3D scanning teknologi bridging mikrokredsløb og makro skala hjernen billeder i 3D roman indlejring overlappende protokol
Summary
Denne artikel introducerer en eksperimentel protokol med 3D-scanningsteknologi, som bygger bro mellem to rumlige skalaer: den makroskopiske rumlige skala af helhjernens anatomi, som er afbildet af MRI ved > 100 μm og den mikroskopiske rumlige skala af neuronal distributioner ved immun Histokemisk farvning og et multielektrode array system og andre metoder (~ 10 μm).
Abstract
Den menneskelige hjerne, som er en multi skala system, har både makroskopiske elektriske signaler, globalt flyder langs tykke hvide stof fiber bundter, og mikroskopiske neuronal pigge, formerings langs axoner og dendritter. Begge skalaer supplerer forskellige aspekter af menneskets kognitive og adfærdsmæssige funktioner. På det makroskopiske niveau har MRI været den nuværende standard billedbehandlingsteknologi, hvor den mindste rumlige opløsning, voxel størrelse, er 0,1 – 1 mm3. Også på mikroskopisk niveau, tidligere fysiologiske undersøgelser var klar over ikke-ensartede neuronal arkitekturer inden for sådanne voxels. Denne undersøgelse udvikler en effektiv måde til præcist at integrere mikroskopiske data i et makroskopisk kort ved at grænseflade biologisk videnskabelig forskning med teknologiske fremskridt i 3D-scanningsteknologi. Da 3D scanningsteknologi for det meste er blevet brugt til ingeniørarbejde og industrielt design indtil nu, det er repurposed for første gang at indlejre microconnectomes i hele hjernen samtidig bevare naturlige spiking i levende hjerneceller. For at opnå dette formål, først, vi konstrueret en scanning protokol til at opnå nøjagtige 3D-billeder fra levende bio-organismer i sagens natur udfordrende at billedet på grund af fugtige og reflekterende overflader. For det andet, vi uddannet til at holde fart for at forhindre nedbrydning af levende hjernevæv, som er en nøglefaktor i at bevare bedre betingelser og registrere mere naturlige neuronal pigge fra aktive neuroner i hjernevæv. To kortikale overflade billeder, uafhængigt udvundet fra to forskellige billedbehandlings moduler, nemlig MRI-og 3D-scanner overflade billeder, viser overraskende en afstands fejl på kun 50 μm som tilstandsværdi af histogrammet. Denne nøjagtighed kan sammenlignes med den mikroskopiske opløsning af intercellulære afstande. også, det er stabilt blandt forskellige individuelle mus. Denne nye protokol, 3D romanen Embedding overlappende (3D-NEO) protokol, broer makroskopiske og mikroskopiske niveauer afledt af denne Integrative protokol og accelererer nye videnskabelige resultater for at studere omfattende forbindelses arkitekturer (dvs. microconnectome).
Introduction
Ikke-ensartede multiscale arkitekturer ved forskellige fysiske og biologiske organisationer er almindeligt forekommende1,2. Hjernen er også en meget ikke-ensartet og multi skala netværksorganisation3,4. Forskellige kognitive funktioner er kodet i sådanne netværk organisationer, bedrift tidsmæssige ændringer af elektriske Spike mønstre af neuronal populationer i submillisecond tidsmæssige opløsninger. Historisk set blev de komplekse netværk blandt neuroner strukturelt observeret i detaljer ved hjælp af farvnings teknikkerne af Santiago Ramón y cajal fra over 150 år siden5. For at observere gruppe adfærd af aktive neuroner, forskere har udviklet forskellige optagelses teknologier6,7,8, og den seneste betydelige udvikling af sådanne teknologier har gjort det muligt for os at registrere elektriske aktiviteter fra et stort antal neuroner samtidigt. Ud fra sådanne funktionelle aktiviteter har forskerne desuden formået at genopbygge netværk af kausale interaktioner mellem et stort antal neuroner og har erklæret den topologiske arkitektur af deres komplekse interaktioner ‘ microconnectome ‘9 . Makroskopiske observationer af hjernen giver også mulighed for med hensyn til en hel hjerne som et netværk organisation, fordi mange hjerneregioner er forbundet med flere fiber-bundter. Indlejringen af microconnectomes i det globale hjerne kort har stadig klare begrænsninger inden for de nuværende teknologiske fremskridt, hvilket er grunden til, at denne integrerings protokol er så vigtig. Der er dog mange udfordringer i udviklingen af integrerings protokollen. For eksempel, for at observere aktiviteter af levende lokale neuronal kredsløb i rent isolerede hjerneområder, hjerne skiver skal produceres til in vitro-optagelser. Derudover er optagelser fra hjerne skiver til in vitro-optagelser stadig et vigtigt valg af mindst to grunde. For det første er det stadig ikke let at observere aktiviteter af mange levende individuelle neuroner samtidig fra hjernen regioner dybere end ~ 1,5 mm og i høj tidsmæssig opløsning (< 1 MS). For det andet, når vi håber at kende den interne arkitektur af en lokal neuronal kredsløb, er vi nødt til at stoppe alle indgange, der kommer fra eksterne hjerneregioner for at eliminere forstyrrende faktorer. For at identificere retninger og positioner af producerede hjerne skiver, vil det være yderligere nødvendigt at integrere de rumlige positioner af disse producerede hjerne skiver ved hjælp af koordinater. Der er dog et par systematiske og pålidelige måder at gøre hjernen skiver på en organiseret måde10,11. Her introduceres en ny koregistration protokol, ved hjælp af 3D scanning teknologi til neurovidenskabelig forskning for at give en integrativ protokol. Denne protokol handler om at koordinere mikro-og makro vægte og integrere mikrodata12,13 og farvnings data på et makroskopisk MRI-rum via 3D-scannings flader af ekstraherede hjerner samt af ikke-invasivt optaget hjerne. Overraskende, indeværende viste en afstand fejl i bare ~ 50 μm nemlig den måde værdi i den histogram. Som følge heraf var tilstandsværdierne for minimumsafstande mellem to overflader mellem MRI-overfladen og den scannede 3D-overflade næsten 50 μm for alle seks mus, hvilket er et passende tal, når der søges efter ensartethed blandt individer. Den typiske skive bredde havde en indspillet Spike aktivitet på omkring 300 μm.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vi har udviklet en ny protokol kaldet 3D-NEO-protokollen til at bygge bro mellem makroskopiske og mikroskopiske rumlige skalaer ved at overlappe to hjerne flader mere præcist end før. Oprindeligt var der to udfordringer i at skabe denne protokol, som gjorde det muligt at nøjagtig overlapning af to hjerne overflade billeder og optagelse af sunde neuronal aktiviteter fra levende organismer. For det første var det nødvendigt effektivt at tørre skære opløsningen omkring den ekstraherede hjerne efter ekstraktion fra k…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
M.S. er taknemmelig for støtte fra alle de ansatte i medicinsk information Engineering kursus i Graduate School of Medicine og Faculty of Medicine, og ønsker at takke Prof. Tetsuya Takakuwa, Prof. Nobukatsu Sawamoto, og Doris Zakian for deres hjælpsomme Kommentarer. Denne undersøgelse blev støttet af en støtte til udfordrende sonderende forskning og af det førende initiativ for fremragende unge forskere (LEADER) program til at M.S. fra MEXT (Ministeriet for uddannelse, kultur, sport, videnskab og teknologi). MRI eksperimenter i dette arbejde blev udført i divisionen for små dyr MRI, medicinsk forskning støtte Center, Graduate School of Medicine, Kyoto University, Japan.
Materials
| Air compressor | Kimura Medical | KA-100 | Animal preparation for MRI |
| All-in-one fluorescence microscope | KEYENCE | BZ-X710 | |
| Anesthesia box | Bio Research Center | RIC-01 | Animal preparation for MRI |
| Anesthesia system | ACOMA Medical Industry | NS-5000A | Animal preparation for MRI |
| Anti-GAD67, clone 1G10.2 | Merk Millipore | MAB5406 | For immunostaining |
| Calcium Chrolide | nacalai tesque | 06729-55 | aCSF |
| Choline Chloride | nacalai tesque | 08809-45 | aCSF |
| curved blunt forceps | |||
| Disposal scalpel | Kai | 10 | |
| D-PBS(-) without Ca and Mg, liquid(10x) | nacalai tesque | For immunostaining | |
| D(+)-Glucose | Wako | 049-31165 | aCSF |
| Gelatin | nacalai tesque | 16605-42 | re-secctioning |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 488 | Invitrogen | A32723 | For immunostaining |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 555 | Invitrogen | A32732 | For immunostaining |
| Heater mat | Bio Research Center | HM-10 | Animal preparation for MRI |
| Heater mat controller | Bio Research Center | BWT-100A | Animal preparation for MRI |
| Heater system | SA Instruments | MR-compatible Small Animal Heating System | Animal preparation for MRI |
| Isoflurane | AbbVie | Animal preparation for MRI | |
| Isoflurane vaporizer | ACOMA Medical Industry | MKIIIai | Animal preparation for MRI |
| Linear Slicer | DOSAKA | Neo Linear Slicer MT | |
| L(+)-Ascorbic Acid Sodium Salt | Wako | 196-01252 | aCSF |
| Magnesium Chrolide Hexahydrate | Wako | 135-00165 | aCSF |
| MaxOne Single-Well MEA | MaxWell Biosystems | ||
| Metal Spatula | |||
| Monitoring system | SA Instruments | Model 1025 | Animal preparation for MRI |
| Monitoring software | SA Instruments | PC-SAM V.5.12 | Animal preparation for MRI |
| MRI compatible cradle | Bruker BioSpin | T12812 | Animal preparation for MRI |
| MRI coil | Bruker BioSpin | T9988 | For MRI |
| MRI operation software | Bruker BioSpin | ParaVision 5.1 | For MRI |
| Neo LinearSlicer MT | D.S.K. | NLS-MT | |
| NeuN (D4G40) XP Rabbit mAb | Cell Signaling | 24307 | For immunostaining |
| Normal Goat Serum | Wako | 143-06561 | For immunostaining |
| Potassium Chloride | Wako | 163-03545 | aCSF |
| Polyethylene Glycol Mono-p-isooctylphenyl Ether | nacalai tesque | 12967-45 | For immunostaining |
| Pressure-sensitive respiration sensor | SA Instruments | RS-301 | Animal preparation for MRI |
| Preclinical MRI scanner | Bruker BioSpin | BioSpec 70/20 USR | For MRI |
| Pyruvic Acid Sodium Salt | nacalai tesque | 29806-54 | aCSF |
| SCAN in a BOX | Open Technologies srl | ||
| scissors | |||
| Sieve bottle | TIGERCROWN | 81 | For 3D scan |
| SlowFade Gold Antifade Mountant | Invitrogen | S36937 | For immunostaining |
| Sodium Chloride | Wako | 191-01665 | aCSF |
| Sodium Dihydrogenphosphate | Wako | 197-09705 | aCSF |
| Sodium Hydrogen Carbonate | Wako | 191-01305 | aCSF |
| Sodium Hydrogensulfite | nacalai tesque | 31220-15 | For immunostaining |
| Thermistor temperature probe | SA Instruments | RTP-101-B, PLTPC-300 | Animal preparation for MRI |
| Tooth bar | Bruker BioSpin | T10146 | Animal preparation for MRI |
| Winged intravenous needle | TERUMO | SV-23CLK | For perfusion |
| 1 mol/l-Tris-HCl Buffer Solution | nacalai tesque | 35436-01 | For immunostaining |
| 1 mol/l-Hydrochloric Acid | nacalai tesque | 37314-15 | For pH adjustment of solution |
| 16%-Paraformaldehyde Aqueous Solution | Electron Microscopy Sciences | 15710 | For immunostaining |
References
- Vogelsberger, M., et al. Properties of galaxies reproduced by a hydrodynamic simulation. Nature. 509 (7499), 177-182 (2014).
- Zhang, B., et al. Integrated systems approach identifies genetic nodes and networks in late-onset Alzheimer’s disease. Cell. 153 (3), 707-720 (2013).
- Sporns, O., Chialvo, D. R., Kaiser, M., Hilgetag, C. C. Organization, development and function of complex brain networks. Trends in Cognitive Sciences. 8 (9), 418-425 (2004).
- Shimono, M. Non-uniformity of cell density and networks in the monkey brain. Scientific Reports. 3, 2541 (2013).
- DeFelipe, J., Jones, E. G. . Cajal on the Cerebral Cortex: An Annotated Translation of the Complete Wrings. , (1988).
- Kandel, E. R., Schwartz, J. H., Jessell, T. M. . Principles of Neural Science. , (2013).
- Pine, J., Taketani, M., Baudry, M. A history of MEA development. Advances in Network Electrophysiology. , 3-23 (2006).
- Grienberger, C., Konnerth, A. Imaging calcium in neurons. Neuron. 73 (5), 862-885 (2012).
- Shimono, M., Beggs, J. M. Functional clusters, hubs, and communities in the cortical microconnectome. Cerebral Cortex. 25 (10), 3743-3757 (2014).
- Amunts, K., et al. BigBrain: An Ultrahigh-Resolution 3D Human Brain Model. Science. 340, 1472-1475 (2013).
- Ali, S., et al. Rigid and non-rigid registration of polarized light imaging data for 3D reconstruction of the temporal lobe of the human brain at micrometer resolution. NeuroImage. 181, 235-251 (2018).
- Kozai, T. D. Y., et al. Ultrasmall implantable composite microelectrodes with bioactive surfaces for chronic neural interfaces. Nature Materials. 11, 1065-1073 (2012).
- Kampasi, K., et al. Dual color optogenetic control of neural populations using low-noise, multishank optoelectrodes. Microsystems & Nanoengineering. 4 (1), 10 (2018).
- Hellwig, B. A quantitative analysis of the local connectivity between pyramidal neurons in layers 2/3 of the rat visual cortex. Biological Cybernetics. 82 (2), 111-121 (2000).
- Bezgin, G., Reid, A. T., Schubert, D., Kötter, R. Matching spatial with ontological brain regions using Java tools for visualization, database access, and integrated data analysis. Neuroinformatics. 7 (1), 7-22 (2009).
- Holmgren, C., Harkany, T., Svennenfors, B., Zilberter, Y. Pyramidal cell communication within local networks in layer 2/3 of rat neocortex. The Journal of Physiology. 551 (1), 139-153 (2003).
- Boucsein, C., Nawrot, M., Schnepel, P., Aertsen, A. Beyond the cortical column: abundance and physiology of horizontal connections imply a strong role for inputs from the surround. Frontiers in Neuroscience. 5 (32), 1-13 (2011).
- Edelsbrunner, H., Aronov, J. P. B., Basu, S., Sharir, M. Surface reconstruction by wrapping finite point sets in space. Discrete and Computational Geometry – The Goodman-Pollack Festschrift. , 379-404 (2003).
- Roland, P. E., et al. Human brain atlas: For high‐resolution functional and anatomical mapping. Human Brain Mapping. 1 (3), 173-184 (1994).
- Johnson, G. A., et al. Waxholm space: an image-based reference for coordinating mouse brain research. NeuroImage. 53 (2), 365-372 (2010).
- Evans, A. C., Janke, A. L., Collins, D. L., Baillet, S. Brain templates and atlases. NeuroImage. 62 (2), 911-922 (2012).
- Okabe, S. Brain/MINDS–a new program for comprehensive analyses of the brain. Microscopy. 64 (1), 3-4 (2015).
- Shimono, M., Hatano, N. Efficient communication dynamics on macro-connectome, and the propagation speed. Scientific Reports. 8 (1), 2510 (2018).
