Technologie de balayage 3D Bridging Microcircuits and Macroscale Brain Images in 3D Novel Embedding Overlapping Protocol
Summary
Cet article introduit un protocole expérimental utilisant la technologie de balayage 3D reliant deux échelles spatiales : l’échelle spatiale macroscopique de l’anatomie du cerveau entier image par IRM à 100 m et l’échelle spatiale microscopique des distributions neuronales à l’aide la coloration immunohistochemistry et un système de tableau multiélectrode et d’autres méthodes (10 m).
Abstract
Le cerveau humain, étant un système à plusieurs échelles, a à la fois des signaux électriques macroscopiques, qui circulent globalement le long d’épais faisceaux de fibres de matière blanche, et des pointes neuronales microscopiques, se propageant le long des axones et des dendrites. Les deux échelles complètent différents aspects des fonctions cognitives et comportementales humaines. Au niveau macroscopique, l’IRM a été la technologie d’imagerie standard actuelle, dans laquelle la plus petite résolution spatiale, la taille du voxel, est de 0,1 à 1 mm3. En outre, au niveau microscopique, les études physiologiques précédentes étaient au courant des architectures neuronales non uniformes dans de tels voxels. Cette étude développe un moyen puissant d’intégrer avec précision les données microscopiques dans une carte macroscopique en interfaçant la recherche scientifique biologique avec les progrès technologiques dans la technologie de numérisation 3D. Depuis la technologie de numérisation 3D a été principalement utilisé pour l’ingénierie et la conception industrielle jusqu’à présent, il est réutilisé pour la première fois d’intégrer des microconnectomes dans l’ensemble du cerveau tout en préservant les pieux naturels dans les cellules vivantes du cerveau. Pour atteindre cet objectif, tout d’abord, nous avons construit un protocole de numérisation pour obtenir des images 3D précises à partir de bio-organismes vivants intrinsèquement difficiles à l’image en raison de surfaces humides et réfléchissantes. Deuxièmement, nous nous sommes entraînés à maintenir la vitesse pour empêcher la dégradation du tissu cérébral vivant, qui est un facteur clé dans la rétention de meilleures conditions et l’enregistrement de pointes neuronales plus naturelles à partir de neurones actifs dans le tissu cérébral. Deux images de surface corticales, extraites indépendamment de deux modules d’imagerie différents, à savoir les images de surface de l’IRM et du scanner 3D, montrent étonnamment une erreur de distance de seulement 50 m comme valeur de mode de l’histogramme. Cette précision est comparable à l’échelle de la résolution microscopique des distances intercellulaires; aussi, il est stable parmi différentes souris individuelles. Ce nouveau protocole, le nouveau protocole 3D intégrant le chevauchement (3D-NEO), comble les niveaux macroscopiques et microscopiques dérivés de ce protocole intégratif et accélère de nouvelles découvertes scientifiques pour étudier des architectures de connectivité complètes (c.-à-d., microconnectome).
Introduction
Les architectures multi-échelles non uniformes à diverses organisations physiques et biologiques sont généralement trouvées1,2. Le cerveau est également une organisation de réseau très non uniforme et multi-échelle3,4. Diverses fonctions cognitives sont codées dans de telles organisations de réseau, détenant des changements temporels des modèles électriques de pointe des populations neuronales dans les résolutions temporelles submillisecondes. Historiquement, les réseaux complexes entre les neurones ont été structurellement observés en détail en utilisant les techniques de coloration par Santiago Ramon y Cajal de plus de 150 ans5. Pour observer les comportements de groupe des neurones actifs, les chercheurs ont développé diverses technologies d’enregistrement6,7,8, et les récents développements significatifs de ces technologies nous ont permis d’enregistrer activités électriques d’un grand nombre de neurones simultanément. En outre, à partir de ces activités fonctionnelles, les scientifiques ont réussi à reconstruire des réseaux d’interactions causales entre un grand nombre de neurones et ont déclaré l’architecture topologique de leurs interactions complexes «microconnectome»9 . Les observations macroscopiques du cerveau permettent également de considérer un cerveau entier comme une organisation de réseau parce que beaucoup de régions de cerveau sont reliées par de multiples faisceaux de fibres. L’intégration des microconnectomes dans la carte globale du cerveau a encore des limites claires dans les progrès technologiques actuels, c’est pourquoi ce protocole d’intégration est si important. Cependant, l’élaboration du protocole d’intégration pose de nombreux défis. Par exemple, afin d’observer les activités des circuits neuronaux locaux vivants dans des régions cérébrales purement isolées, des tranches de cerveau doivent être produites pour les enregistrements in vitro. En outre, les enregistrements de tranches de cerveau pour les enregistrements in vitro sont encore un choix important pour au moins deux raisons. Tout d’abord, il n’est toujours pas facile d’observer les activités de nombreux neurones individuels vivants simultanément à partir de régions du cerveau plus profondes que 1,5 mm et en haute résolution temporelle (lt;1 ms). Deuxièmement, lorsque nous espérons connaître l’architecture interne d’un circuit neuronal local, nous devons arrêter toutes les entrées provenant de régions externes du cerveau pour éliminer les facteurs de confusion. Afin d’identifier les directions et les positions des tranches de cerveau produites, il sera encore nécessaire d’intégrer les positions spatiales de ces tranches de cerveau produites à l’aide de coordonnées. Il existe, cependant, quelques façons systématiques et fiables de faire des tranches de cerveau d’une manière organisée10,11. Ici, un nouveau protocole de coenregistrement est introduit, utilisant la technologie de balayage 3D pour la recherche neuroscientifique afin de fournir un protocole intégratif. Ce protocole agit pour coordonner les micro- et macro-échelles et intégrer les microdonnées du réseau multiélectrode (MEA)12,13 et les données de coloration sur un espace d’IRM macroscopique à travers des surfaces de balayage 3D des cerveaux extraits, ainsi que de cerveaux non invasifs enregistrés. Étonnamment, cela a montré une erreur de distance de seulement 50 m comme valeur de mode de l’histogramme. En conséquence, les valeurs de mode des distances minimales entre deux surfaces entre la surface d’IRM et la surface 3D numérisée étaient près de 50 m pour chacun des six souris, qui est un nombre approprié lors de la vérification de la communité entre les individus. La largeur typique de la tranche avait une activité de pointe enregistrée d’environ 300 m.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nous avons développé un nouveau protocole appelé protocole 3D-NEO pour combler les échelles spatiales macroscopiques et microscopiques en superparant deux surfaces cérébrales avec plus de précision qu’auparavant. À l’origine, il y avait deux défis dans la création de ce protocole qui a rendu possible le chevauchement précis de deux images de surface du cerveau et l’enregistrement des activités neuronales saines à partir d’organismes vivants. Tout d’abord, il était nécessaire d’essuyer efficacement la solut…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
M.S. est reconnaissant pour le soutien de tout le personnel dans le cours d’ingénierie de l’information médicale à l’École supérieure de médecine et de la Faculté de médecine, et tient à remercier le professeur Tetsuya Takakuwa, le professeur Nobukatsu Sawamoto, et Doris Zakian pour leur aide Commentaires. Cette étude a été appuyée par une subvention d’aide pour la recherche exploratoire stimulante et par le programme Leading Initiative for Excellent Young Researchers (LEADER) à M.S. du MEXT (Ministère de l’Éducation, de la Culture, des Sports, des Sciences et de la Technologie). Les expériences d’IRM dans ce travail ont été effectuées dans la Division pour l’IRM des petits animaux, Medical Research Support Center, Graduate School of Medicine, Université de Kyoto, Japon.
Materials
| Air compressor | Kimura Medical | KA-100 | Animal preparation for MRI |
| All-in-one fluorescence microscope | KEYENCE | BZ-X710 | |
| Anesthesia box | Bio Research Center | RIC-01 | Animal preparation for MRI |
| Anesthesia system | ACOMA Medical Industry | NS-5000A | Animal preparation for MRI |
| Anti-GAD67, clone 1G10.2 | Merk Millipore | MAB5406 | For immunostaining |
| Calcium Chrolide | nacalai tesque | 06729-55 | aCSF |
| Choline Chloride | nacalai tesque | 08809-45 | aCSF |
| curved blunt forceps | |||
| Disposal scalpel | Kai | 10 | |
| D-PBS(-) without Ca and Mg, liquid(10x) | nacalai tesque | For immunostaining | |
| D(+)-Glucose | Wako | 049-31165 | aCSF |
| Gelatin | nacalai tesque | 16605-42 | re-secctioning |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 488 | Invitrogen | A32723 | For immunostaining |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 555 | Invitrogen | A32732 | For immunostaining |
| Heater mat | Bio Research Center | HM-10 | Animal preparation for MRI |
| Heater mat controller | Bio Research Center | BWT-100A | Animal preparation for MRI |
| Heater system | SA Instruments | MR-compatible Small Animal Heating System | Animal preparation for MRI |
| Isoflurane | AbbVie | Animal preparation for MRI | |
| Isoflurane vaporizer | ACOMA Medical Industry | MKIIIai | Animal preparation for MRI |
| Linear Slicer | DOSAKA | Neo Linear Slicer MT | |
| L(+)-Ascorbic Acid Sodium Salt | Wako | 196-01252 | aCSF |
| Magnesium Chrolide Hexahydrate | Wako | 135-00165 | aCSF |
| MaxOne Single-Well MEA | MaxWell Biosystems | ||
| Metal Spatula | |||
| Monitoring system | SA Instruments | Model 1025 | Animal preparation for MRI |
| Monitoring software | SA Instruments | PC-SAM V.5.12 | Animal preparation for MRI |
| MRI compatible cradle | Bruker BioSpin | T12812 | Animal preparation for MRI |
| MRI coil | Bruker BioSpin | T9988 | For MRI |
| MRI operation software | Bruker BioSpin | ParaVision 5.1 | For MRI |
| Neo LinearSlicer MT | D.S.K. | NLS-MT | |
| NeuN (D4G40) XP Rabbit mAb | Cell Signaling | 24307 | For immunostaining |
| Normal Goat Serum | Wako | 143-06561 | For immunostaining |
| Potassium Chloride | Wako | 163-03545 | aCSF |
| Polyethylene Glycol Mono-p-isooctylphenyl Ether | nacalai tesque | 12967-45 | For immunostaining |
| Pressure-sensitive respiration sensor | SA Instruments | RS-301 | Animal preparation for MRI |
| Preclinical MRI scanner | Bruker BioSpin | BioSpec 70/20 USR | For MRI |
| Pyruvic Acid Sodium Salt | nacalai tesque | 29806-54 | aCSF |
| SCAN in a BOX | Open Technologies srl | ||
| scissors | |||
| Sieve bottle | TIGERCROWN | 81 | For 3D scan |
| SlowFade Gold Antifade Mountant | Invitrogen | S36937 | For immunostaining |
| Sodium Chloride | Wako | 191-01665 | aCSF |
| Sodium Dihydrogenphosphate | Wako | 197-09705 | aCSF |
| Sodium Hydrogen Carbonate | Wako | 191-01305 | aCSF |
| Sodium Hydrogensulfite | nacalai tesque | 31220-15 | For immunostaining |
| Thermistor temperature probe | SA Instruments | RTP-101-B, PLTPC-300 | Animal preparation for MRI |
| Tooth bar | Bruker BioSpin | T10146 | Animal preparation for MRI |
| Winged intravenous needle | TERUMO | SV-23CLK | For perfusion |
| 1 mol/l-Tris-HCl Buffer Solution | nacalai tesque | 35436-01 | For immunostaining |
| 1 mol/l-Hydrochloric Acid | nacalai tesque | 37314-15 | For pH adjustment of solution |
| 16%-Paraformaldehyde Aqueous Solution | Electron Microscopy Sciences | 15710 | For immunostaining |
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