蛍光レベル (我々 は注意してください、FDLL 比較的ある図 3に完全に photobleached ではない) を明らかにする分のカップルのため photobleached をだった。2 つの深海チャネルのイメージが重なること、場所 2 つのチャネル間の比率 (410/535 と 470/535) pH 7.4 この実験で使用されるに対応します。リポソームの大きい数は FDLL チャンネルで、リポソーム カプセル化された深海のない存在を示して表示されます。深海、FDLL チャンネルの違いよりで発音される高いカバレッジは、おそらく高いリポソームの報道、リポソームがバーストまたは表面に融合する可能性が高いので。
画像解析には、ImageJ では、StackReg のプラグインを使用して (最初のフレーム) に対してフレームの配置が必要です。リポソーム座標を変更する実験のタイム スケール内サンプルのわずかな温度ドリフトが通常発生しますので配置がほとんどの状況で不可欠です。すべてのそれ以上の分析は、スクリプトのソフトウェア コードを使用して実行されます。このコードは、リポソームの自動識別を実行します。リポソームのサイズはアッベ回折限界以下、点広がり関数 (図 4 a) 実際のリポソームの直径よりも大きく、その蛍光が見られます。コードは 2D ガウス関数 (図 4 a) に 2 つのチャネルで各小胞の蛍光強度をフィットし、校正曲線を用いた pH に変換することができます自分の体積強度比を計算します。これらのアクションを実行するとすべての時間枠に、実験 (映画 1) のタイム スケール内のすべての小胞内の pH が得られます。図 4 bは、シトクロムbo3コンテンツが 1.3 %1 つの画像内のすべての小胞 pH 変更の中央分離帯を示しています。(プロトン ポンプ) pH の増加がはっきりと見える-0.1-0.3 V と潜在的な適用は、後半から 0 V、キノン プールを減らすために十分ではありません。シトクロムbo3コンテンツが非常に低い場合 (図 40.1% のタンパク質-脂質比)、中央の曲線になる空リポソーム (図 4) のものとほとんど区別がつかない。個々 の pH 微量ランダム リポソーム (図 5 6、7) を検討する際、違いが明らかになります。シトクロムbo3なしリポソームにノイズ (図 7) に対して重要な pH の変化が表示されますないリポソームの選択 (優性) 増加を示すまたは可能性が pH の低下はその出来高を適用シトクロムbo3 (図 6、灰色ゾーン)。リポソームの pH トレースで明らかな違いは、シトクロムbo3がリポソーム活動の小さなサブセットの存在こそ低蛋白質・脂質比と一貫性が。酵素分子 (約75%) の「外側」の方向を支持する再構成法による pH 上昇減少以上の有病率を説明します。PH 変化を表示するリポソームの割合増加シトクロムbo3と脂質の比率が高い (図 5)。いくつかのリポソームがプロトン ポンプを停止し、潜在的なアプリケーションの終了前にプロトン放熱モードに入るにも注意してください。我々 は陽子リポソーム ルーメン14中に逆流することができます「リーク状態」に入るシトクロムbo3分子にこの動作を属性します。
フィッティングやプロトン ポンプ/漏れ率の定量など pH トレースの詳細な分析を行うことができます我々 は以前14,22を公開しているし、研究データ リーズ リポジトリから取得することができますスクリプトを使用して23,24。
図 1: 法の原則です。(単一の酵素の活動の監視の原則 A) と (B) 断面図でこの作業のセルの内部の一部を示すため使用実験のセットアップの方式。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: リポソームの電気化学応答します。(A) コール ・ コール プロットは、リポソームの前後に OCP (0.22 V 対彼女; 黒平方線) で測定 (1.3%/w シトクロム bo3) 濃度 5 μ G/ml (赤丸線) と 500 μ G/ml (青色の円ライン) の溶液からの吸着。(B) 100 mV/秒 (左側のパネル) のサイクリックボルタモと 10 mV/s (右側のパネル) Au sam (黒破線) リポソームの前後 (1.3%/w シトクロム bo3) 濃度 5 μ G/ml (赤い線) と 500 μ G/ml (青線) のソリューションからの吸着。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3: リポソームの蛍光顕微鏡像。異なる表面カバレッジでリポソームの蛍光画像: 表面 5 μ G/ml (上段)、20 μ G/ml (中段) と 500 μ G/ml (下の行) のリポソーム ソリューションで 30 分インキュベートします。左の列は 470/535 nm 励起/蛍光フィルター セットアップ (1st深海チャネル) に対応します。中央の列 - 410/535 nm (2nd深海チャネル)。右側の列 - 560/645 nm (FDLL チャンネル)。画像は、1 秒露出と同様の光強度 (目的と、カメラの前に顕微鏡による 1.5 倍の倍率 X 60)、X 90 の倍率で撮影されました。スケール バーは、50 μ m に対応この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 4: リポソーム及び pH 変更します。(A) 典型的な単一リポソームを含む蛍光画像の一部の 3 D ビュー。その蛍光強度は、点広がり関数 (表面色) 2 D ガウス関数 (ブラック メッシュ) に取り付けられているように見られています。(B D) pH、異なる応用電位に (通常数百) 単一のイメージ領域内のすべての小胞の中央値として表示されます。0-60 s から潜在能力は適用されません (OCP)。60 と 180 s (グレーゾーン) の間異なる電位が適用された: 0 V (ブラック)-0.1 V (赤)-0.2-0.3 V (青) (緑)、V。180 と 300 の間 s、0.4 V対。彼女が適用されました。脂質比のシトクロムbo3が (B) (C) 1.3% 0.1%、(D) 0%。トレースは、わかりやすくするため相殺されます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 5: pH 微量酵素の 1.3% を含むリポソーム。PH の痕跡は、シトクロムbo3 (1.3%/w) を測定し、1 つの実験の時に分析を含む、ランダムに選択された、72 の単一リポソームの変更します。0-60 s から可能性がない (OCP) を適用;60 と 180 s (グレーゾーン) 間-0.2 V対。彼女;180 と 300 の間 s、0.4 V対。彼女が適用されました。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 6: pH 微量酵素の 0.1% を含むリポソーム。PH の痕跡は、シトクロムbo3 (0.1%/w) を測定し、1 つの実験の時に分析を含む、ランダムに選択された、72 の単一リポソームの変更します。0-60 s から可能性がない (OCP) を適用;60 と 180 s (グレーゾーン) 間-0.2 V対。彼女;180 と 300 の間 s、0.4 V対。彼女が適用されました。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 7: pH 微量酵素なしリポソーム。ランダムに選択すると、シトクロムbo3を測定し、1 つの実験の時に分析せず、72 の単一リポソームの pH 変化の痕跡。0-60 s: から可能性がない (OCP) を適用;60 と 180 s (グレーゾーン) 間-0.2 V対。彼女;180 と 300 の間 s、0.4 V対。彼女が適用されました。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
映画 1: 単一リポソーム pH 変化のアニメーションします。(上部パネル)300 の中に、(対応する領域の 3 D 表面プロットとして表示)、2 つの深海チャネルのリポソーム蛍光の変化実験の s。還元電位は 60 間適用された s と 180 秒と時間の 2 つの深海チャネルの体積強度比の (底板) 対応するプロット。還元の潜在的なアプリケーションの領域は、灰色で網掛けされています。してくださいここをクリックしてこのビデオを表示します。(右クリックしてダウンロード)
補足ファイル。ファイルをダウンロードするここをクリックしてください。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
記載されているメソッドは、プロトン ポンプ リポソームに再構成することができます呼吸膜タンパク質の研究に適してキノン プールと電子を交換することができます。プロトン ポンプ機能は、pH に敏感な (レシオ) 染料リポソーム ルーメン (図 1 a) でカプセル化を使用して単一酵素レベルで監視できます。
メソッドは、サム18電極と電子を交換する脂質二重膜に組み込まれて、ユビキノン (または他のキノン) の能力に依存します。SAM 修飾金電極のプロパティは非常に固有です。リポソームは、吸着、サムと SAM に痩せて急速な酸化とリポソームのキノン プールの縮小を有効にする必要がありますする必要があります。重要なは、電極とリポソームとの相互作用は脂質の膜の整合性を損なわない十分に弱い必要があります。さらに、実験システムの詳細に応じていることが望ましい酸素還元などの側の金触媒反応に SAM の防ぐことができます。最後に、SAM を使用する潜在的なウィンドウ内で安定している必要があります。高品質サム 6MH の超フラット金電極の使用は、シトクロムbo3の場合これらの要件を満たしています。インピー ダンス スペクトルによって示されるように、近い理想的なサムと超スムーズなゴールド サーフェスを作成します原子レベルで平坦シリコン基板から電極を除去します。水で 6MH からサムを形成することに注意してください。我々 はイソプロパノール166MH と Sam に報告したが、Sam 二重層容量値が大きいほどより異種表面を示すインピー ダンス スペクトル (すなわち。、より多くの欠陥) より低い抵抗。さらに、6MH から Sam に水溶液から準備が、少ない背景酸素減少 (金触媒の酸素還元) が観察される Sam と比較してエタノール/イソプロパノール溶液から形成されます。すべてのこれらの観察は、6MH 水溶液中からの Sam が少ない欠陥を備えた高品質であることを示します。高品質の Sam は、長いアルカン鎖 (例えば1-ヒドロキシ-デカン-チオール)、チオール化合物から形作ることができるが、サムの厚みが増すに従って、電子伝達速度の低下します。
(分光) 電気化学の間に彼らはおそらく SAM の品質の悪化、高電位で金の表面に chemosorb 可能性がありますので緩衝溶液に塩化物イオンを避けてください。同じ理由で、塩化物自由参照電極が優先されるべき。
もう一つの重要なポイントは、陽子は、実験のタイム スケールで酵素のプロトン透過経路陽子蓄積を許可するように十分に低くする必要があるリポソームの背景透過性です。正確な脂質はこの透過性に影響を与えます。私たちの仕事では極大腸菌を使用ユビキノン 10 添加脂質抽出物。ただし、これより複雑な脂質組成26の研究で否定されたが、脂肪酸のチェーン長さ25に強く依存するプロトン透過性を示されています。興味深いことに、ユビキノン最近27膜安定性を高めるために示されています。最後に、タンパク質再構成手順から残留洗剤はプロトンの流出に影響を与えるし、それ故に洗剤をできるだけ疎水性ポリスチレン ビーズ、遠心分離によって続いて希釈を使用して完全に削除することが重要だと徹底的に洗浄電気化学セルのプロテオリポソームは表面に吸着した後。場合、疑わしいリポソーム透磁率は外部 pH ジャンプ28に応えて (深海) 経由で内腔 pH 変化に従うことによって確認できます。
Unilamelar リポソームと小さいリポソームは内腔の体積が減少としてより速くまたはより高い pH の変化を示すと予想されて単一の酵素測定が必要です。そのためには、ポリスチレン ビーズがリポソーム形成の遅い速度につながる少量で徐々 に追加されます。70 の平均粒径とそのような条件で均一サイズの小さなリポソームを形成 nm と私たちのケース140.24 の多分散性のインデックス。深海にも洗剤を吸着するポリスチレン ビーズの容量削減ポリスチレン ビーズに吸着します。したがって、その損失を補うため余分なポリスチレン ビーズを追加する必要があります。ポリスチレン ビーズを治療していた (3-4 mM 5 mM) から約四分の一によって脂質タンパク質懸濁液で深海濃度を低減する.以来、リポソームはポリスチレン ビーズで治療の初期に形成され、リポソームのルーメンにおける実際の深海濃度は高いかもしれない。深海、代わりに他の pH 感受性色素を使用できます。ただし、色素が膜不浸透性が重要ですし、レシオ メトリック。後者は、退色とカプセル化された色素の変化量による実験的エラーを回避できます。
推定, 確率的非空リポソームのほとんどが 1 つだけの酵素分子を含むかどうか、簡単な計算が可能です。平均リポソーム直径 70 と仮定すると nm の, 750 Da の脂質分子の重量と 0.65 nm2の脂質領域与える私たち 5.2x10-17 g の準備 (脂質の 5 mg) あたりすなわち、 9.6x1013リポソーム リポソーム質量。シトクロムbo3 0.1% (MW = 144 kDa)、0.2 蛋白質: リポソーム比に対応する、2 x 1013酵素分子があります。ポワソン分布を使用して、1 つがさらに計算を 1 つの酵素の分子 (17%) を見つける確率リポソームあたり 1 つ以上の分子 (1.7%) を見つける確率の 10 倍以上です。酵素と対応するアッセイから決定再構成中に脂質の損失を考慮する場合より正確な計算を行うことができます。蛋白質の試金から、準備されたリポソームの FDLL 蛍光を測定することによって、後者を推定されることができます。
プロトコルが確立され、単一の酵素のトレースが記録されます、さらにメソッドの変更は目的に応じて可能です。1 つは、酵素阻害剤の添加や、イオノフォアのシステムへの導入について考えるかもしれない。溶剤添加イオノフォアを準備するために使用または、SAM の状態やリポソームの透過性阻害剤在庫に影響しないことを確認するには、注意が必要です。
ここで説明したテクニックは、膜プロトン輸送体とキノン変換酵素の特定のグループに限定されます。装置と実験条件ここで使用されるがシトクロムbo3の酵素活性のために最適化されました。、時間分解能が 2-3 秒、露出時間とフィルターを変更する砲塔にかかる時間によって決まります。実験の期間は蛍光色素の退色と、したがって、光の強度によって制限です。我々 は以前、シトクロムbo3 20 陽子/s まで活動が検出されたが、73 ± 2.2 陽子/秒このテクニックを使用する平均陽子移行率を発見しました。どちらかのもっとまたはより少なく活動に酵素のこれらの技術を使用して、画像集録パラメーターが調整されなければならない (すなわち。、光の強度、露光時間とテスト期間)。将来的に、このメソッドを拡張できますプロトン ポンプ酵素、ミトコンドリア複合体をされている例を運転その他電子輸送に向けて私。他の酵素は別の再構成のプロトコルを必要があります、これがそれぞれ異なるトランスポーター用に最適化する必要があります。キノン変換はプロトン ポンプ酵素ことができます学び、例えば、 ATP 駆動29、この場合電気プロトン透過経路をトリガーできませんが (例えばATP) イニシエーター添加が必要です。後者の場合、金変更カバー スリップを使用する必要はありません。また、適切な不透水膜とイオンに敏感な蛍光染料を使用すると、このメソッドは他のイオン ポンプ、例えば、ナトリウムおよびカリウムを拡張できます。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
著者は、BBSRC (BB/P005454/1) の金融支援を認めます。NH は、VILLUM 財団若手研究者プログラムによって資金を供給されました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6-Mercapto-1-hexanol (6MH) | Sigma | 451088 | 97% |
| 8-hydroxypyrene-1,3,6-trisulphonic acid (HPTS) | BioChemika | 56360 | |
| Aluminium holder (Electrochemical cell) | Custom-made | 30x30x7 mm; inner diameter: 26 mm; hole diameter: 15 mm | |
| Auxiliary electrode | platinum wire | ||
| Chloroform | VWR Chemicals | 83627 | |
| E.coli polar lipids | Avanti | 100600C | 25 mg/mL in chloroform |
| Epoxy | EPO-TEK | 301-2FL | low fluorescence epoxy |
| Fiji (ImageJ 1.52d) | Required plugins: StackReg and TurboReg (http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg/) | ||
| Filter cube ("ATTO633") | Chroma Technology Corporation | Ex: 620/60 nm; DM: 660 nm; Em: 700/75 nm | |
| Filter cube ("HPTS1") | Chroma Technology Corporation | Ex: 470/20 nm; DM: 500 nm; Em: 535/48 nm | |
| Filter cube ("HPTS2") | Chroma Technology Corporation | Ex: 410/300 nm; DM: 500 nm; Em: 535/48 nm | |
| Filter cube ("Texas Red") | Chroma Technology Corporation | Ex: 560/55 nm; DM: 595 nm; Em: 645/75 nm | |
| Fluorescent dye-labelled lipids (FDLL) | ThermoFisher Scientific | T1395MP | TexasRed-DHPC was used in this work (λexc 595 nm; λem 615 nm) |
| Fluorescent dye-labelled lipids (FDLL) (alternative) | ATTO-TEC | AD 633-161 | ATTO633-DOPE can be used as alternative (λexc 630 nm; λem 651 nm) |
| Gel filtration column | GE Healthcare | 28-9893-33 | HiLoad 16/600 Superdex 75 pg, for additional protein purification |
| Glass coverslips | VWR International | 631-0172 | No 1.5 |
| Glass syringe | Hamilton | 1725 RNR | 250 µL |
| Glass vials | Scientific Glass Laboratories Ltd | T101/V1 | 1.75 mL capacity |
| Gold | GoodFellow | 99.99% | |
| Gramacidin | Sigma | G5002 | |
| Mercury sulfate reference electrode | Radiometer (Hash) | E21M012 | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | Minispin NL040 | |
| Microscope | Nikon | Eclipse Ti | |
| Microscope Camera | Andor | Zyla 5.5 sCMOS | |
| Microscope Lamp | Nikon | Intensilight C-HGFI | |
| NIS-Elements AR 5.0.2 | Nikon | Microscope acquisition software | |
| n-Octyl β-D-glucopyranoside | Melford Laboratories | B2007 | |
| Nova 1.10 | Metrohm | Potentiostat control software | |
| Objective | Nikon | Plan Apo λ 60x/1.4 oil | |
| OriginPro 2017 | OriginLab | Plotting software | |
| O-ring (Electrochemical cell) | Orinoko | Inner diameter: 16 mm; cross section: 1.5 mm | |
| Plastic tubes | Eppendorf | 3810X | 1.5 mL |
| Polystyrene microbeads | Bio-RAD | 152-3920 | Biobeads, 20-50 mesh |
| Potentiostat | Metrohm Autolab | PGSTAT 128N | |
| Potentiostat | CH Instruments | CHI604C | |
| Scripting software | Matlab | R2017a | Required toolboxes: 'Image Processing Toolbox', 'Parallel Computing Toolbox', 'Curve Fitting Toolbox', 'System Identification Toolbox', 'Optimization Toolbox' |
| Silicon wafers | IDB Technologies LTD | Si-C2 (N<100>P) | Ø 25 mm, 525 um thick |
| Teflon cell (Electrochemical cell) | Custom-made | Outer diameter: 26 mm; inner diameter: 13.5 mm | |
| Temple-Stripped Ultra-Flat Gold Surfaces | Platypus Technologies | AU.1000.SWTSG | Alternative ready-to-use ultra-flat gold surfaces (Thickness below 100 nm on demand) |
| Thin micropipette tips | Sarstedt | 70.1190.100 | or similar gelloader tips 200 µL |
| Ubiquinone-10 | Sigma | C-9538 | |
| Ultracentrifuge | Beckman-Coulter | L-80XP | with Ti 45 rotor |
| Ultrasonic bath | Fisher Scientific | FB15063 |
References
- Claessen, V. I., et al. Single-Biomolecule Kinetics: The Art of Studying a Single Enzyme. Annual Review of Analytical Chemistry. 3 (1), 319-340 (2010).
- Rojek, M. J., Walt, D. R. Observing Single Enzyme Molecules Interconvert between Activity States upon Heating. PLoS ONE. 9 (1), e86224 (2014).
- Velonia, K., et al.
- Lu, H. P., Xun, L., Xie, X. S. Single-molecule enzymatic dynamics. 282 (5395), Science. New York, N.Y. 1877-1882 (1998).
- Engelkamp, H., Hatzakis, N. S., Hofkens, J., De Schryver, F. C., Nolte, R. J. M., Rowan, A. E. Do enzymes sleep and work? Chemical Communications. 9 (9), 935-940 (2006).
- Boukobza, E., Sonnenfeld, A., Haran, G. Immobilization in Surface-Tethered Lipid Vesicles as a New Tool for Single Biomolecule Spectroscopy. The Journal of Physical Chemistry B. 105 (48), 12165-12170 (2001).
- Hsin, T. -M., Yeung, E. S.
- García-Sáez, A. J., Schwille, P. Single molecule techniques for the study of membrane proteins. Applied Microbiology and Biotechnology. 76 (2), 257-266 (2007).
- Onoue, Y., et al. A giant liposome for single-molecule observation of conformational changes in membrane proteins. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1788 (6), 1332-1340 (2009).
- Jefferson, R. E., Min, D., Corin, K., Wang, J. Y., Bowie, J. U. Applications of Single-Molecule Methods to Membrane Protein Folding Studies. Journal of Molecular Biology. 430 (4), 424-437 (2018).
- Rigaud, J. L., Pitard, B., Levy, D. Reconstitution of membrane proteins into liposomes: application to energy-transducing membrane proteins. BBA - Bioenergetics. 1231 (3), 223-246 (1995).
- Jesorka, A., Orwar, O. Liposomes: Technologies and Analytical Applications. Annual Review of Analytical Chemistry. 1 (1), 801-832 (2008).
- Seddon, A. M., Curnow, P., Booth, P. J. Membrane proteins, lipids and detergents: Not just a soap opera. Biochimica et Biophysica Acta - Biomembranes. 1666 (1-2), 105-117 (2004).
- Li, M., et al. Single Enzyme Experiments Reveal a Long-Lifetime Proton Leak State in a Heme-Copper Oxidase. Journal of the American Chemical Society. 137 (51), 16055-16063 (2015).
- Rumbley, J. N., Furlong Nickels, E., Gennis, R. B. One-step purification of histidine-tagged cytochrome bo3 from Escherichia coli and demonstration that associated quinone is not required for the structural integrity of the oxidase. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Protein Structure and Molecular Enzymology. 1340 (1), 131-142 (1997).
- Jeuken, L. J. C., et al. Phase separation in mixed self-assembled monolayers and its effect on biomimetic membranes. Sensors and Actuators, B: Chemical. 124 (2), 501-509 (2007).
- Barsoukov, E., Macdonald, J. R. Impedance Spectroscopy Theory, Experiment, and Applications. , John Wiley & Sons. Chapters 1-2 (2005).
- Jeuken, L. J. C., Connell, S. D., Henderson, P. J. F., Gennis, R. B., Evans, S. D., Bushby, R. J.
- Compton, R. G., Banks, C. E. Chapter 4. Understanding voltammetry. , World Scientific Publishing Europe Ltd. Singapore. (2018).
- Girault, H. H. Chapter 10. Analytical and Physical Electrochemistry. , EPFL Press. Lausanne. (2004).
- Mazurenko, I., Jeuken, L. J. C. Timelapse (movie) of single vesicles fluorescence change upon potential application. , (2018).
- Li, M., Khan, S., Rong, H., Tuma, R., Hatzakis, N. S., Jeuken, L. J. C. Effects of membrane curvature and pH on proton pumping activity of single cytochrome bo3enzymes. Biochimica et Biophysica Acta - Bioenergetics. 1858 (9), 763-770 (2017).
- Li, M., Tuma, R., Jeuken, L. J. C. MATLAB code for the analysis of proton transport activity in single liposomes. , (2017).
- Li, M., Tuma, R., Jeuken, L. J. C. Time-resolved fluorescence microscopic data (traces) of individual lipid vesicles with proton transport activity. , (2017).
- Paula, S., Volkov, A. G., Van Hoek, A. N., Haines, T. H., Deamer, D. W. Permeation of protons, potassium ions, and small polar molecules through phospholipid bilayers as a function of membrane thickness. Biophysical Journal. 70 (1), 339-348 (1996).
- Brookes, P. S., Hulbert, A. J., Brand, M. D. The proton permeability of liposomes made from mitochondria) inner membrane phospholipids: No effect of fatty acid composition. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1330 (2), 157-164 (1997).
- Eriksson, E. K., Agmo Hernández, V., Edwards, K. Effect of ubiquinone-10 on the stability of biomimetic membranes of relevance for the inner mitochondrial membrane. Biochimica et Biophysica Acta - Biomembranes. 1860 (5), 1205-1215 (2018).
- Seneviratne, R., et al. A reconstitution method for integral membrane proteins in hybrid lipid-polymer vesicles for enhanced functional durability. Methods. , 1-8 (2018).
- Veshaguri, S., et al. Direct observation of proton pumping by a eukaryote P-type ATPase. Science. 351 (6280), 1-6 (2016).
