Summary
Cet article introduit un protocole expérimental utilisant la technologie de balayage 3D reliant deux échelles spatiales : l'échelle spatiale macroscopique de l'anatomie du cerveau entier image par IRM à 100 m et l'échelle spatiale microscopique des distributions neuronales à l'aide la coloration immunohistochemistry et un système de tableau multiélectrode et d'autres méthodes (10 m).
Abstract
Le cerveau humain, étant un système à plusieurs échelles, a à la fois des signaux électriques macroscopiques, qui circulent globalement le long d'épais faisceaux de fibres de matière blanche, et des pointes neuronales microscopiques, se propageant le long des axones et des dendrites. Les deux échelles complètent différents aspects des fonctions cognitives et comportementales humaines. Au niveau macroscopique, l'IRM a été la technologie d'imagerie standard actuelle, dans laquelle la plus petite résolution spatiale, la taille du voxel, est de 0,1 à 1 mm3. En outre, au niveau microscopique, les études physiologiques précédentes étaient au courant des architectures neuronales non uniformes dans de tels voxels. Cette étude développe un moyen puissant d'intégrer avec précision les données microscopiques dans une carte macroscopique en interfaçant la recherche scientifique biologique avec les progrès technologiques dans la technologie de numérisation 3D. Depuis la technologie de numérisation 3D a été principalement utilisé pour l'ingénierie et la conception industrielle jusqu'à présent, il est réutilisé pour la première fois d'intégrer des microconnectomes dans l'ensemble du cerveau tout en préservant les pieux naturels dans les cellules vivantes du cerveau. Pour atteindre cet objectif, tout d'abord, nous avons construit un protocole de numérisation pour obtenir des images 3D précises à partir de bio-organismes vivants intrinsèquement difficiles à l'image en raison de surfaces humides et réfléchissantes. Deuxièmement, nous nous sommes entraînés à maintenir la vitesse pour empêcher la dégradation du tissu cérébral vivant, qui est un facteur clé dans la rétention de meilleures conditions et l'enregistrement de pointes neuronales plus naturelles à partir de neurones actifs dans le tissu cérébral. Deux images de surface corticales, extraites indépendamment de deux modules d'imagerie différents, à savoir les images de surface de l'IRM et du scanner 3D, montrent étonnamment une erreur de distance de seulement 50 m comme valeur de mode de l'histogramme. Cette précision est comparable à l'échelle de la résolution microscopique des distances intercellulaires; aussi, il est stable parmi différentes souris individuelles. Ce nouveau protocole, le nouveau protocole 3D intégrant le chevauchement (3D-NEO), comble les niveaux macroscopiques et microscopiques dérivés de ce protocole intégratif et accélère de nouvelles découvertes scientifiques pour étudier des architectures de connectivité complètes (c.-à-d., microconnectome).
Introduction
Les architectures multi-échelles non uniformes à diverses organisations physiques et biologiques sont généralement trouvées1,2. Le cerveau est également une organisation de réseau très non uniforme et multi-échelle3,4. Diverses fonctions cognitives sont codées dans de telles organisations de réseau, détenant des changements temporels des modèles électriques de pointe des populations neuronales dans les résolutions temporelles submillisecondes. Historiquement, les réseaux complexes entre les neurones ont été structurellement observés en détail en utilisant les techniques de coloration par Santiago Ramon y Cajal de plus de 150 ans5. Pour observer les comportements de groupe des neurones actifs, les chercheurs ont développé diverses technologies d'enregistrement6,7,8, et les récents développements significatifs de ces technologies nous ont permis d'enregistrer activités électriques d'un grand nombre de neurones simultanément. En outre, à partir de ces activités fonctionnelles, les scientifiques ont réussi à reconstruire des réseaux d'interactions causales entre un grand nombre de neurones et ont déclaré l'architecture topologique de leurs interactions complexes «microconnectome»9 . Les observations macroscopiques du cerveau permettent également de considérer un cerveau entier comme une organisation de réseau parce que beaucoup de régions de cerveau sont reliées par de multiples faisceaux de fibres. L'intégration des microconnectomes dans la carte globale du cerveau a encore des limites claires dans les progrès technologiques actuels, c'est pourquoi ce protocole d'intégration est si important. Cependant, l'élaboration du protocole d'intégration pose de nombreux défis. Par exemple, afin d'observer les activités des circuits neuronaux locaux vivants dans des régions cérébrales purement isolées, des tranches de cerveau doivent être produites pour les enregistrements in vitro. En outre, les enregistrements de tranches de cerveau pour les enregistrements in vitro sont encore un choix important pour au moins deux raisons. Tout d'abord, il n'est toujours pas facile d'observer les activités de nombreux neurones individuels vivants simultanément à partir de régions du cerveau plus profondes que 1,5 mm et en haute résolution temporelle (lt;1 ms). Deuxièmement, lorsque nous espérons connaître l'architecture interne d'un circuit neuronal local, nous devons arrêter toutes les entrées provenant de régions externes du cerveau pour éliminer les facteurs de confusion. Afin d'identifier les directions et les positions des tranches de cerveau produites, il sera encore nécessaire d'intégrer les positions spatiales de ces tranches de cerveau produites à l'aide de coordonnées. Il existe, cependant, quelques façons systématiques et fiables de faire des tranches de cerveau d'une manière organisée10,11. Ici, un nouveau protocole de coenregistrement est introduit, utilisant la technologie de balayage 3D pour la recherche neuroscientifique afin de fournir un protocole intégratif. Ce protocole agit pour coordonner les micro- et macro-échelles et intégrer les microdonnées du réseau multiélectrode (MEA)12,13 et les données de coloration sur un espace d'IRM macroscopique à travers des surfaces de balayage 3D des cerveaux extraits, ainsi que de cerveaux non invasifs enregistrés. Étonnamment, cela a montré une erreur de distance de seulement 50 m comme valeur de mode de l'histogramme. En conséquence, les valeurs de mode des distances minimales entre deux surfaces entre la surface d'IRM et la surface 3D numérisée étaient près de 50 m pour chacun des six souris, qui est un nombre approprié lors de la vérification de la communité entre les individus. La largeur typique de la tranche avait une activité de pointe enregistrée d'environ 300 m.
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Protocol
Toutes les procédures expérimentales décrites ici ont été approuvées par le Comité des soins aux animaux de l'Université de Kyoto.
1. Animaux (Jour 1)
- Préparer les souris femelles C57BL/6J(n - 6, âgées de 3 à 5 semaines).
REMARQUE: Ce protocole s'applique à toutes les espèces de rongeurs.
2. Paramètres IRM (Jour 1)
- Placez la souris dans une boîte d'anesthésie acrylique placée sur un tapis chauffant ajusté à 37 oC à l'aide d'un contrôleur de tapis chauffant.
- Anesthésiez la souris avec 2% d'isoflurane dans l'air qui circule dans la boîte à un débit de 1,4 L/min à l'aide d'un système d'anesthésie, qui est composé d'un vaporisateur d'isoflurane, d'un débit d'air et d'un compresseur d'air.
- Après l'induction de l'anesthésie, placez la souris dans un berceau compatible avec l'IRM dans la position encline. Vérifiez si l'anesthésie est suffisante en coupant un orteil de la souris avec une pince à épiler pour voir si elle ne ressent pas de douleur.
- Fixez la tête de la souris avec la barre de dent et le masque équipé du berceau. Ensuite, maintenir l'anesthésie avec 1% - 1,5% isoflurane dans l'air à 1,4 L/min via le masque facial.
- Insérez une sonde de température thermistor dans le rectum de la souris et placez un capteur de respiration sensible à la pression sur le dos de la souris.
- Transférer le berceau à l'alésage d'un aimant IRM. Ajuster la concentration d'isoflurane à environ 1% à 1,5% pour assurer une profondeur stable et reproductible de l'anesthésie. Surveiller si la température corporelle est contrôlée entre 33 et 35 oC et le taux de respiration entre 0,5 et 1,3 Hz pendant toute la période des expériences d'IRM, à l'aide d'un système de surveillance (Tableau des matériaux) pour les paramètres physiologiques des petits animaux logiciel dédié (Tableau des Matériaux).
- En utilisant la valeur mesurée de la température rectale, réguler la température du corps en contrôlant la température de l'air chaud fourni dans l'aimant alésage à partir d'un système de chauffage équipé dans le système de surveillance.
3. Acquisitions d'IRM (Jour 1)
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Préparation de l'IRM 3D T2 à haute résolution
- Acquérir trois images de résonance magnétique (MR) dans trois plans orthogonaux (axiaux, coronals et sagittal) afin de vérifier la position de la souris.
- En se référant à ces images, ajustez la position de la souris en déplaçant le berceau de sorte que le centre du cerveau de la souris soit placé au centre du résonateur ainsi qu'au centre des bobines de gradient dans la direction axiale.
- Ajustez le système d'IRM en réglant le résonateur, en ajustant l'homogénéité statique du champ magnétique (calage) et la fréquence de base, et en étalonnant la puissance de la radiofréquence (RF).
- Acquérir des images 2D multitranches T2(T2) à faible résolution avec des orientations coronales et sagittales. Sur la base de ces images, déterminez le champ de vision (FOV) pour une IRM 3D T2W haute résolution.
- Effectuez des shimminglocalisés à l'aide d'un algorithme de shim automatique FASTMAP. Pour le protocole FASTMAP, sélectionnez une région rectangulaire qui couvre l'ensemble du cerveau. Après l'achèvement du calage localisé, confirmer l'inhomogénéité du champ B0 dans la région du cerveau par un spectre localisé de 1H en utilisant la spectroscopie point-résolue (PRESS).
- Acquérir des images 3D T2W à basse résolution pour vous assurer que les paramètres d'analyse de l'IRM 3D T2W haute résolution sont appropriés en vérifiant la position appropriée du FOV, l'absence d'artefacts enveloppants (aliasing) et la suppression efficace des signaux adipeux.
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Séquence d'impulsion d'imagerie
- Après les préparations décrites ci-dessus, acquérir des images 3D T2W haute résolution de l'ensemble du cerveau de la souris, en utilisant une acquisition rapide avec amélioration de la relaxation (RARE) séquence.
REMARQUE: Dans cet article, des expériences d'IRM ont été menées sur un forage horizontal de 7 T, 210 mm, scanner préclinique, équipé d'un système de gradient de 440 mT/m à l'heure de rampe 100 . Un résonateur de volume de quadrature d'un diamètre intérieur de 35 mm a été utilisé pour l'excitation rf et la réception du signal. Les données d'IRM ont été acquises avec un logiciel d'exploitation dédié. Les paramètres d'acquisition de la séquence d'impulsion 3D RARE utilisée dans cette étude sont résumés dans le tableau 1.
- Après les préparations décrites ci-dessus, acquérir des images 3D T2W haute résolution de l'ensemble du cerveau de la souris, en utilisant une acquisition rapide avec amélioration de la relaxation (RARE) séquence.
4. Préparation de solutions expérimentales (Jour 2)
- Préparer 500 ml d'une solution de coupe glacée (2,5 mM KCl, 1,25 mM NaH2PO4, 7 mM MgCl2, 15 mM glucose, 25 mM NaHCO3, 0,5 mM CaCl2, 11,6 mM d'ascorbate de sodium, 3,1 m de pyruvate de sodium, et 100 mm de chlorure de choline, de chlorure de choline, de chlorure de fluide, de 11,6 mM de chlorure de choline, de chlorure de choline, de 11,6 mM avec 95% O2 et 5% CO2). Ajustez le pH à 7,3 à 7,4.
- Préparer 1 L du liquide céphalo-rachidien artificiel (ACSF; 127 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM NaH2PO4, 1 mM MgCl2, 15 mM glucose, 25 mM NaHCO3, et 2 mM CaCl2, bulles avec 95% O2 et 5% CO2). Ajustez le pH à 7,3 à 7,4.
5. Préparation de l'équipement (Jour 2)
- Préparer un « anneau » d'aimant de 6,6 cm2 carrés et 0,5 cm d'épaisseur et, d'autre part, placer du ruban noir et, deuxièmement, du ruban chirurgical sur l'anneau (figure1c-2). Notez que ce matériau est appelé une base de bloc de cerveau (BBB), et le garder froid sur des blocs de glace.
REMARQUE: Plus tard, les bandes seront fixées à la station de tranchage avec des blocs de cerveau pour le vibratome. L'anneau carré est utilisé comme base inférieure de la BBB pour satisfaire deux objectifs, à savoir de migrer les blocs cérébraux en douceur de la station de balayage 3D à un vibratome et de mesurer avec précision les hauteurs des blocs du cerveau dans l'étape de numérisation. - Configurez le BBB avec une plaque tournante automatique. Allumez le scanner et la plaque tournante. Démarrez le logiciel de traitement d'image.
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Avant toutes les expériences, effectuer des étalonnages des caméras et de la platine connectée d'une projection de lumière structurée et d'un scanner 3D de type bureau.
- Allumez le projecteur central, les deux caméras et la platine. Ensuite, ouvrez le logiciel. Dans le logiciel, cliquez sur Configuration optique et sélectionnez la zone d'image comme 100 x 80 et les numéros de grille comme 100 x 100. Ensuite, l'étalonnage de la caméra commence selon les quatre étapes suivantes.
- Pour l'configuration du projecteur, posez la feuille d'étalonnage sur le bureau et placez la planche d'étalonnage sur la feuille d'étalonnage pour ajuster le point de fixation de la zone de mesure au centre de la feuille et l'orientation vers l'avant. Ajuster la distance entre le projecteur et la planche à environ 200 mm. Loosen les vis fixant les deux boutons, et faire pivoter les boutons pour ajuster la sensibilité de la lumière et la mise au point des deux caméras. Ensuite, cliquez sur Flèche pour passer à l'étape suivante.
- Pour orienter les caméras, desserrer les vis fixant les deux caméras elles-mêmes et déplacer les positions et les rotations pour se chevaucher avec la ligne centrale sur la planche d'étalonnage, la ligne verticale, et la croix jaune projetée du projecteur. Réparez les caméras et cliquez à nouveau sur Arrow. Ensuite, l'écran deviendra sombre.
- Pour concentrer les caméras, après avoir desserré les vis de fixation des boutons, augmenter la sensibilité de la lumière et régler la mise au point à nouveau. Ensuite, cliquez sur Flèche pour passer à l'étape suivante.
- Pour la valeur F et le degré d'exposition (de la caméra), ajustez à nouveau la sensibilité de la lumière à juste en dessous de l'endroit où la région rouge disparaît. Puis, cliquez sur Flèche à nouveau, et cliquez sur Calibration démarrer, et choisir Oui si demandé Avez-vous terminé le paramètre optique?
- Cliquez sur Initialize l'étalonnageet vérifiez si les valeurs pixel sont normalisées entre 0 et 255. Ensuite, cliquez sur Continuer.
- En suivant les positions suggérées, enregistrez des images de neuf angles relatifs différents du scanner et de la planche d'étalonnage, et terminez après avoir confirmé le processus d'étalonnage, et, enfin, cliquez sur Mise à jour de l'étalonnage.
- Échangez le tableau d'étalonnage contre la platine, et cliquez sur l'étalonnage dela table tournante.
REMARQUE: Maintenant, tous les étalonnages sont terminés.
- Allumez le projecteur central, les deux caméras et la platine. Ensuite, ouvrez le logiciel. Dans le logiciel, cliquez sur Configuration optique et sélectionnez la zone d'image comme 100 x 80 et les numéros de grille comme 100 x 100. Ensuite, l'étalonnage de la caméra commence selon les quatre étapes suivantes.
6. Brain Surface Scan, Slicing, and MEA Recording (Jour 2)
- Anesthésiez une souris avec 1% à 1,5% d'isoflurane et décapitez la souris. Utilisez un scalpel pour ouvrir la peau et exposer le crâne.
- Couper le cuir chevelu de la souris anesthésié le long de la suture sagittale à l'aide d'un couteau chirurgical, et couper le crâne dans les directions diagonales du point lambda à un point un peu en face de la bregma en utilisant des ciseaux chirurgicaux. Ensuite, décoller doucement le crâne du cerveau à l'aide d'une pince à épiler incurvée.
- Utilisez une spatule pour soulever le cerveau et le transférer dans un plat Petri (100 mm x 20 mm) avec une solution de coupe glacée (préparée à l'étape 4.1). Air de flux contenant 95 % D'O2 et 5 % de CO2 provenant d'une bombe à gaz externe à vitesse de rotation contrôlée de la pompe (4,0 tr/min) pour générer de petites bulles dans la solution de coupe à froid (figure 1a).
- Après 1 h 2, mettre le cerveau sur un tissu en microfibre dont la surface est légèrement recouverte d'un tamis de farine, et essuyer le liquide de la surface du cerveau, en utilisant doucement le tissu en microfibre (Figure 1b).
- Mettez le cerveau avec son aspect dorsal sur le support d'échantillon sur le BBB, et mettez également le BBB au centre de la platine automatique.
- Assombrir la pièce pendant l'analyse 3D et effectuer un scan 3D sur la plaque tournante. Pour vérifier si l'analyse 3D fonctionne bien, cliquez sur l'analyse 3D en sélectionnant l'angle entre deux plans comme 22,5, l'angle de départ comme 0, et l'angle final comme 360 (Figure 1c-1).
- Déplacez le cerveau vers un plat Petri, et bulle le cerveau dans la solution de coupe pour environ 10 s.
- Couper le cerveau en deux blocs au milieu de l'avion coronal à l'aide d'un couteau chirurgical, et déplacer les deux blocs de cerveau doucement à la surface plane à l'aide d'une spatule chirurgicale.
- Attachez les blocs cérébraux du BBB à l'aide de colle instantanée et essuyez doucement et soigneusement le liquide de la surface du cerveau dans un délai de 1 à 2 minutes, à l'aide d'un chiffon en microfibre à nouveau. Ensuite, effectuez à nouveau un scan 3D (figure1c-2).
- Fixez le ruban noir couvrant le centre du BBB au centre de la scène de coupe pour un vibratome (Figure 1d).
- Verser la solution de coupe dans la scène de coupe et mettre la scène de coupe sur le vibratome. Ajuster la vitesse de coupe et l'amplitude. Faire 2 à 5 tranches coronales (300 m d'épaisseur) à partir des deux blocs cérébraux. Maintenir la solution dans l'étape de coupe bouillonnant si possible (Figure 1e).
- Fixez une lame au porte-lame du vibratome et optimisez la vitesse de coupe, la fréquence et l'amplitude des vibrations du système en les fixant à 12,7 mm/min pour la vitesse, 87 à 88 Hz pour la fréquence et 0,8 à 1,0 mm pour la largeur des balançoires. Lorsque la coupe soigneuse est nécessaire, ralentissez la vitesse jusqu'au niveau 2-3.
- Tout en coupant les tranches de cerveau, enregistrez la coordonnées tranchées dans le format, y compris la coordonnées antérieure-postérieure, l'hémisphère, et d'autres conditions (figure 2c).
- Transférer délicatement les tranches de cerveau dans un bécher rempli d'ACSF préchauffé (34 oC) à l'aide d'une pipette en plastique épaisse, et les incuber dans le bécher à 34 oC pour 1 h. Pendant ce temps, effectuez un balayage 3D des blocs de cerveau restants sur la phase de coupe (figure 1c-2).
- Définir une puce MEA sur une unité d'enregistrement. Connectez la puce à une pompe péristétique à l'aide de deux tubes. Utilisez un tube pour guider le même ACSF dans la puce MEA et l'autre tube pour guider ACSF hors de la puce MEA.
- Attachez deux aiguilles (0,60 mm x 19 mm), reliées à l'extrémité des deux tubes, au sommet de la paroi de la puce MEA, et fixez leurs positions avec leurs pointes suivant la paroi intérieure de la puce MEA. Définir le débit de l'ACSF à 4,1 tr/min.
- Après 1 h est passé, déplacer une tranche sur la puce à l'aide d'une pipette en plastique épais, et définir la position à l'aide d'une brosse douce. Ensuite, commencez le processus d'enregistrement des activités neuronales (figure2-d).
7. Staining immunohistochemistry (Jours 3 et 4)
- Une fois l'enregistrement MEA terminé, transférer les tranches dans des tubes de 1,5 ml remplis de paraformaldéhyde (PFA) à 4 % en salin tamponné par phosphate (PBS). Incuber pendant la nuit à 4 oC. Ensuite, retirez la solution PFA de 4% et lavez les tranches 3x avec du PBS pendant 5 min au total.
REMARQUE: Si nécessaire, incorporer les tranches dans 20% de gélatine/PBS et résectionr la tranche pour la rendre plus mince que 50 'm, en utilisant le vibratome. - Préparer une solution de récupération d'antigène (10 mM de citrate de sodium, pH 6,0). Retirez le PBS du dernier lavage et ajoutez la solution de récupération d'antigène.
- Faire bouillir l'eau dans une casserole thermos électrique et couver les tubes avec les tranches pendant 20 min à 95 à 98 oC dans le pot, suivi d'un refroidissement naturel.
- Préparer 50 mM De saline tamponnée Tris et ajouter 1% Na bisulfite (1% Na bisulfite-Tris solution). Ajuster le pH à 7,5. Ensuite, lavez les tranches avec une solution Na bisulfite-Tris de 1 % pendant 5 min à température ambiante (20 à 25 oC).
- Préparer la solution de blocage en ajoutant 4% de sérum de chèvre normal et 0,5% d'octylphénol ethoxylate à la solution 1% Na bisulfite-Tris.
- Retirez la solution Na bisulfite-Tris de 1 % des tubes avec les tranches et ajoutez la solution de blocage. Incuber pendant 2 h à température ambiante.
- Préparez la solution d'anticorps primaire en ajoutant 1 % de sérum de chèvre normal et 0,5 % de Triton X-100 à la solution Na bisulfite-Tris de 1 % et en diluant les anticorps primaires. Utilisez les concentrations suivantes d'anticorps primaires : 1:800 de souris anti-GAD67 et 1:500 de lapin anti-NeuN.
- Retirez la solution Na bisulfite-Tris de 1 % des tubes avec les tranches et ajoutez la solution d'anticorps primaire. Incuber la nuit à 4 oC.
- Préparer 50 mM Tris tamponné saline et ajouter 8,5 g/L NaCl (solution Tris-NaCl). Titrate le pH à 7,5. Ensuite, lavez les tranches 3x avec la solution Tris-NaCl (20 à 25 oC) pendant 5 min au total.
- Préparez la deuxième solution d'anticorps en ajoutant 3 % de sérum de chèvre normal et 0,3 % de Triton X-100 à la solution Tris-NaCl et en diluant les anticorps secondaires. Utilisez les concentrations suivantes d'anticorps secondaires : 1:500 d'anti-souris de chèvre et 1:500 d'anti-lapin de chèvre.
- Retirez la solution Tris-NaCl des tubes avec les tranches et ajoutez la solution d'anticorps secondaire. Incuber pendant 2 h à température ambiante. Ensuite, lavez les tranches 3x avec la solution Tris-NaCl pendant 5 min au total.
- Placer les tranches sur la lame à l'aide d'une petite brosse et appliquer le support de montage et un bordereau. Examinez les diapositives à l'aucuner au microscope confocal. Prenez des images de la surface d'une tranche (Figure 2e).
8. Traitement de données IRM pour extraire les volumes cortical
- Installer le logiciel libre FSL (https://fsl.fmrib.ox.ac.uk/fsl/fslwiki/FslInstallation). Préparer les images IRM acquises dans la section 3.
- Modifiez le format d'image à l'aide de la commande nIFTI-PAIR-GZ de fslchfiletype. Élargir l'image du cerveau pour la rendre aussi grande qu'un cerveau humain en utilisant la commande fslcreatehd, et, si nécessaire, changer l'orientation en utilisant fslorient avec l'option -setqformcode 1. Après cela, récupérer le format de fichier d'origine en utilisant fslchfiletype NIFTI-GZ. La commande exacte est la suivante.
fslchfiletype NFTI-PAIR [image d'entrée].nii.gz
fslcreatehd 144 196 160 1 0,95 0,6 1,15 0 0 0 0 4 [image d'entrée].hdr.gz
fslorient -setqformmcode 1 [image d'entrée].hdr.gz
fslchfiletype NIFTI-GZ [image d'entrée] - Tapez fsl pour ouvrir le logiciel FSL. Extraire les cerveaux en utilisant la commande de pari de l'interface utilisateur graphique (GUI), mais ne pas peler trop. Ensuite, contrôlez soigneusement les seuils d'intensité fractionnel, ... et les coordonnées du centre de la sphère initiale de la surface du cerveau. Les valeurs optimales sont différentes pour les données individuelles.
- Redimensionnez l'image du cerveau à la taille originale du cerveau de la souris, en utilisant la même procédure que dans l'étape 8.2. La commande exacte est la suivante :
fslchfiletype NFTI-PAIR [image d'entrée].nii.gz
fslcreatehd 144 196 180 1 0.1 0.1 0.08 0 0 0 0 4 [image d'entrée].hdr.gz
fslorient -setqformmcode 1 [image d'entrée].hdr.gz
fslchfiletype NIFTI-GZ [image d'entrée] - Coregistrate toutes les images du cerveau en utilisant la commande flirt, et de produire une image moyenne du cerveau en utilisant l'option -ajouter et l'option -div de la commande fslmaths.
fslmaths [image du cerveau 1] - ajouter ... ajouter [image du cerveau N] -div N [nom de l'image moyenne] - flotteur odt - Rendre le nettoyant moyen du cerveau en utilisant l'option -thr de la commande fslmaths. Ensuite, sélectionnez une valeur de seuil optimale adaptative aux cas individuels.
fslmaths [nom d'image moyenne] 'thr [valeur de la foule, par exemple, 5000] [image moyenne seuil] - Enfin, remodeler l'image moyenne du cerveau dans la coordonnées d'un individu en utilisant la commande flirt à nouveau. Ensuite, préparez des cortex extraits assez propres (Figure 2a).
REMARQUE : Malheureusement, l'ampoule olfactive et le cervelet ne seront pas parfaits dans la surface reconstruite de cerveau des volumes de MRI en raison des limitations essentielles du logiciel de FSL aux morceaux de peal toutes les parties de cerveau comprenant l'ampoule olfactive et le cervelet.
9. Traitement d'image IRM pour rayé surfaces corticales
- Télécharger un autre logiciel libre, 3D Slicer (https://download.slicer.org/).
- Ouvrez les images MR des cerveaux extraits (cliquez sur Fichier et sélectionnez DonnéesAdd) produites selon la section 8, à l'aide des modules Volume Rendering et Editor en 3D Slicer.
- Changez le mode de l'éditeur au rendu de volume,et cliquez sur un bouton cible pour faire l'image du cerveau venir au centre de l'écran.
- Sélectionnez le mode MR-T2-cerveau et accordez le seuil en déplaçant la barre Shift. Ensuite, revenez du rendu volume à l'éditeur et cliquez sur le bouton d'effet Seuil.
- Appliquer l'étiquette 41. cortex cérébral et enregistrer les données de surface du cerveau comme un fichier .stl. Ensuite, changer le format de fichier de .vtk à .stl, et enregistrer le fichier en vérifiant le formulaire.
10. Prétraitement pour données d'analyse 3D
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Effectuez une coenregistrement automatique parmi 8 ou 16 images prises sous 8 ou 16 angles différents dans une séquence d'un scan pour corriger les petits décalages entre eux en cliquant sur l'enregistrement global inclus dans l'option alignement, et de les intégrer. Répéter les balayages sous différents angles pour obtenir la surface du cerveau entier (Figure 2b).
- Si l'intégration entre les images numérisées sous différents angles n'a pas été couronnée de succès, cliquez sur alignement manuel et sélectionnez une paire d'une image fixe et une image en mouvement.
- Cliquez Sur Commencer pour commencer l'alignement manuel des images en sélectionnant trois ou quatre points communs dans des images différentes. Ensuite, cliquez sur OK. L'algorithme d'optimisation est l'algorithme de point itératif le plus proche (ICP)10. Il n'inclut pas une déformation non linéaire.
- Faites un maillage de toutes les images alignées (c.-à-d., des jeux de données de points) en sélectionnant toutes les images et en cliquant sur le bouton de génération Mesh. Ensuite, sélectionnez l'option Petit objet artistique pour obtenir le maillage comme la plus haute résolution. Ensuite, enregistrez l'image comme binaire .stl, ou dans le format ASCII.
11. Coenregistrement de la surface D'IRM et de la surface d'analyse 3D
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Ouvrez la surface irm et fusionnez-la avec la surface d'analyse 3D à l'aide du logiciel de traitement de surface. Ensuite, effectuez un processus d'alignement manuel en utilisant la même procédure que décrite dans les étapes 10.1.1 et 10.1.2. Ensuite, enregistrez à nouveau ces images de surface coenregistrées (figure 2a,b).
- Si nécessaire, nettoyez les données de surface individuelles, par exemple, en éliminant les petits bruits entourant la région du cerveau, en particulier dans le cas des données d'IRM, et en remplissant les trous s'il en existe, en particulier dans le cas des données d'analyse 3D.
- Enfin, ouvrez les données de surface avec un logiciel d'analyse de données, par exemple, MATLAB, et effectuez et évaluez les histogrammes des distances minimales entre les deux surfaces.
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Representative Results
Nous avons évalué les distances entre les surfaces corticales, produites en dépouillant le volume d'IRM, et les surfaces obtenues à partir de balayages 3D des cerveaux extraits. Les valeurs de mode de l'histogramme des distances ne sont que de 55 m (Figure 3a). De plus, lors de l'accumulation de l'histogramme à partir du point où la distance est égale à zéro, la valeur accumulée atteint 90 % du nombre total d'échantillons à 300 m (figure 3b). L'histogramme final des distances entre deux surfaces a montré un pic typique autour de 50 m. Si nous interprétons cette valeur d'un point de vue macroscopique, il est intéressant de noter que la précision, la valeur du mode de 50 m, correspond à la limitation géométrique, qui était attendue de la taille voxel des IRM (Figure 3a), à savoir, 100 m. Ce point suggère indirectement que l'algorithme qui se chevauche, ICP, entre l'IRM et l'analyse 3D a fonctionné superbement bien et que les niveaux de bruit de l'IRM et de l'analyse 3D ont été supprimés en tant que faible valeur (Figure 2a,b) 14.
Figure 1 : Le flux expérimental. (a) Tout d'abord, après avoir extrait un cerveau d'une souris, le cerveau a été abandonné dans une solution de coupe à bulles. (b) Après avoir essuyé la solution de coupe avec une serviette douce et très absorbante, (c) le cerveau a été scanné sur une plaque tournante. (d) En faisant des tranches (étape 8 du processus), les blocs de cerveau ont été scannés sur un BBB parce qu'il est facile de déplacer des blocs de cerveau à la base pour un vibratome (étapes 7 et 8 du processus). (e) Après avoir obtenu suffisamment de tranches pour enregistrer les activités électriques ou pour tacher les distributions cellulaires et d'autres méthodes, les blocs cérébraux restants ont été scannés à nouveau (étape 10 du processus). L'épaisseur des blocs cérébraux restants a fourni des informations de soutien importantes supplémentaires sur l'endroit où les tranches ont été prélevées. (f) Enfin, nous avons enregistré les activités fonctionnelles ou les architectures structurelles en utilisant des méthodes MEA ou de coloration et d'autres méthodes. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2 : Le pipeline de traitement des données. (a) Exemple d'une surface corticale produite par le décapage des cortex des volumes d'IRM, comme expliqué dans les sections 8 et 9 du protocole. ( b) Exemple d'une surface corticale directement numérisée par un système de scanner 3D. (c) Exemple d'un mémo utilisé pour résumer la région du cerveau à partir de l'endroit où les différentes tranches de cerveau ont été extraites. d) Exemple de la découpe corticale sur un plat d'électrode. (e) Exemple d'une tranche corticale du cerveau tachée par NeuN (rouge) et GAD67 (vert). Toutes les informations vont maintenant être rassemblées dans une base de données unifiée. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3 : Précision de chevauchement entre les IRM et les scans 3D. (a) Histogrammes de distances entre les surfaces extraites par peeling des volumes d'IRM. Les surfaces provenaient d'enregistrements de balayage 3D. Le graphique à barres principale est l'histogramme moyen pour tous les individus, et d'autres lignées colorées sont des résultats pour les souris individuelles (N - 6, âgés de 21 à 40 jours, toutes étaient des souris femelles). Une tendance générale, stable pour tous les individus, pourrait être trouvée. (b) La valeur accumulée de l'histogramme est indiquée sous la forme d'un graphique à barres. Le pourcentage cumulé a atteint 90 % à 300 m (lignes pointillées). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 4 : Image conceptualisée de deux échelles d'informations intégrées dans une interface utilisateur graphique (GUI). L'anatomie macroscopique du cerveau et l'information microscopique du circuit neuronal ont été intégrées dans un système représenté par une toile. Le haut degré de précision, montré dans la figure 3, nous a permis d'intégrer ces deux échelles de façon réaliste. L'image macroscopique présentée ici provient d'un atlas cérébral évolutif15. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
| Paramètres | valeurs |
| Temps de répétition (TR) | 2 000 ms |
| Temps d'écho (TE) | 9 ms |
| TE efficace: | 45 ms |
| Facteur RARE | 16 Annonces |
| Taille de la matrice d'acquisition | 196 x 144 x 144 |
| Champ de vision (FOV) | 19,6 x 14,4 x 14,4 mm3 |
| Bande passante d'acquisition | 75 kHz |
| orientation | Axial (orientation coronale dans le réglage du scanner) |
| Parammètres de suppression de graisse | |
| fréquence des graisses | 2,6 ms-gaussian-en forme d'impulsion avec 1051 hz bande passante |
| gradient spoiler | |
| scans factices | 2 fois |
| Nombre de moyennes | 3 (en) |
| Temps d'acquisition | 2 h 42 min |
Tableau 1 : Paramètres d'acquisition de la séquence d'impulsion3D RARE utilisée dans cette étude.
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Discussion
Nous avons développé un nouveau protocole appelé protocole 3D-NEO pour combler les échelles spatiales macroscopiques et microscopiques en superparant deux surfaces cérébrales avec plus de précision qu'auparavant. À l'origine, il y avait deux défis dans la création de ce protocole qui a rendu possible le chevauchement précis de deux images de surface du cerveau et l'enregistrement des activités neuronales saines à partir d'organismes vivants. Tout d'abord, il était nécessaire d'essuyer efficacement la solution de coupe entourant le cerveau extrait après l'extraire du crâne sans blesser l'organisme cérébral (étape 6.2 du protocole). Deuxièmement, puisque les première et troisième conditions de sécheresse et de délai sont des facteurs négatifs potentiels pour l'organisme vivant, la finition de toutes les étapes du processus de numérisation de l'extraction du cerveau à la préparation de la tranche dans les 10-15 minutes a également été nécessaire de garder les neurones actifs.
La capacité d'enregistrer avec succès les activités cérébrales à l'aide de ce protocole a maintenant rendu possible la coordination non seulement des organisations structurelles, mais aussi des activités fonctionnelles sur la carte du cerveau entier. Un autre aspect positif de ce protocole est que depuis qu'un BBB a été préparé, l'étalonnage du scanner à la base du vibratome est devenu beaucoup plus lisse.
Comme mentionné dans les résultats représentatifs, l'histogramme des distances entre deux surfaces a montré un pic à environ 50 m. Bien que nous ayons effectué le processus de chevauchement, comme si en voyant du point de vue macroscopique. Si nous interprétons le résultat du point de vue microscopique, le 50 m est une échelle spatiale comparable dans la distribution des neurones, puisque les probabilités de connectivité entre les paires de neurones corticaux se désintègrent dans les 100 'm16,17, même dans quelques millimètres18. Pratiquement, les études d'imagerie meA ou calcium utilisent souvent des tranches de 300 à 400 m d'épaisseur. Ainsi, la technique présentée ici fournira des preuves objectives solides si les tranches sont correctement intégrées dans des cartes originales du cerveau entier. Une fois que le chevauchement est réalisé avec précision, une précision supplémentaire sera obtenue uniquement à partir de l'information locale observée au microscope. Par conséquent, en effectuant un processus d'optimisation en deux étapes consistant en des étapes d'optimisation globales et locales, il sera possible d'atteindre une résolution spatiale équivalant semi-automatiquement à la taille typique d'un neurone à l'avenir.
Ce protocole d'intégration précis fournit la technologie de base pour générer divers atlas cérébraux18,20,21 et même pour étudier plus en profondeur l'IRM d'autres primates22,23 et l'homme cerveaus post-mortem (bien que le cerveau humain a sulci, il est possible d'obtenir un nombre suffisant de points d'enregistrement de gyri). Maintenant, nous développons également une interface visuelle pour intégrer de nombreux échantillons de données enregistrés dans une coordure spatiale commune. Une figure d'image comme celle-ci est montrée dans la figure 4. Dans le cas des cerveaux de mammifères, l'intégration entre des échelles quantitativement différentes fera également de nouveaux progrès qualitativement dans la compréhension des états de la maladie et dans l'évaluation des effets des médicaments. En général, cela sera difficile à appliquer aux poissons, reptiles et amphibiens, parce que les chercheurs auront du mal à maintenir la forme du cerveau mince extrait stable à sa forme pré-extraite, et les images IRM de leurs cerveaux plus petits seront également relativement plus bruyants.
Le protocole 3D-NEO a été introduit par cette recherche dans un domaine de recherche neuroscientifique ou biologique cellulaire, démontrant avec succès une grande précision dans le pont entre l'anatomie macroscopique et la distribution neuronale microscopique, y compris le architectures topologiques de macro- et microconnectomes.
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Disclosures
Les auteurs n'ont rien à révéler.
Acknowledgments
M.S. est reconnaissant pour le soutien de tout le personnel dans le cours d'ingénierie de l'information médicale à l'École supérieure de médecine et de la Faculté de médecine, et tient à remercier le professeur Tetsuya Takakuwa, le professeur Nobukatsu Sawamoto, et Doris Zakian pour leur aide Commentaires. Cette étude a été appuyée par une subvention d'aide pour la recherche exploratoire stimulante et par le programme Leading Initiative for Excellent Young Researchers (LEADER) à M.S. du MEXT (Ministère de l'Éducation, de la Culture, des Sports, des Sciences et de la Technologie). Les expériences d'IRM dans ce travail ont été effectuées dans la Division pour l'IRM des petits animaux, Medical Research Support Center, Graduate School of Medicine, Université de Kyoto, Japon.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Air compressor | Kimura Medical | KA-100 | Animal preparation for MRI |
| All-in-one fluorescence microscope | KEYENCE | BZ-X710 | |
| Anesthesia box | Bio Research Center | RIC-01 | Animal preparation for MRI |
| Anesthesia system | ACOMA Medical Industry | NS-5000A | Animal preparation for MRI |
| Anti-GAD67, clone 1G10.2 | Merk Millipore | MAB5406 | For immunostaining |
| Calcium Chrolide | nacalai tesque | 06729-55 | aCSF |
| Choline Chloride | nacalai tesque | 08809-45 | aCSF |
| Curved blunt forceps | |||
| Disposal scalpel | Kai | 10 | |
| D-PBS(-) without Ca and Mg, liquid (10x) | nacalai tesque | For immunostaining | |
| D(+)-Glucose | Wako | 049-31165 | aCSF |
| Gelatin | nacalai tesque | 16605-42 | re-secctioning |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 488 | Invitrogen | A32723 | For immunostaining |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 555 | Invitrogen | A32732 | For immunostaining |
| Heater mat | Bio Research Center | HM-10 | Animal preparation for MRI |
| Heater mat controller | Bio Research Center | BWT-100A | Animal preparation for MRI |
| Heater system | SA Instruments | MR-compatible Small Animal Heating System | Animal preparation for MRI |
| Isoflurane | AbbVie | Animal preparation for MRI | |
| Isoflurane vaporizer | ACOMA Medical Industry | MKIIIai | Animal preparation for MRI |
| Linear Slicer | DOSAKA | Neo Linear Slicer MT | |
| L(+)-Ascorbic Acid Sodium Salt | Wako | 196-01252 | aCSF |
| Magnesium Chrolide Hexahydrate | Wako | 135-00165 | aCSF |
| MaxOne Single-Well MEA | MaxWell Biosystems | ||
| Metal Spatula | |||
| Monitoring system | SA Instruments | Model 1025 | Animal preparation for MRI |
| Monitoring software | SA Instruments | PC-SAM V.5.12 | Animal preparation for MRI |
| MRI compatible cradle | Bruker BioSpin | T12812 | Animal preparation for MRI |
| MRI coil | Bruker BioSpin | T9988 | For MRI |
| MRI operation software | Bruker BioSpin | ParaVision 5.1 | For MRI |
| Neo LinearSlicer MT | D.S.K. | NLS-MT | |
| NeuN (D4G40) XP Rabbit mAb | Cell Signaling | 24307 | For immunostaining |
| Normal Goat Serum | Wako | 143-06561 | For immunostaining |
| Potassium Chloride | Wako | 163-03545 | aCSF |
| Polyethylene Glycol Mono-p-isooctylphenyl Ether | nacalai tesque | 12967-45 | For immunostaining |
| Pressure-sensitive respiration sensor | SA Instruments | RS-301 | Animal preparation for MRI |
| Preclinical MRI scanner | Bruker BioSpin | BioSpec 70/20 USR | For MRI |
| Pyruvic Acid Sodium Salt | nacalai tesque | 29806-54 | aCSF |
| SCAN in a BOX | Open Technologies srl | ||
| Scissors | |||
| Sieve bottle | TIGERCROWN | 81 | For 3D scan |
| SlowFade Gold Antifade Mountant | Invitrogen | S36937 | For immunostaining |
| Sodium Chloride | Wako | 191-01665 | aCSF |
| Sodium Dihydrogenphosphate | Wako | 197-09705 | aCSF |
| Sodium Hydrogen Carbonate | Wako | 191-01305 | aCSF |
| Sodium Hydrogensulfite | nacalai tesque | 31220-15 | For immunostaining |
| Thermistor temperature probe | SA Instruments | RTP-101-B, PLTPC-300 | Animal preparation for MRI |
| Tooth bar | Bruker BioSpin | T10146 | Animal preparation for MRI |
| Winged intravenous needle | TERUMO | SV-23CLK | For perfusion |
| 1 mol/l-Tris-HCl Buffer Solution | nacalai tesque | 35436-01 | For immunostaining |
| 1 mol/l-Hydrochloric Acid | nacalai tesque | 37314-15 | For pH adjustment of solution |
| 16%-Paraformaldehyde Aqueous Solution | Electron Microscopy Sciences | 15710 | For immunostaining |
References
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