Summary

Подготовка и генной модификации нечеловеческих приматов гемопоэтических стволовых и прогениторных клеток

Published: February 15, 2019
doi:

Summary

Цель настоящего Протокола заключается в изоляции нечеловеческие приматов CD34+ клеток от загрунтовать костного мозга, ген изменить эти клетки с лентивирусные векторы и подготовить продукт для вливания в аутологичной хозяина. Длина общего протокола составляет около 48 часов.

Abstract

Трансплантация гемопоэтических стволовых и прогениторных клеток (HSPC) был краеугольным камнем терапия лейкемии и других раковых заболеваний для почти половины столетия, лежит в основе только известного лечения заражения вирусом иммунодефицита человека (ВИЧ-1) и показывает огромные перспективы в лечение генетических заболеваний, таких как бета-талассемия. Наша группа разработала протокол к модели HSPC генной терапии в нечеловеческих приматов (Евросоюзе), позволяя ученых оптимизировать многие из те же реагенты и методы, которые применяются в клинике. Здесь мы описываем методы для очистки CD34+ HSPCs и долгосрочные сохранение подмножества гемопоэтических стволовых клеток (ГСК) загрунтовать костного мозга (БМ). Идентичные методы могут быть использованы для очистки других HSPC источников (например, мобилизованных периферической крови стволовые клетки [PBSCs]). Приводится 2 день протокол, в котором клетки очищенный, культивированный, изменение с человека (LV) и подготовил для инфузии обратно в аутологичной принимающей. Ключевые индикацию успеха включают в себя чистоту CD34+ HSPC населения, очищенный HSPCs способность образовывать морфологически различные колонии в полутвердых средств массовой информации и, самое главное, эффективности генной модификации. Ключевым преимуществом HSPC генной терапии является способность предоставлять источник долгоживущих клеток, которые порождают все типы гемопоэтических клеток. Таким образом эти методы использовались для модели лечения для рака, генетических заболеваний и инфекционных заболеваний. В каждом случае Терапевтическая эффективность устанавливается путем усиления функции различных HSPC потомства, включая красные кровяные клетки, Т-клетки, клетки B или миелоидной подмножеств. Методы для изоляции, изменять и подготовить HSPC продукты непосредственно применимыми и переводимых для множественных заболеваний человека больных.

Introduction

Генная терапия стволовой клетки является мощным средством для решения широкого круга человеческих патологий. HSPC генная терапия является особенно привлекательным подход, благодаря i) относительная простота сбора эти клетки от больных, ii богатство знаний, которая доступна относительно клеток поверхности фенотипы и ex vivo культуры параметры и, как и поле расширяется, потому что iii) он представляет ученых с возрастающей toolbox генной модификации стратегий с учетом различных заболеваний, представляющих интерес. Мы активно изучаем HSPC генной терапии подходы с нескольких точек зрения, включая основные науки HSPC биологии, приживления генно модифицированных HSPCs в доклинических моделях в естественных условиях, и применение соответствующих групп пациентов. Мы и другие характеризовали поверхности фенотипа клетки функционально различных HSPC подмножеств1,2,3, мобилизации и принадлежности схем, которые максимально HSPC урожайности и приживления при минимизации токсичности4,5и генной модификации и Джин редактирования стратегии, которые были адаптированы к широкий спектр злокачественных, генетических и инфекционных заболеваний6,,78, 9,10. Функция и приживления генно модифицированных HSPCs может быть оценен в ряд малых и крупных животных моделей, включая мыши, собаки и Евросоюзе. В частности NHP модели выгодно, потому что многие реагентов, например, антител специфических для HSPC клеток поверхности белки как CD34 и CD90, могут использоваться попеременно в человека и NHP клетки. Кроме того в отличие от мышей, крупных животных, таких как Евросоюзе позволяют приближением шкалы генной модификации необходимые для клинической эффективности. Наконец Евросоюзе являются золотым стандартом для моделирования человеческих патологий, таких как ВИЧ-1 инфекции11 и формирующейся модели системы для кандидата противоопухолевой и анти-ВИЧ immunotherapies12,13.

Целью настоящего Протокола является наметить методы для очистки, генетического изменения и подготовку NHP HSPC инфузии. Хотя в сферу применения настоящего Протокола, мы ранее показали, что эти продукты привито в аутологичной NHP хостов, порождают все гемопоэтических линии и предоставлять терапевтическую эффективность в широкий спектр болезней модели1. Мы также характеризуется clonality голокоренные HSPCs и построил платформу для отслеживания кинетики, торговлей и фенотип отдельных HSPCs и их потомства, следующие аутологичной трансплантации1,14. Представленные здесь методы были разработаны с целью: i) чтобы изолировать высоки чисто HSPCs и долгосрочный голокоренные HSC подмножеств, ii) для поддержания примитивных СКК во время ex vivo культуры и iii) эффективно ген изменить либо массовая HSPCs или долгосрочный отлаживание HSC подмножеств. Мы используем магнитные помощь сортировки клеток (ПДК), а также активации флуоресценции клеток, сортируя (FACS), чтобы изолировать фенотипически/функционально различных HSPC населения, в соответствии с методами многих групп2,15, 16. Поддержание примитивных СКК в культуре (то есть, минимизации дифференцировка этих клеток в совершено прародителей, которые порождают полностью дифференцированной лимфоидных и миелоидного подмножеств) является важным аспектом протокола, описанных здесь. Хотя мы ранее характеризовались подходы к расширению HSPCs при сохранении примитивных фенотип17,18, здесь, мы описываем протокол, который фокусируется на поддержание СКК через минимальный (48 ч) и определены ex vivo культуры.

Эффективное модификации HSPCs и HSC подмножества является главной целью настоящего Протокола. Среди нескольких подходов, мы уже сообщали, два являются на сегодняшний день наиболее исследованных в клинических испытаниях: LV-опосредованной генной модификации и нуклеиназы опосредованной гена редактирования1,6,19. Джин редактирования стратегии использовать один из ряда нуклеиназы платформ для специально изменения целевого гена интереса, например, C-C хемокиновых рецепторов типа 5 (CCR5) для лечения ВИЧ инфекции7,19 или Bcl11A для лечения hemoglobinopathies6. Здесь мы сосредоточены на LV-опосредованной генной модификации, в котором трансгенных грузов интегрировать semirandomly в геном1,8,20. Ключевым преимуществом LV подходов является возможность доставить большое количество генетического материала (до 8 или 9 kilobases). Хотя Джин редактирования стратегии разрабатываются Целевой трансген, представляющие интерес для интеграции только в указанном локусе гомологичных доноров рекомбинации (HDR), эти методы требуют дальнейшего развития в пробирке и в небольших животных моделях. В отличие от LV векторов широко использовались в Евросоюзе и пациентов21,22. Важно отметить, что протокол, описанных здесь, который использует загрунтовать BM как отправной HSPC источника, может быть легко и широко адаптирована, например, изолировать PBSCs. Как описано выше, мы воспользоваться высокой степени генетического сходства между Евросоюзе и людей использовать реагенты, которые применимы для обоих видов. Наконец этот подход был адаптирован для изменения других гемопоэтических подгруппы, а именно T клетки12,,2324; с появлением эффективных подходов Т-клеточной иммунотерапии полагались на той же платформе LV, используемые в настоящем Протоколе. Эти методы являются подходящими для любой исследователь заинтересован в биологии HSPC или LV-опосредованной генной модификации. Например, протокол очистки HSPC, представленные здесь могут использоваться для характеристики Роман HSC-обогащенный подмножеств, как описано ранее в1,15,25. Аналогичным образом LV трансдукции, что представленные здесь методы могут также применяться и дальнейшее развитие для многих других типов клеток и экспериментальных вопросов, как в модели в vitro и in vivo.

Таким образом мы представляем методы изолировать и генетически модифицировать NHP HSPCs. Эти методы могут быть легко адаптированы для других видов и других источников HSPCs. Этот тщательно исследованные протокол показывает большие надежды в моделировании эффективной терапии для многочисленных заболеваний человека.

Protocol

Аутологичной трансплантации NHP, грунтовка (мобилизации), коллекции клеток и генной модификации, проводятся в соответствии с ранее опубликованные протоколы26. Все экспериментальные процедуры рассматриваются и утверждаются институциональный уход животных и использования ?…

Representative Results

Описанные выше протокол предназначен для изоляции и Джин изменить NHP CD34+ HSPCs, которые впоследствии могут быть проникнуты обратно в аутологичной узла (рис. 1 и рис. 2). Когда после этого протокола, мы обычно получить до 8 х 109 всего…

Discussion

LV вектор Инжиниринг является метод наиболее характерны для гена изменить типы клеток, таких как CD34+ HSPCs, для последующей трансплантации в естественных условиях. Протокол, описанные здесь призван увеличить количество генно модифицированных HSPCs, которые сохраняются долгосрочные в …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Авторы благодарят Хелен Crawford за подготовку этой рукописи, Джим Woolace для графического дизайна и Вероника Нельсон и Devikha Chandrasekaran для участия в разработке протокола. В разработке этого протокола был поддержан грантов из низ национального института аллергии и инфекционных заболеваний (R01 AI135953 и AI138329 к H.P.K.) и Национальный сердца, легких и крови института (R01 HL136135, HL116217, P01 HL122173 и U19 HL129902 к H.P.K.), а также NIH P51 OD010425 и частично через низ/NCI онкологический центр, поддержка Грант Р30 CA015704. H.P.K. является Markey молекулярной медицины следователь и получил поддержку как первого получателя Хосе Каррерас/э. Donnall Томас наделила Председателя для исследований рака и Председатель наделен Фред загон для клеток и генной терапии.

Materials

Stemspam SFEM II ("HSPC") Media StemCell 09655
Hank's Balanced Salt Solution Gibco 14175095
Phosphate-Buffered Saline Gibco 14190-144
Penicillin/Streptomycin Gibco 15140-122
Dimethyl Sulfoxide Sigma Aldrich D2650-100
100% Ethanol Decon labs M18027161M
Cyclosporine Sigma 30024-25MG
500 mM EDTA Invitrogen 15575-038
Heat-Inactivated Fetal Bovine Serum Sigma Aldrich PS-0500-A
CH-296/ RetroNectin (2.5 mL, 1 µg/µL) TaKaRA T100B
Bovine Serum Albumin Sigma A7906-100g
HEPES Sigma H9897
Rat anti-mouse IgM magnetic beads Miltenyi Biotec 130-047-301
Recombinant HumanStem Cell Factor (SCF) Peprotech 300-07
Recombinant Human Thrombopoietin (TPO) Peprotech 300-18
Recombinant Human FMS-like tyrosine kinase 3 (FLT-3) Peprotech 300-19
Protamine sulfate Sigma P-4505
14 mL Polypropylene Round-Bottom Tube Corning 352059
Colony Gel 1402 ReachBio 1402
QuadroMACS Separators Miltenyi Biotec 130-090-976
MACS L25 Columns Miltenyi biotec 130-042-401
10 mM PGE2 Cayman Chemical 14753-5mg
TC-treated T-75 flasks Bioexpress T-3001-2
Non-TC-treated T-75 flasks Thermo-Fisher 13680-57
20 ml syringes BD Biosciences 302830
16.5 G needles BD Precision 305198
Syringe Tip Cap BD Biosciences 305819
QuickExtract DNA Solution Epicentre QE09050
8-tube strip cap PCR Tubes USA scientific 1402-2708
96-well Thermocycler Thermo-Fisher 4375786
Pre-Separation filters Miltenyi Biotec 130-041-407
Strainer, Cell; BD Falcon; Sterile; Nylon mesh; Mesh size: 70um; Color: white; 50/CS fisher scientific 352350
Ultracomp ebeads eBioscience 01-2222-42
MACSmix Tube Rotator Miltenyi 130-090-753
3 mL Luer-Lock Syringes Thermo-Fisher 14823435
35 mm x 10 mm cell culture dish Corning 430165
60 mm x 15 mm cell culture dish Corning 430196
150 mm x 25 mm cell culture dish Corning 430599
Non TC treated flasks Falcon 353133
Qiagen DNA extraction Qiagen 51104
PE Anti-Human CD90 (Thy1) Clone:5E10 Biolegend 328110
PE-CF594 Mouse Anti-Human CD34 Clone:563 BD horizon 562449
APC-H7 Mouse Anti-Human CD45RA Clone: 5H9 BD Pharmingen 561212
V450 Mouse Anti-NHP CD45 Clone:d058-1283 BD Biosciences 561291
Autologous Serum Collected from autologous host and cryopreserved prior to mobilization and collection of CD34+ HSPCs N/A Beard, B. C. et al. Efficient and stable MGMT-mediated selection of long-term repopulating stem cells in nonhuman primates. Journal of Clinical Investigation. 120 (7), 2345-2354, (2010).
Virus-Conditioned Media (VCM) Kiem Lab, FHCRC Co-operative Center for Excellence in Hematology (CCEH) N/A Beard, B. C. et al. Efficient and stable MGMT-mediated selection of long-term repopulating stem cells in nonhuman primates. Journal of Clinical Investigation. 120 (7), 2345-2354, (2010).
Anti-CD34 antibody, Clone 12.8 Kiem Lab N/A Beard, B. C. et al. Efficient and stable MGMT-mediated selection of long-term repopulating stem cells in nonhuman primates. Journal of Clinical Investigation. 120 (7), 2345-2354, (2010).
Lenti F primer: AGAGATGGGTGCGAGAGCGTCA Integrated DNA Technologies N/A Peterson, C. W. et al. Multilineage polyclonal engraftment of Cal-1 gene-modified cells and in vivo selection after SHIV infection in a nonhuman primate model of AIDS. Mol Ther Methods Clin Dev. 3 16007, (2016).
Lenti R primer: TGCCTTGGTGGGTGCTACTCCTAA Integrated DNA Technologies N/A Peterson, C. W. et al. Multilineage polyclonal engraftment of Cal-1 gene-modified cells and in vivo selection after SHIV infection in a nonhuman primate model of AIDS. Mol Ther Methods Clin Dev. 3 16007, (2016).
Actin F primer: TCCTGTGGCACTCACGAAACT Integrated DNA Technologies N/A Peterson, C. W. et al. Multilineage polyclonal engraftment of Cal-1 gene-modified cells and in vivo selection after SHIV infection in a nonhuman primate model of AIDS. Mol Ther Methods Clin Dev. 3 16007, (2016).
Actin R primer: GAAGCATTTGCGGTGGACGAT Integrated DNA Technologies N/A Peterson, C. W. et al. Multilineage polyclonal engraftment of Cal-1 gene-modified cells and in vivo selection after SHIV infection in a nonhuman primate model of AIDS. Mol Ther Methods Clin Dev. 3 16007, (2016).

References

  1. Radtke, S., et al. A distinct hematopoietic stem cell population for rapid multilineage engraftment in nonhuman primates. Science Translational Medicine. 9 (414), (2017).
  2. Majeti, R., Park, C. Y., Weissman, I. L. Identification of a hierarchy of multipotent hematopoietic progenitors in human cord blood. Cell Stem Cell. 1 (6), 635-645 (2007).
  3. Notta, F., et al. Isolation of single human hematopoietic stem cells capable of long-term multilineage engraftment. Science. 333 (6039), 218-221 (2011).
  4. Hoggatt, J., et al. Rapid mobilization reveals a highly engraftable hematopoietic stem cell. Cell. 172 (1-2), 191-204 (2018).
  5. Chandrasekaran, D., Nakamoto, B., Watts, K. L., Kiem, H. P., Papayannopoulou, T. Modeling promising nonmyeloablative conditioning regimens in nonhuman primates. Human Gene Therapy. 25 (12), 1013-1022 (2014).
  6. Humbert, O., Peterson, C. W., Norgaard, Z. K., Radtke, S., Kiem, H. P. A nonhuman primate transplantation model to evaluate hematopoietic stem cell gene editing strategies for beta-hemoglobinopathies. Molecular Therapy. Methods & Clinical Development. 8, 75-86 (2018).
  7. Peterson, C. W., et al. Differential impact of transplantation on peripheral and tissue-associated viral reservoirs: Implications for HIV gene therapy. PLoS Pathogens. 14 (4), e1006956-e1006956 (2018).
  8. Zhen, A., et al. Long-term persistence and function of hematopoietic stem cell-derived chimeric antigen receptor T cells in a nonhuman primate model of HIV/AIDS. PLoS Pathogens. 13 (12), e1006753 (2017).
  9. Moffett, H. F., et al. Hit-and-run programming of therapeutic cytoreagents using mRNA nanocarriers. Nature Communications. 8 (1), 389 (2017).
  10. Burtner, C. R., et al. Intravenous injection of a foamy virus vector to correct canine SCID-X1. Blood. 123 (23), 3578-3584 (2014).
  11. Evans, D. T., Silvestri, G. Nonhuman primate models in AIDS research. Current Opinion in HIV and AIDS. 8 (4), 255-261 (2013).
  12. Taraseviciute, A., et al. Chimeric antigen receptor T cell-mediated neurotoxicity in nonhuman primates. Cancer Discovery. 8 (6), 750-763 (2018).
  13. McGary, C. S., et al. CTLA-4(+)PD-1(-) memory CD4(+) T cells critically contribute to viral persistence in antiretroviral therapy-suppressed, SIV-infected rhesus macaques. Immunity. 47 (4), 776-788 (2017).
  14. Beard, B. C., Adair, J. E., Trobridge, G. D., Kiem, H. P. High-throughput genomic mapping of vector integration sites in gene therapy studies. Methods in Molecular Biology. 1185, 321-344 (2014).
  15. Zonari, E., et al. Efficient ex vivo engineering and expansion of highly purified human hematopoietic stem and progenitor cell populations for gene therapy. Stem Cell Reports. 8 (4), 977-990 (2017).
  16. Doulatov, S., et al. Revised map of the human progenitor hierarchy shows the origin of macrophages and dendritic cells in early lymphoid development. Nature Immunology. 11 (7), 585-593 (2010).
  17. Fares, I., et al. Cord blood expansion. Pyrimidoindole derivatives are agonists of human hematopoietic stem cell self-renewal. Science. 345 (6203), 1509-1512 (2014).
  18. Gori, J. L., et al. Endothelial cells promote expansion of long-term engrafting marrow hematopoietic stem and progenitor cells in primates. Stem Cells Translational Medicine. 6 (3), 864-876 (2017).
  19. Peterson, C. W., et al. Long-term multilineage engraftment of autologous genome-edited hematopoietic stem cells in nonhuman primates. Blood. 127 (20), 2416-2426 (2016).
  20. Peterson, C. W., et al. Multilineage polyclonal engraftment of Cal-1 gene-modified cells and in vivo selection after SHIV infection in a nonhuman primate model of AIDS. Molecular Therapy. Methods & Clinical Development. 3, 16007 (2016).
  21. Thompson, A. A., et al. Gene therapy in patients with transfusion-dependent beta-thalassemia. The New England Journal of Medicine. 378 (16), 1479-1493 (2018).
  22. Eichler, F., et al. Hematopoietic stem-cell gene therapy for cerebral adrenoleukodystrophy. The New England Journal of Medicine. 377 (17), 1630-1638 (2017).
  23. Paul, B., et al. Efficient enrichment of gene-modified primary T cells via CCR5-targeted integration of mutant dihydrofolate reductase. Molecular Therapy. Methods & Clinical Development. 5 (9), 347-357 (2018).
  24. Levine, B. L., Miskin, J., Wonnacott, K. Global manufacturing of CAR T cell therapy. Molecular Therapy. Methods & Clinical Development. 4, 92-101 (2017).
  25. Masiuk, K. E., et al. Improving gene therapy efficiency through the enrichment of human hematopoietic stem cells. Molecular Therapy. 25 (9), 2163-2175 (2017).
  26. Trobridge, G. D., et al. Efficient transduction of pigtailed macaque hematopoietic repopulating cells with HIV-based lentiviral vectors. Blood. 111 (12), 5537-5543 (2008).
  27. Beard, B. C., et al. Efficient and stable MGMT-mediated selection of long-term repopulating stem cells in nonhuman primates. Journal of Clinical Investigation. 120 (7), 2345-2354 (2010).
  28. Horn, P. A., et al. Efficient lentiviral gene transfer to canine repopulating cells using an overnight transduction protocol. Blood. 103 (10), 3710-3716 (2004).
  29. Adair, J. E., et al. Semi-automated closed system manufacturing of lentivirus gene-modified haematopoietic stem cells for gene therapy. Nature Communications. 7, 13173 (2016).
  30. Kutner, R. H., Zhang, X. Y., Reiser, J. Production, concentration and titration of pseudotyped HIV-1-based lentiviral vectors. Nature Protocols. 4 (4), 495-505 (2009).
  31. Salmon, P., Trono, D. Production and titration of lentiviral vectors. Current Protocols in Human Genetics. 54 (1), (2007).
  32. Geraerts, M., Willems, S., Baekelandt, V., Debyser, Z., Gijsbers, R. Comparison of lentiviral vector titration methods. BMC Biotechnology. 6, 34 (2006).
  33. Kiem, H. P., et al. Improved gene transfer into baboon marrow repopulating cells using recombinant human fibronectin fragment CH-296 in combination with interleukin-6, stem cell factor, FLT-3 ligand, and megakaryocyte growth and development factor. Blood. 92 (6), 1878-1886 (1998).
  34. Morton, W. R., Knitter, G. H., Smith, P. M., Susor, T. G., Schmitt, K. Alternatives to chronic restraint of nonhuman primates. Journal of the American Veterinary Medical Association. 191 (10), 1282-1286 (1987).
  35. Noser, J. A., et al. Cyclosporine increases human immunodeficiency virus type 1 vector transduction of primary mouse cells. Journal of Virology. 80 (15), 7769-7774 (2006).
  36. Uchida, N., Hsieh, M. M., Washington, K. N., Tisdale, J. F. Efficient transduction of human hematopoietic repopulating cells with a chimeric HIV1-based vector including SIV capsid. Experimental Hematology. 41 (9), 779-788 (2013).
  37. Cornetta, K., Anderson, W. F. Protamine sulfate as an effective alternative to polybrene in retroviral-mediated gene-transfer: implications for human gene therapy. Journal of Virological Methods. 23 (2), 187-194 (1989).
  38. Goerner, M., et al. The use of granulocyte colony-stimulating factor during retroviral transduction on fibronectin fragment CH-296 enhances gene transfer into hematopoietic repopulating cells in dogs. Blood. 94 (7), 2287-2292 (1999).
  39. Dao, M. A., Hashino, K., Kato, I., Nolta, J. A. Adhesion to fibronectin maintains regenerative capacity during ex vivo culture and transduction of human hematopoietic stem and progenitor cells. Blood. 92 (12), 4612-4621 (1998).
  40. North, T. E., et al. Prostaglandin E2 regulates vertebrate haematopoietic stem cell homeostasis. Nature. 447 (7147), 1007-1011 (2007).
  41. Goessling, W., et al. Prostaglandin E2 enhances human cord blood stem cell xenotransplants and shows long-term safety in preclinical nonhuman primate transplant models. Cell Stem Cell. 8 (4), 445-458 (2011).
  42. Booth, C., Gaspar, H. B., Thrasher, A. J. Treating immunodeficiency through HSC gene therapy. Trends in Molecular Medicine. 22 (4), 317-327 (2016).
  43. Humbert, O., et al. Rapid immune reconstitution of SCID-X1 canines after G-CSF/AMD3100 mobilization and in vivo gene therapy. Blood Advances. 2 (9), 987-999 (2018).

Play Video

Cite This Article
Radtke, S., Perez, A. M., Venkataraman, R., Reddy, S., Haworth, K. G., Humbert, O., Kiem, H., Peterson, C. W. Preparation and Gene Modification of Nonhuman Primate Hematopoietic Stem and Progenitor Cells. J. Vis. Exp. (144), e58933, doi:10.3791/58933 (2019).

View Video