Summary
Her presenterer vi en protokoll for å studere molekylære mekanisme proton translokasjon over lipid membraner av enkelt liposomer, bruke cytochrome bo3 som et eksempel. Kombinere elektrokjemi og fluorescens mikroskopi, pH endringer i lumen enkelt blemmer, som inneholder én eller flere enzym, kan oppdages og analysert individuelt.
Abstract
Proton pumpe enzymer av elektron overføre kjeder par Redoks-reaksjoner på proton translokasjon over membranen, opprette en proton motiv kraft brukes til ATP produksjon. Amphiphilic natur membran proteiner krever spesiell oppmerksomhet til deres håndtering, og rekonstituering i naturlige lipid miljøet er uunnværlig når studere membran transport prosesser som proton translokasjon. Her detalj vi en metode som har blitt brukt for etterforskningen av proton pumpe mekanisme membran redoks enzymer, tar cytochrome bo3 fra Escherichia coli som et eksempel. En kombinasjon av elektrokjemi og fluorescens mikroskopi brukes til å kontrollere redoks delstaten quinone svømmebasseng og skjermen pH endringene i lumen. På grunn av romlig oppløsning av fluorescerende mikroskopi, kan hundrevis av liposomer måles samtidig mens enzym innholdet kan skaleres til en enkelt enzym eller transporter per liposome. Respektive enkelt enzym analysen kan avsløre mønstre i enzym funksjonelle dynamikken som ellers kan skjules av oppførselen til hele befolkningen. Vi inkluderer en beskrivelse av et skript for automatisert bildeanalyser.
Introduction
Informasjon om enzym mekanismer og kinetics hentes vanligvis på ensemble eller macroscale nivå med enzym befolkning i tusenvis til millioner av molekyler, der målinger representerer en statistisk gjennomsnitt. Det er imidlertid kjent at komplekse macromolecules for eksempel enzymer kan vise heterogene i deres oppførsel og molekylære mekanismer observert på ensemble nivå er ikke nødvendigvis gyldig for hvert molekyl. Slike avvik på individuelle molekyl skala er mye bekreftet av studier av enkelt enzymer med en rekke metoder voksende under de siste to tiårene1. Spesielt er fluorescens påvisning av personlige enzym aktivitet brukt til å undersøke heterogenitet enzym aktivitet2,3 eller oppdage såkalte minne effekten (perioder med høy enzym aktivitet etterfulgt av perioder med lav aktivitet og omvendt)4,5.
Mange enkelt enzym studier krever at enzymer er immobilized på overflaten eller romlig fast på en annen måte å være langt nok i synsfeltet for kontinuerlig observasjon. Enzym innkapsling i liposomer har vist aktiverer enzymet immobilisering mens forebygge den negative effekten skyldes det overflate-enzym eller protein-protein interaksjoner6,7. I tillegg tilbyr liposomer en enestående mulighet til å studere enkelt membran proteiner i deres naturlige lipid bilayer miljø8,9,10.
En klasse av membran proteiner, transportører, øvelser en retningsbestemt translokasjon av stoffer over cellemembranen, en virkemåte som bare kan studeres når proteiner er rekonstitueres i lipid bilayers (f.eks, liposomer)11, 12,13. For eksempel spiller proton translokasjon, utstilt ved flere enzymer prokaryotic og eukaryotic elektronet transport kjeder, en viktig rolle i cellular respirasjon ved å opprette en proton motiv kraft brukes for ATP syntese. I dette tilfellet er proton pumpe aktivitet koblet til elektron overføringen, selv om den detaljerte mekanismen av denne prosessen ofte forblir unnvikende.
Nylig viste vi muligheten til å par fluorescerende oppdagelsen med elektrokjemi å studere proton pumpe aktiviteten til enkelt enzymer i terminal ubiquinol oksidase av Escherichia coli (cytochrome bo3) rekonstituert i liposomer14. Dette ble oppnådd ved innkapsling av en pH-sensitive membran-ugjennomtrengelig fluorescerende fargestoff inn lumen av liposomer forberedt fra E. coli polar lipider (figur 1A). Hvor protein var optimalisert slik at de fleste liposomer inneholdt enten ingen eller bare ett rekonstituert enzym molekyl (ifølge Poisson-fordelingen). De to underlag cytochrome bo3 ble levert av legger ubiquinone til lipid mix som dannet liposomer og (ambient) oksygen i løsningen. Liposomer er så tynt adsorbert på en semi-gjennomsiktig ultrajevn gull elektrode, dekket med en selv montert monolayer av 6-mercaptohexanol. Endelig er elektroden montert på bunnen av en enkel spectroelectrochemical celle (figur 1B). Elektrokjemiske kontrollen av quinone basseng redoks kan fleksibelt utløse eller stoppe den enzymatiske reaksjonen når som helst mens pH-sensitive fargestoff brukes til å overvåke pH endringer i lumen av liposomer som følge av proton translokasjon av de enzymer. Ved hjelp av fluorescens intensiteten av en andre, lipid-bundet fluorescerende farge, størrelse og volum av personlige liposomer kan bestemmes og dermed kvantifisering av enzymet proton pumpe aktivitet. Bruker denne teknikken, fant vi spesielt at cytochrome bo3 molekyler er i stand til å inngå en spontan lekkasje tilstand som raskt forsvinner proton motiv kraft. Målet med denne artikkelen er å innføre teknikken av enkelt liposome målinger i detalj.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. forberedelse av en Lipid/UQ-10/FDLL-blanding
Merk: E. coli lipider brukes for liposomer utarbeidelse bør være aliquoted og grundig blandet med ubiquinone-10 (enzym substrat) og lang-bølgelengde fluorescerende farge-merket lipider (for liposomer størrelse vilje) før den rekonstituering.
- Bruker glass sprøyte, Overfør 200 µL av kloroform lager av lipid polar Pakk ut fra Escherichia coli (25 mg/mL) i hetteglass å gjøre 5 mg dele.
- Legge til 50 µL av 1 mg/mL ubiquinone-10 (UQ-10, i kloroform) til lipider å gjøre den endelige forholdet UQ-10: lipider 1: 100 (1% w/w).
- Legge til 20 µL av 1 mg/mL (0,4% w/w) av lipid en lang-bølgelengde med fluorescerende farge-merket (FDLL) til lipider/UQ-10 mix.
- Homogenize kloroform løsningen av kort vortexing og fordampe mesteparten av kloroform under en mild nitrogen eller argon flyt. Fjerne kloroform spor ved ytterligere fordampning under vakuum minst 1t.
Merk: Lipid dele kan lagres under en inert atmosfære på 20 ° C i flere måneder.
2. rekonstituering Cytochrome bo3
Merk: For rensing av cytochrome bo3 fra E. coli, følg protokollen fra Rumbley et al. 15 for å sikre høy renhet av innfødt-brettet enzym prøver, legge størrelse-utestenging kromatografi etter affinitet rensing trinn som Rumbley et al. 15
- Legg 312,5 µL 40 mm MOPPER-KOH/60 mM K2så4, pH 7.4, til en aliquot av lipider/UQ-10/FDLL tørr bland (5 mg, trinn 1.4) og bland med vortex til lipid filmen er fullt resuspended, etterfulgt av 2 min behandling i ultralydbad.
- Legge til 125 µL av 25 mM 8-hydroxypyrene-1,3,6-trisulphonic syre (HPTS), en pH-sensitive fluorescerende farge som må være innkapslet inne i liposomer.
- Legg 137.5 µL av 250 mM n-octyl β-D-glucopyranoside (OGP) surfactant, blander med vortex og sonicate i en ultralyd vannbad i 10 min å sikre alle lipider er solubilized i surfactant micelles. Overføre spredning til en 1,5 mL plastrør.
Merk: Skyet suspensjon av lipider bør bli gjennomsiktig etter solubilization med surfactant. - Legge til den nødvendige mengden av cytochrome bo3 (se merknaden nedenfor) og legge til ultrapure vann for å lage et totalt volum på 50 µL (cytochrome bo3 løsning pluss vann). Inkuber ved 4 ° C i 10 min på en berg-mikser.
Merk: Typisk mengden for enkelt enzym forhold er 0.1-0,2% (w/w protein-til-lipid, dvs. 5 – 10 µg protein), men det kan økes til 1-2% (50-100 µg protein) hvis målet er å observere bare elektrokjemiske aktiviteten (se nedenfor). Som en negativ kontroll, kan liposomer uten cytochrome bo3 tilberedes. - Veie 2 x 50 mg og 2 x 100 mg av polystyren microbeads i fire 1.5 mL-tube caps og lukke med parafin film å hindre tørking.
Merk: Før bruk, polystyren microbeads bør vaskes med metanol og vann lagret i vann etter produsentens håndbok.
Merk: Hvis en vann/microbead blanding brukes, polystyren microbeads kan enkelt overføres til hetten brønnene med bredt tips med. Vann kan deretter fjernes fra microbeads med en tynn spiss brønnene. - Legge til 1m50 mg av polystyren microbeads i rekonstituering blandingen (trinn 2.4) ved å sette lokket med polystyren microbeads på 1,5 mL-plast røret med spredning og utfører en kort spin for et par sekunder. Ruge på 4 ° C på en rull mikser for polystyren microbeads til adsorberes surfactant i 30 min.
- Gjenta tillegg av polystyren microbeads og incubations som følger: legge til 50 mg microbeads for 60 min incubation; legge til 100 mg microbeads for 60 min incubation; og legge til 100 mg av microbeads i 120 min med inkubering.
Merk: Løsningen over den utlignede microbeads vil slå gjennomskinnelig under trinn 2.6 som proteoliposomes er dannet.
- Gjenta tillegg av polystyren microbeads og incubations som følger: legge til 50 mg microbeads for 60 min incubation; legge til 100 mg microbeads for 60 min incubation; og legge til 100 mg av microbeads i 120 min med inkubering.
- Skille proteoliposome løsningen fra den polystyren microbeads med en tynn spiss brønnene. Fortynne spredning i 90 mL 20 mm MOPPER-KOH/30 mM K2så4, pH 7.4 (MOPPER buffer) og i en Ti45 ultracentrifuge tube.
- Ultracentrifuge spredning bruker Type 45 Ti rotoren 125.000 x g (på rmax) 1t til pellets til proteoliposomes.
Merk: Mindre sentrifuge rør kan brukes selv om fortynning i stor buffer volum bidrar til å redusere konsentrasjonen av den ikke-kapslet HPTS i siste suspensjon. - Forkaste nedbryting, skyll pellets med 20 mM MOPPER-KOH/30 mM K2så4, pH 7.4 buffer (uten resuspending pellet). Etter forkaster skyllingsprosess bufferen, nytt avbryte proteoliposomes 500 µL av MOPPER buffer av pipettering det frem og tilbake med tynne tips brønnene. Deretter overføre til et 1,5 mL plastrør.
- Sentrifuge suspensjon i 5 min på 12.000 x g fjerne rusk. Overføre nedbryting (rekonstituert proteoliposomes) til en ny medisinglass.
- Lagre rekonstituert proteoliposomes spredning på 4 ° C over natten og bruk innen 2 dager.
3. fabrikasjon av semi-transparent gull elektroder
Merk: Glatt gull overflaten oppnås ved en mal stripping metode for et 30 nm tykke lag av 99,99% gull fra en atomically glatt silisium wafer. Liten tykkelsen av gull laget er viktig siden det må være delvis gjennomsiktig tillater fluorescens observasjon. Detaljer om gull fordampning (fysisk vanndamp deponering, PVD) kan finne andre steder16 og bare mal-stripping er dekket her. Alternativt kan ultrajevn gull chips kjøpt andre steder (se Tabell for materiale).
- Fest opptil 9 glass cover slips (0,17 mm tykk) på fordampet gull overflaten med bi-komponent lav-fluorescens epoxy. Kurere limet på 80 ° C 4 h.
- Like før endring med en selv montert monolayer (trinn 4), kan du koble glass cover papirlapper fra silisiumskiver med blad. På grunn av thinness av cover papirlapper, vær forsiktig når løsne dekselet papirlapper å ikke sprekk eller bryte glass lysbilder.
4. endring av gull overflaten med selv montert Monolayer (SAM)
- Forberede 5 mL vann løsning av 1 mM 6-mercaptohexanol (6MH).
- Dyppe fersk frittliggende gull-belagt cover slips (trinn 3.1) i 6MH løsning og la på 20-25 ° C over natten (> 16 h) til SAM.
Merk: Thiol løsninger har en ubehagelig lukt, så en lukket fartøy bør brukes når rugende gull-belagt cover slip. - Neste dag, fjerne gull-belagt cover slip fra 6MH løsning, vask kort med vann eller metanol og deretter med isopropanol. Tørr under en mild gasstrømmen.
5. elektrokjemiske Testing av Proteoliposomes aktivitet
Merk: Den elektrokjemiske aktiviteten av enzym kontrolleres først på et tett liposomer lag (trinn 5) og lavere vesicle dekning brukes i enkelt blemmer eksperiment for å måle pH endringer i lumen av liposomer (trinn 6).
- Samle gull-belagt cover slip i en spectro-elektrokjemiske cellen (se figur 1). Ta kontakt til gull med en flat wire utenfor et område definert av gummi O-ring.
- Legg 2 mL elektrolytt buffer løsning og plasser referanse og ekstra elektrodene i cellen.
Merk: Som ytterligere diskutert under diskusjon, er referanser elektroder uten klor foretrukket å hindre dannelsen av Au (I) Cl under elektrokjemi. Her, en Hg/Hg2SO4 (satt. Strikk2SO4) referanse elektrode brukes og potensialer får versus Standard Hydrogen elektrode (hun) bruker 0.658 V vs hun for Hg/Hg2SO4 (Lør. Strikk2så4). - Kjøre elektrokjemiske impedans spektroskopi (0,1 Hz – 100 kHz) på åpne cellen potensielle (OCP) potensial til å vurdere kvaliteten på SAM. Konvertere impedans verdier å adgang og dele 2πω tegne en Cole-Cole tomten, hvor ω er frekvensen (se følgende referanser16,17,18 for detaljer om konvertering og tolke impedans Spectra).
Merk: Kompakt og tett SAMs av 6MH bør gi en halvsirkel Cole-Cole plot og gi kapasitans verdiene i området 2,5-3,0 µF/cm2 (figur 2A). Hvis du er betydelig avvik fra halvsirkel form eller ut-av-omfang kapasitans verdier, endre elektroden. - Kjøre tom syklisk voltammograms (CVs) med skanning 100 og 10 mV/s i regionen potensielle-0.3-0,8 V. En typisk CV vises (figur 2B, stiplet linje).
Merk: Dette bør vise nesten ren kapasitiv atferd og fravær av betydelig faradaic gjeldende, selv under ambient oksygen forhold som brukes her. - Legg proteoliposomes (0,5 mg/mL siste lipider konsentrasjon, 1-2% (w/w) forholdet cytochrome bo3 lipid) til elektrokjemiske cellen og bland litt med en pipette. Vent til opptak av proteoliposomes på elektroden overflaten er ferdig (30-60 minutter ved romtemperatur).
Merk: Syklisk voltammograms (CVs) på 10 mV/s kan kjøre under proteoliposomes opptak til å følge prosessen. Opptak er ferdig når påfølgende CVs slutte. Informasjon om CV teknikker kan finnes i følgende lærebøker. 19 , 20 - Vask cellen ved å endre buffer løsning minst 10 ganger, men unngå å la elektrode overflaten helt tørt.
- Kjøre elektrokjemiske impedans spektroskopi OCP (figur 2A, blå linjen) å bekrefte SAM på gull elektroden uendret og CVs med skanning 10 og 100 mV/s til å observere katalytisk ubiquinol oksidasjon (og oksygen reduksjon) av cytochrome bo 3 på utbruddet potensial elektrokjemiske quinone reduksjon om 0 V vs hun) (figur 2B).
6. påvisning av enzymatisk Proton pumpe av fluorescens mikroskopi
- Endre gull elektroden som i trinn 5, men bruker 100 x mindre proteoliposomes forhold til trinn 5.5 (dvs., 5 µg/mL). For enkelt enzym studier, redusere cytochrome bo3 lipid forhold til 0,1-0,2% (w/w).
Merk: Liposomer vil tynt adsorberes på elektroden overflaten slik at enkelt vesicle overvåking av fluorescens mikroskopi. Under disse single-enzym forholdene er hvor mye enzym immobilisert på elektroden overflaten utilstrekkelig for observasjon av en katalytisk gjeldende. - Plass den elektrokjemiske cellen på olje målet (60 X) med en invertert fluorescens mikroskop med en dråpe neddyppingsolje. Bruke riktig filtre for FDLL fluorescens, fokus på elektroden overflaten. Enkelt liposomer skal vises som lyspunkter på Diffraksjon grensen på mikroskopet/målet. Ta et bilde av FDLL fluorescens.
- Bytt til en av HPTS fluorescens filteret sett på mikroskopet kan kontrollere HPTS fluorescens er klart synlig og skilles fra bakgrunnen (se trinn 6.4 samtidig valgte eksponering). Øke lysintensiteten hvis det ikke er tilfelle.
- Programmet mikroskop programvaren utfører en tidsbestemt bilde oppkjøpet av vekslende to HPTS filteret sett (menyen programmer | Define/Run ND oppkjøpet). Angi forsinkelsen mellom bilde oppkjøp minimum. I dette eksperimentet, kan du bruke en 1 s eksponering og 0,3 s forsinkelse (på grunn av turret bevegelsen).
Merk: Forholdet mellom fluorescens intensiteter på disse to kanalene senere konverteres til pH i liposomer på hvert tidspunkt. Varigheten av oppkjøpet kan variere avhengig av forventet pH endre hastigheten; 5 min brukes i denne artikkelen. - Juster innstillingene for potentiostat å endre potensial under bilde oppkjøpet. Bruk for eksempel følgende sekvens i dette eksperimentet,: 0-60 s: ingen potensial brukes (i.e. OCP); 60-180 s:-0.2 V (vs hun); 180-300 s: 0,4 V (vs hun). I dette tilfellet, bare anvendt potensial i fase (-0.2 V vs hun) er tilstrekkelig for å effektivt redusere quinone bassenget.
- Kjøre samtidig tidsbestemt bilder oppkjøpet (mikroskopet) og potensial sekvensen (potentiostat) ved å manuelt starte begge målene samtidig.
Merk: Eksperimentet kan gjentas på samme elektroden flere tid ved å flytte mikroskop scenen til et annet område på overflaten. Forsinkelsen mellom oppkjøpene bør være minst 5-10 min å sikre fullstendig pH balanse av liposomer på overflaten. Forskjellige varigheter og potensielle mønstre kan brukes trenger, selv om imaging tid er begrenset på grunn av photobleaching av HPTS under oppkjøpet.
7. analyse av fluorescens bilder
Merk: En typisk eksperiment gir et sett med bilder med litt tid (f.eks 2.6 s) for hver av de to kanalene, dvs. (varighet * 2 / 2.6) bilder. Et eksempel på slike bildet satt registrert under et enkelt enzym eksperiment kan nås via forskning Data Leeds oppbevaringssted21. En bilde behandling består av flere delaktiviteter ved hjelp av Fiji (ImageJ) og høyt nivå matematisk analyse programmering språkprogramvare (heretter referert til som skripting programvare, se Tabellen for materiale for detaljer).
- Bruk Fiji å skille tid forfalle filen, justere bilder og lagre som separate kanaler og tidsrammer.
- Åpne tid forfalle arkiv benytter Bioformats importøren gitt Fiji (makrokommandoen: Kjør ("Bio-formater importør")).
- Bruke plugin StackReg til å justere hver ramme for det første å ta hensyn til mulig scenen bevegelser eller termisk drift oppstod under oppkjøpet (makrokommandoen: Kjør ("StackReg", "transformasjon = oversettelse")).
- Lagre separate ukomprimert bildefiler for hver kanal og steg tid i TIFF-format i en mappe.
- Ekstra de nøyaktige tidsangivelsene for hver ramme fra tid forfalle filen metadata og lagre dem som en CSV-fil i den samme mappen som bildene. Eventuelt ekstra tidsangivelser programmvre oppkjøp og lagre manuelt i en CSV-fil med et regnearkprogram.
Merk: Mappen med bilder og tidsangivelser er nå klar til å bli analysert av skripting. Trinn 7.1.1. -7.1.4. kan være lager disponering bruker et Fiji skript (et skript skrevet i Python for satsvis behandling av tid forfalle filer er angitt, bruker "Ctrl-Skift-N" (i Windows), så filen | Åpne laste skriptet).
- Bruk skripting programvaren automatiske behandling av bildene. Laste inn angitt koden til programvaren og klikk Kjør til slutt. Når tilskyndet, Velg mappen som inneholder bildene fra trinn 7.1.
Merk: Et skript for analyse er gitt som mlx-formatet live skript, med omfattende kommentarer, identifisere enkelt liposomer, Tilpass dem til 2D-Gaussian funksjonen, filtrere dem og kvantifisere pH-verdier på hvert tidspunkt. Følgende sub utføres automatisk av skriptet.- Legg alle tidsrammer bilder for ett enkelt eksperiment i minnet.
- Gjennomsnittlig alle bilder for én kanal (Velg kanalen med høyeste fluorescens intensiteten) og bruk Average bildet til å identifisere alle maksimumsgrenser som kan tilsvare de enkelt liposomer.
- Tilpass identifiserte maksimumsgrensene på gjennomsnitt bildet til 2D-Gaussian funksjonen og lagre den resulterte passer parametere for hver liposome (se figur 4A montert liposome eksempel).
- Filtrere maksimumsgrensene i henhold til forventet enkelt liposomer kriterier, for eksempel størrelse, sirkularitet og intensitet. Avvise liposomer som er dårlig utstyrt på grunn av lav signal til støy, tett nabolandet liposome eller være for nær bilde kanten.
- Last tidsangivelser fra den eksterne filen og passe hver filtrerte liposome til 2D-gaussian funksjonen på hvert bilde for tid separat.
Merk: Bruk av parallell programmering og kjerner CPU kan betydelig forbedre beregningen hastigheten på dette stadiet. - Filtrere liposomer igjen i henhold til lignende kriteriene som i trinn 7.2.4 men brukt til hver tidsramme.
- På hver tid trinn, definere fluorescens intensitet forholdet mellom en liposome som andelen volumer omsluttet av montert 2D-Gaussian funksjonen på to kanaler. Beregn pH-verdier på forholdet mellom intensiteter bestemmes av de to HPTS kanalene og bruker en kalibreringskurven (trinn 8). Plot resulterende pH-tid kurver for i liposomer og observere deres pH endre når potensialet brukes.
8. utføre en kalibreringskurven av HPTS fluorescens
Merk: For å konvertere HPTS fluorescens forholdet til en intravesicular pH, en kalibreringskurven må først opprettes som ville ta hensyn til spesielle vilkår eksperimenter som gull transmisjon, filtre kvalitet, etc. Dette trinnet har utført bare én eller to ganger og kalibrering data kan brukes så lenge parameterne installasjonsprogrammet og mål er de samme i trinn 6.
- Forberede en elektrode med tynt adsorbert liposomer (uten cytochrome bo3 som beskrevet i trinn 5 og 6.1).
- Legge til 2 µL 0,1 mg/mL gramicidin løsning i etanol 2 mL buffer opprette konsentrasjon 100 ng/mL.
- Ta to fluorescens bilder for de to HPTS-kanalene.
- Endre pH i cellen ved tillegg av små dele 1 M HCl eller 1 M H2så4. Måle pH i bufferen med en standard pH-meter og ta to fluorescens bilder for de to HPTS-kanalene.
- Gjenta trinn 8.4 for området pH 6 til 9.
- Ved hjelp av algoritmen fra 7.2, passer, filtrere og beregne gjennomsnittlig HPTS fluorescens forholdet mellom individuelle liposomer ved hver pH. Ta HPTS forholdet gjennomsnitt over alle liposomer.
- Passe den resulterende pH-forhold avhengigheten til denne formelen:
, der pKen Ren og Rber montering parametere. - Bruk pKen Ren og Rbkonvertere HPTS forholdet mellom individuelle liposomer i trinn 7.2.7. til pH-verdier.
, der pKen Ren og Rber montering parametere.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Kvaliteten på gull-endret cover slip (elektroden) med en SAM av 6MH kontrolleres før hvert eksperiment med elektrokjemiske impedans spektroskopi. Figur 2A viser representant Cole-Cole tomter målt ved hjelp av elektrokjemiske impedans spektroskopi før og etter liposomer er adsorbert. Hvis kvaliteten på SAM er tilstrekkelig, vise impedans spektroskopi en nesten ren kapasitiv atferd som resulterer i en halvsirkel Cole-Cole plott. Diameteren på semi-sirkel i et Cole-Cole plott tilsvarer tolags kapasitans av elektroden overflaten, som bør være i området 2,5-3,0 µF/cm2 . Merk at kapasitans ikke bør endre betydelig på liposomer adsorpsjon, selv om en liten økning i kapasitans kan observeres (høy liposomer dekning, figur 2A, nederst) eller en liten endring i impedans kan observeres på lav frekvenser (lav liposome dekning, figur 2A, øverst).
Elektrokjemi kan brukes til å teste katalytisk aktiviteten til cytochrome bo3 i proteoliposomes, der katalytisk strøm målt med syklisk voltammetry gjenspeiler ubiquinol oksygen oxidoreductase aktiviteten. Imidlertid betydelig katalytisk strømmer kan bare oppdages ved høye mengder adsorbert proteoliposomes og et tett lag med proteoliposomes på gull-endret cover slip er nødvendig. Figur 2B demonstrerer representant syklisk voltammograms (CVs) av elektroden før og etter liposomer adsorpsjon med enten lav eller høy liposome dekning. Ingen faradaic gjeldende er observert på tom CV fordi oksygen reduksjon av nakne gull elektroden blokkeres av SAM. Når overflaten er mettet med liposomer med høy cytochrome bo3 innhold (1,3% (w/w) i dette tilfellet), en klar katalytisk bølge på grunn av oksygen reduksjon er observert med en utbruddet potensial 0 V, dvs. potensialet i ubiquinone reduksjon (figur 2B, blå linjen). Ubiquinone bassenget fungerer både som naturlig substrater for enzymet og et elektron-megler, overfører elektroner fra enzymet til elektroden overflaten. Vi oppmerksom på at under høy liposome dekning, ingen forskjell om personlige blemmer er mulig ved mikroskopi og lavere dekning er nødvendig for enkelt liposome studier. På lav liposome dekning (men høy protein lipid forhold), er katalytisk gjeldende betydelig redusert, knapt kan skjelnes fra bakgrunnen (figur 2B, rød linje). Merk at under enkelt enzym forhold (lav protein lipid forhold), katalytisk gjeldende er enda lavere og ikke kan måles pålitelig.
Figur 3 viser fluorescens bilder av liposomer adsorbert på elektrodene på tre forskjellige coverages. Alle bilder ble tatt i samme lys og eksponering forhold og lysstyrke ble justert like for å aktivere direkte sammenligning. Fargestoff-inneholder-liposomer vises på bildene som lyspunkter. Den sentrale delen av bildet var photobleached for et par minutter å avsløre bakgrunnen fluorescens nivå (vi oppmerksom på at FDLL er relativt photostable og er ikke photobleached helt i Figur 3). Bildene på to HPTS kanaler er superimposable, hvor forholdet mellom de to kanalene (410/535 og 470/535) tilsvarer pH 7.4 brukes i dette eksperimentet. Et større antall liposomer vises med FDLL kanalen, som angir at liposomer som har ingen HPTS innkapslet. Forskjellen mellom HPTS og FDLL kanal er mer uttalt på høyere dekning, muligens fordi høy liposome dekning, liposomer er mer sannsynlig å briste eller sikring på overflaten.
Bildeanalyser krever justering av rammer (mot det første bildet) bruker ImageJ, plugin StackReg. Justeringen er uunnværlig i de fleste situasjoner siden en liten termisk drift av prøven oppstår vanligvis i tidsskalaen for eksperimentet, endre liposome koordinatene. Alle videre analyse utføres med en skriptkode i programvare. Denne koden utfører automatisk liposome identifikasjon. Størrelsen på liposomer er under den Abbe Diffraksjon grensen, er deres fluorescens sett på som et punkt spredning funksjon mye større enn den faktiske liposome diameteren (figur 4A). Koden passer fluorescens intensiteten av hver vesicle på to kanaler til en 2D-Gaussian funksjon (figur 4A) og beregner sine volumetriske intensitet ratio som kan konverteres til pH bruker en kalibreringskurven. Ved å utføre disse handlingene på alle tidsrammer, hentes pH inne hver vesicle i tidsskalaen eksperimentet (film 1). Figur 4B viser medians av alle vesicle pH endringer i et enkelt bilde når cytochrome bo3 innhold er 1,3%. En økning i pH (proton pumpe) er tydelig når en potensiell mellom-0.1 og-0.3 V brukes, men ikke for 0 V siden sistnevnte er ikke tilstrekkelig til å redusere quinone bassenget. Når cytochrome bo3 innhold er mye lavere (protein-til-lipid forholdet mellom 0,1%, figur 4C), median kurvene blir nesten utvisket mot de av Tom liposomer (Figur 4 d). Forskjellen blir tydelig når du vurderer individuelle pH spor av tilfeldige liposomer (figur 5, 6 og 7). Mens liposomer uten cytochrome bo3 vise betydelige pH endringer med hensyn til støy (figur 7), et utvalg av liposomer viser en økning (nesten kun) eller en reduksjon av pH når en potensiell er brukt som actives cytochrome bo3 (tall 6, gråsone). Den åpenbare forskjellen i pH-spor mellom liposomer er konsistent med lav protein-til-lipid forholdet, der cytochrome bo3 finnes bare i en undergruppe av liposomer aktivitet. Utbredelsen av en pH økning nedgang forklares av metoden rekonstituering som favoriserer "ytre" retningen enzym molekyler (ca. 75%). Brøkdel av tilsatte utskilte fettstoffer som viser en pH endring øker når det cytochrome bo3 lipid forhold er høyere (figur 5). Merk også at noen liposomer stoppe proton pumpe og inngå proton spre modus før slutten av potensielle programmet. Vi attributt dette til cytochrome bo3 molekylene inn "lekkasjen staten", som tillater protoner å strømme tilbake til liposome lumen14.
Videre analyse av pH spor inkludert montering og fastsettelse av proton pumpe/lekker priser kan gjøres ved hjelp av et skript vi har publisert tidligere14,22 og kan fås fra Leeds forskning datalager 23 , 24.
Figur 1: prinsippet om metoden. (A) prinsippet om enkelt enzym aktivitet avlytting og (B) ordningen eksperimentell oppsettet brukes i dette arbeidet med en cutaway for å demonstrere en intern del av cellen. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: elektrokjemisk reaksjon av liposomer. (A) Cole-Cole tomter målt på OCP (0.22 V vs hun, svart kvadrat linje) før og etter liposomer (1,3% w/w cytochrome bo3) adsorpsjon fra løsninger på konsentrasjoner av 5 µg/mL (rød sirkel linje) og 500 µg/mL (blå circle-linjen). (B) sykliske voltammograms på 100 mV/s (venstre panel) og 10 mV/s (høyre panel) av Au-SAM (svart stiplet linje) før og etter liposomer (1,3% w/w cytochrome bo3) adsorpsjon fra løsninger på konsentrasjoner av 5 µg/mL (rød linje) og 500 µg/mL (blå linjen). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: fluorescens mikroskopi i liposomer. Fluorescens bilder av liposomer på ulike overflaten dekning: overflater ruges i 30 min med en liposomer løsning 5 µg/mL (øverste rad), 20 µg/mL (midterste rad) og 500 µg/mL (nederste rad). Venstre kolonne tilsvarer 470/535 nm eksitasjon/utslipp Filteroppsett (1st HPTS kanal); midterste kolonnen - 410/535 nm (2nd HPTS kanal); høyre kolonne - 560/645 nm (FDLL kanal). Bildene ble tatt ved forstørrelse 90 X (60 X mål og 1,5 X forstørrelse av mikroskopet før kameraet), 1 s avsøring og lignende lysintensiteten. Skala barer tilsvarer 50 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: Liposome identifikasjon og pH endre. (A) 3D-visning av en del av fluorescens bilde som inneholder en typisk enkelt liposome. Fluorescens intensitet er sett på som et punkt spredning funksjon (farge overflaten) som er utstyrt til en 2D-Gaussian funksjon (sort mesh). (B-D) pH, vises som medianen til alle blemmer innenfor enkeltbilde (vanligvis flere hundre) på forskjellige anvendt potensialer. Fra 0-60 s, brukes ingen potensial (OCP). Mellom 60 og 180 s (gråsone) forskjellige potensialer ble brukt: 0 V (svart),-0.1 V (rød),-0.2 V (grønn),-0.3 V (blå). Mellom 180 og 300 s, 0,4 V vs. Hun ble brukt. Cytochrome bo3 til prosenter lipid var (B) 1.3%, (C) 0,1%, (D) 0%. Sporene er forskjøvet klarhet. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5: pH spor av liposomer 1,3 prosent av enzymet. Spor av pH endring av 72 enkelt liposomer, tilfeldig valgt, inneholder cytochrome bo3 (1,3% w/w) målt og analysert under et eksperiment. Fra 0-60 s, ingen potensialet er brukt (OCP); mellom 60 og 180 s (gråsone)-0.2 V vs. HUN; mellom 180 og 300 s, 0,4 V vs. Hun ble brukt. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 6: pH spor av liposomer 0,1 prosent av enzymet. Spor av pH endring av 72 enkelt liposomer, tilfeldig valgt, inneholder cytochrome bo3 (0,1% w/w) målt og analysert under et eksperiment. Fra 0-60 s, ingen potensialet er brukt (OCP); mellom 60 og 180 s (gråsone)-0.2 V vs. HUN; mellom 180 og 300 s, 0,4 V vs. Hun ble brukt. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 7: pH spor av liposomer uten enzym. Spor av pH endring av 72 enkelt liposomer, tilfeldig valgt, uten cytochrome bo3 målt og analysert under et eksperiment. Fra 0-60 s: Ingen potensialet er brukt (OCP); mellom 60 og 180 s (gråsone)-0.2 V vs. HUN; mellom 180 og 300 s, 0,4 V vs. Hun ble brukt. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Film 1: animasjon enkelt liposome pH endring. (topp panel) Endring av en liposome fluorescens på to HPTS kanaler (vist som 3D-overflate plott av tilsvarende området) under 300 s av eksperimentet. Reductive potensialet ble brukt mellom 60 s og 180 s. (nedre panelet) tilsvarende tomt volumetriske intensitet forholdet mellom to HPTS kanaler versus tid. Sonen for reductive potensiell program er skyggelagt med grått. Vennligst klikk her å se denne videoen. (Høyreklikk for å laste ned.)
Tilleggsfiler. Klikk her for å laste ned filene.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Metoden beskrevet er egnet til å studere proton pumpe av respiratoriske membran proteiner som kan rekonstitueres i liposomer og kan utveksle elektroner med quinone bassenget. Proton pumpe aktivitet kan overvåkes på enkelt-enzym nivå ved hjelp av pH-sensitive (ratiometric) fargestoffer innkapslet i liposome lumen (figur 1A).
Metoden er avhengig av evnen til ubiquinone (eller andre quinones), innlemmet i lipid-bilayer å utveksle elektroner med elektroder endret med en SAM18. Egenskaper for gull elektroden, modifisert med en SAM, er svært spesifikke. Liposomer må adsorberes på SAM og SAM må være tynn nok til å aktivere rask elektrokjemiske oksidering og reduksjon av quinone i liposomer. Viktigere, må samspillet mellom elektroden og liposome være svak nok ikke å svekke integriteten til lipid membran. Videre, avhengig av hvilke detaljer av eksperimentelle, det er ønskelig hvis SAM hindrer gull-katalysert siden reaksjoner, som oksygen reduksjon. Til slutt, SAM må være stabilt i potensielle vinduet brukes. Bruk av flate gull elektroder endret med høy kvalitet SAM av 6MH oppfyller disse kravene ved cytochrome bo3. Stripping gull elektroder fra atomically-flat silisiumskiver skaper en svært jevne gull overflate med en nær perfekt SAM som indikert av impedans spectra. Vær oppmerksom på at vi danne SAM fra 6MH i vann. Vi har tidligere rapportert om SAMs med 6MH i isopropanol16, men disse SAMs utstilling høyere tolags kapasitans verdier og impedans spectra som indikerer en mer heterogen overflate (dvs., mer feil) med en lavere motstand. Videre, når SAMs fra 6MH er forberedt fra en vann-løsning, mindre bakgrunnen oksygen reduksjon (på grunn av gull catalyzed oksygen reduksjon) er observert i forhold til SAMs dannet fra en etanol/isopropanol løsning. Alle disse observasjonene indikerer at SAMs fra 6MH i vann løsninger har en høyere kvalitet med mindre defekter. Høyere kvalitet SAMs kan også dannes fra thiol-forbindelser med lengre Alkan kjeder (f.eks 1-hydroxy-decane-thiol), men elektron overføring kinetics bli tregere da SAM tykkelse øker.
Under (spectro) elektrokjemi, bør kloridioner unngås i buffer løsning siden de kan chemosorb på gull overflaten på høy potensialene, muligens dårligere SAM-kvalitet. Av samme grunn, bør en flammehemmende referanse elektrode Superforecast foretrekkes.
Et annet viktig poeng er bakgrunnen permeabilitet av liposomer til protoner, som bør være lavt nok til at proton akkumulering som følge av enzymatisk proton translokasjon på tidsskalaen av eksperimentet. Nøyaktig lipid sammensetningen kan påvirke denne permeabilitet. I vårt arbeid, vi bruker polar E. coli lipid ekstrakter supplert med ubiquinone-10. Proton permeabilitet har blitt vist å sterkt avhengig av fatty acid kjeden lengde25, selv om dette har vært motsagt i studier med mer komplekst lipid komposisjoner26. Interessant, har ubiquinone nylig vist å forbedre membran stabilitet27. Endelig gjenværende vaskemidler fra protein rekonstituering prosedyren kan påvirke proton lekkasje og derfor er det viktig å fjerne vaskemidler så fullstendig som mulig bruker hydrofobe polystyren microbeads, fortynning etterfulgt av sentrifugering og grundig skylling elektrokjemiske cellen etter at proteoliposomes er adsorbert på overflaten. Hvis tvilsomt, kan liposome permeabilitet verifiseres ved å følge lumen pH endringen (via HPTS) i et svar til en ekstern pH hoppe28.
Enkelt enzym måling krever unilamelar liposomer og mindre liposomer forventes å vise raskere eller høyere pH endringer som den lumen volumet reduseres. For å oppnå dette, legges polystyren microbeads gradvis i små mengder fører til trege hastigheten liposomer formasjonen. I slike forhold, dannes små liposomer homogen størrelse med en gjennomsnittlig diameter på 70 nm og en polydispersity indeks over 0.24 i vårt tilfelle14. HPTS også adsorbs på den polystyren microbeads, reduserer kapasiteten til polystyren microbeads for adsorberes vaskemiddel. Derfor skal overflødig polystyren microbeads legges til kompensere for sine tap. Behandling med polystyren microbeads ble observert for å redusere HPTS konsentrasjonen i lipid-protein suspensjon av omtrent en fjerdedel (fra 5 mM til 3-4 mM). Den faktiske HPTS konsentrasjonen i liposome's lumen kan imidlertid være høyere siden liposomer dannes tidlig på behandling med polystyren microbeads. I stedet for HPTS, kan andre pH-sensitive fargestoffer brukes. Det er imidlertid viktig at fargestoff er membran-ugjennomtrengelig og ratiometric. Sistnevnte unngår eksperimentelle feil photobleaching og varierende mengder innkapslede fargestoff.
Enkle beregninger gjøres å anslå om stochastically, de fleste ikke-tom liposomer inneholder bare én enzym molekyl. Forutsatt en gjennomsnittlig liposome diameter på 70 nm, en lipid molekylvekt av 750 Da og et lipid 0,65 nm2 gir oss en liposome masse 5.2x10-17 g, dvs 9.6x1013 liposomer per forberedelse (5 mg av lipid). På 0,1% av cytochrome bo3 (MW = 144 kDa), 2 x 1013 enzym molekyler er til stede, tilsvarer 0,2 protein: liposome forholdet. Bruker en Poisson-fordelingen, kan en ytterligere beregne at sannsynligheten for å finne ett enzym molekyl (17%) per liposome er ti ganger høyere enn sannsynligheten for å finne mer enn ett molekyl (1,7%). Mer nøyaktige beregninger gjøres hvis tap av enzym og lipider under rekonstituering bestemmes av tilsvarende analyser tas hensyn. Sistnevnte kan estimeres fra en protein analysen og ved å måle FDLL fluorescens av forberedt liposomer.
Når protokollen er etablert og enkelt enzym spor registreres, ytterligere modifiseringer av metoden er mulig avhengig av målet. Man skulle tro om enzym inhibitor tillegg eller innføring av en ionophore i systemet. Forsiktighet bør utvises at tillegg av løsemidler brukes til å forberede ionophore eller hemmer lager ikke påvirker tilstanden til SAM eller permeabilitet i liposomer.
Teknikken som er beskrevet her er begrenset til en bestemt gruppe av enzymer som både membran proton transportører og quinone-konvertering. Utstyr og eksperimentelle forhold var som brukes her optimalisert for den enzymatiske aktiviteten cytochrome bo3. Her er tid oppløsningen 2-3 sekunder, avhenger av eksponeringstid og tiden det tar for dreieskiven endre filtre. Varigheten av forsøket er begrenset av photobleaching fluorescerende fargestoff og dermed av lysintensiteten. Vi har tidligere funnet gjennomsnittlig proton translokasjon rate av cytochrome bo3 å være 73 ± 2.2 protoner/s bruker denne teknikken, men aktiviteter ned til 20 protoner/s ble oppdaget. For å bruke disse teknikkene for enzymer med enten mer eller mindre aktivitet, bilde oppkjøpet parametere må tilpasses (dvs., intensitet, eksponeringstid og varigheten av forsøket). I fremtiden, kan denne metoden utvides mot andre elektronet transport kjøring proton pumpe enzymer, et eksempel mitokondrie komplekse jeg. Andre enzymer kan kreve forskjellige rekonstituering protokoller, og dette måtte være optimalisert for hver annen transporter. Proton pumper som ikke quinone-konvertering enzym kan også studert, f.eks ATP-drevet29, men i dette tilfellet proton translokasjon ikke kan utløses electrochemically, men tillegg av en initiator (f.eks ATP) er nødvendig. I sistnevnte tilfelle er det ikke nødvendig å bruke en gull-endret cover slip. Forutsatt at en passende membran-ugjennomtrengelig og ion-sensitive fluorescerende fargestoff brukes, kan videre denne metoden utvides til andre ioniske pumper, f.eks natrium og kalium.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Forfatterne bekrefter BBSRC (BB/P005454/1) for økonomisk støtte. NH ble finansiert av VILLUM Foundation unge etterforsker Program.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6-Mercapto-1-hexanol (6MH) | Sigma | 451088 | 97% |
| 8-hydroxypyrene-1,3,6-trisulphonic acid (HPTS) | BioChemika | 56360 | |
| Aluminium holder (Electrochemical cell) | Custom-made | 30x30x7 mm; inner diameter: 26 mm; hole diameter: 15 mm | |
| Auxiliary electrode | platinum wire | ||
| Chloroform | VWR Chemicals | 83627 | |
| E.coli polar lipids | Avanti | 100600C | 25 mg/mL in chloroform |
| Epoxy | EPO-TEK | 301-2FL | low fluorescence epoxy |
| Fiji (ImageJ 1.52d) | Required plugins: StackReg and TurboReg (http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg/) | ||
| Filter cube ("ATTO633") | Chroma Technology Corporation | Ex: 620/60 nm; DM: 660 nm; Em: 700/75 nm | |
| Filter cube ("HPTS1") | Chroma Technology Corporation | Ex: 470/20 nm; DM: 500 nm; Em: 535/48 nm | |
| Filter cube ("HPTS2") | Chroma Technology Corporation | Ex: 410/300 nm; DM: 500 nm; Em: 535/48 nm | |
| Filter cube ("Texas Red") | Chroma Technology Corporation | Ex: 560/55 nm; DM: 595 nm; Em: 645/75 nm | |
| Fluorescent dye-labelled lipids (FDLL) | ThermoFisher Scientific | T1395MP | TexasRed-DHPC was used in this work (λexc 595 nm; λem 615 nm) |
| Fluorescent dye-labelled lipids (FDLL) (alternative) | ATTO-TEC | AD 633-161 | ATTO633-DOPE can be used as alternative (λexc 630 nm; λem 651 nm) |
| Gel filtration column | GE Healthcare | 28-9893-33 | HiLoad 16/600 Superdex 75 pg, for additional protein purification |
| Glass coverslips | VWR International | 631-0172 | No 1.5 |
| Glass syringe | Hamilton | 1725 RNR | 250 µL |
| Glass vials | Scientific Glass Laboratories Ltd | T101/V1 | 1.75 mL capacity |
| Gold | GoodFellow | 99.99% | |
| Gramacidin | Sigma | G5002 | |
| Mercury sulfate reference electrode | Radiometer (Hash) | E21M012 | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | Minispin NL040 | |
| Microscope | Nikon | Eclipse Ti | |
| Microscope Camera | Andor | Zyla 5.5 sCMOS | |
| Microscope Lamp | Nikon | Intensilight C-HGFI | |
| NIS-Elements AR 5.0.2 | Nikon | Microscope acquisition software | |
| n-Octyl β-D-glucopyranoside | Melford Laboratories | B2007 | |
| Nova 1.10 | Metrohm | Potentiostat control software | |
| Objective | Nikon | Plan Apo λ 60x/1.4 oil | |
| OriginPro 2017 | OriginLab | Plotting software | |
| O-ring (Electrochemical cell) | Orinoko | Inner diameter: 16 mm; cross section: 1.5 mm | |
| Plastic tubes | Eppendorf | 3810X | 1.5 mL |
| Polystyrene microbeads | Bio-RAD | 152-3920 | Biobeads, 20-50 mesh |
| Potentiostat | Metrohm Autolab | PGSTAT 128N | |
| Potentiostat | CH Instruments | CHI604C | |
| Scripting software | Matlab | R2017a | Required toolboxes: 'Image Processing Toolbox', 'Parallel Computing Toolbox', 'Curve Fitting Toolbox', 'System Identification Toolbox', 'Optimization Toolbox' |
| Silicon wafers | IDB Technologies LTD | Si-C2 (N<100>P) | Ø 25 mm, 525 um thick |
| Teflon cell (Electrochemical cell) | Custom-made | Outer diameter: 26 mm; inner diameter: 13.5 mm | |
| Temple-Stripped Ultra-Flat Gold Surfaces | Platypus Technologies | AU.1000.SWTSG | Alternative ready-to-use ultra-flat gold surfaces (Thickness below 100 nm on demand) |
| Thin micropipette tips | Sarstedt | 70.1190.100 | or similar gelloader tips 200 µL |
| Ubiquinone-10 | Sigma | C-9538 | |
| Ultracentrifuge | Beckman-Coulter | L-80XP | with Ti 45 rotor |
| Ultrasonic bath | Fisher Scientific | FB15063 |
References
- Claessen, V. I., et al. Single-Biomolecule Kinetics: The Art of Studying a Single Enzyme. Annual Review of Analytical Chemistry. 3 (1), 319-340 (2010).
- Rojek, M. J., Walt, D. R. Observing Single Enzyme Molecules Interconvert between Activity States upon Heating. PLoS ONE. 9 (1), e86224 (2014).
- Velonia, K., et al. Single-Enzyme Kinetics of CALB-Catalyzed Hydrolysis. Angewandte Chemie International Edition. 44 (4), 560-564 (2005).
- Lu, H. P., Xun, L., Xie, X. S. Single-molecule enzymatic dynamics. 282 (5395), Science. New York, N.Y. 1877-1882 (1998).
- Engelkamp, H., Hatzakis, N. S., Hofkens, J., De Schryver, F. C., Nolte, R. J. M., Rowan, A. E. Do enzymes sleep and work? Chemical Communications. 9 (9), 935-940 (2006).
- Boukobza, E., Sonnenfeld, A., Haran, G. Immobilization in Surface-Tethered Lipid Vesicles as a New Tool for Single Biomolecule Spectroscopy. The Journal of Physical Chemistry B. 105 (48), 12165-12170 (2001).
- Hsin, T. -M., Yeung, E. S. Single-Molecule Reactions in Liposomes. Angewandte Chemie International Edition. 46 (42), 8032-8035 (2007).
- García-Sáez, A. J., Schwille, P. Single molecule techniques for the study of membrane proteins. Applied Microbiology and Biotechnology. 76 (2), 257-266 (2007).
- Onoue, Y., et al. A giant liposome for single-molecule observation of conformational changes in membrane proteins. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1788 (6), 1332-1340 (2009).
- Jefferson, R. E., Min, D., Corin, K., Wang, J. Y., Bowie, J. U. Applications of Single-Molecule Methods to Membrane Protein Folding Studies. Journal of Molecular Biology. 430 (4), 424-437 (2018).
- Rigaud, J. L., Pitard, B., Levy, D. Reconstitution of membrane proteins into liposomes: application to energy-transducing membrane proteins. BBA - Bioenergetics. 1231 (3), 223-246 (1995).
- Jesorka, A., Orwar, O. Liposomes: Technologies and Analytical Applications. Annual Review of Analytical Chemistry. 1 (1), 801-832 (2008).
- Seddon, A. M., Curnow, P., Booth, P. J. Membrane proteins, lipids and detergents: Not just a soap opera. Biochimica et Biophysica Acta - Biomembranes. 1666 (1-2), 105-117 (2004).
- Li, M., et al. Single Enzyme Experiments Reveal a Long-Lifetime Proton Leak State in a Heme-Copper Oxidase. Journal of the American Chemical Society. 137 (51), 16055-16063 (2015).
- Rumbley, J. N., Furlong Nickels, E., Gennis, R. B. One-step purification of histidine-tagged cytochrome bo3 from Escherichia coli and demonstration that associated quinone is not required for the structural integrity of the oxidase. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Protein Structure and Molecular Enzymology. 1340 (1), 131-142 (1997).
- Jeuken, L. J. C., et al. Phase separation in mixed self-assembled monolayers and its effect on biomimetic membranes. Sensors and Actuators, B: Chemical. 124 (2), 501-509 (2007).
- Barsoukov, E., Macdonald, J. R. Impedance Spectroscopy Theory, Experiment, and Applications. , John Wiley & Sons. Chapters 1-2 (2005).
- Jeuken, L. J. C., Connell, S. D., Henderson, P. J. F., Gennis, R. B., Evans, S. D., Bushby, R. J. Redox Enzymes in Tethered Membranes. Journal of the American Chemical Society. 128 (5), 1711-1716 (2006).
- Compton, R. G., Banks, C. E. Chapter 4. Understanding voltammetry. , World Scientific Publishing Europe Ltd. Singapore. (2018).
- Girault, H. H. Chapter 10. Analytical and Physical Electrochemistry. , EPFL Press. Lausanne. (2004).
- Mazurenko, I., Jeuken, L. J. C. Timelapse (movie) of single vesicles fluorescence change upon potential application. , (2018).
- Li, M., Khan, S., Rong, H., Tuma, R., Hatzakis, N. S., Jeuken, L. J. C. Effects of membrane curvature and pH on proton pumping activity of single cytochrome bo3enzymes. Biochimica et Biophysica Acta - Bioenergetics. 1858 (9), 763-770 (2017).
- Li, M., Tuma, R., Jeuken, L. J. C. MATLAB code for the analysis of proton transport activity in single liposomes. , (2017).
- Li, M., Tuma, R., Jeuken, L. J. C. Time-resolved fluorescence microscopic data (traces) of individual lipid vesicles with proton transport activity. , (2017).
- Paula, S., Volkov, A. G., Van Hoek, A. N., Haines, T. H., Deamer, D. W. Permeation of protons, potassium ions, and small polar molecules through phospholipid bilayers as a function of membrane thickness. Biophysical Journal. 70 (1), 339-348 (1996).
- Brookes, P. S., Hulbert, A. J., Brand, M. D. The proton permeability of liposomes made from mitochondria) inner membrane phospholipids: No effect of fatty acid composition. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1330 (2), 157-164 (1997).
- Eriksson, E. K., Agmo Hernández, V., Edwards, K. Effect of ubiquinone-10 on the stability of biomimetic membranes of relevance for the inner mitochondrial membrane. Biochimica et Biophysica Acta - Biomembranes. 1860 (5), 1205-1215 (2018).
- Seneviratne, R., et al. A reconstitution method for integral membrane proteins in hybrid lipid-polymer vesicles for enhanced functional durability. Methods. , 1-8 (2018).
- Veshaguri, S., et al. Direct observation of proton pumping by a eukaryote P-type ATPase. Science. 351 (6280), 1-6 (2016).
