Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Bioengineering

Люцифер желтый - Надежный параклеточной проницаемости маркер а в клеточной модели человеческого кровяного мозга барьер

doi: 10.3791/58900 Published: August 19, 2019

Summary

Мы представляем флуоресценции анализ, чтобы продемонстрировать, что Люцифер желтый (LY) является надежным маркером для определения очевидной параклеточной проницаемости hCMEC /D3 клеточных монослоев, в пробирке модель человеческого гематоэнцефалического барьера. Мы использовали этот ацензию для определения кинетики сольственного монослойного образования в культурных клетках hCMEC/D3.

Abstract

Гематоэнцефалический барьер BBB состоит из эндотелиальных клеток, которые образуют барьер между системной циркуляции и мозга, чтобы предотвратить обмен несущественных ионов и токсичных веществ. Плотные соединения (TJ) эффективно уплотнять параклеточное пространство в монослойных в результате чего нетронутыми барьер. Это исследование описывает LY основе флуоресценции ассс, который может быть использован для определения его очевидного коэффициента проницаемости (Pприложение) и, в свою очередь, может быть использован для определения кинетики формирования слияния монослойных и в результате жесткой связи барьерцелостноста в монослойах hCMEC/D3. Мы также демонстрируем дополнительную полезность этого исследования для определения функциональной целостности TJ в трансинфицированных клетках. Наши данные из LY Pприложение анализа показывает, что hCMEC /D3 клетки, посеянные в трансвелл установки эффективно ограничить LY параклеточного транспорта 7 дней после культуры. В качестве дополнительной полезности представленного анализа мы также демонстрируем, что трансфекция наночастиц ДНК не изменяет пароклеточный перенос LY в монослойах hCMEC/D3.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Барьер крови-мозг (BBB) защитный барьер ограничивая приток компонентов плазмы в ткань мозга и состоит из эндотелиальных клеток мозга наряду с поддерживающими клетками, такими как перициты. Основная роль BBB заключается в том, чтобы служить в качестве барьера, который уплотняет пространство между периферической крови и центральной нервной системы (ЦНС) для поддержания гемостаза нервной микросреды1,2. Капиллярные эндотелиальные клетки мозга эффективно уплотняют параклеточный путь через образование межклеточных узких узлов (TJs)1. Этот защитный барьер позволяет глюкозе и выбранным питательным веществам проникать в мозг, в то время как он предотвращает прохождение через этот жесткий барьер большинство ионов, токсичных веществ и лекарств. Помимо своей защитной роли, функция естественного барьера BBB представляет собой серьезную проблему в разработке систем доставки лекарств, ориентированных на ЦНС.

Модели культуры клеток In vitro BBB являются полезными инструментами для изучения его биологии и понимания влияния лечения наркотиками на целостность Барьера TJ. Мы использовали микрососудистую эндотелиальную линию мозга человека (hCMEC/D3) в качестве модели in vitro, так как она является общепринятой моделью эндотелия мозга человека3 и резюмирует многие функции человеческого BBB. hCMEC/D3is один из наиболее часто используемых клеточныхлиний для моделирования BBB in vitro 4,5,6,7,8. Несмотря на свои сравнительно низкие значения трансэндотелиального электрического сопротивления (TEER), мера герметичности барьера, эта линия клетки сохраняет большую часть морфологических и функциональных свойств эндотелиальных клеток мозга, даже как монокультура при отсутствии cocultured глиальных клеток6,7. Линия клеток hCMEC/D3 выражает несколько маркеров BBB, включая активные транспортеры и рецепторы до приблизительно прохождения 35 без прохождения дедифференцирования к нестабильным фенотипам6,7,9 ,10,11. Наиболее поразительной характеристикой линии клеток hCMEC/D3 в качестве моделиin vitro BBB является ее способность формировать TJs 5,9,11,12. Следует отметить, что, хотя стволовые клетки полученных bBB модели показали более высокую проницаемость во многих исследованиях по сравнению с hCMEC / D3 клеточной линии, и они выражают некоторые маркеры BBB, они еще не развиваться как наиболее распространенные модели BBB ячейки13. Важно отметить, что стволовые клетки, полученные bBB модели по-прежнему характеризуются по отношению к максимальным числам прохода, которые позволяют клеткам поддерживать стабильные фенотипы BBB14.

Три основных метода обычно используются для определения целостности барьера TJ, включая измерение TEER, измерение коэффициента проницаемости (Papp) малых гидрофильных молекул трассировщика, таких как сахароза, инулин, Люцифер желтый, и т.д. и иммуно-пятно известных молекулярных маркеров TJs, таких как claudin-5, ЗО-1, окклудин и т.д.5. TEER является относительно простым и количественным методом, который измеряет электрическое сопротивление черезмонослои клеток, культивированные на пористых мембранных субстратах 5. Однако значения TEER могут зависеть от экспериментальных переменных, таких как состав культуры и тип измерительного прибора. Вероятное сочетание этих факторов приводит к широкому распределению значений TEER в диапазоне от 2 до 1150 см2 в линии клеток hCMEC/D3, культивируется в течение 2-21 дней13. Immunostaining является визуальным методом, чтобы определить наличие TJ белков путем маркировки целевого белка с использованием антител. Тем не менее, иммуностоирование включает в себя ряд экспериментальных шагов, в том числе необходимость исправить / пермяки клеток, которые могут привести к экспериментальным артефактов и флуоресцентные сигналы могут исчезать с течением времени. Вышеуказанные факторы могут привести к субъективным ошибкам, влияющим на качество данных.

Основное внимание в этой работе заключается в представлении LY основе очевидной проницаемости ассссопределить определить кинетику созидательного монослой образования в культивированных hCMEC / D3 клеток. Хотя другие передовые системы in vitro BBB, такие как системы совместной культуры, микрофлюидные системы, физиологически более актуальны, с значительно улучшенной барьерной функцией15,16,17, hCMEC/D3 Трансвелл установка является простой и надежной моделью для оценки кинетики формирования TJ и быстро экранировать влияние различных препаратов на барьерфункции. В целом значенияP-приложений согласуются для различных гидрофильных растворов в монослойах hCMEC/D3. Например, заявленные значенияp-приложений для различных низкомолекулярных масс solutes (таких как сахароза, маннитол, LY и т.д.) в различных моделях in vitro BBB находятся в порядке 10-4 см/мин5,18,19 , 20. В нашей экспериментальной установки, мозг эндотелиальных клеток посеяны на коллагена покрытием микропористые мембраны для клеточной привязанности и монослой образования, чтобы имитировать барьер in vivo. LY добавил в апической стороне, как ожидается, пройти межклеточные узкие соединения и накапливаются в базолатеральной стороне. Более высокие концентрации LY в базолатеральной стороне указывают на незрелый, не полностью функциональный барьер, в то время как более низкие концентрации отражают ограниченный транспорт из-за наличия функциональных TJ, что приводит к зрелому барьеру.

LY является гидрофильной краситель с различными возбуждения / выбросы пиков и позволяет избежать необходимости радиомаркировки трассировщик молекул, таких как сахароза, маннитол или инулин. Таким образом, значения флуоресценции LY могут быть использованы для непосредственного расчета его параклеточной проницаемости через монослои BBB. Кроме того, по сравнению со многими коммерчески доступные красители, используемые в биомедицинских областях, которые страдают от небольших сдвигов Стокса, таких как флуоресцеин21, Стокс сдвиг LY составляет около 108 нм с достаточным спектральным разделением, что позволяет LY флуоресценции данных, как надежный считывание для определения параклеточной проницаемости. Мы использовали западные blotting как orthogonal метод для того чтобы продемонстрировать изменения в выражении плотного протеина маркера соединения, no zo-1, над временем культуры. Выражение ЗО-1, обнаруженное с помощью западного блоттинга, используется для дополнения данныхприложения LY P и в сочетании эти данные позволяют предположить, что наблюдаемые изменения в значенияхприложения LY P отражают образование монослой с постепенным увеличением выражение плотного маркера соединения, ЗО-1.

Как указывалось ранее, в центре внимания этой работы является демонстрация LY анализ как простой метод для мониторинга формирования слияния монослой с функциональными плотными соединениями. Однако, чтобы продемонстрировать дополнительную полезность разработанного анализа, мы измерилиприложение LY P в наночастицах ДНК-трансфицированных монослойах hCMEC/D3. Нуклеиновые кислоты могут быть конденсированы в полиэлектролитные наночастицы диаметром 100-200 нм с помощью электростатического взаимодействия между положительно заряженными группами полимеров и отрицательно заряженными фосфатными группами нуклеиновых кислот22, 23. Мы ссылаемся на эти комплексы как наночастицы ДНК (ДНК NPs) в нашей работе. Хотя наше намерение состоит в том, чтобы трансфектировать клетки и выразить желаемый белок, мы должны обеспечить, чтобы барьерные свойства монослойов hCMEC/D3 не были скомпрометированы. Наши данные свидетельствуют о том, что стандартный режим трансфекции генов 4 h luciferase не измеримо изменяет проницаемость LY, демонстрирующую полезностьанализа приложения LY P для определения изменений в целостности барьерного барьера TJ.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1.Общая культура клеток hCMEC/D3

  1. Реанимация замороженных клеток
    ПРИМЕЧАНИЕ: Все поддержания культуры клеток и эксперименты были проведены внутри стерильного капюшона биобезопасности. Культурные носители, добавки и реагенты были приобретены в качестве стерильных продуктов или стерилизованы с помощью фильтрации с помощью мембранного фильтра 0,22 мкм для предотвращения микробного загрязнения.
    1. Добавьте 8,5 мл коллагенового раствора (0,15 мг/мл) в колбу культуры тканей (75 см2 области роста; отныне называют T75) и поместите его в инкубатор (37 градусов по Цельсию, 5% CO2)на 1 ч.
    2. Удалить раствор коллагена и осторожно промыть колбу стерилизованной фосфат-буферной солей (PBS). Добавьте 15 мл полной среды роста в колбу и оставьте в инкубаторе CO2 на 15 минут.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Полная среда (окончательная концентрация) содержала эндотелиальный рост клеток Базальный Средний-2 (500 мл) дополненный сывороткой крупного рогатого скота плода (5%), пенициллин-стрептомицин (1%), гидрокортизон (1,4 м/м), кислота аскорбиновая (5 мкг/мл), химически определенный липид концентрата (1/100), HEPES (10 мМ) и основной фактор роста фибробластов (1 нг/мл).
    3. Переместите кривиальный из замороженных клеток hCMEC/D3 из резервуара с жидким азотом и быстро разморозьте флакон в водяной бане 37 градусов по Цельсию (1 мин).
    4. После того, как только крошечный хлопья льда виден, быстро аспирировать и передать клетки в колбу, содержащую предварительно подогревом среды. Аккуратно встряхните колбу, чтобы позволить смешиванию клеток со средой роста.
    5. Поместите колбу в инкубатор (37 градусовпо Цельсию, 5% CO 2) и наблюдать за клетками под легким микроскопом через 2 ч, чтобы убедиться, что клетки прикреплены.
    6. После того, как клетки прикрепляются к нижней части колбы, удалить старый рост среды и добавить 10 мл свежего предварительно подогретого роста среды для замены диметилсульфоксида в старом среде роста24.
    7. После 24 ч проверьте под легким микроскопом, чтобы наблюдать шпиндель-образные клетки и заменить старую среду роста с предварительно разогретой свежей средой роста.
  2. Обслуживание культуры ячеек
    1. Пополнить среды роста через день до 100% слияния. Проверьте клетки под микроскопом, прежде чем удалить старую среду роста, а также после добавления свежей среды роста. Выняйте колбу из инкубатора и исследуете клетки hCMEC/D3 под фазовым контрастным микроскопом, чтобы убедиться, что они выглядят здоровыми.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Большинство клеток должны быть прикреплены к нижней части колбы, имеют шпиндель-образной морфологии и часто раз, свет преломляется вокруг их мембран также видел. Среда роста должна быть прозрачной (необлачной) и розовато-оранжевого цвета.
    2. Удалите старую среду роста из колбы и перенесите 10 мл предварительно подогретой свежей среды в колбу.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Среда должна быть добавлена к верхней стороне колбы, а не непосредственно на поверхности клеток, чтобы избежать влияния на вложение клеток.
    3. Включите колбу обратно в горизонтальное положение и осторожно рок несколько раз и проверить hCMEC / D3 клеток под микроскопом, прежде чем вернуть колбу в инкубатор (37 КК, 5% CO2).
    4. Наблюдайте за клетками под перевернутым световым микроскопом каждый раз до и после обработки клеток, как во время обычной культуры работы, так и во время экспериментов. Запись любых заметных изменений в количестве клеток или морфологии в лабораторной тетрадь.
  3. Пропуск ячеек
    1. Инкубировать новую колбу T75 с 8,5 мл коллагенового раствора на 1 ч винкубаторе (37 градусов по Цельсию, 5% CO 2).
    2. Удалить раствор коллагена и осторожно мыть колбу со стерилизованные PBS. Добавьте 10 мл предварительно разогретого hCMEC/D3 среды к новой колбе и поместите колбу в инкубатор (37 градусов по Цельсию, 5% CO2).
    3. Выняйте колбу из инкубатора и исследуете клетки hCMEC/D3 под фазовым контрастным микроскопом, чтобы проверить, являются ли клетки 100% сливочные.
    4. Удалить hCMEC/D3 клеточной среды из колбы, содержащей клетки и мыть hCMEC/D3 клеток с 10 мл PBS.
      ПРИМЕЧАНИЕ: FBS добавил к среде роста содержит ингибиторы протеазы, такие как 1-антитрипсин и No2-макроглобулин. Они препятствуют процессу трипсинизации. Таким образом, важно мыть клетки с PBS, чтобы удалить следы FBS, чтобы предотвратить ингибирование процесса трипсизации.
    5. Добавьте 1 мл 0,25% трипсина, содержащего 0,02% ЭДТА, и протрите в течение 2-5 мин в инкубаторе (37 градусов по Цельсию, 5% CO2) (нажмите колбу мягко по бокам, чтобы помочь отслоение).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Никогда не оставляйте клетки на трипсин / EDTA в течение более 6 мин.
    6. Добавьте 10 мл предварительно разогретого hCMEC/D3 среды, чтобы остановить процесс трипсиизации и повторно приостановить hCMEC/D3 ячейки трубачи вверх и вниз несколько раз. Затем снимите всю клеточную подвеску с колбы в трубку объемом 15 мл.
    7. Перенесите 1 мл клеточной подвески из трубки 15 мл в новую колбу с предварительно подогретой свежей средой (расщепление клеток 1:10) и верните новую колбу обратно в инкубатор.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Перед передачей в новую колбу, пипетка подвески ячейки вверх и вниз несколько раз, чтобы свести к минимуму градиенты концентрации клеток.

2. Клеточное покрытие

  1. Поместите ткани культуры вставки с микропористыми мембранами (размер пор: 0,4 мкм, материал: полиэтилен терефталат (ПЭТ)) в 24-хорошо культуры пластины.
  2. Добавьте 400 л коллагена i типа I (0,15 мг/мл) в каждую вставку культуры тканей и инкубировать на 1 ч в инкубатор CO2 (37 градусов по Цельсию, 5% CO2). Рок 24-хорошо пластины мягко, чтобы даже распространение коллагена раствора по микропористым мембраны в ткани культуры вставки.
  3. Удалите коллагеновый раствор и аккуратно промойте микропористую мембрану 0,4 мл 1x буфера PBS.
  4. Плита hCMEC/D3 клетки с плотностью 50000 клеток / см2 в клетке вставки (15000 клеток в 500 л среднего).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для того, чтобы свести к минимуму различия в количестве клеток в каждой вставке культуры ткани, клеточная подвеска была перенакрыта с помощью 10 мл пипетки перед добавлением клеток в вставки.
  5. Поместите 24-колодую пластину с установкой культуры тканей в инкубатор (37 градусов по Цельсию, 5% CO2),чтобы позволить клеточному креплению и пролиферации.
  6. Инкубировать пластину в течение 7 дней, чтобы клетки достигли 100% сплава. Удалите среду роста через день и перенесите 0,5 мл предварительно разогретых свежих носителей в вставки культуры тканей.
  7. Повторите процедуру покрытия (шаги 2.2-2.6) на 12-хорошей пластине, 48-хорошей пластине и 96-хорошей пластине. Используйте 12-колодую пластину для западного промотирования, чтобы определить изменения в экспрессии ЗО-1. Используйте 48-колодую пластину для трансфекции ДНК NP. Используйте 96-ну хорошую пластину для атсии, чтобы определить жизнеспособность клеток в трансинфицированных клетках.

3. Кинетика клеточного роста.

  1. Семена клеток при плотности 50000 клеток / см2 в коллагена покрытием 24-ну хорошо ткани культуры пластины.
  2. На каждый день эксперимента, удалить среды роста и осторожно мыть клетки дважды с 500 зл и 1x PBS. Затем добавьте 30 кл 0,25% раствор атрипсина, содержащий 0,02% ЭДТА, и оставьте тарелку примерно на 2-5 мин в инкубаторе (37 градусов по Цельсию, 5% CO2).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Постепенное образование сопливого монослой может повлиять на степень отслоения клеток и необходимо увеличить объемы трипсина/ЭДТА, как указано здесь: 30 Л в течение 1-5 дней после посева, 60 Л в течение 6-7 дней после посева и 100 Л в течение 8-10 дней после посева .
  3. Добавьте либо 470 qL, 440 qL или 400 л среды роста на основе объема трипсина / EDTA решение, добавленное в шаге 3.2 для подготовки 500 л клеточной суспензии в каждой скважине.
  4. Приостановить клетки пиптинг вверх и вниз в каждом колодце несколько раз и наблюдать клетки под микроскопом, чтобы убедиться, что все клетки приостановлены в среде роста. Если некоторые клетки по-прежнему прикреплены к нижней пластины после pipetting несколько раз, осторожно соскребать клетки с помощью пластиковой клетки скребок для облегчения отслоения клеток.
  5. Удалить 0,1 мл клеточной суспензии от 500 л клеточной подвески в шаге 3.3 и добавить в трубку 1,5 мл. Затем добавьте 0,1 мл 0,4% Трипан синий раствор в суспензии клетки и хорошо перемешать.
  6. Очистите гемаситометр 70% изопропиловым спиртом. Добавьте 20 кл.с. смеси со ступени 3,5 с каждой стороны в V-паз е и найдите 16 квадратов под микроскопом. 16 квадратов считаются одной сеткой. Найдите две случайные сетки по обе стороны от гемаситометра и подсчитайте все живые, несиние клетки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Клетки, которые появились синий цвет из исключены из подсчета, lt;1% клеток окрашенных синий во все моменты времени.
  7. Рассчитайте плотность клеток (клетки/см2)на основе следующих формул.
    Средний q ячеек/сетки (Eq.1) Equation 1
    Коэффициент разбавления Equation 2 (Eq.2)
    Плотность клеток (жизнеспособные клетки/см2)
    Equation 3
    (Eq.3)
    Уравнения 1-3. Жизнеспособные ячейки - это количество ячеек, подсчитанных в каждой сетке, количество сеток соответствует количеству сеток, расположенных под микроскопом, объем смеси клеточной подвески и 0,4% Трипан синий объем подготовлен в шаге 3.5, объем клеточной подвески удален объем удалены из 500 л клеточной подвески в шаге 3,5, объем клеточной подвески в каждой скважине является 500 Л клеточной подвески от шага 3.3, область роста ткани культуры пластины является область роста одного колодца в 24-хорошо пластины.

4. Люцифер желтый очевидной проницаемости (LY P приложение ) асссе

  1. Для определенияприложения LY P на каждый день после посева, следуйте шагам, начиная с 4.3. Для определенияприложения P в трансинфицированных клетках hCMEC/D3 добавьте 8,3 л трансфекционной формулировки (рисунок1),смешанной с 50 злицом полной среды роста и инкубировать для 4 ч. Трансфекционные формулировки описаны в разделе 5.
  2. После 4 ч трансфекции, осторожно мыть апкальную сторону дважды с помощью стерильного буфера 1x PBS, чтобы удалить любые остаточные трансфекционной смеси. Различные объемы буфера PBS, оставленного после удаления, могут повлиять на концентрацию LY в апической стороне. Позаботьтесь о том, чтобы остаточный буфер PBS в вставках культуры тканей был полностью удален. Тщательно аспирировать остаточные реагенты и средние, чтобы свести к минимуму отслоение клеток.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг пропускается при измерении ежедневной очевидной проницаемости (Pприложение) из hCMEC/D3 клеток.
  3. Удалите среду роста и добавьте 1,5 мл предварительно подогретого (37 градусов по Цельсию) транспортного буфера (25 мМ HEPES, 145 мМ NaCl, 3 мМ KCl, 1 мМ CaCl2, 0,5 мм ММ MgCl2, 1 мМ2PO4, 5 мм глюкозы, pH 7.4) к басолатеральной стороне.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Объем транспортного буфера во всех базолатеральных отсеках должен быть равным для обеспечения точности расчета коэффициента проницаемости.
  4. Добавьте 58,3 л из 20 растворов мкм LY к апической стороне каждой вставки transwell. Сохраните 50 зл из 20 раствора мкм LY для измерений флуоресценции. После удаления остаточного буфера PBS с аптической стороны полностью добавьте решение LY как можно быстрее, чтобы избежать высыхания ячеек hCMEC/D3. Обеспечьте точные объемы решения LY в апической стороне.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы свести к минимуму распад интенсивности LY флуоресценции, воздействие света должно быть ограничено. После того, как порошок LY будет восстановлен, раствор должен храниться при 4 градусах Цельсия, защищенном от света.
  5. Инкубировать в роторную пластину шейкер (37 кв.м., 100 об/мин) в течение 60 мин. Затем удалите 30 л образца LY из каждого апического отсека. Затем перенесите раствор 20 КМ LY и атические боковые образцы на предварительно маркированные трубки и разбавьте образец в 10 раз с помощью транспортного буфера.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Требуется разбавить 20 мКМ LY фондовых раствор атакжемальных побочных образцов, потому что высокая интенсивность флуоресценции этих образцов может потенциально перегрузки и повреждения флуоресценции детектор флуоресценции микроплиты.
  6. Удалить 500 л из каждого баролатерального отсека и перенести образец на предварительно маркированные трубки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Образцы удаляются из отдельного трансвеллы в указанных временных точках. Время точек каждый день после посева, начиная с первого дня до дня 10.
  7. Подготовьте ряд стандартов LY для стандартной кривой (39.00 нм, 78.13 нм, 156.25 нМ, 312 нм, 625 нм, 1250 нм, 2500 нм).
  8. Добавьте 100 юл каждого стандарта (в дубликате), актикальный и базолатеральный образец к каждой скважине в черной 96-колодской пластине(рисунок 1).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Черные пластины поглощают свет и уменьшают фон и флуоресценцию кроссовера среди колодцев.
  9. Используйте флуоресценцию микроплиты (набор точек: возбуждение 428 нм, выброс 536 нм) для измерения интенсивности LY флуоресценции для расчета Pприложение. Флуоресценция пластины считыватель используется для этого исследования.
  10. Рассчитайте значения восстановленияP и %LY, как описано в тексте рукописи.
    Уравнение 4. Формула для расчета значенийp-приложений.
    Рассчитайте коэффициент очевидной проницаемости (Papp)и восстановление %LY с помощью следующих уравнений. Следует отметить, что значенияприложения P могут быть рассчитаны либо на основе массы25, либо на основе концентрации LY.
    Equation 4 ИлиEquation 5
    VA - объем в апическом отсеке
    VB - объем в баролатеральном отсеке
    A - площадь поверхности вставки мембраны Transwell (0,3 см2)
    MA0 - начальная масса в апическом отсеке
    ММБ/Зт - изменение массы с течением времени в баролатеральном отсеке
    CA0 - начальная концентрация в апическом отсеке
    КСВ/Зт - изменение концентрации с течением времени в баролатеральном отсеке.
    Уравнение 5. Формула для расчета % восстановленияLY.
    Восстановление (%) Equation 6
    MAf является масса в апический отсек в точке времени окончания, MBf является масса в базолатеральном отсеке в точке конца времени, MA0 является начальной массой в апикальномотсеке . 26 Примечание: Начальная масса рассчитывается на основе объема решения 20 км LY на этапе 4.5. Этот эксперимент всегда проводился с использованием ячеек под проходом No 35 и проводился четыре самостоятельных раза.

5. Истощение кальция

  1. Удалите среду роста из вставок Transwell и 12-хорошо пластины и осторожно мыть апкальной стороны и 12-хорошо пластины с помощью предварительно подогретого кальция свободной среде (минимальный основной средний орлан Спиннер (S-MEM) среды) для удаления ионов кальция из трансвелл вставки и 12-колодец пластины.
  2. Добавьте 500 юл или 2 мл предварительно разогретого S-MEM 1xmedium к вставкам или 12-хорошую пластину и инкубировать втечение 24 ч в инкубаторе (37 кв. м, 5% CO 2). После инкубации, удалить S-MEM 1x среды и мыть клетки один раз с помощью предварительно нагревается 1x PBS буфера.
  3. Следуйте шагам 4.4-4.10, описанным в разделе 4 для лечения LY и последующих шагов. Следуйте шагам 8.1.2-8.2.4, описанным в разделе 8 для западных промотирования и последующих шагов.

6. Трансфекция

  1. Подготовка наночастиц ДНК (ДНК-НП).
    1. Разбавить запас раствор омнича-Люк плазмида в 10 мМ ацетат натрия (NaAc) буфер (pH 5.0) и позволяют раствор ДНК стоять в течение 10 мин при комнатной температуре (RT).
      ПРИМЕЧАНИЕ: ДНК NP, содержащий преимущественно одиночные молекулы ДНК могут быть подготовлены в концентрациях ДНК 20-40 мкг/мл23. Таким образом, гВИЗ-Люк плазмидный складраствор должен быть разбавлен. Замороженный запас плазмида гВИЗ-Люка должен быть полностью разморожен на льду, чтобы свести к минимуму температурный стресс. Аккуратно вихрь разбавленного сосуды ДНК на 30 с на стандартном вихре скамейки, установленном на позиции ручки 3-5.
    2. Рассчитайте желаемые соотношения N/P, используемые здесь в качестве численного параметра для отражения состава NP.
      Equation 7
      Уравнение 6. Расчет соотношения N/P: соотношение родинок групп аминов катионных полимеров к фосфатным группам ДНК. Масса катионных полимеров означает общее взвешенное количество катионного полимера; (Масса/Зарядка) катионные полимеры относятся к молекулярному весу катионного полимера (полиэтилнегликоля) 5к-блок-полиаспартамид с 48 диэтиленетриаминами боковых цепочек (PEG-DET)) нормализованы до количества заряженных первичных аминов (48) на циатический полимер ( mol/mol), это значение для нашего полимера 306 Da; Масса ДНК означает общее количество ДНК, используемой в формулировке, полученной путем умножения объема и концентрации в мг/мл; (Масса/Зарядка) ДНК относится к молекулярному весу ДНК, нормализованному к количеству фосфатной группы на двухцепочечную ДНК (325 Да на нуклеобазу).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Таблица подготовки ДНК NP(Таблица 1) содержит рецепт формулировки для различных образцов, протестированных в наших экспериментах. ДНК NP были подготовлены с использованием техники быстрого титрования. Полимерный раствор PEG-DET был добавлен вдоль стенок трубки, удерживая трубку в горизонтальном положении. Затем трубка была переключена на вертикальное положение, после чего быстро вихрь на максимальной скорости для 10s. ДНК NP было разрешено стоять в течение 30 минут на RT до использования. Правило большого пальца для дозирования ДНК NP составляет 0,5 мкг ДНК для около 1 см2 области роста. Таким образом, для каждой вставки трансвелл /каждый хорошо в 48-ну хорошо пластины / каждый хорошо в 96-лукпластины, подготовить ДНК NP на N / P 10, содержащий 0,157/0,5/0.195 мкг / хорошо гВИЗ-Люк ДНК.
    3. Для образцов, содержащих указанную концентрацию Poloxamer P84 (P84), добавьте P84 к ДНК NP и вихрю на 5 с. Окончательная концентрация P84 в каждой выборке составляет либо 0,01%, либо 0,03% вт.
  2. Трансфекция ДНК NP в 48-колодцевой установке пластины
    1. Семя клетки с плотностью 50000 клеток / см2 в 48 хорошо пластины и расти до слияния в инкубаторе (37 кв., 5% CO2).
    2. Для каждой группы лечения смешайте 25 кЛ указанного образца (трансфекционный состав) и 150 л полного среднего роста и 175 л этой смеси к каждой скважине.
    3. Наблюдайте за клетками hCMEC/D3 под микроскопом, чтобы убедиться, что клетки выглядят здоровыми и на 100% стыковывки во время эксперимента.
    4. Удалите среду роста из скважин и 175 йЛ трансфекционной смеси для каждой скважины. Затем инкубировать тарелку на 4 ч в инкубаторе (37градусов по Цельсию, 5% CO 2).
    5. После 4 ч удалите трансфекционную смесь и промойте клетки hCMEC/D3 с предварительно подогретым стерильным буфером 1x PBS.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы свести к минимуму случайное отслоение hCMEC/D3 клеток от поверхности пластины/вставки во время стирки, тщательно пипетка достаточно стерильной PBS вдоль стенок скважин и удалить любые наночастицы в остаточной культуры средств массовой информации.
    6. Аккуратно раскачивать тарелку несколько раз и тщательно аспирировать и отбрасывать PBS мыть и добавить 500 зл. hCMEC/D3 предварительно подогретой среды культуры.
    7. Микроскопически исследовать клетки и записывать наблюдения на морфологии клеток и любых возможных эффектов трансфекции.
    8. Инкубировать для 24 h в инкубаторе культуры 37 кс, чтобы позволить люциферазы производства. После 24 ч, удалить рост среды полностью и мыть клетки один раз с предварительно подогретых 1x PBS.
    9. Выщелачить трансинфицированных клеток, добавив 100 л ледяной люциферазы клеточной культуры культуры лиза 1x реагента на хорошо.
    10. Для измерения содержания белка люциферазы добавьте 20 л клеточного лизата и 100 л люциферазы ассеа-буфера (20 мм глицилглицин (pH 8), 1 мМ MgCl2, 0,1 мМ EDTA, 3,5 мМ DTT, 0,5 мМ ATP, 0,27 мм кофермента AL.
    11. Прочитайте люминесценцию образца, описанную в шаге 6.2.10 на Luminometer с единым авто-инжектором.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Люминесценция должна быть интегрирована в течение 10 с перед чтением.
    12. Измерьте общее количество клеточного белка в лизате с помощью набора анализов бисинхониновой кислоты (BCA assay) путем следования протоколу производителя.
    13. Рассчитайте и выразите экспрессию гена люциферазы как относительные световые единицы (RLU) на общий клеточный белок.

7. Люминесцентный атлет

  1. Семя клетки с плотностью 50000 клеток / см2 в 96 хорошо пластины и расти до слияния в инкубаторе (37 кв., 5% CO2).
  2. Трансфектирует клетки с 9,7 л трансфекционной формулы (детали подготовки находятся в разделе 6) и 58,4 л полной среды роста для 4 ч.
  3. Удалите трансфекционную смесь и осторожно промойте клетки предварительно подогретым буфером PBS 1x дважды, чтобы полностью удалить реагенты обработки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Различные объемы остаточного буфера могут разбавить ассационные реагенты СПС в различной степени и потенциально могут повлиять на данные.
  4. Смешайте 75 л свежего предварительно разогретого среднего и ат-атс-реагента атсис в 1:1 разбавления с помощью многоканального пипетка. Убедитесь, что уровень жидкости во всех многоканальных наконечниках пипетки одинаков.
  5. Поместите тарелку на nutating шейкер в течение 15 минут при комнатной температуре. После 15 минут добавления реагентов, передача 60 зл и l каждого образца в белую 96-колодую пластину.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Белые пластины лучше отражать выходной свет, чем четкие или черные пластины.
  6. Поп любые пузырьки воздуха с помощью иглы до чтения пластины. Прочитайте пластину на люминометре с 1 с интеграцией времени. Прочитайте пластину в течение 20 минут после добавления АТФа асссиревы реагентов. Сроки имеет решающее значение для сравнения между различными пластинами, потому что люминесценция сигнал преходящий с быстрой скоростью распада.
  7. Рассчитать процент (%) жизнеспособность клеток с использованием этой формулы: (люминесценция трансинфицированных клеток/люминесценции контроля, необработанных клеток) x 100.

8. Западная промотирование для измерения плотного соединения белка ЗО-1

  1. Лиза и протеина
    ПРИМЕЧАНИЕ: Все шаги для извлечения белка из клеток должны быть выполнены при 2-8 градусах Цельсия.
    1. Семена клеток при плотности 50000 клеток / см2 в коллагена покрытием 12-ну хорошо ткани культуры пластины.
    2. На 3-й день, день 5, день 7, день 10 после посева и на 7-й день (клетки предварительно инкубированы с кальцием свободной среде), удалить среду роста и осторожно мыть клетки дважды с 2 мл льда ледяной 1x PBS. Затем добавьте 300 л смеси ледяного 1x ЛИПА лисис буфера, содержащего 3 мкг/мл апротинина в каждой скважине.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Смесь должна быть свежеприготовлена и храниться на льду. Апротинин используется для ингибирования протеаз, присутствующих в лисатах от деградации белка интерес.
    3. После двух циклов заморозки оттепели (-80 градусов по Цельсию) соскребите клетки с помощью холодного пластикового скребка клеток. Соберите щелочники клеток в микрофуговых трубках. Затем центрифуги труб на 200 х г в течение 30 мин при 4 градусах По Цельсию.
    4. Соберите супернатант в чистые трубки и поместите их на лед. Измерьте общее количество клеточного белка в лисатах с помощью набора анализов BCA, следуя протоколу производителя.
  2. Западная промотирование для обнаружения плотного соединения белка ЗО-1
    1. Денатурные аликвоты общего количества гомогенатов, содержащих 40 мкг общего белка с буфером 1x Laemmli при 95 градусах по Цельсию, 5 мин и подлежащих электрофорезу в снижении 6-7,5% натрия додецил сульфат полиакриламида гель (SDS-PAGE) (90 V, 10 мин через укладку геля, 120 V через разрешители гели).
      ПРИМЕЧАНИЕ: При загрузке образцов или стандартов, не забудьте загрузить медленно и осторожно в каждой полосе, стараясь не сломать колодец в этом процессе.
    2. Перенесите отделенные белки на мембрану нитроцеллюлозы с буфером передачи pH 8.5, который содержит 192 мМ глицин, 25 мм трис базы, 10% метанола и 0,1% SDS (75 V, 110 мин при комнатной температуре).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Не прикасайтесь к мембране. Используйте 70% изопропанола промывают пластиковые щипцвые для обработки мембраны. Для того, чтобы успешно перенести белок ЗО-1 (МВт 200 кДа) на мембрану, рН должен быть около 8,3-8,5. Если буфер передачи более кислый, чем это, передача не произойдет. Если полосы лестницы видны еще на геле, было бы полезно увеличить время передачи и концентрации SDS.
    3. После мытья мембраны с помощью соления Tris-буфера, содержащего 0.1%Tween 20 (T-TBS), используйте блокирующий раствор (1:1 LiCOR-Odyssey Block: 1x Tris buffered saline) для блокирования мембран в течение 60 мин.
    4. Аккуратно разрежьте мембрану на две полосы. Инкубировать двумя первичными антителами (моноклональные антитела ЗО-1, разбавление, 1: 900, и глицеральдегид омандрогеназой 3-фосфатной дегидрогеназы (GAPDH) антитела, разбавления, 1: 10000) на ночь при 4 градусах Цельсия. Затем инкубировать мембраны ЗО-1 и GAPDH с осла анти-мыш IgG (разбавление, 1:50,000). После мытья мембран с помощью T-TBS, изображение мембран в 700 канал на 16-битный образ.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Во-первых, мы определили влияние времени культивирования на проницаемость LY для определения очевидной кинетики формирования TJ. Средние значенияприложения LY P с 1-го дня до 10-постов показаны на рисунке 2a. На 1 день, средний Pприложение было 4,25 х 10-4 см / мин и немного упал до 3,32 х 10-4 см / мин на второй день. Среднее значениеприложения P немного увеличилось до 3,93 х 10-4 см/мин на 3-й день и колебалось без каких-либо существенных изменений до 6-го дня. Значенияприложения P значительно снизились до 2,36 х 10-4 см/мин в день 7 по сравнению с днем 1 (P qlt; 0.05), вероятно, предполагая, что барьер стал более жестким. Значенияприложения P стабилизировались в диапазоне между 2,14 x 10-4 и 2,36 x 10-4 см/мин с 7-го на 10-й день, что подразумевало, что образование барьера было полным и функциональным, что привело к снижению парацеллюлятного переноса LY. Мы вычислили процент (%) LY восстановлены на каждый день, чтобы быть около 80%, значение, которое считается оптимальным для надежного расчета значенияp приложения 27 (Figure 2b). Восстановление% является важным показателем в LY-ассе. Например, если клетки усваивают большинство LY, LY обездвиживается в клетках или прилипает к клеточной мембране или LY деградирует во время инкубации, было бы неточным интерпретировать, что наблюдается низкий сигнал LY в басолатеральном отсеке указывает на жесткий барьер. Таким образом, восстановление% дает больше уверенности в том, что мы не потеряли значительное количество LY из-за одной или нескольких из вышеперечисленных возможностей и позволяет уверенно оценить значенияприложения LY P. Как отмечалось ранее в разделе введения, более высокая концентрация LY в базолатеральной стороне указывает на неполный барьер, в то время как более низкие концентрации отражают ограниченный транспорт, предполагая зрелый, полный барьер из-за присутствия функциональных Tjs. Мы также представляем дополнительные доказательства с помощью ортогоналки, Западного обнаружения протеина Зо-1(рисунок4), чтобы подтвердить, что наблюдаемые изменения вприложении LY P коррелирует с образованием плотных соединений.

Так как установка вставки Transwell не позволяет непосредственно отслеживать изменения плотности клеток, мы определили изменения плотности клеток, используя стандартный вид видеосик Trypan blue exclusion. Поэтому мы определили изменения плотности клеток на прозрачной пластине культуры тканей, что позволило нам контролировать кинетику роста клеток. Увеличение плотности клеток с 5,5 и 1,0 х 104 клетки/смот 2 до 1,9 и 0,2 х 105 клеток/см2 с первого дня до 10-поста посева (рисунок3)было линейным с коэффициентом регрессии 0,94. Эти данные также свидетельствуют о том, что наблюдаемые изменения в приложении LY P (рисунок2a)являются результатом формирования конфлеантного монослой в течение 10-дневного периода. Мы наблюдали клетки под перевернутым световым микроскопом каждый день и визуально задокументировали постепенное увеличение числа клеток и образование монослой.

Мы использовали западные промотирования для обнаружения изменений в выражении плотного белка соединения ЗО-1 с течением времени(рисунок 4). Изменения в экспрессии ЗО-1 используются для устного дополнения данныхприложения LY P и обеспечения того, чтобы наблюдаемые изменения вприложении LY P указывают на формирование жесткого барьера. Интенсивность полосы No 1 была проанализирована денситометрией и нормализована по отношению к экспрессии гена домашнего хозяйства, GAPDH. Две полосы на рисунке представляют две изоформы ЗО-1 (ЗО-1) и «ЗО-1»-28. Анализ денситометрии показал, что пиксельное значение ЗО-1 увеличилось с 3-7 дня после посева, что свидетельствует о том, что белок TJ ЗО-1 формируется постоянно с 3-7 дня. После лечения истощения кальция на 7-й день после посева, полоса ЗО-1 была почти необнаруживаемой, что указывает на то, что ЗО-1 не смог образоваться в отсутствие ионов кальция. Кроме того, пиксельное значение ЗО-1 заметно снизилось в день 10 после посева. Интенсивность сигнала GAPDH с 3-10-го дня появилась сопоставима, за исключением 7-го дня, когда клетки лечились с помощью среды, свободной от кальция. Возможная причина для более низкой экспрессии GAPDH в клетках кальция-обработанных может быть должна к меньшему полному протеину (28.9 мкг всего протеина), снова, вероятно из-за истощения кальция. В целом, анализ денситометрии группы показал постепенное увеличение экспрессии ЗО-1 (по отношению к GAPDH) до 7-го дня и снижение экспрессии на 10-й день, когда клетки культивировались в полной среде роста. Анализ также выявил более низкую экспрессию ЗО-1 (по отношению к GAPDH) на 7-й день в клетках, обработанных средой, свободной от кальция.

В то время как в центре внимания этой работы является представлениеанализа приложения LY P как метода определения кинетики монослойного образования, чтобы продемонстрировать дополнительную полезность разработанного анализа, мы определили, повлияла ли трансфекция ДНК NP на барьер TJ целостность путем измерения LY Pприложение через hCMEC/D3 клетки 4 ч после трансфекции (рисунок5). Наши ДНК-НП, содержащие Poloxamer P84, посредник высокий уровень экспрессии генов в труднотрансфектной линии клеток hCMEC/D3(рисунок 6a). В частности, мы хотели определить, могут ли гидрофобные домены Poloxamer P84 в наших ДНК-НП могут возмущать целостность TJ в транс-инфицированных клетках. %LY восстановлены в каждой группе лечения было около 92%, предполагая, что рассчитанные значенияP приложения являются надежными (рисунок5b). Мы отметили, что процедура трансфекции с использованием различных формулировок не влияет наприложениеLY P, по отношению к нетрансинфекционным клеткам, подвергаемым LY в одиночку. Внеклеточный кальций является важнейшим компонентом для поддержания клеточных соединений в различных типах клеток29,30,31, включая микрососуд эндотелиальных клеток микрососуд. Таким образом, поддержание клеток в среде, свободной от кальция (CFM) приводит к нарушению TJs32,33. Поэтому мы использовали клетки, обработанные CFM в течение 24 ч в качестве положительного контроля.

Наши данные показывают, чтоприложение LY P для клеток, инкубированных CFM, было в 2 раза выше по сравнению с контрольными клетками, инкубированными с помощью обычной среды роста. Это 100% увеличение вP приложение предполагает, что клетки потеряли свои TJs из-за потери ионов кальция, необходимых для его формирования. Примечательно, что фактическое значение (5,14 х 10-4 см/мин) было немного выше, чем среднее значениеприложения P с 1-6-го дня посева (рисунок2), когда TJs еще не были полностью сформированы. Хотя это и не является значительным, клетки, трансфицируемые ДНК NP, содержащей 0,01-0.03% Poloxamer P84 показали небольшое увеличение значенийприложения LY P по сравнению с необработанными клетками, поддерживаемыми в обычной среде культуры. Это наблюдение показало, что трансфекция ДНК NP и P84 не оказала существенного влияния на целостность барьера TJ. В целом, значенияприложения LY P в трансинфицированных клетках примерно в среднем составляли 2,5x10-4 см/мин, и это значение соответствовало среднему значению, отмеченного в течение дня 7-10 после посева (рисунок2), когдаприложение LY P было наименьшим, предлагая наличие функциональных TJs, которые эффективно ограничены LY параклеточного транспорта.

Мы представляем дополнительные данные трансфекции, чтобы показать, что отсутствие изменений в приложении LY P (рисунок5) не является несущественным наблюдением. Несмотря на высокий уровень трансфекции, наблюдаемый в группе ДНК NPs-P84, мы не отметили никаких изменений в приложении LY P, предполагая, что наши формулировки не возмущают барьер TJ. Относительно низкая эффективность трансфекции в обнаженных ДНК-обработанных клетках типична тем, что анионическая природа плазмидной ДНК (из-за фосфатных групп в ее позвоночнике) и ее гидрофильная природа ограничивают клеточное поглощение. ДНК конденсируется в ДНК NP опосредовано 50-кратное увеличение трансфекции по сравнению с голым pDNA (Рисунок 6). Добавление 0,01% P84 к ДНК NP привело к 18-кратное увеличение по сравнению с ДНК NP-в одиночку (P lt; 0.01). Увеличение концентрации P84 до 0,03 wt.% привело к 30-кратному увеличению по сравнению с ДНК NP-alone (P'lt; 0.001). Эти результаты примечательны, учитывая, что эндотелиальные клетки мозга являются труднопередаваемым типом клеток.

Мы измерили жизнеспособность клеток, трансфицируемых в различных условиях, чтобы подтвердить, что процедура трансфекции не вызывает клеточного стресса. Аденозин трифосфат (АТФ) является энергетической валютой жизни и отражает клеточную метаболическую функцию. Мы использовали атс на основе люциферазы, где значения люминесценции прямо пропорциональны уровням АТФ. Possimo et al. сообщили, что люминесценция АТФ-аналитика была надежной мерой жизнеспособности метаболических клеток34. Жизнеспособность клеток hCMEC/D3, трансфицированных различными составами, была сопоставима с необработанными клетками (рисунок 5b),что говорит о том, что уровни АТФ также были похожи. Таким образом, ДНК-НП, содержащие Poloxamer P84 (от 0,01% до 0,03% ву), являются безопасными формулировками доставки генов.

Figure 1
Рисунок 1 . Экспериментальная установка для LY P приложение изучение. 24-хорошая установка пластины, содержащая трансвелл вставки (адаптированы, чтобы показать трансфекцию днк наночастиц в качестве примера, данные нарисунке 5). Каждая колонка была обработана с указанным образцом для 4 h. Контроль показывает hCMEC/D3 клетки обработанные с вполне средой роста пока истощение кальция 24 h показывает что клетки были incubated с циномкой кальция свободной до выдержки LY. Правильный шаблон изображает LY измерения интенсивности флуоресценции в черной пластине 96-наилучшим образом. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 2
Рисунок 2 . Явная кинетика формирования барьеров TJ, определяемых с помощью LY P приложение асссея. (a) LY P приложение через hCMEC/D3 монослой, культивированный на трансвелл вставки были измерены повседневной после посева клеток. (б) %LY выздоровел в каждой группе лечения. Данные представляют собой среднее значение SD двух независимых экспериментов (n'3/experiment). Статистические сравнения проводились с использованием непарного t-теста (Яп Лт; 0,05, N.S. не является значительным). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры. 

Figure 3
Рисунок 3 . Кинетика роста клеток определяется с помощью trypan синий вывод ецнак. клетки hCMEC/D3 были посеяны в 24-хорошей пластине при плотностиклеток 50 000 клеток/см 2. На каждый день эксперимента, клетки были разобщены и смешаны с равным объемом 0,4% Трипан синий до подсчета жизнеспособных клеток на гемаситометр. Данные представляют собой средний sD трех независимых измерений. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 4
Рисунок 4 . Явная кинетика экспрессии ЗО-1, обнаруженная с помощью западного промотирования. ()Клетки hCMEC/D3 были посеяны в 12-колодецной пластине при плотности клеток 50 000 клеток/см2. В каждый день эксперимента (день 3, день 5, день 7 и день 10-пост посева), клетки были лисицированы 400 зл 1x RIPA буфер, содержащий 3 мкг/мл апротинин. Клеточные лизаты, содержащие 40 мкг всего белка, были загружены на 4-7,5% SDS-полиакриламидный гель. (b) Анализ денситометрии пластыря позволил нормализовать выражение белка ЗО-1 ГАПДХ. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры. 

Figure 5
Рисунок 5 . Влияние трансфекции ДНК NP на герметичность барьера TJ, измеренное с помощью LY P приложение асссея. () hCMEC/D3 клетки были культивированы на трансвелл вставки в течение 7 дней, трансинфицированы PEG-DET, содержащие gWI-Luc плазмид ДНК с / без Pluronic P84 для 4 ч, а затем заменить предварительно подогретый транспортный буфер, содержащий 50 мКМ LY для 1 ч. Контроль представляет hCMEC/D3 клетки инкубируются со средой роста для 4 ч следуют LY воздействия (n'4,Pйlt;0.05, N.S. не является значительным). (b) %LY восстановлено в каждой группе обработки, значения представленные средние SD (n no 4). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры. 

Figure 6
Рисунок 6 . ДНК-NPs посредника высокий уровень трансгенной экспрессии в hCMEC/D3 монослой. (a ) hCMEC/D3 клетки были культивированы 7 дней и трансфицированы с PEG-DET, содержащей гВИ-Люк плазмидДНК ДНК с /без Pluronic P84 (N/P 10, доза ДНК на хорошо: 0,5 мкг) для 4 ч, трансфекционная смесь была удалена и клетки были культивированы в течение 24 ч в полном росте среды до измерения экспрессии генов. Уровни экспрессии генов люциферазы были выражены как относительные световые единицы (RLU) норнализированы к общему содержанию клеточного белка. Данные представляют собой среднее значение SD трех независимых экспериментов. Статистические сравнения проводились с использованием непарного t-теста (яп. (b) ДНК-НПы являются безопасными трансфекционными составами в монослойах hCMEC/D3. Влияние трансфекции ДНК ДНК на жизнеспособность клеток оценивалось с помощью люминесцентного анализа АТФ. hCMEC/D3 клетки были трансфицированы с указанными образцами для 4 h следуя за которое асссис был дирижирован после следовать протоколу изготовления. Процент (%) жизнеспособность клеток была рассчитана следующим образом: (люминесценция трансинфицированных клеток/люминесценция контроля, необработанных клеток)x100. Данные представляют собой среднее значение SD двух независимых экспериментов (n'3/experiment). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Экспериментальная установка Название примера Объем плазмидной ДНК 1 мг/мл (КЛ) Объем буфера NaAc 10 мм, рН 5 (КЛ) Объем полимера 5 мг/мл (КЛ) Объем 10% ж/в. P84 (Зл) Объем среды роста (Зл)
Ткань культурывставляет Контроль, необработанные клетки 0 0 0 0 58.3
Голая ДНК 0.157 8.143 50
ДНК NP 7.843 0.3
ДНК NP 0.01%P84 7.6681 0.1749
ДНК NP 0.03%P84 7.26 0.0583
48-хорошая тарелка Контроль, необработанные клетки 0 0 0 0 175
Голая ДНК 0.5 24.5 150
ДНК NP 23.56 0.94
ДНК NP 0.01%P84 23.385 0.175
ДНК NP 0.03%P84 23.035 0.525
96-хорошая тарелка Контроль, необработанные клетки 0 0 0 0 68.1
Голая ДНК 0.195 58.4
ДНК NP 9.35 0.37
ДНК NP 0.01%P84 8.9307 0.0681
ДНК NP 0.03%P84 9.0669 0.2043

Таблица 1. Np формулировки, используемые для получения данных сообщили.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Ключевая роль BBB заключается в предотвращении обмена несущественных ионов и токсичных веществ между системной циркуляции и мозга для поддержания гемостаза нейронной микросреды. Одной из характерных особенностей BBB является способность капиллярных эндотелиальных клеток образовывать плотные соединения (TJs), которые эффективно запечатывают параклеточный маршрут транспорта. Мы продемонстрировали ly Pприложение асссе в качестве количественного метода для определения очевидной кинетики образования барьеров TJ в культурных монослойах hCMEC/D3. Выражение ЗО-1, обнаруженное с помощью западного промотирования ортогонически, подтвердило данные из исследованийприложения LY P, подробно обсуждаемые в следующем абзаце. В качестве дополнительной полезности разработанного анализа, мы также показали, что трансфекция ДНК NP не измеримо изменилаприложение LY P, указывающее на пригодность этого анализа для определения изменений в характеристиках барьера TJ в экспериментальной установке.

Западные данные помотки показали явное увеличение экспрессии ЗО-1 на 3, 5, 7-пост посева и небольшое сокращение на день 10-пост посева (Рисунок 4a). С рисунка 1, можно увидеть, что LY Pприложение уменьшилось с дня 1-7 после посева предлагая формирование TJs. После лечения истощения кальция, LY Pприложение показало заметное увеличение (Рисунок2a) в то время как выражение ЗО-1 показал заметное снижение (Рисунок 4a). Внеклеточный кальций является важнейшим компонентом для поддержания клеточных соединений в различных типах клеток29,30,31, включая микрососуд эндотелиальных клеток микрососуд. Недостаток кальция в среде роста нарушены и разъединенных TJs33. Как и ожидалось, значениеприложения P из обесточенных кальция клеток было значительно выше, чем необработанные клетки и близко к значениюприложения P пустых вставок, не содержащих клеток (Рисунок 2a). LY показал устойчивый плато в Pзначения приложения с 7-10 после посева (Рисунок 2a) предполагая, что барьер был полностью сформирован на 7-й день, что привело к ограниченному транспорту LY на басолатеральной стороне. Западные данные поблучни показали небольшое снижение экспрессии ЗО-1 на 10-й день по сравнению с 7-постовым посевом дня. Эта разница в наблюдении, вероятно, связана с вкладом других внеклеточных белков, помимо ЗО-1, в поддержание герметичности барьера. Таким образом, мы успешно использовали данные из двух ортогональных методов для определения кинетики жесткого образования барьера соединения в модели клеток человека BBB. В то время каканализ приложения LY P измерял функциональность барьера TJ, западные данные поблучники прослеживались по форме TJ, используя зо-1 в качестве маркерного белка.

В качестве дополнительной полезности разработанного анализа, мы подтвердили, что трансфекция ДНК NP в монослойах hCMEC/D3 не влияет на целостность TJs(рисунок 5). Необработанные клетки, инкубированные средой роста, использовались в качестве отрицательного контроля, а клетки, предварительно инкубированные с помощью среды, свободной от кальция в течение 24 ч, использовались в качестве положительного контроля. Клетки, в которых TJs были нарушены в результате истощения кальция показали 210% увеличение в LY Pприложение по сравнению с необработанных клеток. Наши данные свидетельствуют о том, что трансфекция ДНК NP в присутствии или отсутствии P84 не влияет на целостность TJ. Следует отметить, что отсутствие измененийприложения LY P в трансинфицированных клетках не является несущественным наблюдением. В самом деле, наши ДНК NPs посредника значительные уровни экспрессии генов в труднотрансфектных hCMEC/D3 монослой9,35,36,37. ДНК-НП, содержащий 0,01 или 0,03 вт. % P84 увеличилэкспрессию гена люциферазы примерно в 18 и 30 раз, соответственно, по сравнению с ДНК-НП только(рисунок 6a). Мы также продемонстрировали, что наши МЕТОДы лечения не оказывают негативного влияния на уровни клеточного АТС, используемые здесь в качестве индикатора функциональной жизнеспособности клеток(рисунок 6b). Наши результаты подчеркивают расширенную полезность этогоly P-приложения для определения целостности барьера TJ в экспериментальной установке трансфекции.

Одним из важнейших шагов в выполнении LY-ассея является сохранение одинакового количества LY в апической стороне и равного объема транспортного буфера в базолатеральной стороне в различных временных точках всего эксперимента. Если бы в скважинах использовались различные объемы LY или неравные объемы транспортного буфера, расчетприложения P был бы ненадежным, что привело бы к искусственно большим стандартным отклонениям. Другим важным аспектом является ограничение воздействия света, чтобы свести к минимуму распад интенсивности ФЛуоресценции LY. Кроме того, жидкость должна быть полностью удалена, прежде чем добавлять точно такой же объем решения LY и транспортный буфер в апическую сторону и базолатеральную сторону, соответственно. Это гарантирует, что считывание флуоресценции может быть надежно использовано для расчетаприложения P. Другим важным шагом в этом эксперименте является немедленное измерение LY флуоресценции базолатеральных образцов и избежать необходимости замораживания образцов после сбора. Подвергая LY-содержащие образцы циклам замораживания-оттепели, приводит к большей внутригрупповой вариации сигнала флуоресценции. Одно из ограничений использования трансвелл установки является то, что живые клетки трудно быть визуализированы обычной микроскопии или изображения конфокальной микроскопии. Кроме того, это не легко перевести в установку, которая позволяет совместного культивирования различных типов клеток, если смешанные культивирования скажем, глиальных и эндотелиальных клеток является возможность. Тем не менее, LY анализ имеет следующие преимущества: LY является красителем с различными возбуждения / выбросы пиков и относительно большой сдвиг Стокса по сравнению с красителями, как флуоресцеин натрия, что позволяет надежного измерения зонда пересечения BBB и избегает необходимость в дополнительных радиомаркировке, как в случае трассировок, таких как сахароза или маннитол. Высокое восстановление %s LY обеспечивает надежные данные для уверенного расчета значенийP-приложения.

Основываясь на наших выводах, мы пришли к выводу, что методприложения LY P представляет собой простой и надежный анализ для количественной оценки параклеточной проницаемости через монослои hCMEC/D3. Используя методприложения LY P, мы оптимизировали время культуры для формирования нетронутого барьера, и мы продемонстрировали дополнительную полезность разработанного анализа, определив целостность TJ в ДНК NP-транс-инфицированных клеточных монослойных.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторам нечего раскрывать.

Acknowledgments

Авторы благодарны за финансовую поддержку от 2017 Новый следователь премии от Американской ассоциации фармации, Hunkele Dreaded Disease награду от Duquesne университета и школы фармации стартовых средств для лаборатории Manickam. Мы хотели бы поблагодарить лабораторию утечки (Duquesne University) за западную помощь blotting и разрешение на использование их Одиссея 16-битный imager. Мы также хотели бы включить специальную ноту признательность за Kandarp Dave (Manickam лаборатории) за помощь в западной blotting.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
hCMEC/D3 cell line Cedarlane Laboratories 102114.3C-P25 human cerebral microvascular endothelial cell line 
gWizLuc Aldevron  5000-5001 Plasmid DNA encoding luciferase gene
lucifer yellow CH dilithium salt  Invitrogen 155267
Transwell inserts with polyethylene terephthalate (PET) track-etched membranes Falcon 353095
Tissue culture flask  Olympus Plastics 25-207
24-well Flat Bottom  Olympus Plastics 25-107
Black 96-Well Immuno Plates  Thermo Scientific 437111
S-MEM 1X Gibco 1951695 Spinner-minimum essential medium (S-MEM)
EBM-2 Clonetics CC-3156 Endothelial cell basal medium-2(EBM-2) 
phosphate-buffered saline 1X HyClone SH3025601
Collagen Type I  Discovery Labware, Inc. 354236
Pierce BCA Protein Assay Kit  Thermo Scientific 23227
Cell Culture Lysis 5X Reagent  Promega E1531
Beetle Luciferin, Potassium Salt  Promega E1601
SpectraMax i3  Molecular Devices Fluorescence Plate Reader
Trypan Blue Solution, 0.4% Gibco 15250061
ZO-1 Polyclonal Antibody  ThermoFisher 61-7300
anti-GAPDH antibody abcam ab8245
Alexa Fluor680-conjugated AffiniPure Donkey Anti-Mouse LgG(H+L) Jackson ImmunoResearch Inc 128817
12-well, Flat Bottom Olympus Plastics 25-106
RIPA buffer (5X) Alfa Aesar J62524
Aprotinin Fisher BioReagents BP2503-10
Odyssey CLx imager LI-COR Biosciences for scanning western blot membranes

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Abbott, N. J., Patabendige, A. A., Dolman, D. E., Yusof, S. R., Begley, D. J. Structure and function of the blood-brain barrier. Neurobiology Of Disease. 37, (1), 13-25 (2010).
  2. Griep, L. M., et al. BBB on chip: microfluidic platform to mechanically and biochemically modulate blood-brain barrier function. Biomedical Microdevices. 15, (1), 145-150 (2013).
  3. Camos, S., Mallolas, J. Experimental models for assaying microvascular endothelial cell pathophysiology in stroke. Molecules. 15, (12), 9104-9134 (2010).
  4. Cucullo, L., et al. Immortalized human brain endothelial cells and flow-based vascular modeling: a marriage of convenience for rational neurovascular studies. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 28, (2), 312-328 (2008).
  5. Wolff, A., Antfolk, M., Brodin, B., Tenje, M. In vitro Blood-Brain Barrier Models-An Overview of Established Models and New Microfluidic Approaches. Journal of Pharmaceutical Sciences. 104, (9), 2727-2746 (2015).
  6. Weksler, B., Romero, I. A., Couraud, P. O. The hCMEC/D3 cell line as a model of the human blood brain barrier. Fluids and Barriers of the CNS. 10, (1), 16 (2013).
  7. Ohtsuki, S., et al. Quantitative targeted absolute proteomic analysis of transporters, receptors and junction proteins for validation of human cerebral microvascular endothelial cell line hCMEC/D3 as a human blood-brain barrier model. Molecular Pharmaceutics. 10, (1), 289-296 (2013).
  8. Tornabene, E., Brodin, B. Stroke and Drug Delivery--In vitro Models of the Ischemic Blood-Brain Barrier. Journal of Pharmaceutical Sciences. 105, (2), 398-405 (2016).
  9. Weksler, B., Romero, I. A., Couraud, P. O. The hCMEC/D3 cell line as a model of the human blood brain barrier. Fluids and Barriers of the CNS. 10, (1), 16 (2013).
  10. Llombart, V., et al. Characterization of secretomes from a human blood brain barrier endothelial cells in-vitro model after ischemia by stable isotope labeling with aminoacids in cell culture (SILAC). Journal of Proteomics. 133, 100-112 (2016).
  11. Weksler, B. B., et al. Blood-brain barrier-specific properties of a human adult brain endothelial cell line. The FASEB Journal. 19, (13), 1872-1874 (2005).
  12. Avdeef, A. How well can in vitro brain microcapillary endothelial cell models predict rodent in vivo blood-brain barrier permeability? European Journal of Pharmaceutical Sciences. 43, (3), 109-124 (2011).
  13. Rahman, N. A., et al. Immortalized endothelial cell lines for in vitro blood-brain barrier models: A systematic review. Brain Research. 1642, 532-545 (2016).
  14. Cecchelli, R., et al. A stable and reproducible human blood-brain barrier model derived from hematopoietic stem cells. PLoS One. 9, (6), e99733 (2014).
  15. Shao, X., et al. Development of a blood-brain barrier model in a membrane-based microchip for characterization of drug permeability and cytotoxicity for drug screening. Analytica Chimica Acta. 934, 186-193 (2016).
  16. Walter, F. R., et al. A versatile lab-on-a-chip tool for modeling biological barriers. Sensors and Actuators B: Chemical. 222, 1209-1219 (2016).
  17. Cecchelli, R., et al. In vitro model for evaluating drug transport across the blood–brain barrier. Advanced Drug Delivery Reviews. 36, (1999).
  18. Cecchelli, R., et al. Modelling of the blood–brain barrier in drug discovery and development. Nature reviews Drug discovery. 6, (8), 650 (2007).
  19. Reichel, A., Begley, D. J., Abbott, N. J. The Blood-Brain Barrier. Springer. 307-324 (2003).
  20. Deli, M. A., Ábrahám, C. S., Kataoka, Y., Niwa, M. Permeability Studies on In vitro Blood–Brain Barrier Models: Physiology, Pathology, and Pharmacology. Cellular and Molecular Neurobiology. 25, (1), 59-127 (2005).
  21. Ren, T. B., et al. A General Method To Increase Stokes Shift by Introducing Alternating Vibronic Structures. Journal of the American Chemical Society. 140, (24), 7716-7722 (2018).
  22. Pack, D. W., Hoffman, A. S., Pun, S., Stayton, P. S. Design and development of polymers for gene delivery. Nature Reviews Drug Discovery. 4, (7), 581-593 (2005).
  23. Oupický, D., Konák, C., Ulbrich, K., Wolfert, M. A., Seymour, L. W. DNA delivery systems based on complexes of DNA with synthetic polycations and their copolymers. Journal of Controlled Release. 65, (2000).
  24. Couraud, P. O. The hCMEC/D3 CELL LINE: IMMORTALIZED HUMAN CEREBRAL MICROVASCULAR ENDOTHELIAL CELLS As a model of human Blood-Brain Barrier. Institut Cochin, INSERM U1016. France. (2012).
  25. Youdim, K. ureshA., A, A. A. aN. J. In vitro trans-monolayer permeability calculations: often forgotten assumptions. research focus reviews. 8, (2003).
  26. Eigenmann, D. E., Xue, G., Kim, K. S., Moses, A. V., Hamburger, M., Oufir, M. Comparative study of four immortalized human brain capillary endothelial cell lines, hCMEC/D3, hBMEC, TY10, and BB19, and optimization of culture conditions, for an in vitro blood-brain barrier model for drug permeability studies. Fluid and Barriers of the CNS. 10, (33), (2013).
  27. Hubatsch, I., Ragnarsson, E. G. E., Artursson, P. Determination of drug permeability and prediction of drug absorption in Caco-2 monolayers. Nature Protocols. 2, (9), 2111-2119 (2007).
  28. Balda, M. S., Anderson, J. M. Two classes of tight junctions are revealed by ZO-1 isoforms. The American Physiological Society. (1992).
  29. Brown, R. C., Davis, T. P. Calcium Modulation of Adherens and Tight Junction Function: A Potential Mechanism for Blood-Brain Barrier Disruption After Stroke. Stroke. 33, (6), 1706-1711 (2002).
  30. Gorodeski, G., Jin, W., Hopfer, U. Extracellular Ca2+ directly regulates tight junctional permeability in the human cervical cell line CaSki. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 272, (2), C511-C524 (1997).
  31. Stuart, R. O., Sun, A., Panichas, M., Hebert, S. C., Brenner, B. M., Nigam, S. K. Critical Role for lntracellular Calcium in Tight Junction Biogenesis. Journal of Cellular Physiology. 159, (1994).
  32. Tobey, N. A. Calcium-switch technique and junctional permeability in native rabbit esophageal epithelium. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. (2004).
  33. Tobey, N. A., Argote, C. M., Hosseini, S. S., Orlando, R. C. Calcium-switch technique and junctional permeability in native rabbit esophageal epithelium. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 286, (2004).
  34. Posimo, J. M., et al. Viability assays for cells in culture. Journal of visualized experiments : JoVE. (83), e50645 (2014).
  35. Cipolla, M. J., Crete, R., Vitullo, L., Rix, R. D. Transcellular transport as a mechanism of blood-brain barrier disruption during stroke. Frontiers in Bioscience. 9, (3), 777-785 (2004).
  36. Kreuter, J. Influence of the surface properties on nanoparticle-mediated transport of drugs to the brain. Journal of nanoscience and nanotechnology. 4, (5), 484-488 (2004).
  37. Markoutsa, E., et al. Uptake and permeability studies of BBB-targeting immunoliposomes using the hCMEC/D3 cell line. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 77, (2), 265-274 (2011).
Люцифер желтый - Надежный параклеточной проницаемости маркер а в клеточной модели человеческого кровяного мозга барьер
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zhao, W., Han, L., Bae, Y., Manickam, D. S. Lucifer Yellow - A Robust Paracellular Permeability Marker in a Cell Model of the Human Blood-brain Barrier. J. Vis. Exp. (150), e58900, doi:10.3791/58900 (2019).More

Zhao, W., Han, L., Bae, Y., Manickam, D. S. Lucifer Yellow - A Robust Paracellular Permeability Marker in a Cell Model of the Human Blood-brain Barrier. J. Vis. Exp. (150), e58900, doi:10.3791/58900 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter