Summary
В этой статье вводится экспериментальный протокол с использованием технологии 3D-сканирования, преодолевая две пространственные шкалы: макроскопическую пространственную шкалу анатомии всего мозга, изображенную МРТ на уровне 100 мкм, и микроскопическую пространственную шкалу нейронных распределений с использованием иммуногистохимии окрашивания и мультиэлектродной системы массива и других методов (10 мкм).
Abstract
Человеческий мозг, будучи многоразмерной системой, имеет как макроскопические электрические сигналы, глобально течет вдоль толстых бело-материволоконных волоконных пучков, так и микроскопические нейронные шипы, распространяющиеся вдоль аксонов и дендритов. Обе шкалы дополняют различные аспекты когнитивных и поведенческих функций человека. На макроскопическом уровне МРТ является современной стандартной технологией визуализации, при которой наименьшее пространственноеразрешение, размер вокселя, составляет 0,1-1 мм 3. Кроме того, на микроскопическом уровне, предыдущие физиологические исследования были осведомлены о неравномерной нейронной архитектуры в таких voxels. Это исследование разрабатывает мощный способ точного встраивания микроскопических данных в макроскопическую карту путем сопутсь биологическим научным исследованиям с технологическими достижениями в технологии 3D-сканирования. Так как технология 3D-сканирования в основном использовалась для проектирования и промышленного дизайна до сих пор, она впервые перепрофилирована для встраивания микроконнектомов во весь мозг, сохраняя при этом естественный пик в живых клетках мозга. Для достижения этой цели, во-первых, мы построили протокол сканирования для получения точных 3D-изображений из живых биоорганизмов, по своей сути сложных для изображения из-за влажных и отражающих поверхностей. Во-вторых, мы обучены держать скорость, чтобы предотвратить деградацию живой ткани мозга, что является ключевым фактором в сохранении лучших условий и записи более естественных нейрональных шипов от активных нейронов в тканях мозга. Два корковых поверхностных изображения, независимо извлеченные из двух различных модулей изображения, а именно МРТ и 3D-изображения поверхности сканера, удивительно показывают ошибку расстояния всего 50 мкм в качестве значения режима гистограммы. Эта точность сопоставима по масштабу с микроскопическим разрешением межклеточных расстояний; кроме того, он стабилен среди различных отдельных мышей. Этот новый протокол, 3D-роман встраивания перекрывающихся (3D-NEO) протокол, мосты макроскопических и микроскопических уровней, полученных в этом интегративном протоколе и ускоряет новые научные выводы для изучения всеобъемлющих архитектур подключения (т.е., микроконнектом).
Introduction
Неоднородные многомасштабные архитектуры в различных физических и биологических организациях обычно встречаются1,2. Мозг также является очень неравномерной и многомасштабной сетевой организации3,4. Различные когнитивные функции закодированы в таких сетевых организациях, удерживая временные изменения электрических шипов моделей нейронных популяций в субмиллисекундных временных разрешениях. Исторически сложилось так, что сложные сети среди нейронов были структурно наблюдались в деталях с использованием методов окрашивания Сантьяго Рамон у Cajal от более чем 150 лет назад5. Для наблюдения за групповым поведением активных нейронов исследователи разработали различные технологии записи6,7,8,и последние значительные разработки таких технологий позволили нам зафиксировать электрической деятельности от огромного количества нейронов одновременно. Кроме того, благодаря такой функциональной деятельности ученым удалось реконструировать сети причинно-следственных связей между огромным числом нейронов и задекларировать топоологическую архитектуру своих сложных взаимодействий «микроконнектом»9 . Макроскопические наблюдения мозга также позволяют в отношении всего мозга, как сетевая организация, потому что многие области мозга связаны несколькими волокнами.ru. Встраивание микроконнектомов в глобальную карту мозга по-прежнему имеет явные ограничения в рамках текущих технологических достижений, поэтому этот протокол встраивания так важен. Однако перед разработкой протокола встраивания существует много проблем. Например, для того, чтобы наблюдать за активностью живых местных нейронных цепей в чисто изолированных областях мозга, мозг ломтики должны быть произведены для записи в пробирке. Кроме того, записи из ломтиков мозга для записи in vitro по-прежнему являются важным выбором по крайней мере по двум причинам. Во-первых, до сих пор нелегко наблюдать за активностью многих живых отдельных нейронов одновременно из областей мозга глубже, чем 1,5 мм, и в высоком височном разрешении (Злт;1 мс). Во-вторых, когда мы надеемся узнать внутреннюю архитектуру локальной нейронной цепи, мы должны остановить все входы, поступающие из внешних областей мозга, чтобы устранить смешанные факторы. Для того, чтобы определить направления и положения произведенных ломтиков мозга, будет дополнительно необходимо интегрировать пространственные позиции этих произведенных ломтиков мозга с помощью координат. Есть, однако, несколько систематических и надежных способов сделать мозг ломтиками в организованном порядке10,11. Здесь вводится новый протокол корегистрации, использующий технологию 3D-сканирования для нейронаучных исследований, чтобы обеспечить интегративный протокол. Этот протокол действует для координации микро- и макромасштабов и встраивания мультиэлектродных массивов (МЭА) микроданных12,13 и окрашивания данных на макроскопическое пространство МРТ через 3D-сканирование поверхностей извлеченных мозгов, а также неинвазивно записанный мозг. Удивительно, но это показало погрешность расстояния всего в 50 мкм в качестве значения режима гистограммы. В результате значения режима минимальных расстояний между двумя поверхностями между поверхностью МРТ и отсканированной 3D-поверхностью составляли почти 50 мкм для всех шести мышей, что является подходящим числом при проверке общности среди людей. Типичная ширина среза имела зарегистрированную активность шипа около 300 мкм.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все экспериментальные процедуры, описанные здесь, были одобрены Комитетом по уходу за животными Киотского университета.
1. Звери (День 1)
- Приготовьте самки c57BL/6J мышей(n No 6, в возрасте от 3 до 5 недель).
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол применим ко всем видам грызунов.
2. Настройки МРТ (День 1)
- Поместите мышь в акриловую коробку анестезии, помещенную на коврик для нагревателя, скорректированную до 37 градусов по Цельсию с помощью контроллера коврика для нагревателя.
- Анестезия мыши с 2% изофлуран в воздухе, протекающей через коробку со скоростью потока 1,4 л/ мин с помощью системы анестезии, которая состоит из изофлуарана испаритель, измеритель воздушного потока, и воздушный компрессор.
- После индукции анестезии поместите мышь в колыбель, совместимую с МРТ, в лежачем положении. Проверьте, достаточно ли анестезии, отсечения ног мыши пинцетом, чтобы увидеть, если он не чувствует боли.
- Закрепите голову мыши зубной прутьем и маской для лица, оснащенной колыбелью. Затем, поддерживать анестезию с 1% -1,5% изофлуран в воздухе на 1,4 л / мин через маску для лица.
- Вставьте зонд температуры термистора в прямую кишку мыши и поместите чувствительный к давлению датчик дыхания на задней части мыши.
- Перенесите колыбель на отверстие магнита МРТ. Отрегулируйте концентрацию изофлюрани примерно до 1%-1,5%, чтобы обеспечить стабильную и воспроизводимую глубину анестезии. Мониторинг, если температура тела контролируется между 33-35 градусов по Цельсию и частота дыхания между 0,5-1,3 Гц в течение всего периода МРТ экспериментов, используя систему мониторинга (Таблица материалов) для физиологических параметров мелких животных с специальное программное обеспечение(Таблица материалов).
- Используя измеренное значение ректальной температуры, регулировать температуру тела, контролируя температуру теплого воздуха, поставляемого в магнитную скважину из системы нагревателя, оборудованной в системе мониторинга.
3. МРТ Приобретения (День 1)
-
Подготовка к 3D-медерное МРТ высокого разрешения
- Приобретите три магнитно-резонансных (МР) изображения в трех ортогональных (осевых, корональных и сагиттальных) плоскостях, чтобы проверить положение мыши.
- Ссылаясь на эти изображения, отрегулируйте положение мыши, перемещая колыбель так, чтобы центр мозга мыши расположился в центре ресонатора, а также в центре градиентных катушек в осевом направлении.
- Отрегулируйте систему МРТ, настраивая резонатор, регулируя однородность статического магнитного поля (шимминг) и основную частоту, и калибруя мощность радиочастот (РЧ).
- Приобретите изображения с низким разрешением 2D-многослойного T2-взвешенного (T2W) с корональной и сагиттальной ориентацией. На основе этих изображений определите поле зрения (FOV) для МРТ высокого разрешения 3D T2W.
- Выполняйте локализованный shimming с помощью алгоритма автоматического ошиного хода FASTMAP. Для протокола FASTMAP выберите прямоугольную область, которая охватывает весь мозг. После завершения локализованного перебора, подтвердите неоднородность поля B0 в области мозга локализованным спектром 1H с помощью точечной спектроскопии (PRESS).
- Приобретите изображения с низким разрешением 3D T2W, чтобы убедиться, что настройки сканирования для 3D T2W МРТ высокого разрешения являются подходящими, проверяя соответствующее положение FOV, отсутствие артефактов обертывания (псевдоним) и эффективное подавление жировых сигналов.
-
Изображение последовательности импульса
- После подготовки, описанной выше, приобрести высокое разрешение 3D T2W изображения всего мозга мыши, используя быстрое приобретение с релаксации повышение (RARE) последовательность.
ПРИМЕЧАНИЕ: В этой статье были проведены МРТ-эксперименты на 7 Т, 210 мм горизонтальной скважине, доклиническом сканере, оснащенном градиентной системой 440 мТ/м в рампе времен100. Для возбуждения ИП ИП и приема сигнала использовался резонатор объема четырехкратной разгрузки с внутренним диаметром 35 мм. Данные МРТ были получены с помощью специального программного обеспечения для работы. Параметры приобретения последовательности импульсов 3D RARE, используемые в данном исследовании, приведены в таблице 1.
- После подготовки, описанной выше, приобрести высокое разрешение 3D T2W изображения всего мозга мыши, используя быстрое приобретение с релаксации повышение (RARE) последовательность.
4. Подготовка экспериментальных решений (День 2)
- Приготовьте 500 мл раствора леденящей голой резки (2,5 мм КЛ, 1,25 мМ2PO4,7 мМ MgCl2,15 мМ глюкозы, 25 мм NAHCO3, 0,5 мм CaCl2, 11,6 мм натрия ascorbate, 3,1 мм натрия пирут, и 100 мм пузырь хлопья, 100 мм пузырь хлопина, 100 мм пузырь хлопина, 11,6 мм натрия ascorbate, 3,1 мм натриевый пирупват, и 100 мм пузырь хлои, 100 м пузырь хлоид, 100 мм пузырь хлои, 100 мм пузырьхого хлоина, 100 мм пузырьхого хлопена, 100 мм пузырьх хлопина, 100 мм пузырь хлоид с 95% O2 и 5% CO2). Отрегулируйте рН до 7,3–7,4.
- Подготовка 1 l искусственной спинномозговой жидкости (ACSF; 127 мм NaCl, 2,5 мМ KCl, 1,25 мМ2PO4, 1 мМ MgCl2, 15 мм глюкозы, 25 мм NaHCO3, и 2 мМ CaCl2, пузырь с 95% O2 и 5% CO2). Отрегулируйте рН до 7,3-7,4.
5. Подготовка оборудования (День 2)
- Приготовьте 6,6 см2 квадрата, 0,5 см магнита "кольцо" и, во-первых, поместите черную ленту и, во-вторых, хирургическую ленту на кольцо (рис.1с-2). Обратите внимание, что этот материал называется мозг блок базы (BBB), и держать его холодным на блоках льда.
ПРИМЕЧАНИЕ: Позже ленты будут прикреплены к нарезной станции с мозговыми блоками для вибратом. Квадратное кольцо используется в качестве нижней базы BBB для удовлетворения двух целей, а именно для плавного переноса блоков мозга с 3D-станции сканирования на вибратом и для точного измерения высоты блоков мозга на этапе сканирования. - Настройка BBB с автоматическим проигрыватель. Включите сканер и поворотный круг. Запустите программное обеспечение для обработки изображений.
-
Предваряя все эксперименты, выполняйте калибровки камер и подключенный поворотный круг структурированной световой проекции и 3D-сканера настольного типа.
- Включите центральный проектор, две камеры и поворотный круг. Затем откройте программное обеспечение. В программном обеспечении нажмите Оптическая настройка и выберите область изображения как 100 x 80, а номера сетки — 100 x 100. Затем калибровка камеры начинается в соответствии со следующими четырьмя шагами.
- Для установки проектора положите калибровочный лист на стол и положите калибровочной доску на калибровочный лист, чтобы отрегулировать точку крепления измерительной зоны до центра листа и ориентацию на переднюю часть. Отрегулируйте расстояние между проектором и доской примерно до 200 мм. Освободьте винты, фиксирующие две ручки, и поверните ручки, чтобы отрегулировать светочувствительность и фокус двух камер. Затем нажмите Стрелка, чтобы перейти к следующему шагу.
- Чтобы сориентировать камеры, ослабить винты фиксации двух камер себя и переместить позиции и вращения перекрываться с центральной линией на калибровочной доске, вертикальная линия, и желтый крест проецируется от проектора. Исправьте камеры и нажмите «Стрелку» снова. Затем экран станет темным.
- Чтобы сфокусировать камеры, после ослабления крепления винтов ручек, увеличьте чувствительность к свету и снова настройте фокус. Затем нажмите Стрелка, чтобы перейти к следующему шагу.
- Для значения F и степени экспозиции (камеры), отрегулируйте чувствительность света снова чуть ниже, где красная область исчезает. Затем, нажмите Стрелка еще раз, и нажмите Калибровка начала, и выбрать Да, если спросил ивы закончить оптическую настройку?
- Нажмите Инициализовать калибровкуи проверьте, нормализуются ли значения пикселя между 0–255. Затем нажмите Продолжить.
- Следуя предложенным позициям, записывайте изображения девяти различных относительных углов сканера и калибровочной доски, и заканчивайте после подтверждения процесса калибровки и, наконец, нажмите «Обновление калибровки».
- Обменять калибровование платы на проигрыватель, и нажмите на калибровку Turntable.
ПРИМЕЧАНИЕ: Теперь все калибровки закончены.
- Включите центральный проектор, две камеры и поворотный круг. Затем откройте программное обеспечение. В программном обеспечении нажмите Оптическая настройка и выберите область изображения как 100 x 80, а номера сетки — 100 x 100. Затем калибровка камеры начинается в соответствии со следующими четырьмя шагами.
6. Сканирование поверхности мозга, нарезка и запись MEA (День 2)
- Анестезируйка мыши с изофлураном 1%-1,5% и обезглавить мышь. Используйте скальпель, чтобы открыть кожу и разоблачить череп.
- Вырезать кожу головы обезболированной мыши вдоль sagittal шов с помощью хирургического ножа, и вырезать череп в диагонали направления от лямбда точки к точке немного перед bregma с помощью хирургических ножниц. Затем аккуратно снимите череп с мозга с помощью изогнутых пинцетов.
- Используйте шпатель, чтобы поднять мозг и перенести его в чашку Петри (100 мм х 20 мм) с раствором ледяной резки (подготовлен в шаге 4.1). Поток воздуха, содержащего 95% O2 и 5% CO2 от внешней газовой бомбы с контролируемой вращающейся скоростью насоса (4,0 об/мин) для генерации небольших пузырьков в ледяном растворе резки (Рисунок 1a).
- После 1-2 мин, положить мозг на ткань микроволокна, поверхность которой слегка покрыта мучной сито, и протрите жидкость с поверхности мозга, осторожно используя ткань микроволокна(рисунок 1b).
- Положите мозг с его оборотным аспектом на примере стенда на BBB, а также положить BBB в центре автоматического проигрыватель.
- Затемняйте помещение во время 3D-сканирования и выполняйте 3D-сканирование на вертушке. Чтобы проверить, работает ли 3D-сканирование хорошо, нажмите 3D-сканирование, выбрав угол между двумя выстрелами как 22,5, стартовый угол как 0, и окончательный угол как 360 (Рисунок 1c-1).
- Переместите мозг в чашку Петри, и пузырь мозга в резки раствор около 10 с.
- Разрежьте мозг на два блока в середине корональной плоскости с помощью хирургического ножа, и переместить два блока мозга мягко на плоскую поверхность с помощью хирургического шпателя.
- Прикрепите блоки мозга BBB с помощью мгновенного клея, и мягко и осторожно протрите жидкость с поверхности мозга в течение 1-2 мин, используя ткань из микроволокна снова. Затем выполните 3D-сканирование снова(рисунок 1c-2).
- Прикрепите черную ленту, закрывающую центр BBB, к центру сцены резки для вибратом(рисунок 1d).
- Налейте резки раствора в резку этапе и установить резки этапе на вибратом. Отрегулируйте скорость резки и амплитуду. Сделать 2-5 корональных ломтиков (300 мкм толщиной) из двух блоков мозга. Держите раствор в стадии резки восходящей, если это возможно(Рисунок 1e).
- Прикрепите лезвие к держателю лезвия вибратомии и оптимизировать скорость резки, частоту и амплитуду системы, установив их как 12,7 мм/мин для скорости, 87-88 Гц для частоты и 0,8-1,0 мм для ширины качели. При тщательной резки необходимо, замедлить скорость до уровня 2-3.
- При резке ломтиков мозга, запись нарезанные координаты в формате, в том числе передней задней координат, полушария и других условий(Рисунок 2c).
- Аккуратно перенесите ломтики мозга в стакан, наполненный предварительно разогретым (34 градусов по Цельсию) ACSF с помощью толстой пластиковой пипетки, и инкубировать их в стакане на 34 градусов по Цельсию для 1 ч. В течение этого времени, выполнить 3D-сканирование оставшихся блоков мозга на этапе резки(Рисунок 1c-2).
- Установите чип MEA на блок записи. Подключите чип к перистальтике насоса с помощью двух труб. Используйте одну трубку, чтобы направлять тот же ACSF в чип MEA, а другую трубку, чтобы направлять ACSF из чипа MEA.
- Прикрепите две иглы (0,60 мм х 19 мм), соединенные на кончиках двух труб, к верхней части стены чипа MEA, и зафиксировать их позиции с их кончиками после внутренней стенки чипа MEA. Установите скорость потока ACSF до 4,1 об/мин.
- После 1 ч прошло, переместить ломтик на чип с помощью толстой пластиковой пипетки, и установить положение с помощью мягкой кисти. Затем начните процесс записи нейронной активности(рисунок 2-d).
7. Иммуногистохимия окрашивание (Дни 3 и 4)
- После завершения записи MEA перенесите ломтики на 1,5 мл труб, наполненных 4% параформальдегидом (PFA) в фосфатно-буферный солен (PBS). Инкубировать их на ночь при 4 градусах Цельсия. Затем удалите 4% PFA раствор, и мыть ломтики 3x с PBS в течение 5 минут в общей сложности.
ПРИМЕЧАНИЕ: При необходимости вставьте ломтики в 20% желатина / PBS и резекции ломтик, чтобы сделать его тоньше, чем 50 мкм, используя вибратом. - Подготовка раствора для извлечения антигена (цитрат натрия 10 мМ, рН 6.0). Удалите PBS из последней стирки и добавьте раствор извлечения антигена.
- Вскипятите воду в электрическом термосе и инкубировать трубки с ломтиками в течение 20 минут при 95-98 градусов по Цельсию в кастрюле, а затем естественное охлаждение.
- Приготовьте 50 мМ трис-буферизированный солен и добавьте 1% Na bisulfite (1% Решение Na bisulfite-Tris). Отрегулируйте рН до 7,5. Затем промойте ломтики раствором Na bisulfite-Tris в течение 5 мин при комнатной температуре (20–25 градусов по Цельсию).
- Приготовьте блокирующее решение, добавив 4% нормальной козьей сыворотки и 0,5% этикилат атэтиксилата октильфенола к 1% раствору Na bisulfite-Tris.
- Удалите 1% Раствор Na bisulfite-Tris из трубок с ломтиками и добавьте блокирующий раствор. Инкубировать 2 ч при комнатной температуре.
- Подготовьте основной антитело, добавив 1% нормальной сыворотки коз и 0,5% Triton X-100 к 1% Na bisulfite-Tris раствор и разбавления первичных антител. Используйте следующие концентрации первичных антител: 1:800 мыши анти-GAD67 и 1:500 кролика анти-NeuN.
- Удалить 1% Na bisulfite-Tris раствор из труб с ломтиками и добавить основной раствор антитела. Инкубировать его на ночь при 4 градусах Цельсия.
- Приготовьте 50 мМ трис-буферизированный солен и добавьте 8,5 г/л NaCl (раствор Tris-NaCl). Титрат рН до 7,5. Затем вымойте ломтики 3x раствором Tris-NaCl (20–25 градусов по Цельсию) в общей сложности на 5 минут.
- Подготовьте второй антитело, добавив 3% нормальной козьей сыворотки и 0,3% Triton X-100 в раствор Tris-NaCl и разбавив вторичные антитела. Используйте следующие концентрации вторичных антител: 1:500 козла анти-мыш и 1:500 козла анти-кролика.
- Удалите раствор Tris-NaCl из трубок с ломтиками и добавьте вторичный раствор антитела. Инкубировать его в течение 2 ч при комнатной температуре. Затем вымойте ломтики 3x раствором Tris-NaCl в общей сложности 5 минут.
- Поместите ломтики на слайд с помощью небольшой кисти и применить монтаж амносов и coverslip. Изучите слайды с помощью конфокального микроскопа. Сфотографировать поверхность ломтика(Рисунок 2e).
8. Обработка данных МРТ для извлечения кортикальных томов
- Установите свободное программноеобеспечение FSL (https://fsl.fmrib.ox.ac.uk/fsl/fslwiki/FslInstallation). Подготовьте МРТ-изображения, полученные в разделе 3.
- Измените формат изображения с помощью команды fslchfiletype NIFTI-PAIR-G. Расширить изображение мозга, чтобы сделать его таким же большим, как человеческий мозг, используя команду fslcreatehd, и, при необходимости, изменить ориентацию с помощью fslorient с опцией -setqformcode 1. После этого восстановите исходный формат файла с помощью fslchfiletype NIFTI-G . Точная команда заключается в следующем.
fslchfiletype NFTI-PAIR (ввхожное изображение).nii.gz
fslcreatehd 144 196 160 1 0,95 0,6 1,15 0 0 0 4 (входное изображение).hdr.gz
fslorient -setqformmcode 1 (ввхожёе изображение).hdr.gz
fslchfiletype НИФТИЗГ (ввхожное изображение) - Введите fsl, чтобы открыть программное обеспечение FSL. Извлекайте мозги, используя команду ставок, из графического пользовательского интерфейса (GUI), но не чистить слишком много. Затем, контролировать фракционные пороги интенсивности, ... Оптимальные значения отличаются для отдельных данных.
- Изобразите изображение мозга до исходного размера мозга мыши, используя ту же процедуру, что и в шаге 8.2. Точная команда, как следовать:
fslchfiletype NFTI-PAIR (ввхожное изображение).nii.gz
fslcreatehd 144 196 180 1 0,1 0,1 0,0 0 0 0 4 «входное изображение».hdr.gz
fslorient -setqformmcode 1 (ввхожёе изображение).hdr.gz
fslchfiletype НИФТИЗГ (ввхожное изображение) - Coregistrate все изображения мозга с помощью команды флирта, и производить усредненный образ мозга, используя -добавить вариант и -div вариант fslmaths команды.
fslmaths «изображение мозга 1» -добавить ... - Сделайте усредненку мозга чище, используя опцию -thr команды fslmaths. Затем выберите оптимальное пороговое значение, адаптивное к отдельным случаям.
fslmaths (среднее имя изображения) - thr (thr значение, например, 5000) «пороговое среднее изображение» - Наконец, изменить усредненство изображение мозга в координаты человека с помощью команды флирта снова. Затем, подготовить довольно чистые извлеченные коры головного мозга(рисунок 2a).
ПРИМЕЧАНИЕ: К сожалению, обонятельная лампа и мозжечок не будет совершенным в реконструированных поверхности мозга от объемов МРТ из-за существенных ограничений FSL программного обеспечения, чтобы покорить все части мозга, включая обонятельную луковицу и мозжечок.
9. Обработка изображений МРТ для полоски кортикальных поверхностей
- Скачать другое бесплатное программное обеспечение, 3D Slicer(https://download.slicer.org/).
- Откройте MR изображения извлеченных мозгов (нажмите файл и выберите Добавить данные),произведенные в соответствии с разделом 8, используя объем Рендеринга и редактора модулей в 3D Slicer.
- Измените режим от редактора к рендерингу томаи нажмите кнопку-мишень, чтобы изображение мозга пришло к центру экрана.
- Выберите режим MR-T2-мозга и настройте порог, переместив панель Shift. Затем отойдите от рендеринга тома к редактору и нажмите кнопку эффекта Порога.
- Примените этикетку 41. Кора головного мозга и сохранить данные поверхности мозга, как .stl файл. Затем измените формат файла с .vtk на .stlи сохраните файл, проверив форму.
10. Предварительная обработка данных 3D-сканирования
-
Выполните автоматическую корегистрацию среди 8 или 16 изображений, сделанных с 8 или 16 различных углов в последовательности сканирования, чтобы исправить небольшие несоответствия между ними, нажав Глобальную регистрацию, включенную в опцию выравнивания, и интегрировать их. Повторите сканирование с разных углов, чтобы получить всю поверхность мозга(рисунок 2b).
- Если интеграция между изображениями, отсканированными под разными углами, не увенчалась успехом, нажмите выравнивание руководства и выберите пару фиксированного изображения и движущегосяизображения.
- Нажмите "Начать", чтобы начать ручное выравнивание изображений, выбрав три или четыре точки общего на разных изображениях. Затем нажмите OK. Алгоритм оптимизации — это итеративный алгоритм ближайшей точки (ICP)10. Он не включает нелинейную деформацию.
- Сделайте сетку всех выровненных изображений (т.е. наборов данных точек), выбрав все изображения и нажав кнопку генерации сетки. Затем выберите вариант Малый художественный объект, чтобы получить сетку в качестве самого высокого разрешения. Затем сохраните изображение как двоичное .stl или в формате ASCII.
11. Корегистрация МРТ поверхности и 3D-сканирования поверхности
-
Откройте поверхность МРТ и сваите ее с 3D-сканированием поверхности с помощью программного обеспечения для обработки поверхности. Затем выполните процесс ручного выравнивания, используя ту же процедуру, что описано в шагах 10.1.1 и 10.1.2. Затем снова сохраните эти скоорвенные изображения поверхности (рисунок 2a,b).
- При необходимости очищайте данные о отдельных поверхностях, например, стирая небольшие шумы, окружающие область мозга, особенно в случае данных МРТ, и заполняя отверстия, если таковые имеются, особенно в случае данных 3D-сканирования.
- Наконец, откройте данные поверхности с помощью программного обеспечения для анализа данных, например, MATLAB, и выполните и оцените гистограммы минимальных расстояний между двумя поверхностями.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Мы оценивали расстояния между корковыми поверхностями, получаемыми путем зачистки объема МРТ, и поверхностями, полученными в виде 3D-сканирования извлеченных мозгов. Значения режима гистограммы расстояний составляют всего 55 мкм(рисунок 3а). Кроме того, при накоплении гистограммы из точки, где расстояние равна нулю, накопленное значение достигает 90% от общего числа выборки на уровне 300 мкм(рисунок 3b). Окончательная гистограмма расстояний между двумя поверхностями показала типичный пик около 50 мкм. Если интерпретировать это значение с макроскопической точки зрения, интересно, точность, значение режима 50 мкм, соответствует геометрическому ограничению, которое ожидалось от размера вокселя МРТ(рисунок 3a),а именно, 100 мкм. Этот пункт косвенно предполагает, что перекрывающийся алгоритм, ICP, между МРТ и 3D-сканированием работал превосходно хорошо, и что уровень шума как МРТ, так и 3D-сканирования были подавлены как низкое значение (Рисунок 2a,b)14.
Рисунок 1: Экспериментальный поток. ()Во-первых, после извлечения мозга из мыши, мозг был сброшен в пузырчатый раствор резки. (б) После вытирания разрезания раствора мягким и очень абсорбирующим полотенцем, (с) мозг был отсканирован на вертушке. (d) При создании ломтиков (шаг 8 процесса), блоки мозга были отсканированы на BBB, потому что легко перемещать блоки мозга к основанию для вибратом (шаги 7 и 8 процесса). (e) После получения достаточного количества ломтиков для записи электрической деятельности или для окрашивания клеток и других методов, остальные блоки мозга были отсканированы снова (шаг 10 процесса). Толщина остальных блоков мозга предоставила дополнительную важную информацию о поддержке того, откуда были взяты ломтики. (f) Наконец, мы записали функциональные действия или структурные архитектуры с использованием MEA или методов окрашивания и других методов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2: Конвейер обработки данных. () Пример корковой поверхности, вырабатываемой путем зачистки корей от объемов МРТ, как это объясняется в разделах 8 и 9 протокола. (b) Пример корковой поверхности, непосредственно сканированной системой 3D сканера. (с) Пример памятки, используемой для обобщения области мозга, откуда были извлечены отдельные ломтики мозга. (d) Пример того, когда корковое ломтик находится на электроде. (e) Пример окрашенных корковых ломтик мозга NeuN (красный) и GAD67 (зеленый). Теперь вся информация будет собрана в единую базу данных. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3: Точность перекрытия между МРТ и 3D-сканированием. () Гистограммы расстояний между поверхностями, извлеченными путем пилинга из объемов МРТ. Поверхности были получены с 3D-записей сканирования. Основной график бар усредненный гистограмма для всех людей, и другие цветные линии являются результатами для отдельных мышей (N No 6, в возрасте 21-40 дней, все были самок мышей). Можно найти общую тенденцию, стабильную для всех людей. (b) Накопленное значение гистограммы отображается в виде барного графика. Накопленный процент достиг 90% на уровне 300 мкм (пунктирные линии). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 4: Концептуальное изображение две шкалы информации, интегрированные в один графический пользовательский интерфейс (GUI). И макроскопическая анатомия мозга, и микроскопическая информация о нейронных схемах были интегрированы в одну систему, представленную сетью. Высокая степень точности, показанная на рисунке 3, позволила нам реалистично интегрировать эти две шкалы. Макроскопическое изображение, представленное здесь, из масштабируемого атласа мозга15. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
| Параметры | Значения |
| Время повторения (TR) | 2000 мс |
| Время эхо (TE) | 9 мс |
| Эффективный TE: | 45 мс |
| РЕДКИЙ ФАКТОР | 16 Год |
| Размер матрицы приобретения | 196 x 144 x 144 |
| Поле зрения (FOV) | 19,6 x 14,4 x 14,4 мм3 |
| Пропускная способность приобретения | 75 кГц |
| Ориентации | Осья (корональная ориентация в настройках сканера) |
| Параметры подавления жира | |
| жира частота | 2.6 мс-гауссианской формы no 2 импульса с пропускной способностью 1051 Гц |
| градиент спойлера | |
| фиктивные скана | 2 раза |
| Количество средних | 3 |
| Время приобретения | 2 ч 42 мин |
Таблица 1: Параметры приобретения последовательности импульсов 3D RARE, используемых в данном исследовании.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Мы разработали новый протокол под названием 3D-NEO протокол для преодоления макроскопических и микроскопических пространственных масштабах путем перекрытия двух поверхностей мозга более точно, чем раньше. Первоначально, было две проблемы в создании этого протокола, который сделал возможным точное перекрытие двух изображений поверхности мозга и записи здоровой нейронной деятельности из живых организмов. Во-первых, необходимо было эффективно протереть резку, окружающую извлеченный мозг, после извлечения его из черепа, не повреждая организм мозга (шаг 6.2 протокола). Во-вторых, поскольку первое и третье условиесухо сухости и задержки времени являются потенциальными негативными факторами для живого организма, завершение всех этапов процесса сканирования от извлечения мозга до срезанных препаратов в течение 10-15 мин также было необходимо для сохранения нейроны активны.
Способность успешно записывать деятельность мозга с помощью этого протокола стала возможной координацией не только структурных организаций, но и функциональной деятельности на карте всего мозга. Другим положительным аспектом этого протокола является то, что с момента подготовки BBB калибровка от сканера до основания вибратом стала гораздо более гладкой.
Как указано в репрезентативном результате, гистограмма расстояний между двумя поверхностями показала пик около 50 мкм. Хотя мы выполнили процесс перекрытия, как бы видя с макроскопической точки зрения. Если мы интерпретируем результат с микроскопической точки зрения, 50 мкм является сопоставимой пространственной шкалы в распределении нейронов, так как вероятность подключения между парами корковых нейронов распадается в пределах 100 мкм16,17, даже в течение нескольких миллиметров18. Практически, MEA или кальция изображений исследования часто используют 300-400 мкм толщиной ломтиками. Таким образом, метод, представленный здесь, обеспечит убедительные объективные доказательства, если ломтики должным образом встроены в оригинальные карты всего мозга. После точного перекрытия дополнительная точность будет получена исключительно из локальной информации, наблюдаемой под микроскопом. Таким образом, выполняя двухэтапный процесс оптимизации, состоящий из глобальных и локальных шагов оптимизации, можно будет достичь пространственного разрешения, приравнивающего полуавтоматический размер нейрона в будущем.
Этот точный протокол интеграции обеспечивает базовую технологию для создания различных атласов мозга18,20,21 и даже для более углубленного МРТ других приматов22,23 и человека посмертный мозг (хотя человеческий мозг имеет sulci, можно получить достаточное количество точек записи от gyri). Сейчас мы также разрабатываем визуальный интерфейс для интеграции многих записанных образцов данных в одну общую пространственную координату. На рисунке 4 показана одна фигура изображения, например, на рисунке 4. В случаях мозга млекопитающих, интеграция между количественно различных масштабах также сделает новые успехи качественно в понимании состояния болезни и в оценке воздействия наркотиков. Как правило, это будет трудно применить к рыбам, рептилий и земноводных, потому что исследователи будут трудно держать форму извлеченных тонкий мозг стабильной его предварительно извлеченной форме, и МРТ изображения их меньше мозга также будет относительно шумнее.
Протокол 3D-NEO был введен этим исследованием в нейронаучной или клеточной биологической области исследований, успешно демонстрируя высокую точность в преодолении между макроскопической анатомии и микроскопических нейронов распределения, в том числе топологические архитектуры макро- и микроконнектомов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
М.С. благодарен за поддержку со стороны всего персонала в медицинской информации инженерного курса в Высшей школе медицины и факультета медицины, и хочет поблагодарить профессора Tetsuya Такакува, профессор Нобукацу Савамото, и Дорис Закян за их полезность Комментарии. Это исследование было поддержано Грант-в-помощь для сложных исследований исследований и ведущей инициативы для превосходных молодых исследователей (LEADER) программы м.с. от MEXT (Министерство образования, культуры, спорта, науки и технологии). Эксперименты МРТ в этой работе были проведены в Отделе МРТ малых животных, Центре медицинской поддержки, Высшей школе медицины, Киотском университете, Япония.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Air compressor | Kimura Medical | KA-100 | Animal preparation for MRI |
| All-in-one fluorescence microscope | KEYENCE | BZ-X710 | |
| Anesthesia box | Bio Research Center | RIC-01 | Animal preparation for MRI |
| Anesthesia system | ACOMA Medical Industry | NS-5000A | Animal preparation for MRI |
| Anti-GAD67, clone 1G10.2 | Merk Millipore | MAB5406 | For immunostaining |
| Calcium Chrolide | nacalai tesque | 06729-55 | aCSF |
| Choline Chloride | nacalai tesque | 08809-45 | aCSF |
| Curved blunt forceps | |||
| Disposal scalpel | Kai | 10 | |
| D-PBS(-) without Ca and Mg, liquid (10x) | nacalai tesque | For immunostaining | |
| D(+)-Glucose | Wako | 049-31165 | aCSF |
| Gelatin | nacalai tesque | 16605-42 | re-secctioning |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 488 | Invitrogen | A32723 | For immunostaining |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 555 | Invitrogen | A32732 | For immunostaining |
| Heater mat | Bio Research Center | HM-10 | Animal preparation for MRI |
| Heater mat controller | Bio Research Center | BWT-100A | Animal preparation for MRI |
| Heater system | SA Instruments | MR-compatible Small Animal Heating System | Animal preparation for MRI |
| Isoflurane | AbbVie | Animal preparation for MRI | |
| Isoflurane vaporizer | ACOMA Medical Industry | MKIIIai | Animal preparation for MRI |
| Linear Slicer | DOSAKA | Neo Linear Slicer MT | |
| L(+)-Ascorbic Acid Sodium Salt | Wako | 196-01252 | aCSF |
| Magnesium Chrolide Hexahydrate | Wako | 135-00165 | aCSF |
| MaxOne Single-Well MEA | MaxWell Biosystems | ||
| Metal Spatula | |||
| Monitoring system | SA Instruments | Model 1025 | Animal preparation for MRI |
| Monitoring software | SA Instruments | PC-SAM V.5.12 | Animal preparation for MRI |
| MRI compatible cradle | Bruker BioSpin | T12812 | Animal preparation for MRI |
| MRI coil | Bruker BioSpin | T9988 | For MRI |
| MRI operation software | Bruker BioSpin | ParaVision 5.1 | For MRI |
| Neo LinearSlicer MT | D.S.K. | NLS-MT | |
| NeuN (D4G40) XP Rabbit mAb | Cell Signaling | 24307 | For immunostaining |
| Normal Goat Serum | Wako | 143-06561 | For immunostaining |
| Potassium Chloride | Wako | 163-03545 | aCSF |
| Polyethylene Glycol Mono-p-isooctylphenyl Ether | nacalai tesque | 12967-45 | For immunostaining |
| Pressure-sensitive respiration sensor | SA Instruments | RS-301 | Animal preparation for MRI |
| Preclinical MRI scanner | Bruker BioSpin | BioSpec 70/20 USR | For MRI |
| Pyruvic Acid Sodium Salt | nacalai tesque | 29806-54 | aCSF |
| SCAN in a BOX | Open Technologies srl | ||
| Scissors | |||
| Sieve bottle | TIGERCROWN | 81 | For 3D scan |
| SlowFade Gold Antifade Mountant | Invitrogen | S36937 | For immunostaining |
| Sodium Chloride | Wako | 191-01665 | aCSF |
| Sodium Dihydrogenphosphate | Wako | 197-09705 | aCSF |
| Sodium Hydrogen Carbonate | Wako | 191-01305 | aCSF |
| Sodium Hydrogensulfite | nacalai tesque | 31220-15 | For immunostaining |
| Thermistor temperature probe | SA Instruments | RTP-101-B, PLTPC-300 | Animal preparation for MRI |
| Tooth bar | Bruker BioSpin | T10146 | Animal preparation for MRI |
| Winged intravenous needle | TERUMO | SV-23CLK | For perfusion |
| 1 mol/l-Tris-HCl Buffer Solution | nacalai tesque | 35436-01 | For immunostaining |
| 1 mol/l-Hydrochloric Acid | nacalai tesque | 37314-15 | For pH adjustment of solution |
| 16%-Paraformaldehyde Aqueous Solution | Electron Microscopy Sciences | 15710 | For immunostaining |
References
- Vogelsberger, M., et al. Properties of galaxies reproduced by a hydrodynamic simulation. Nature. 509 (7499), 177-182 (2014).
- Zhang, B., et al. Integrated systems approach identifies genetic nodes and networks in late-onset Alzheimer’s disease. Cell. 153 (3), 707-720 (2013).
- Sporns, O., Chialvo, D. R., Kaiser, M., Hilgetag, C. C. Organization, development and function of complex brain networks. Trends in Cognitive Sciences. 8 (9), 418-425 (2004).
- Shimono, M. Non-uniformity of cell density and networks in the monkey brain. Scientific Reports. 3, 2541 (2013).
- DeFelipe, J., Jones, E. G. Cajal on the Cerebral Cortex: An Annotated Translation of the Complete Wrings. , Oxford University Press. (1988).
- Kandel, E. R., Schwartz, J. H., Jessell, T. M. Principles of Neural Science. , McGraw-Hill. New York, NY. (2013).
- Pine, J. A history of MEA development. Advances in Network Electrophysiology. Taketani, M., Baudry, M. , Springer. New York, NY. 3-23 (2006).
- Grienberger, C., Konnerth, A. Imaging calcium in neurons. Neuron. 73 (5), 862-885 (2012).
- Shimono, M., Beggs, J. M. Functional clusters, hubs, and communities in the cortical microconnectome. Cerebral Cortex. 25 (10), 3743-3757 (2014).
- Amunts, K., et al. BigBrain: An Ultrahigh-Resolution 3D Human Brain Model. Science. 340, 1472-1475 (2013).
- Ali, S., et al. Rigid and non-rigid registration of polarized light imaging data for 3D reconstruction of the temporal lobe of the human brain at micrometer resolution. NeuroImage. 181, 235-251 (2018).
- Kozai, T. D. Y., et al. Ultrasmall implantable composite microelectrodes with bioactive surfaces for chronic neural interfaces. Nature Materials. 11, 1065-1073 (2012).
- Kampasi, K., et al. Dual color optogenetic control of neural populations using low-noise, multishank optoelectrodes. Microsystems & Nanoengineering. 4 (1), 10 (2018).
- Hellwig, B. A quantitative analysis of the local connectivity between pyramidal neurons in layers 2/3 of the rat visual cortex. Biological Cybernetics. 82 (2), 111-121 (2000).
- Bezgin, G., Reid, A. T., Schubert, D., Kötter, R. Matching spatial with ontological brain regions using Java tools for visualization, database access, and integrated data analysis. Neuroinformatics. 7 (1), 7-22 (2009).
- Holmgren, C., Harkany, T., Svennenfors, B., Zilberter, Y. Pyramidal cell communication within local networks in layer 2/3 of rat neocortex. The Journal of Physiology. 551 (1), 139-153 (2003).
- Boucsein, C., Nawrot, M., Schnepel, P., Aertsen, A. Beyond the cortical column: abundance and physiology of horizontal connections imply a strong role for inputs from the surround. Frontiers in Neuroscience. 5 (32), 1-13 (2011).
- Edelsbrunner, H. Surface reconstruction by wrapping finite point sets in space. Discrete and Computational Geometry - The Goodman-Pollack Festschrift. Aronov, J. P. B., Basu, S., Sharir, M. , Springer-Verlag. 379-404 (2003).
- Roland, P. E., et al. Human brain atlas: For high‐resolution functional and anatomical mapping. Human Brain Mapping. 1 (3), 173-184 (1994).
- Johnson, G. A., et al. Waxholm space: an image-based reference for coordinating mouse brain research. NeuroImage. 53 (2), 365-372 (2010).
- Evans, A. C., Janke, A. L., Collins, D. L., Baillet, S. Brain templates and atlases. NeuroImage. 62 (2), 911-922 (2012).
- Okabe, S. Brain/MINDS–a new program for comprehensive analyses of the brain. Microscopy. 64 (1), 3-4 (2015).
- Shimono, M., Hatano, N. Efficient communication dynamics on macro-connectome, and the propagation speed. Scientific Reports. 8 (1), 2510 (2018).
