Preparación y modificación genética de primates no humanos tallo hematopoyéticas y células progenitoras
Summary
El objetivo de este protocolo es aislar a primates no humanos CD34 de las células+ de cebada la médula ósea, estas células con vectores lentivirales de modificar genes y para preparar un producto para infusión en el huésped autólogo. La longitud del protocolo total es aproximadamente de 48 h.
Abstract
Trasplante de la célula de (HSPC) madre y progenitoras hematopoyético ha sido una terapia de la piedra angular para la leucemia y otros cánceres durante casi medio siglo, subyace la única cura conocida de infección por virus de inmunodeficiencia humana (VIH-1) y muestra la inmensa promesa en el tratamiento de enfermedades genéticas tales como la talasemia beta. Nuestro grupo ha desarrollado un protocolo de terapia del gene modelo HSPC en primates no humanos (NHPs), permitiendo a los científicos optimizar muchos de los mismos reactivos y técnicas que se aplican en la clínica. Aquí, describimos los métodos para purificar el CD34+ HSPCs y subconjuntos de células madre hematopoyéticas (HSC) que persiste a largo plazo de cebada de la médula (BM). Técnicas idénticas pueden ser empleadas para la purificación de otras fuentes de la HSPC (por ejemplo, sangre periférica movilizada células madre [PBSCs]). Se describe, es un protocolo de 2 días en el que las células son purificadas, cultivadas, modificadas con lentivirus (LV) y preparadas para infusión en el huésped autólogo. Lecturas claves de éxito incluyen la pureza de la CD34+ HSPC población, la capacidad de HSPCs purificadas para formar colonias morfológicamente distintas en medios semisólidos y, lo más importante, eficiencia de modificación genética. La ventaja clave de la terapia génica HSPC es la capacidad de proporcionar una fuente de larga vida células que dan lugar a todos los tipos de células hematopoyéticas. Como tales, estos métodos se han utilizado para terapias de modelo para el cáncer, enfermedades genéticas y enfermedades infecciosas. En cada caso, eficacia terapéutica se establece al mejorar la función de clara progenie HSPC, incluyendo células de sangre rojas, células T, células B o subconjuntos mieloides. Los métodos para aislar, modificar y preparar HSPC productos son directamente aplicables y traducible a múltiples enfermedades en pacientes humanos.
Introduction
Terapia génica de la célula de vástago es un medio poderoso para abordar una amplia gama de patologías humanas. La terapia génica HSPC es un enfoque especialmente atractivo, debido a i) la relativa facilidad de la recogida de estas células de pacientes, ii) la riqueza del conocimiento que está disponible en cuanto a fenotipos de superficie celular y ex vivo parámetros de cultura y, como el campo se amplía, porque iii) presenta los científicos con una caja de herramientas cada vez más de estrategias de modificación génica adaptados a varias enfermedades de interés. Estamos investigando activamente HSPC enfoques de terapia de gen desde varios ángulos, incluyendo la ciencia básica de Biología HSPC, el engraftment de HSPCs modificado gen en modelos preclínicos in vivo y la aplicación a las poblaciones de pacientes. Nosotros y otros hemos caracterizado el fenotipo de superficie celular de funcionalmente distintas HSPC subconjuntos1,2,3, la movilización y regímenes de acondicionamiento que maximizan el rendimiento de la HSPC y engraftment minimizando toxicidad4,5y el gene de la modificación y edición de gene estrategias que se ajustan a una amplia gama de maligno, genética y enfermedades infecciosas6,7,8, 9,10. La función y el engraftment de HSPCs gene modificado pueden evaluarse en un número de modelos de animales grandes y pequeños, como ratones, perros, NHPs. En particular, modelos NHP son ventajosos porque muchos reactivos, por ejemplo, anticuerpos específicos para proteínas de superficie de célula HSPC como CD34 y CD90, pueden ser utilizados indistintamente en humanos y células NHP. Además, en contraste con los ratones, animales grandes, como NHPs permiten una mejor aproximación de la magnitud de la modificación genética necesaria para la eficacia clínica. Finalmente, NHPs son el estándar de oro para el modelado de patologías humanas tales como HIV-1 infección11 y son un modelo emergente para candidato anticáncer y anti-VIH inmunoterapias12,13.
El propósito de este protocolo es exponer métodos para purificar, modificar genéticamente y preparación de productos de infusión HSPC NHP. Aunque fuera del alcance de este protocolo, previamente hemos demostrado que estos productos engraft en anfitriones NHP autólogos, dan lugar a todos los linajes hematopoyéticos y proporcionan eficacia terapéutica en una amplia gama de modelos de enfermedad1. También hemos caracterizado el clonality de engrafting HSPCs y construido una plataforma para el seguimiento de la cinética, tráfico y el fenotipo de HSPCs individuales y su progenie, siguiente trasplante autólogo1,14. Los métodos presentados aquí han sido desarrollados con los siguientes objetivos: i) al aislar HSPCs altamente puros y subconjuntos HSC engrafting a largo plazo, ii) para mantener HSCs primitivo durante ex vivo de la cultura y iii) eficacia gene-modificar ya sea a granel HSPCs o a largo plazo engrafting subconjuntos HSC. Empleamos asistida magnética celular clasificación (MACS), así como de células activado por fluorescencia (FACS), para aislar a fenotípicamente/funcionalmente HSPC poblaciones distintas, consistentes con los métodos de muchos grupos2,15, de la clasificación 16. El mantenimiento de HSCs primitivos en la cultura (es decir, minimizar la diferenciación de estas células en progenitores comprometidos que dan lugar a completamente diferenciados subconjuntos linfoides y mieloides) es una faceta esencial del protocolo descrito aquí. Aunque anteriormente hemos caracterizado enfoques para ampliar HSPCs manteniendo un fenotipo primitivo17,18, aquí, se describe un protocolo que se centra en el mantenimiento de las HSCs vía un mínimo (48 h) y define ex vivo de la cultura.
La modificación eficaz de HSPCs y HSC subconjuntos es un objetivo central de este protocolo. Entre varios enfoques hemos divulgado, dos son los más investigados en ensayos clínicos: modificación genética mediada por LV y nucleasa-mediated gene edición1,6,19. Estrategias gene-edición para utilizan uno de un número de plataformas de nucleasa para modificar específicamente un gen específico de interés, por ejemplo, C-C chemokine receptor tipo 5 (CCR5) para el tratamiento de VIH infección7,19 o Bcl11A para el tratamiento de hemoglobinopatías6. Aquí, nos centramos en la modificación genética de LV-mediada, en la cual cargas transgénicas semirandomly integran en el genoma1,8,20. Una ventaja clave de los enfoques de LV es la capacidad para entregar grandes cantidades de material genético (hasta 8 o 9 kilobases). Aunque estrategias gene-edición se están desarrollando para un transgen de interés integrar sólo en un lugar especificado por recombinación homóloga donantes (HDR), estos métodos requieren más desarrollo in vitro y en modelos animales pequeños. Por el contrario, vectores de LV se han utilizado extensivamente en NHPs y en pacientes21,22. Lo importante, el protocolo descrito aquí, que utiliza habían cebada BM como una fuente partida de la HSPC, puede ser fácilmente y ampliamente adaptado, por ejemplo, para aislar PBSCs. Como se describió anteriormente, aprovechamos el alto grado de similitud genética entre NHPs y los seres humanos para utilizar reactivos que son aplicables a ambas especies. Por último, este enfoque ha sido adaptado para modificar otros subconjuntos hematopoyéticos, es decir, T las células12,23,24; la llegada de los eficaces métodos de inmunoterapia de T-cell ha confiado pesadamente en la misma plataforma de LV en este protocolo. Estos métodos son apropiados para cualquier investigador interesado en la biología de la HSPC o modificación genética mediada por LV. Por ejemplo, podría utilizarse el protocolo de purificación de la HSPC presentado aquí para caracterizar nuevos subconjuntos de HSC-enriquecido, como se describió anteriormente1,15,25. Asimismo, la transducción de LV métodos presentados aquí podrían del mismo modo ser aplicada y desarrollada por numerosos tipos celulares y preguntas experimentales, tanto en modelos in vitro e in vivo.
En Resumen, se presentan métodos para aislar y modificar genéticamente HSPCs NHP. Estos métodos pueden ser muy fácilmente adaptables para otras especies y otras fuentes de HSPCs. Este protocolo minuciosamente investigado muestra gran promesa en el modelaje de las eficaces terapias para numerosas enfermedades humanas.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vector de LV ingeniería es el método mejor caracterizado gene-modificar tipos de células como CD34+ HSPCs, para el posterior trasplante in vivo. El protocolo descrito aquí está diseñado para maximizar el número de HSPCs gen modificado que persisten a largo plazo en vivo y proporcionan beneficios clínicos en pacientes con diversas enfermedades malignas, infecciosas y genéticas. Aunque han surgido estrategias gene-edición durante la última década, las células modificadas de LV son los mejores estudi…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores agradecen a Helen Crawford para la preparación de este manuscrito, Jim Woolace para diseño gráfico y Veronica Nelson y Devikha Chandrasekaran para participar en el desarrollo del protocolo. El desarrollo de este protocolo fue apoyado por subvenciones del NIH Instituto Nacional de alergias y enfermedades infecciosas (R01 AI135953 y AI138329 a H.P.K.) y nacional del corazón, pulmón y Blood Institute (R01 HL136135, HL116217, HL122173 P01 y U19 HL129902 a H.P.K.), así como NIH P51 OD010425 y, en parte, a través del centro del cáncer de NIH/NCI, apoyo beca P30 CA015704. H.P.K. es un investigador de Medicina Molecular de Markey y recibió el apoyo como el recipiente inaugural de la Cátedra José Carreras/E. Donnall Thomas dotado para la investigación del cáncer y la Cátedra Fred aparador para celular y Gene Therapy.
Materials
| Stemspam SFEM II ("HSPC") Media | StemCell | 09655 | |
| Hank's Balanced Salt Solution | Gibco | 14175095 | |
| Phosphate-Buffered Saline | Gibco | 14190-144 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Dimethyl Sulfoxide | Sigma Aldrich | D2650-100 | |
| 100% Ethanol | Decon labs | M18027161M | |
| Cyclosporine | Sigma | 30024-25MG | |
| 500 mM EDTA | Invitrogen | 15575-038 | |
| Heat-Inactivated Fetal Bovine Serum | Sigma Aldrich | PS-0500-A | |
| CH-296/ RetroNectin (2.5 mL, 1 µg/µL) | TaKaRA | T100B | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A7906-100g | |
| HEPES | Sigma | H9897 | |
| Rat anti-mouse IgM magnetic beads | Miltenyi Biotec | 130-047-301 | |
| Recombinant HumanStem Cell Factor (SCF) | Peprotech | 300-07 | |
| Recombinant Human Thrombopoietin (TPO) | Peprotech | 300-18 | |
| Recombinant Human FMS-like tyrosine kinase 3 (FLT-3) | Peprotech | 300-19 | |
| Protamine sulfate | Sigma | P-4505 | |
| 14 mL Polypropylene Round-Bottom Tube | Corning | 352059 | |
| Colony Gel 1402 | ReachBio | 1402 | |
| QuadroMACS Separators | Miltenyi Biotec | 130-090-976 | |
| MACS L25 Columns | Miltenyi biotec | 130-042-401 | |
| 10 mM PGE2 | Cayman Chemical | 14753-5mg | |
| TC-treated T-75 flasks | Bioexpress | T-3001-2 | |
| Non-TC-treated T-75 flasks | Thermo-Fisher | 13680-57 | |
| 20 ml syringes | BD Biosciences | 302830 | |
| 16.5 G needles | BD Precision | 305198 | |
| Syringe Tip Cap | BD Biosciences | 305819 | |
| QuickExtract DNA Solution | Epicentre | QE09050 | |
| 8-tube strip cap PCR Tubes | USA scientific | 1402-2708 | |
| 96-well Thermocycler | Thermo-Fisher | 4375786 | |
| Pre-Separation filters | Miltenyi Biotec | 130-041-407 | |
| Strainer, Cell; BD Falcon; Sterile; Nylon mesh; Mesh size: 70um; Color: white; 50/CS | fisher scientific | 352350 | |
| Ultracomp ebeads | eBioscience | 01-2222-42 | |
| MACSmix Tube Rotator | Miltenyi | 130-090-753 | |
| 3 mL Luer-Lock Syringes | Thermo-Fisher | 14823435 | |
| 35 mm x 10 mm cell culture dish | Corning | 430165 | |
| 60 mm x 15 mm cell culture dish | Corning | 430196 | |
| 150 mm x 25 mm cell culture dish | Corning | 430599 | |
| Non TC treated flasks | Falcon | 353133 | |
| Qiagen DNA extraction | Qiagen | 51104 | |
| PE Anti-Human CD90 (Thy1) Clone:5E10 | Biolegend | 328110 | |
| PE-CF594 Mouse Anti-Human CD34 Clone:563 | BD horizon | 562449 | |
| APC-H7 Mouse Anti-Human CD45RA Clone: 5H9 | BD Pharmingen | 561212 | |
| V450 Mouse Anti-NHP CD45 Clone:d058-1283 | BD Biosciences | 561291 | |
| Autologous Serum | Collected from autologous host and cryopreserved prior to mobilization and collection of CD34+ HSPCs | N/A | Beard, B. C. et al. Efficient and stable MGMT-mediated selection of long-term repopulating stem cells in nonhuman primates. Journal of Clinical Investigation. 120 (7), 2345-2354, (2010). |
| Virus-Conditioned Media (VCM) | Kiem Lab, FHCRC Co-operative Center for Excellence in Hematology (CCEH) | N/A | Beard, B. C. et al. Efficient and stable MGMT-mediated selection of long-term repopulating stem cells in nonhuman primates. Journal of Clinical Investigation. 120 (7), 2345-2354, (2010). |
| Anti-CD34 antibody, Clone 12.8 | Kiem Lab | N/A | Beard, B. C. et al. Efficient and stable MGMT-mediated selection of long-term repopulating stem cells in nonhuman primates. Journal of Clinical Investigation. 120 (7), 2345-2354, (2010). |
| Lenti F primer: AGAGATGGGTGCGAGAGCGTCA | Integrated DNA Technologies | N/A | Peterson, C. W. et al. Multilineage polyclonal engraftment of Cal-1 gene-modified cells and in vivo selection after SHIV infection in a nonhuman primate model of AIDS. Mol Ther Methods Clin Dev. 3 16007, (2016). |
| Lenti R primer: TGCCTTGGTGGGTGCTACTCCTAA | Integrated DNA Technologies | N/A | Peterson, C. W. et al. Multilineage polyclonal engraftment of Cal-1 gene-modified cells and in vivo selection after SHIV infection in a nonhuman primate model of AIDS. Mol Ther Methods Clin Dev. 3 16007, (2016). |
| Actin F primer: TCCTGTGGCACTCACGAAACT | Integrated DNA Technologies | N/A | Peterson, C. W. et al. Multilineage polyclonal engraftment of Cal-1 gene-modified cells and in vivo selection after SHIV infection in a nonhuman primate model of AIDS. Mol Ther Methods Clin Dev. 3 16007, (2016). |
| Actin R primer: GAAGCATTTGCGGTGGACGAT | Integrated DNA Technologies | N/A | Peterson, C. W. et al. Multilineage polyclonal engraftment of Cal-1 gene-modified cells and in vivo selection after SHIV infection in a nonhuman primate model of AIDS. Mol Ther Methods Clin Dev. 3 16007, (2016). |
References
- Radtke, S., et al. A distinct hematopoietic stem cell population for rapid multilineage engraftment in nonhuman primates. Science Translational Medicine. 9 (414), (2017).
- Majeti, R., Park, C. Y., Weissman, I. L. Identification of a hierarchy of multipotent hematopoietic progenitors in human cord blood. Cell Stem Cell. 1 (6), 635-645 (2007).
- Notta, F., et al. Isolation of single human hematopoietic stem cells capable of long-term multilineage engraftment. Science. 333 (6039), 218-221 (2011).
- Hoggatt, J., et al. Rapid mobilization reveals a highly engraftable hematopoietic stem cell. Cell. 172 (1-2), 191-204 (2018).
- Chandrasekaran, D., Nakamoto, B., Watts, K. L., Kiem, H. P., Papayannopoulou, T. Modeling promising nonmyeloablative conditioning regimens in nonhuman primates. Human Gene Therapy. 25 (12), 1013-1022 (2014).
- Humbert, O., Peterson, C. W., Norgaard, Z. K., Radtke, S., Kiem, H. P. A nonhuman primate transplantation model to evaluate hematopoietic stem cell gene editing strategies for beta-hemoglobinopathies. Molecular Therapy. Methods & Clinical Development. 8, 75-86 (2018).
- Peterson, C. W., et al. Differential impact of transplantation on peripheral and tissue-associated viral reservoirs: Implications for HIV gene therapy. PLoS Pathogens. 14 (4), e1006956-e1006956 (2018).
- Zhen, A., et al. Long-term persistence and function of hematopoietic stem cell-derived chimeric antigen receptor T cells in a nonhuman primate model of HIV/AIDS. PLoS Pathogens. 13 (12), e1006753 (2017).
- Moffett, H. F., et al. Hit-and-run programming of therapeutic cytoreagents using mRNA nanocarriers. Nature Communications. 8 (1), 389 (2017).
- Burtner, C. R., et al. Intravenous injection of a foamy virus vector to correct canine SCID-X1. Blood. 123 (23), 3578-3584 (2014).
- Evans, D. T., Silvestri, G. Nonhuman primate models in AIDS research. Current Opinion in HIV and AIDS. 8 (4), 255-261 (2013).
- Taraseviciute, A., et al. Chimeric antigen receptor T cell-mediated neurotoxicity in nonhuman primates. Cancer Discovery. 8 (6), 750-763 (2018).
- McGary, C. S., et al. CTLA-4(+)PD-1(-) memory CD4(+) T cells critically contribute to viral persistence in antiretroviral therapy-suppressed, SIV-infected rhesus macaques. Immunity. 47 (4), 776-788 (2017).
- Beard, B. C., Adair, J. E., Trobridge, G. D., Kiem, H. P. High-throughput genomic mapping of vector integration sites in gene therapy studies. Methods in Molecular Biology. 1185, 321-344 (2014).
- Zonari, E., et al. Efficient ex vivo engineering and expansion of highly purified human hematopoietic stem and progenitor cell populations for gene therapy. Stem Cell Reports. 8 (4), 977-990 (2017).
- Doulatov, S., et al. Revised map of the human progenitor hierarchy shows the origin of macrophages and dendritic cells in early lymphoid development. Nature Immunology. 11 (7), 585-593 (2010).
- Fares, I., et al. Cord blood expansion. Pyrimidoindole derivatives are agonists of human hematopoietic stem cell self-renewal. Science. 345 (6203), 1509-1512 (2014).
- Gori, J. L., et al. Endothelial cells promote expansion of long-term engrafting marrow hematopoietic stem and progenitor cells in primates. Stem Cells Translational Medicine. 6 (3), 864-876 (2017).
- Peterson, C. W., et al. Long-term multilineage engraftment of autologous genome-edited hematopoietic stem cells in nonhuman primates. Blood. 127 (20), 2416-2426 (2016).
- Peterson, C. W., et al. Multilineage polyclonal engraftment of Cal-1 gene-modified cells and in vivo selection after SHIV infection in a nonhuman primate model of AIDS. Molecular Therapy. Methods & Clinical Development. 3, 16007 (2016).
- Thompson, A. A., et al. Gene therapy in patients with transfusion-dependent beta-thalassemia. The New England Journal of Medicine. 378 (16), 1479-1493 (2018).
- Eichler, F., et al. Hematopoietic stem-cell gene therapy for cerebral adrenoleukodystrophy. The New England Journal of Medicine. 377 (17), 1630-1638 (2017).
- Paul, B., et al. Efficient enrichment of gene-modified primary T cells via CCR5-targeted integration of mutant dihydrofolate reductase. Molecular Therapy. Methods & Clinical Development. 5 (9), 347-357 (2018).
- Levine, B. L., Miskin, J., Wonnacott, K. Global manufacturing of CAR T cell therapy. Molecular Therapy. Methods & Clinical Development. 4, 92-101 (2017).
- Masiuk, K. E., et al. Improving gene therapy efficiency through the enrichment of human hematopoietic stem cells. Molecular Therapy. 25 (9), 2163-2175 (2017).
- Trobridge, G. D., et al. Efficient transduction of pigtailed macaque hematopoietic repopulating cells with HIV-based lentiviral vectors. Blood. 111 (12), 5537-5543 (2008).
- Beard, B. C., et al. Efficient and stable MGMT-mediated selection of long-term repopulating stem cells in nonhuman primates. Journal of Clinical Investigation. 120 (7), 2345-2354 (2010).
- Horn, P. A., et al. Efficient lentiviral gene transfer to canine repopulating cells using an overnight transduction protocol. Blood. 103 (10), 3710-3716 (2004).
- Adair, J. E., et al. Semi-automated closed system manufacturing of lentivirus gene-modified haematopoietic stem cells for gene therapy. Nature Communications. 7, 13173 (2016).
- Kutner, R. H., Zhang, X. Y., Reiser, J. Production, concentration and titration of pseudotyped HIV-1-based lentiviral vectors. Nature Protocols. 4 (4), 495-505 (2009).
- Salmon, P., Trono, D. Production and titration of lentiviral vectors. Current Protocols in Human Genetics. 54 (1), (2007).
- Geraerts, M., Willems, S., Baekelandt, V., Debyser, Z., Gijsbers, R. Comparison of lentiviral vector titration methods. BMC Biotechnology. 6, 34 (2006).
- Kiem, H. P., et al. Improved gene transfer into baboon marrow repopulating cells using recombinant human fibronectin fragment CH-296 in combination with interleukin-6, stem cell factor, FLT-3 ligand, and megakaryocyte growth and development factor. Blood. 92 (6), 1878-1886 (1998).
- Morton, W. R., Knitter, G. H., Smith, P. M., Susor, T. G., Schmitt, K. Alternatives to chronic restraint of nonhuman primates. Journal of the American Veterinary Medical Association. 191 (10), 1282-1286 (1987).
- Noser, J. A., et al. Cyclosporine increases human immunodeficiency virus type 1 vector transduction of primary mouse cells. Journal of Virology. 80 (15), 7769-7774 (2006).
- Uchida, N., Hsieh, M. M., Washington, K. N., Tisdale, J. F. Efficient transduction of human hematopoietic repopulating cells with a chimeric HIV1-based vector including SIV capsid. Experimental Hematology. 41 (9), 779-788 (2013).
- Cornetta, K., Anderson, W. F. Protamine sulfate as an effective alternative to polybrene in retroviral-mediated gene-transfer: implications for human gene therapy. Journal of Virological Methods. 23 (2), 187-194 (1989).
- Goerner, M., et al. The use of granulocyte colony-stimulating factor during retroviral transduction on fibronectin fragment CH-296 enhances gene transfer into hematopoietic repopulating cells in dogs. Blood. 94 (7), 2287-2292 (1999).
- Dao, M. A., Hashino, K., Kato, I., Nolta, J. A. Adhesion to fibronectin maintains regenerative capacity during ex vivo culture and transduction of human hematopoietic stem and progenitor cells. Blood. 92 (12), 4612-4621 (1998).
- North, T. E., et al. Prostaglandin E2 regulates vertebrate haematopoietic stem cell homeostasis. Nature. 447 (7147), 1007-1011 (2007).
- Goessling, W., et al. Prostaglandin E2 enhances human cord blood stem cell xenotransplants and shows long-term safety in preclinical nonhuman primate transplant models. Cell Stem Cell. 8 (4), 445-458 (2011).
- Booth, C., Gaspar, H. B., Thrasher, A. J. Treating immunodeficiency through HSC gene therapy. Trends in Molecular Medicine. 22 (4), 317-327 (2016).
- Humbert, O., et al. Rapid immune reconstitution of SCID-X1 canines after G-CSF/AMD3100 mobilization and in vivo gene therapy. Blood Advances. 2 (9), 987-999 (2018).
