Summary
Vi præsenterer her, en protokol for at studere den molekylære mekanisme af proton translokation over lipid membraner af enkelt Liposomer, ved hjælp af cytokrom bo3 som et eksempel. Kombinere elektrokemi og Fluorescens mikroskopi, pH-ændringer i lumen af enkelt blærer, der indeholder én eller flere enzym, kan registreres og analyseres individuelt.
Abstract
Proton-pumpe enzymer af elektron overføre kæder par redox reaktioner på proton translokation på tværs af membranen, oprettelse af proton-drivkraft til ATP produktion. Amphiphilic karakteren af membranproteiner kræver særlig opmærksomhed på deres håndtering og rekonstituering i naturlige lipid miljøet er uundværlig, når man studerer membran transport processer som proton translokation. Vi detalje her, en metode, der har været brugt i efterforskningen af den proton-pumpe mekanisme af membran redox enzymer, tager cytokrom bo3 fra Escherichia coli , som et eksempel. En kombination af elektrokemi og Fluorescens mikroskopi bruges til at styre redox delstaten Quinon pool og overvåge pH ændringer i lumen. På grund af den rumlige opløsning af fluorescerende mikroskopi, kan hundredvis af Liposomer måles samtidigt mens enzym indhold kan skaleres til en enkelt enzym eller transporter pr. Liposom. Respektive enkelt enzym-analyse kan afsløre mønstre i enzym funktionelle dynamik, der ellers kan være skjult af funktionsmåden for hele befolkningen. Vi omfatter en beskrivelse af et script til automatisk billedanalyse.
Introduction
Oplysninger om enzym mekanismer og kinetik er normalt fremstillet på ensemble eller overordnet niveauet med enzym indbyggertal i tusinder til millioner af molekyler, hvor målinger repræsenterer en statistiske gennemsnit. Det vides dog, at komplekse makromolekyler såsom enzymer kan demonstrere heterogenitet i deres adfærd og molekylære mekanismer observeret på niveauet ensemble er ikke nødvendigvis gyldig for hvert molekyle. Sådanne afvigelser på enkelte molekyle-skalaen er blevet udførligt bekræftet ved studier af enkelt enzymer med en række forskellige metoder ved at opstå i løbet af de sidste to årtier1. Navnlig, har fluorescens påvisning af individuelle enzymaktivitet været anvendt til undersøge heterogenitet af enzymer aktivitet2,3 eller oplev såkaldte memory-effekt (perioder med høj enzymer aktivitet efterfulgt af perioder med lav aktivitet og omvendt)4,5.
Mange enkelt enzym undersøgelser kræver, at enzymerne, der er immobiliseret på overfladen eller rumligt fast på en anden måde at forblive tilstrækkelig lang i synsfelt for kontinuerlig observation. Enzym indkapsling i Liposomer har vist sig at aktiverer enzymet immobilisering samtidig forhindre eventuelle negative virkninger skyldes den overflade-enzym eller protein-protein interaktioner6,7. Derudover tilbyder Liposomer en unik mulighed for at studere enkelt Membranproteiner i deres naturlige lipid tolagede miljø8,9,10.
En klasse af membranproteiner, transportører, udøver en retningsbestemt translokation af stoffer over cellemembranen, en opførsel, som kun kan studeres, når proteiner er fremstillet i lipid dobbeltlag (fx, Liposomer)11, 12,13. For eksempel, spiller proton translokation, udstillet af flere enzymer af prokaryote og eukaryote elektron transportkæder, en vigtig rolle i cellulære respiration ved at oprette en proton-motiv magtanvendelse for ATPsyntesen. I dette tilfælde er proton pumpe aktivitet koblet til elektron overførslen, selv om de nærmere regler for denne proces ofte er fortsat undvigende.
For nylig har påvist vi muligheden for at par fluorescerende detection med elektrokemi at studere proton pumpe aktivitet af enkelt enzymer i terminal ubiquinol oxidase af Escherichia coli (cytokrom bo3) rekonstitueres i Liposomer14. Dette blev opnået ved indkapsling af en pH-følsom membran-vandtætte fluorescerende farvestof i lumen af Liposomer forberedt fra E. coli polar lipider (figur 1A). Protein beløb var optimeret, så de fleste Liposomer enten indeholdt ingen eller kun én rekonstitueret enzym molekyle (ifølge Poisson-fordelingen). De to substrater af cytokrom bo3 blev fastsat ved at tilføje ubikinon til lipid mix, der dannede Liposomer og (ambient) ilt i løsning. Liposomer er så tyndt adsorberet til et semi-transparent ultra-glat guld elektrode dækket med en selvsamlede éncellelag af 6-mercaptohexanol. Endelig er elektroden monteret i bunden af et simpelt spectroelectrochemical celle (figur 1B). Elektrokemiske kontrol af Quinon pool redox tilstand tillader sig at fleksibelt udløse eller stoppe den enzymatiske reaktion på ethvert tidspunkt, mens pH-følsom farvestof bruges til at overvåge pH ændringer inde i Liposomer som følge af proton translokation af lumen af enzymer. Ved hjælp af fluorescens-intensiteten af en anden, lipid-bundet fluorescerende farvestof, størrelsen og omfanget af individuelle Liposomer kan bestemmes og dermed kvantificering af enzymet proton pumpe aktivitet. Brug af denne teknik, fandt vi især, at cytokrom bo3 molekyler er i stand til at indgå i en spontan læk tilstand, der hurtigt forsvinder proton drivkraft. Målet med denne artikel er at introducere teknikken med enkelt Liposom målinger i detaljer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. forberedelse af et Lipid/UQ-10/FDLL Mix
Bemærk: E. coli lipider bruges til Liposomer forberedelse skal være aliquoted og grundigt blandet med ubikinon-10 (enzym substrat) og lang bølgelængde fluorescerende farvestof-mærket lipider (til Liposomer størrelsesbestemmelse) forud for den rekonstituering.
- Bruger et glas sprøjte, overføre 200 µL chloroform bestand af lipid polar uddrag fra Escherichia coli (25 mg/mL) i hætteglas til at gøre 5 mg delprøver.
- Tilsæt 50 µL af 1 mg/mL ubikinon-10 (UQ-10; i chloroform) til lipider at gøre endelige forholdet UQ-10: lipider 1: 100 (1% w/w).
- Tilføj 20 µL af 1 mg/mL (0,4% w/w) af en lang bølgelængde fluorescerende farvestof-mærket lipid (FDLL) til lipider/UQ-10 mix.
- Homogeniseres chloroform løsning af korte vortexing og fordampe de fleste af chloroform under en blid nitrogen eller argon flow. Fjerne chloroform spor helt af yderligere fordampning under vakuum i mindst 1 time.
Bemærk: Lipid delprøver kan opbevares under en inaktiv atmosfære ved-20 ° C i flere måneder.
2. rekonstituering af cytokrom bo3
Bemærk: Til rensning af cytokrom bo3 fra E. coli, følge protokollen fra Rumbley mfl. 15 for at sikre høj renhed af indbygget foldet enzym prøver, tilføje størrelse-udelukkelse kromatografi efter trinnet affinitet rensning beskrevet af Rumbley et al. 15
- Tilføj 312.5 µL af 40 mM MOPS-KOH/60 mM K24, pH 7,4, skal en alikvot af lipider/UQ-10/FDLL tør blande (5 mg, trin 1.4) og blandes med vortex indtil lipid film er fuldt genopslemmes, fulgt af 2 min af behandling i et ultralydsbad.
- Tilsæt 125 µL af 25 mM 8-hydroxypyrene-1,3,6-trisulphonic syre (HPTS), en pH-følsom fluorescerende farvestof, der skal være indkapslet inde Liposomer.
- Tilføj 137.5 µL 250 mM n-octyl β-D-glucopyranoside (OGP) overfladeaktivt stof, blandes ved hjælp af vortex og Læg instrumenterne i ultralydsbad i en ultralyds vandbad i 10 min at sikre alle lipider er oploeses i overfladeaktivt stof micelles. Overføre spredning til en 1,5 mL plastikrør.
Bemærk: Overskyet suspension af lipider bør være gennemsigtig efter oploesning med overfladeaktivt stof. - Tilføje den nødvendige mængde af cytokrom bo3 (se nedenfor), og der tilsættes ultrarent vand for at gøre en samlet maengde paa 50 µL (cytokrom bo3 løsning plus vand). Der inkuberes ved 4 ° C i 10 min på en valse mixer.
Bemærk: Typisk beløb for enkelt enzym betingelser er 0,1-0,2% (w/w protein til lipid, dvs. 5 – 10 µg protein), selv om det kan forhøjes indtil 1 – 2% (50-100 µg protein), hvis målet er at observere kun den elektrokemiske aktivitet (se nedenfor). Som en negativ kontrol kan være forberedt Liposomer uden cytokrom bo3 . - Afvejes 2 x 50 mg og 2 x 100 mg af polystyren microbeads i fire 1,5 mL-rør caps og lukke med paraffin film til at forhindre udtørring.
Bemærk: Før brug, polystyren microbeads skal vaskes med methanol, vand og opbevares i vand efter producentens manual.
Bemærk: Hvis der anvendes en vand/microbead blanding, polystyren microbeads kan bekvemt overføres til cap med en mikropipette med en lang spids. Vandet kan derefter fjernes fra microbeads ved hjælp af en mikropipette med en tynd spids. - Tilføje en 1st50 mg af polystyren microbeads til rekonstitution blanding (trin 2.4) ved at sætte fælles landbrugspolitik med polystyren microbeads på 1,5 mL-plastik røret med spredning og udføre en kort prøvetur for et par sekunder. Der inkuberes ved 4 ° C på en valse mixer for polystyren microbeads til adsorberes det overfladeaktive stof i 30 min.
- Gentag tilføjelser af polystyren microbeads og inkubationer som følger: tilføje 50 mg af microbeads i 60 min inkubation; Tilføj 100 mg af microbeads i 60 min inkubation; og tilføje 100 mg af microbeads for 120 min inkubation.
Bemærk: Løsningen ovenfor det udlignede microbeads vil slå gennemskinnelige under trin 2.6 som proteoliposomes er dannet.
- Gentag tilføjelser af polystyren microbeads og inkubationer som følger: tilføje 50 mg af microbeads i 60 min inkubation; Tilføj 100 mg af microbeads i 60 min inkubation; og tilføje 100 mg af microbeads for 120 min inkubation.
- Separat proteoliposome løsning fra de polystyren microbeads ved hjælp af en mikropipette med en tynd spids. Fortynd spredning i 90 mL 20 mm MOPS-KOH/30 mM K2så4, pH 7,4 (MOPS buffer) og overførsel i en Ti45 ultracentrifuge tube.
- Ultracentrifuge spredning ved hjælp af Type 45 Ti rotor på 125.000 x g (på rmax) for 1 h at sammenpresse proteoliposomes.
Bemærk: Mindre centrifugeglas kan bruges, selvom fortynding i stor buffer volumen hjælper med at reducere koncentrationen af den ikke-indkapslede HPTS i den endelige suspension. - Supernatanten, skyl pellets med 20 mM MOPS-KOH/30 mM K2så4, pH 7,4 buffer (uden resuspending pellet). Efter kassering føres bufferen, genopslæmmes i proteoliposomes i 500 µL af MOPS buffer af pipettering det frem og tilbage med tynd spids mikropipette. Derefter overføre til en 1,5 mL plastikrør.
- Der centrifugeres suspension for 5 min på 12.000 x g til at fjerne snavs. Overføre supernatanten (rekonstitueret proteoliposomes) ind i en ny hætteglas.
- Gemme den rekonstituerede proteoliposomes spredning ved 4 ° C natten over og brug inden for 2 dage.
3. fabrikation af semi-gennemsigtige guld elektroder
Bemærk: Den glatte guld overflade opnås ved en skabelon stripping metode af en 30 nm tykke lag af 99,99% guld fra en atomically glat silicium wafer. Lille tykkelsen af laget guld er vigtig, da det skal være semi-gennemsigtig til at tillade fluorescens observation. Detaljer af guld fordampning (fysisk dampudfældning, PVD) kan være finde andetsteds16 og eneste skabelon-stripping er dækket her. Alternativt, ultra-glat gold chips kan købes andre steder (Se Tabel af materialer).
- Lim op til 9 glas dækning underkjoler (0,17 mm tyk) på den fordampede guld overflade ved hjælp af bi-komponent lav-fluorescens epoxy. Helbrede lim på 80 ° C i 4 timer.
- Lige før ændring med en selvsamlede éncellelag (trin 4), frigøre glas dækning glider fra silicium wafers med en kniv. På grund af thinness i cover underkjoler, Vær forsigtig ved afmontering dæksel glider ikke knæk eller bryde glas lysbilleder.
4. ændring af guld overflade med selvsamlede éncellelag (SAM)
- Forberede 5 mL vand opløsning af 1 mM 6-mercaptohexanol (6MH).
- Dyp frisk fritliggende Guld-belagte dække underkjoler (trin 3.1) i 6MH løsning og lade ved 20 – 25 ° C natten over (> 16 h) til at danne SAM.
Bemærk: Thiol løsninger har en ubehagelig lugt, så en lukket fartøj skal anvendes, når inkubere Guld-belagte dække slip. - Den næste dag, fjerne den Guld-belagte dække slip fra 6MH løsning, vaske kort med vand eller methanol og derefter med isopropanol. Tør under en blid gasstrømmen.
5. elektrokemiske afprøvning af Proteoliposomes aktivitet
Bemærk: Den elektrokemiske aktivitet af enzymet er først kontrolleret på en tæt pakket Liposomer lag (trin 5) og lavere vesikel dækningsområder anvendes i enkelt vesikler eksperiment til at måle pH-ændringer i lumen af Liposomer (trin 6).
- Samle guld-belagte dække glide i en spectro-elektrokemisk celle (Se figur 1). Skabe kontakt til guld med en flad ledning uden for et område, der er defineret af en gummi O-ring.
- Der tilsættes 2 mL stødpudeopløsning elektrolyt og placere reference og hjælpeansatte elektroder i cellen.
Bemærk: Som yderligere beskrevet i afsnittet diskussion, er referencer elektroder uden chlorid foretrukket at forhindre dannelsen af Au, (I) Cl under elektrokemi. Her, en Hg/Hg2SO4 (sad. K2SO4) referenceelektrode bruges og potentialer er givet versus Standard Hydrogen elektrode (hun) ved hjælp af 0.658 V vs hun for Hg/Hg2SO4 (lør. K2så4). - Køre elektrokemiske impedans spektroskopi (0,1 Hz – 100 kHz) på åbne celle potentielle (OCP) potentiale til at vurdere kvaliteten af SAM. Konvertere impedans værdier til optagelse og dividere med 2πω til at plotte en Cole Cole plot, hvor ω er frekvensen (Se følgende referencer16,17,18 oplysninger om konvertering og fortolke impedans Spectra).
Bemærk: Kompakt og tætte SAM'er af 6MH bør give en tæt til semi-cirkel Cole Cole plot og give kapacitans værdier i intervallet 2,5-3,0 µF/cm2 (figur 2A). Hvis væsentlig afvigelse fra semi-cirkel form eller out-of-range kapacitans værdier er opnået, ændre elektrode. - Køre Tom cyklisk voltammograms (CVs) med scanning satser 100 og 10 mV/s i regionen potentielle -0,3-0,8 V. En typisk CV er vist på (figur 2B, stiplet linje).
Bemærk: Dette bør vise næsten ren kapacitiv adfærd og fravær af signifikant faradaic strøm, selv under luftens ilt betingelser anvendes her. - Tilføj proteoliposomes (0,5 mg/mL endelige lipider koncentration, 1-2% (w/w) forholdet mellem cytokrom bo3 til lipid) til cellen elektrokemiske og bland lidt med en pipette. Vente på adsorptionen af proteoliposomes på elektrode overflade er færdige (30-60 min. ved stuetemperatur).
Bemærk: Cyklisk voltammograms (CVs) på 10 mV/s kan køre under proteoliposomes adsorption at følge processen. Adsorptionen er færdig når fortløbende CVs stopper ændre. Oplysninger om CV teknikker kan findes i de følgende lærebøger. 19 , 20 - Vaske cellen ved at ændre stødpudeopløsning mindst 10 gange, men undgå at efterlade elektrode overfladen helt tørt.
- Køre elektrokemiske impedans spektroskopi på OCP (figur 2A, blå linje) at bekræfte SAM på den guld elektrode forbliver uændret og CVs med scan satser 10 og 100 mV/s at observere katalytisk ubiquinol oxidation (og ilt reduktion) af cytokrom bo 3 på debut potentialer af elektrokemiske Quinon reduktion om 0 V vs hun) (figur 2B).
6. påvisning af enzymatisk Proton pumpe af Fluorescens mikroskopi
- Ændre den guld elektrode som i trin 5, men ved hjælp af 100 x mindre proteoliposomes i forhold til trin 5.5 (dvs., 5 µg/mL). For enkelt enzym undersøgelser, reducere cytokrom bo3 lipid forhold til 0,1-0,2% (w/w).
Bemærk: Liposomer bliver tyndt adsorberes på elektrode overflade gør det muligt enkelt vesikel overvågning af Fluorescens mikroskopi. På disse betingelser, single-enzym er mængden af enzymet immobiliseret på elektrode overflade utilstrækkelig til observation af en katalytisk strøm. - Placer den elektrokemiske celle på olieobjektiv (60 X) af en inverteret fluorescens mikroskop med en dråbe immersionsolie. Ved hjælp af passende filtre til FDLL fluorescens, fokusere på elektrode overflade. Enkelt Liposomer skal vises som lyse pletter på diffraktion grænsen for mikroskopet/mål. Tage et billede af FDLL fluorescens.
- Skifte til en af HPTS fluorescens filter sæt på mikroskop for at kontrollere, at HPTS Fluorescens er klart synlige og kan skelnes fra baggrunden (på den valgte eksponeringstid, se trin 6.4). Øge lysintensiteten, hvis det ikke er tilfældet.
- Programmere mikroskop software til at udføre en tidsindstillet billede erhvervelse af skiftevis to HPTS filter sæt (menu applikationer | Define/Run ND erhvervelse). Indstille forsinkelse mellem billede erhvervelser på minimum. I dette eksperiment, bruge en 1 s eksponering og 0,3 s forsinkelse (på grund af tårn bevægelsen).
Bemærk: Forholdet mellem fluorescens intensiteter på disse to kanaler vil blive senere konverteret til pH inde Liposomer på hvert tidspunkt. Varigheden af erhvervelse kan variere afhængigt af den forventede pH ændring sats; 5 min bruges i denne artikel. - Justere indstillingerne for potentiostat for at ændre mulighederne under image erhvervelse. For eksempel i dette eksperiment, bruge følgende sekvens: 0-60 s: ingen potentiale anvendes (dvs. OCP); 60-180 s:-0.2 V (vs hun); 180-300 s: 0,4 V (vs hun). I dette tilfælde, kun den anvendte potentiale i anden fase (-0.2 V vs hun) er tilstrækkelig til effektivt reducere Quinon pool.
- Køre samtidigt tidsindstillede billeder erhvervelse (mikroskop) og den potentielle sekvens (potentiostat) af manuelt igangsætning begge målinger på samme tid.
Bemærk: Eksperimentet kan gentages på den samme elektrode flere tid ved at flytte mikroskop fase til et andet område på overfladen. Forsinkelsen mellem opkøb skal være mindst 5-10 min at forsikre komplet pH ækvilibrering af Liposomer på overfladen. Forskellige varigheder og potentielle mønstre kan anvendes alt efter behov, selvom imaging tid er begrænset på grund af photobleaching af HPTS under erhvervelse.
7. analyse af fluorescens billeder
NOTE: Et typisk eksperiment producerer en række billeder med en gang trin (f.eks. 2.6 s) for hver af de to kanaler, dvs., (varighed * 2 / 2,6) billeder. Et eksempel på sådanne billede, der registreres i løbet af en enkelt enzym eksperiment kan tilgås via forskning Data Leeds repository21. Et billede behandling består af flere trin ved hjælp af Fiji (ImageJ) og højt niveau matematisk analyse programmering sprog software (fremover kaldet som scripting software, se Tabel af materialer for detaljer).
- Bruge Fiji adskille tid bortfalder fil, justere billeder og gemme som separate kanaler og tidsrammer.
- Åben tid bortfalder fil ved hjælp af Bioformats importør i Fiji (makrokommandoen: køre ("Bio-formater importør")).
- Bruge plugin StackReg til at justere hver ramme til den første, der tages højde for mulige stadium bevægelser eller termisk drift opstod under erhvervelse (makrokommandoen: køre ("StackReg", "transformation = oversættelse")).
- Gemme separat ukomprimerede billedfiler til hver kanal, og hver gang skridt i TIFF-format i en enkelt mappe.
- Uddrag de præcise registreringstidspunkter for hver ramme fra tid bortfalder fil metadata og gemme dem som en CSV-fil i samme mappe som billederne. Alternativt, udtrække tidsstempler ved hjælp af erhvervelse software og gemme manuelt i en CSV-fil ved hjælp af et regneark software.
Bemærk: Mappen med billeder og tidsstempler er nu klar til at blive analyseret af scripting software. Trin 7.1.1. – 7.1.4. kan være automatized ved hjælp af en Fiji script (et script skrevet i Python for batchbehandling af tid bortfalder filer er fastsat, bruge "Ctrl-Shift-N" (i Windows), så fil | Åben hen til ladning skriptet).
- Brug scripting software til automatiseret behandling af billederne. Indlæser den angivne kode til softwaren og klik på Kør til ende. Når du bliver bedt om det, skal du vælge mappen med billeder fra trin 7.1.
Bemærk: Et script for analyse er fastsat som mlx-format live script, med omfattende kommentarer, at identificere enkelt Liposomer, passer dem til 2D-Gaussisk funktion, filtrere dem og kvantificere pH værdierne på hvert tidspunkt. De følgende underordnede trin udføres automatisk af scriptet.- Indlæse alle tidsrammer billeder til et enkelt eksperiment i hukommelsen.
- Gennemsnit alle billeder til en enkelt kanal (Vælg kanalen med den højeste fluorescens-intensiteten) og bruge den gennemsnit billede til at identificere alle beløbsgrænser, der måske svarer til en enkelt Liposomer.
- Passer de identificerede beløbsgrænser på gennemsnit billedet til 2D-Gaussisk funktion og gemme den resulterede passer parametre for hver Liposom (Se figur 4A monteret Liposom f.eks).
- Filtrer beløbsgrænser kriterier forventede enkelt Liposomer som størrelse, cirkularitet og intensitet. Afvise Liposomer, der er dårligt monteret på grund af lavt signal til støj, nøje tilstødende Liposom eller at være for tæt på billedet kant.
- Indlæse tidsstempler fra den eksterne fil og passer hver filtrerede Liposom til 2D-Gaussisk funktion på hver gang indramme billed separat.
Bemærk: Brug af parallel programmering og multicore CPU kan markant forbedre beregningen hastighed på dette stadium. - Filtrer Liposomer igen efter de samme kriterier som i trin 7.2.4 men anvendt til hver tidsramme.
- Hver gang skridt, define fluorescens intensitet forholdet mellem en Liposom som forholdet mellem diskenheder omsluttet af udstyret 2D-Gaussisk funktion på to kanaler. Beregn pH-værdier fra forholdet mellem intensiteter bestemmes ud fra de to HPTS kanaler og ved hjælp af en kalibreringskurve (trin 8). Plot resulterende pH-tid kurver for Liposomer og observere deres pH ændre når potentiale anvendes.
8. udføre en kalibreringskurve af HPTS fluorescens
Bemærk: For at konvertere HPTS fluorescens forholdet til en intravesicular pH, en kalibreringskurve skal først oprettes der ville tage hensyn til særlige forhold af eksperimenter som guld transmittans, filtre kvalitet, osv. Dette trin skal udføres kun en gang eller to gange og kalibreringsdata kan anvendes, så længe parametrene setup og måling forbliver den samme i trin 6.
- Forberede en elektrode med tyndt adsorberet Liposomer (uden cytokrom bo3 som beskrevet i trin 5 og 6.1).
- Tilføj 2 µL af 0,1 mg/mL gramicidin opløsning i ethanol til 2 mL buffer til at oprette koncentration 100 ng/mL.
- Fange to fluorescens billeder for de to HPTS kanaler.
- Ændre pH i cellen ved tilsætning af små prøver af 1 M HCl eller 1 M H2så4. Måle pH-værdien af bufferen med et standard pH-meter og fange to fluorescens billeder for de to HPTS kanaler.
- Gentag trin 8,4 for pH-området 6 til 9.
- Hjælp af algoritme fra 7.2, passer, filtrere og beregne det gennemsnitlige HPTS fluorescens forholdet af individuelle Liposomer på hver pH. Tage HPTS forholdet gennemsnitlige over alle Liposomer.
- Passe den resulterende pH-forholdet afhængighed til følgende ligning:
, hvor pKen, Rasmussenet og Rber montering af parametre. - Bruge pKen, Rasmussenet og Rbtil at konvertere HPTS forholdet mellem enkelte Liposomer taktfast 7.2.7. pH værdier.
, hvor pKen, Rasmussenet og Rber montering af parametre.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Kvaliteten af guld-modificeret dække slip (elektrode) med en SAM af 6MH kontrolleres før hver eksperiment med elektrokemisk impedans spektroskopi. Figur 2A viser repræsentative Cole Cole parceller målt ved hjælp af elektrokemiske impedans spektroskopi, før og efter Liposomer er adsorberet. Hvis kvaliteten af SAM er tilstrækkelig, bør impedans spektroskopi viser en næsten ren kapacitiv opførsel der resulterer i en semi-cirkel Cole Cole plot. Diameteren af halvcirkel i en Cole Cole plot er lig med dobbelt lag kapacitans af overfladen, elektrode, som skal være i området 2.5-3.0 µF/cm2 . Bemærk, at kapacitansen ikke bør ændre væsentligt på Liposomer adsorption, selvom en svag stigning i kapacitans kan observeres (høj Liposomer dækning, figur 2A, nederst) eller en lille forskydning i impedans kan iagttages på lavt frekvenser (lav Liposom dækningsområder, figur 2A, øverst).
Elektrokemi kan bruges til at teste den katalytiske aktivitet af cytokrom bo3 i proteoliposomes, hvor katalytiske strømninger målt med cyklisk voltammetry afspejler ubiquinol-ilt oxidoreductase aktivitet. Dog betydelig katalytisk strømme kan kun påvises ved høje mængder af adsorberet proteoliposomes og et tæt pakket lag af proteoliposomes på guld-modificeret dække spillekupon er nødvendig. Figur 2B viser repræsentative cyklisk voltammograms (CVs) af elektroden før og efter Liposomer adsorption med enten lav eller høj Liposom dækning. Ingen faradaic aktuelle er observeret på tomt CV fordi ilt reduktion af den nøgne guld elektrode er blokeret af SAM. Når overfladen er mættet med Liposomer med høj cytokrom bo3 indhold (1,3% (w/w) i dette tilfælde), en klar katalytisk bølge på grund af reduktion af ilt er observeret med en debut potentiale af 0 V, dvs. potentialet i ubikinon reduktion (figur 2B, blå linje). Ubikinon pool fungerer både som den naturlige substrat for enzymet og som elektron mægler, overføre elektroner fra enzymet elektrode overflade. Vi bemærker at under høj Liposom dækning, ingen sondring af enkelte blærer er muligt ved mikroskopi og lavere dækning er nødvendig for enkelt Liposom undersøgelser. Lav Liposom dækning (men højt proteinindhold lipid-forhold) reduceres den katalytiske aktuelle betydeligt, næsten ikke skelnes fra baggrunden (figur 2B, rød linje). Bemærk at den katalytiske nuværende betingelser enkelt enzym (lavt proteinindhold til lipid ratio), er endnu lavere og ikke kan måles pålideligt.
Figur 3 viser fluorescens billeder af Liposomer adsorberet på elektroderne på tre forskellige dækningsområder. Alle billeder er taget i identiske lys og eksponering betingelser og deres lysstyrke blev justeret lige hen til muliggøre direkte sammenligning. De dye-indeholdende-Liposomer er synlige på billederne som lyse pletter. Den centrale del af billedet var photobleached for et par minutter til at afsløre fluorescens baggrundsniveau (vi bemærke, at FDLL er relativt photostable ikke og photobleached helt i figur 3). Billeder på de to kanaler, HPTS er superimposable, hvor forholdet mellem de to kanaler (410/535 og 470/535) svarer til pH 7,4 anvendes i dette eksperiment. Et større antal Liposomer er synlige med FDLL kanalen, hvilket indikerer tilstedeværelsen af Liposomer, der har ingen HPTS indkapslet. Forskellen mellem HPTS og FDLL kanaler er mere udtalt på højere dækningsområder, muligvis fordi ved høj Liposom dækning, Liposomer er mere tilbøjelige til at briste eller fuse på overfladen.
Billedanalyse kræver tilpasning af rammer (mod den første frame) ved hjælp af ImageJ, plugin StackReg. Justeringen er uundværlig i de fleste situationer, da en lille termisk drift af prøven sker normalt inden for tidsplanen for eksperimentet, ændre Liposom koordinater. Alle yderligere analyser udføres ved hjælp af en software scriptkode. Denne kode udfører automatisk Liposom identifikation. Størrelsen af Liposomer er under abbed diffraktion grænse, er deres fluorescens ses som et punkt spredes funktion meget større end den faktiske Liposom diameter (figur 4A). Koden passer fluorescens-intensiteten af hver vesikel på to kanaler til en 2D-Gaussisk funktion (figur 4A) og beregner deres volumetriske intensitet ratio, der kan konverteres til pH ved hjælp af en kalibreringskurve. Ved at udføre disse handlinger på alle tidsrammer, opnås pH inde hver vesikel inden for tidsskalaen for eksperimentet (film 1). Figur 4B viser medianerne for alle vesikel pH ændringer inden for et enkelt billede når cytokrom bo3 indhold er 1,3%. En stigning i pH (proton pumpe) er klart synlig, når en potentiel mellem-0.1 og -0,3 V er anvendt, men ikke for 0 V siden sidstnævnte er ikke tilstrækkelig til at mindske Quinon pool. Når cytokrom bo3 indhold er meget lavere (protein til lipid ratio på 0,1%, figur 4 c), de mediane kurver blive næsten ikke skelnes fra dem af Tom Liposomer (figur 4D). Forskellen bliver tydelig, når man overvejer individuelle pH spor af tilfældige Liposomer (figur 5, 6 og 7). Mens Liposomer uden cytokrom bo3 viser ingen betydelig pH ændringer med hensyn til støj (figur 7), et udvalg af Liposomer viser en stigning (overvejende) eller et fald i pH når en potentiale er anvendt at actives cytokrom bo3 (tallene 6, grå zone). Den åbenlyse forskel i pH-spor mellem Liposomer er i overensstemmelse med lavt protein til lipid forholdet, hvor cytokrom bo3 er kun til stede i en lille delmængde af Liposomer aktivitet. Forekomsten af en pH stigning over nedgangen kan forklares ved metoden rekonstitution, der favoriserer en "passiv" orientering af enzym molekyler (ca. 75%). Brøkdel af Liposomer, der viser en pH ændringen øger når cytokrom bo3 til lipid ratio er højere (figur 5). Bemærk også at nogle Liposomer stoppe proton pumpe og indgå proton varmeafledning tilstand inden udgangen af den potentielle anvendelse. Vi tillægger cytokrom bo3 molekyler ind i en "lækage stat", som tillader protoner at flyde tilbage i Liposom lumen14denne adfærd.
En yderligere analyse af pH spor herunder deres montering og bestemmelse af proton pumpe/utæt satser kan gøres ved hjælp af et script, vi har offentliggjort tidligere14,22 og kan fås fra forskning Data Leeds Repository 23 , 24.
Figur 1: princippet om metoden. (A) princippet om enkelt enzym Aktivitetsovervågning og (B) ordningen af eksperimentel opsætning bruges i dette arbejde med en cutaway til at demonstrere en indre del af cellen. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: elektrokemiske reaktion af Liposomer. (A) Cole-Cole parceller målt på OCP (0,22 V vs hun, sort firkant linje) før og efter Liposomer (1,3% w/w cytokrom bo3) adsorption fra løsninger i koncentrationer på 5 µg/mL (rød cirkel linje) og 500 µg/mL (blue circle line). B cyklisk voltammograms på 100 mV/s (venstre panel) og 10 mV/s (højre panel) af Au-SAM (sort stiplet linje) før og efter Liposomer (1,3% w/w cytokrom bo3) adsorption fra løsninger på koncentrationer på 5 µg/mL (rød linje) og 500 µg/mL (blå linje). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Fluorescens mikroskopi af Liposomer. Fluorescens billeder af Liposomer på forskellige overflade dækningsområder: overflader inkuberes i 30 min med en Liposomer løsning 5 µg/mL (øverste række), 20 µg/mL (midterste række) og 500 µg/mL (nederste række). Venstre kolonne svarer til 470/535 nm excitation/emission filteropsætning (1st HPTS kanal); midterste kolonne - 410/535 nm (2nd HPTS kanal); højre kolonne - 560/645 nm (FDLL kanal). Billederne blev taget på forstørrelse 90 X (60 X mål og 1,5 X forstørrelse af mikroskop før kameraet), 1 s eksponering og lignende lysintensitet. Skala barer svarer til 50 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Liposom identifikation og pH ændre. (A) 3D-visning af en del af fluorescens billede, der indeholder en typisk enkelt Liposom. Fluorescens intensiteten er set som et punkt spredes funktion (farve overflade), der er monteret på en 2D-Gaussisk funktion (sort mesh). (B-D) pH, vises som medianværdien af alle vesikler i enkelt billedområde (typisk flere hundrede) på forskellige anvendt potentialer. Fra 0-60 s, ingen potentiale er anvendt (OCP). Mellem 60 og 180 Sørensen (grå zone) forskellige potentialer blev anvendt: 0 V (sort),-0.1 V (rød),-0.2 V (grøn), -0,3 V (blå). Mellem 180 og 300 s, 0,4 V vs. Hun blev anvendt. Cytokrom bo3 lipid fordelingerne var (B) 1,3%, (C) 0,1%, (D) 0%. Sporene er forskudt for klarhed. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: pH spor af Liposomer som indeholder 1,3% af enzym. Spor af pH ændring af 72 enkelt Liposomer, tilfældigt udvalgte, der indeholder cytokrom bo3 (1,3% w/w) målt og analyseret under et eksperiment. Fra 0-60 s, ingen potentiale er anvendt (OCP); mellem 60 og 180 Sørensen (grå zone)-0.2 V vs. HUN; mellem 180 og 300 s, 0,4 V vs. Hun blev anvendt. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6: pH spor af Liposomer som indeholder 0,1% af enzym. Spor af pH ændring af 72 enkelt Liposomer, tilfældigt udvalgte, der indeholder cytokrom bo3 (0,1% w/w) målt og analyseret under et eksperiment. Fra 0-60 s, ingen potentiale er anvendt (OCP); mellem 60 og 180 Sørensen (grå zone)-0.2 V vs. HUN; mellem 180 og 300 s, 0,4 V vs. Hun blev anvendt. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 7: pH spor af Liposomer uden enzym. Spor af pH ændringen af 72 enkelt Liposomer, tilfældigt udvalgte, uden cytokrom bo3 målt og analyseret under et eksperiment. Fra 0-60 s: Ingen potentiale er anvendt (OCP); mellem 60 og 180 Sørensen (grå zone)-0.2 V vs. HUN; mellem 180 og 300 s, 0,4 V vs. Hun blev anvendt. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Movie 1: Animation af enkelt Liposom pH ændringen. (øverste panel) Ændring af en Liposom fluorescens på to HPTS kanaler (vist som 3D-overflade plot af det tilsvarende område) under 300 s af eksperimentet. Reduktiv potentiale blev anvendt mellem 60 s og 180 s. (nederste panel) tilsvarende plot af volumetriske intensitet forholdet mellem to HPTS kanaler versus tid. Zone reduktiv potentielle anvendelse er nedtonet i gråt. Venligst klik her for at se denne video. (Højreklik for at hente.)
Supplerende filer. Venligst klik her for at downloade filer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Metoden er velegnet til at studere proton pumpe af respiratorisk Membranproteiner, der kan være rekonstitueret ind i Liposomer og er i stand til at udveksle elektroner med Quinon pool. Proton pumpe aktivitet kan overvåges på single-enzym niveau ved hjælp af pH-følsomme (ratiometric) farvestoffer indkapslet i Liposom lumen (figur 1A).
Metoden bygger på ubikinon (eller andre kinoner), indarbejdet i lipid tolagede, evne til at udveksle elektroner med elektroder modificeret med en SAM18. Egenskaberne for guld elektrode, modificeret med en SAM, er meget specifikke. Liposomer skal adsorberes på SAM og SAM skal være tynd nok til at muliggøre hurtig elektrokemisk oxidation og reduktion af Quinon pool i Liposomer. Vigtigere, skal samspillet mellem elektrode og Liposom være svage nok ikke at forringe integriteten af lipid membranen. Desuden, afhængigt af detaljerne i den eksperimentelle system, det er ønskeligt hvis SAM forhindrer guld-katalyseret side reaktioner, såsom reduktion af ilt. Endelig, SAM skal være stabil i vinduet potentielle anvendes. Brug af ultra-flad guld elektroder modificeret med høj kvalitet SAM af 6MH opfylder disse krav i forbindelse med cytokrom bo3. Stripping guld elektroderne fra atomically-flade silicium wafers skaber en ultra-glat guld overflade med en i nærheden af ideelle SAM, som angivet af impedans spektre. Bemærk venligst at vi danner SAM fra 6MH i vand. Vi har tidligere rapporteret på SAMs med 6MH i isopropanol16, men disse SAM'er udviser højere dobbeltlags kapacitans værdier og impedans spectra, der indikerer et mere heterogene overflade (dvs., flere fejl) med en lavere modstand. Desuden, når de er SAM'er fra 6MH er udarbejdet af en opløsning i vand, er mindre baggrund ilt reduktion (på grund af guld katalyseret ilt reduktion) observeret, i forhold til SAMs dannet fra en ethanol/isopropanol løsning. Alle disse observationer indikerer, at SAM'er fra 6MH i vand løsninger har en højere kvalitet med mindre defekter. Højere kvalitet SAMs kan også dannes fra thiol-forbindelser med længere Alkan kæder (f.eks. 1-hydroxy-decan-thiol), men elektron overførsel kinetik blive langsommere, da SAM tykkelsen øges.
Under (spectro) elektrokemi, chloridioner, bør undgås i stødpudeopløsning da de kan chemosorb på guld overflade på høj potentialer, eventuelt forværres SAM kvalitet. Af samme grund bør en klorid-fri referenceelektrode foretrækkes.
Et andet vigtigt punkt er baggrunden permeabilitet af Liposomer til protoner, som bør være lav nok til at tillade proton akkumulering som følge af enzymatisk proton translokation på tidsskalaen af eksperiment. Den nøjagtige lipid sammensætning kan påvirke denne permeabilitet. I vores arbejde bruger vi polar E. coli lipid ekstrakter suppleret med ubikinon-10. Proton permeabilitet har vist at stærkt afhængige af fedtsyre kæde længde25, selv om dette er blevet modsagt i studier med mere komplekse lipid kompositioner26. Interessant, har ubikinon for nylig vist sig at forbedre membran stabilitet27. Endelig, resterende rengøringsmidler fra protein rekonstitution procedure kan påvirke proton lækage og derfor er det vigtigt at fjerne rengøringsmidler saa fuldstaendigt som muligt ved hjælp af hydrofobe polystyren microbeads, fortynding efterfulgt af centrifugering og grundig skylning af elektrokemiske celler efter proteoliposomes er adsorberet på overfladen. Hvis tvivlsomt, kan Liposom permeabilitet kontrolleres ved at følge lumen pH ændringen (via HPTS) i et svar til en ekstern pH springet28.
Enkelt enzym måling kræver unilamelar Liposomer og mindre Liposomer forventes at udvise hurtigere eller højere pH-ændringer som den lumen volumen falder. For at opnå dette, tilføjes polystyren microbeads gradvist i små mængder fører til langsom sats af Liposomer dannelse. I sådanne forhold, små Liposomer af homogen størrelse er dannet med en gennemsnitlig diameter på 70 nm og en polydispersity indeks af 0,24 i vores case14. HPTS binder også på de polystyren microbeads, reduktion af kapaciteten i polystyren microbeads til adsorberes vaskemiddel. Overskydende polystyren microbeads bør derfor føjes til kompensation for dets tab. Behandling med polystyren microbeads blev observeret for at reducere koncentrationen af HPTS i lipid-protein suspension af ca. en fjerdedel (fra 5 mM til 3-4 mM). Men den faktiske HPTS koncentration i de Liposom lumen kan være højere siden Liposomer er dannet tidligt på behandling med polystyren microbeads. I stedet for HPTS, kan andre pH-følsom farvestoffer bruges. Det er imidlertid vigtigt, at farvestoffet er membran-vandtætte og ratiometric. Sidstnævnte undgår eksperimentelle fejl på grund af photobleaching og varierende mængder af indkapslede farvestof.
Simple beregninger kan gøres til at vurdere, om stochastically, de fleste af de ikke-tomme Liposomer indeholder kun ét enzym molekyle. Antager en gennemsnitlig Liposom diameter 70 nm, lipid molekylevægt 750 Da og et lipid område af 0,65 nm2 giver os en Liposom massen af 5.2x10-17 g, dvs., 9.6x1013 Liposomer pr. forberedelse (5 mg af lipid). På 0,1% af cytokrom bo3 (MW = 144 kDa), 2 x 1013 enzym molekyler er til stede, svarende til 0,2 protein: Liposom forholdet. Bruger en Poisson fordeling, kan man yderligere beregne at sandsynligheden for at finde et enzym molekyle (17%) per Liposom er ti gange højere end sandsynligheden for at finde mere end ét molekyle (1,7%). Mere præcise beregninger kan foretages, hvis tab af enzymet og lipider under rekonstitution bestemmes ud fra tilsvarende assays tages i betragtning. Sidstnævnte kan estimeres fra et protein assay og ved at måle FDLL fluorescens af rede Liposomer.
Når protokollen er etableret og enkelt enzym spor registreres, yderligere ændringer af metoden er muligt alt efter formålet. Man kan tænke på et enzym-hæmmer tilsætning eller indførelse af en ionophor ind i systemet. Pleje bør tages til at kontrollere, at tilsætning af opløsningsmidler bruges til at forberede ionophor hæmmer materiel ikke påvirker tilstanden af SAM eller permeabilitet af Liposomer.
Teknikken, som beskrevet her er begrænset til en bestemt gruppe af enzymer, der er både membran proton transportvirksomheder og konvertering af Quinon. Udstyr og forsøgsbetingelser var som bruges her optimeret til den enzymatiske aktivitet af cytokrom bo3. Her, er tidsopløsning 2-3 sekunder, bestemmes af eksponeringstiden og den tid det tager for tårn til at ændre filtre. Varigheden af forsøget er begrænset af photobleaching af fluorescerende farvestof og dermed af lysintensiteten. Vi har tidligere fundet gennemsnitlige proton translokation sats af cytokrom bo3 at blive 73 ± 2.2 protoner/s ved hjælp af denne teknik, selvom aktiviteter ned til 20 protoner/s blev opdaget. Hvis du vil bruge disse teknikker for enzymer med enten mere eller mindre aktivitet, image erhvervelse parametre skal tilpasses (dvs., lys intensitet, eksponeringstid og varigheden af forsøget). Fremover vil kan denne metode udvides mod andre elektron transport kørsel proton pumpe enzymer, et eksempel er mitokondrie kompleks jeg. Andre enzymer kan kræve forskellige rekonstitution protokoller, og dette skulle være optimeret til hver anden transportør. Proton pumper, der ikke er konvertering af Quinon enzymer kan også blive undersøgt, fx ATP-drevet29, selv i dette tilfælde proton translokation kan ikke udløses elektrokemisk, men tilføjelsen af en initiator (fx ATP) er påkrævet. I sidstnævnte tilfælde er der ingen grund til at bruge en guld-modificeret dække slip. Forudsat at en passende membran-vandtætte og ion-følsomme fluorescerende farvestof bruges, kan denne metode desuden udvides til at omfatte andre Ioniske pumper, f.eks., natrium og kalium.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Forfatterne anerkender BBSRC (BB/P005454/1) for økonomisk støtte. NH blev finansieret af VILLUM FONDEN Young Investigator Program.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6-Mercapto-1-hexanol (6MH) | Sigma | 451088 | 97% |
| 8-hydroxypyrene-1,3,6-trisulphonic acid (HPTS) | BioChemika | 56360 | |
| Aluminium holder (Electrochemical cell) | Custom-made | 30x30x7 mm; inner diameter: 26 mm; hole diameter: 15 mm | |
| Auxiliary electrode | platinum wire | ||
| Chloroform | VWR Chemicals | 83627 | |
| E.coli polar lipids | Avanti | 100600C | 25 mg/mL in chloroform |
| Epoxy | EPO-TEK | 301-2FL | low fluorescence epoxy |
| Fiji (ImageJ 1.52d) | Required plugins: StackReg and TurboReg (http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg/) | ||
| Filter cube ("ATTO633") | Chroma Technology Corporation | Ex: 620/60 nm; DM: 660 nm; Em: 700/75 nm | |
| Filter cube ("HPTS1") | Chroma Technology Corporation | Ex: 470/20 nm; DM: 500 nm; Em: 535/48 nm | |
| Filter cube ("HPTS2") | Chroma Technology Corporation | Ex: 410/300 nm; DM: 500 nm; Em: 535/48 nm | |
| Filter cube ("Texas Red") | Chroma Technology Corporation | Ex: 560/55 nm; DM: 595 nm; Em: 645/75 nm | |
| Fluorescent dye-labelled lipids (FDLL) | ThermoFisher Scientific | T1395MP | TexasRed-DHPC was used in this work (λexc 595 nm; λem 615 nm) |
| Fluorescent dye-labelled lipids (FDLL) (alternative) | ATTO-TEC | AD 633-161 | ATTO633-DOPE can be used as alternative (λexc 630 nm; λem 651 nm) |
| Gel filtration column | GE Healthcare | 28-9893-33 | HiLoad 16/600 Superdex 75 pg, for additional protein purification |
| Glass coverslips | VWR International | 631-0172 | No 1.5 |
| Glass syringe | Hamilton | 1725 RNR | 250 µL |
| Glass vials | Scientific Glass Laboratories Ltd | T101/V1 | 1.75 mL capacity |
| Gold | GoodFellow | 99.99% | |
| Gramacidin | Sigma | G5002 | |
| Mercury sulfate reference electrode | Radiometer (Hash) | E21M012 | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | Minispin NL040 | |
| Microscope | Nikon | Eclipse Ti | |
| Microscope Camera | Andor | Zyla 5.5 sCMOS | |
| Microscope Lamp | Nikon | Intensilight C-HGFI | |
| NIS-Elements AR 5.0.2 | Nikon | Microscope acquisition software | |
| n-Octyl β-D-glucopyranoside | Melford Laboratories | B2007 | |
| Nova 1.10 | Metrohm | Potentiostat control software | |
| Objective | Nikon | Plan Apo λ 60x/1.4 oil | |
| OriginPro 2017 | OriginLab | Plotting software | |
| O-ring (Electrochemical cell) | Orinoko | Inner diameter: 16 mm; cross section: 1.5 mm | |
| Plastic tubes | Eppendorf | 3810X | 1.5 mL |
| Polystyrene microbeads | Bio-RAD | 152-3920 | Biobeads, 20-50 mesh |
| Potentiostat | Metrohm Autolab | PGSTAT 128N | |
| Potentiostat | CH Instruments | CHI604C | |
| Scripting software | Matlab | R2017a | Required toolboxes: 'Image Processing Toolbox', 'Parallel Computing Toolbox', 'Curve Fitting Toolbox', 'System Identification Toolbox', 'Optimization Toolbox' |
| Silicon wafers | IDB Technologies LTD | Si-C2 (N<100>P) | Ø 25 mm, 525 um thick |
| Teflon cell (Electrochemical cell) | Custom-made | Outer diameter: 26 mm; inner diameter: 13.5 mm | |
| Temple-Stripped Ultra-Flat Gold Surfaces | Platypus Technologies | AU.1000.SWTSG | Alternative ready-to-use ultra-flat gold surfaces (Thickness below 100 nm on demand) |
| Thin micropipette tips | Sarstedt | 70.1190.100 | or similar gelloader tips 200 µL |
| Ubiquinone-10 | Sigma | C-9538 | |
| Ultracentrifuge | Beckman-Coulter | L-80XP | with Ti 45 rotor |
| Ultrasonic bath | Fisher Scientific | FB15063 |
References
- Claessen, V. I., et al. Single-Biomolecule Kinetics: The Art of Studying a Single Enzyme. Annual Review of Analytical Chemistry. 3 (1), 319-340 (2010).
- Rojek, M. J., Walt, D. R. Observing Single Enzyme Molecules Interconvert between Activity States upon Heating. PLoS ONE. 9 (1), e86224 (2014).
- Velonia, K., et al.
- Lu, H. P., Xun, L., Xie, X. S. Single-molecule enzymatic dynamics. 282 (5395), Science. New York, N.Y. 1877-1882 (1998).
- Engelkamp, H., Hatzakis, N. S., Hofkens, J., De Schryver, F. C., Nolte, R. J. M., Rowan, A. E. Do enzymes sleep and work? Chemical Communications. 9 (9), 935-940 (2006).
- Boukobza, E., Sonnenfeld, A., Haran, G. Immobilization in Surface-Tethered Lipid Vesicles as a New Tool for Single Biomolecule Spectroscopy. The Journal of Physical Chemistry B. 105 (48), 12165-12170 (2001).
- Hsin, T. -M., Yeung, E. S.
- García-Sáez, A. J., Schwille, P. Single molecule techniques for the study of membrane proteins. Applied Microbiology and Biotechnology. 76 (2), 257-266 (2007).
- Onoue, Y., et al. A giant liposome for single-molecule observation of conformational changes in membrane proteins. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1788 (6), 1332-1340 (2009).
- Jefferson, R. E., Min, D., Corin, K., Wang, J. Y., Bowie, J. U. Applications of Single-Molecule Methods to Membrane Protein Folding Studies. Journal of Molecular Biology. 430 (4), 424-437 (2018).
- Rigaud, J. L., Pitard, B., Levy, D. Reconstitution of membrane proteins into liposomes: application to energy-transducing membrane proteins. BBA - Bioenergetics. 1231 (3), 223-246 (1995).
- Jesorka, A., Orwar, O. Liposomes: Technologies and Analytical Applications. Annual Review of Analytical Chemistry. 1 (1), 801-832 (2008).
- Seddon, A. M., Curnow, P., Booth, P. J. Membrane proteins, lipids and detergents: Not just a soap opera. Biochimica et Biophysica Acta - Biomembranes. 1666 (1-2), 105-117 (2004).
- Li, M., et al. Single Enzyme Experiments Reveal a Long-Lifetime Proton Leak State in a Heme-Copper Oxidase. Journal of the American Chemical Society. 137 (51), 16055-16063 (2015).
- Rumbley, J. N., Furlong Nickels, E., Gennis, R. B. One-step purification of histidine-tagged cytochrome bo3 from Escherichia coli and demonstration that associated quinone is not required for the structural integrity of the oxidase. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Protein Structure and Molecular Enzymology. 1340 (1), 131-142 (1997).
- Jeuken, L. J. C., et al. Phase separation in mixed self-assembled monolayers and its effect on biomimetic membranes. Sensors and Actuators, B: Chemical. 124 (2), 501-509 (2007).
- Barsoukov, E., Macdonald, J. R. Impedance Spectroscopy Theory, Experiment, and Applications. , John Wiley & Sons. Chapters 1-2 (2005).
- Jeuken, L. J. C., Connell, S. D., Henderson, P. J. F., Gennis, R. B., Evans, S. D., Bushby, R. J.
- Compton, R. G., Banks, C. E. Chapter 4. Understanding voltammetry. , World Scientific Publishing Europe Ltd. Singapore. (2018).
- Girault, H. H. Chapter 10. Analytical and Physical Electrochemistry. , EPFL Press. Lausanne. (2004).
- Mazurenko, I., Jeuken, L. J. C. Timelapse (movie) of single vesicles fluorescence change upon potential application. , (2018).
- Li, M., Khan, S., Rong, H., Tuma, R., Hatzakis, N. S., Jeuken, L. J. C. Effects of membrane curvature and pH on proton pumping activity of single cytochrome bo3enzymes. Biochimica et Biophysica Acta - Bioenergetics. 1858 (9), 763-770 (2017).
- Li, M., Tuma, R., Jeuken, L. J. C. MATLAB code for the analysis of proton transport activity in single liposomes. , (2017).
- Li, M., Tuma, R., Jeuken, L. J. C. Time-resolved fluorescence microscopic data (traces) of individual lipid vesicles with proton transport activity. , (2017).
- Paula, S., Volkov, A. G., Van Hoek, A. N., Haines, T. H., Deamer, D. W. Permeation of protons, potassium ions, and small polar molecules through phospholipid bilayers as a function of membrane thickness. Biophysical Journal. 70 (1), 339-348 (1996).
- Brookes, P. S., Hulbert, A. J., Brand, M. D. The proton permeability of liposomes made from mitochondria) inner membrane phospholipids: No effect of fatty acid composition. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1330 (2), 157-164 (1997).
- Eriksson, E. K., Agmo Hernández, V., Edwards, K. Effect of ubiquinone-10 on the stability of biomimetic membranes of relevance for the inner mitochondrial membrane. Biochimica et Biophysica Acta - Biomembranes. 1860 (5), 1205-1215 (2018).
- Seneviratne, R., et al. A reconstitution method for integral membrane proteins in hybrid lipid-polymer vesicles for enhanced functional durability. Methods. , 1-8 (2018).
- Veshaguri, S., et al. Direct observation of proton pumping by a eukaryote P-type ATPase. Science. 351 (6280), 1-6 (2016).
