Summary
このプロトコルは、視覚化し、キャプチャ レーザーマイクロダイ死後人間小脳から新鮮凍結組織におけるプルキンエ細胞を分離する染色無料のアプローチを使用します。このプロトコルの目的は、RNA 配列のため質の高い RNA の十分な量を生成することです。
Abstract
レーザー キャプチャ レーザーマイクロダイ セクション (LCM) は、細胞診および/または表現型に関連する細胞または異種組織からの領域のコレクションでは、有利なツールです。さまざまな蛋白質のための分子方法でキャプチャされた製品を使用できます DNA または RNA の分離。しかし、死後の人間の脳組織からの RNA の保全は特に挑戦的です。LCM の標準的な可視化技術、組織学的またはさらに免疫組織化学的染色手順 RNA を低下します。したがって、LCM の死後ひと脳組織の RNA の整合性を維持する目的で可視化のためステンレスのプロトコルを設計しました。小脳のプルキンエ細胞は、ステンレスの可視化, その大きさと特徴的な場所のための良い候補です。小脳皮質には、細胞密度、高倍率顕微鏡を識別する良い原型を作るそれらの異なる個別の層があります。プルキンエ細胞は大型ニューロンの小型ニューロンの特性の密度の高い携帯電話ネットワークは、顆粒細胞の層と細胞体の中に疎である分子の層の間に位置しています。このアーキテクチャのためステンレスの可視化の使用は可能です。この表現型を模倣する他の臓器や細胞システムは、適当でしょう。ステンレスのプロトコルはエタノールで新鮮凍結組織を固定し、高倍率光学顕微鏡形態学的可視化改善のためキシレンと脂質を除去する設計されています。このプロトコルは、他の固定方法については考慮しませんし、uv (紫外線) を使用してキャプチャした新鮮凍結組織サンプルは専用-LCM システム。ここでは、断面および後続の RNA 配列の RNA の品質を維持しながら UV LCM のプルキンエ細胞から新鮮な冷凍死後ひと小脳組織との RNA の浄化を修正する完全なプロトコルを提案する.私たちの手でこのプロトコルは染色試薬を必要とせず細胞可視化の例外的なレベルを生成し、転写プロファイリング実験に必要な高い RNA 整合性数字 (≥8) で RNA が得られます。
Introduction
レーザー キャプチャ レーザーマイクロダイ セクション (LCM) は、その後分子駆動評価の病理組織学的に関連する細胞の分離を可能にする貴重な研究ツールです。これら異種組織標本の病理組織学的および臨床的データとの相関分子生物学的解析の使用は、生物学的研究1の並進運動の意義を評価する際に必要なステップです。RNA による遺伝子発現データを解析するとき凍結するティッシュ セクションの使用それは RNA の優れた品質のことができますようお勧めと同様数量2を最大化します。それが RNA シーケンス3から意味のあるデータに不可欠な高品質・ RNA 量も確立されています。ただし、最小公倍数の新鮮な冷凍事後組織からの RNA を使用している場合 RNA の劣化は大きな課題が、それが死亡時にすぐに発生してその程度は組織コレクション メソッド4,5 に関連するさまざまな要因によって仲介されます。.さらに、RNA の劣化が悪化する染色技術組織の詳細や細胞の識別を認識する必要がある場合。染色技術、ヘマトキシリン ・ エオシン、ニッスル染色などで専門的な蛍光抗体法および免疫組織化学周囲の間質から細胞の鑑別に有用が RNA を低下し、転写産物発現の変更が示されています。プロファイル6。したがって、当研究室では、死後人間の小脳のプルキンエ細胞の LCM 分離後の RNA シーケンスのため RNA を維持するために特別に設計されたステンレス プロトコルを作成しています。
LCM の新鮮凍結するティッシュを処理固定方法は必ず RNA と組織の両方の整合性を影響することができます。ホルマリン固定は形態学的保全のための標準が、架橋する原因かもしれない RNA のフラグメントし RNA 増幅7を妨げます。架橋1を誘発しない凝固定着剤として、エタノールの固定は RNA の隔離のためのより良い代替手段です。組織形態の可視化を高めるためには、キシレンは、最良の選択では、それは組織からの脂質を削除します。しかし、組織が乾燥し、レーザー キャプチャ7脆性の原因となる組織断片化になる、lcm、キシレンを利用する場合、制限知られています。キシレンはまた、揮発性の毒素と発煙のフードで正しく処理する必要があります。それにもかかわらず、キシレンは8RNA の整合性を維持しながら組織の可視化を高めるために示されています。したがって、我々 のプロトコルは 70% のエタノールの固定のエタノール脱水、キシレン潜伏形態の明快さのために続いて使用中心します。
彼らは、速度、精度、および RNA の品質が異なるに示されている異なったタイプのレーザー ベース レーザーマイクロダイ セクション システムに注意してくださいすることが重要です。赤外線 (IR) レーザーはレーザーマイクロダイ セクションと紫外線 (UV) レーザー マイクロビーム レーザーマイクロダイ セクション システムをキャプチャし、ほぼ同時に登場した8小説 LCM プラットフォームは両方でした。IR LCM システムは組織切片上に直接配置透明熱可塑性フィルムを使用して「コンタクト システム」を採用しています、興味のセル選択してフィルムに付着、集光によって IR レーザーから。また、UV LCM システムは「非接触システム」という集光レーザビームを切り取った細胞や組織興味の地域倒立か正立顕微鏡デザインのいずれかを使用して、2 つの現在利用可能な商用プラットフォームの構成に応じて組織が重力に逆らってカタパルト レーザー誘起圧力波による回収装置に取得または組織がそれぞれ、重力によって収集されます。UV LCM システムの重要な利点には、高速細胞捕捉、非接触アプローチと多く小さいレーザー ビーム直径9によるより正確な解剖汚染無料コレクションが含まれます。このプロトコルは、UV LCM システム用に設計されました、IR LCM システムでテストされていません。いずれかの UV LCM システム設計におけるコレクション キャップに蓄積細胞、観察の使用を高めるとき顕微鏡で細胞の明快さは適していません、セルはコレクション キャップに入ることになります。したがって、組織の可視化を高めるためには、我々 は液体充填コレクション キャップに対して UV LCM システムで可視の観察として設計されている不透明なコレクション キャップの使用をテストしました。液体蒸発され、顕微鏡で働いている間頻繁に交換する必要があります、液体充填コレクション キャップに挑戦することができます。時間には、キャプチャされた組織はすぐに7を溶解する RNA の安定性の重要な要因がようになります。
当研究室は、(ET) 本態性振戦患者の小脳・小脳の関連神経変性疾患の死後神経病理学的変化を研究します。我々 は仮定する私たちをリード ET ケースとプルキンエ細胞の数の減少などのコントロールを区別プルキンエ細胞を中心とした形態学的変化増加樹状回帰とさまざまな軸索の変化を示しているそのプルキンエ細胞の変性は、ET 病態10、11,12,13コアの生物学的機能です。転写プロファイルは細胞退行性変化の基になる分子基盤を探索する多くの神経疾患で使用されています。ただし、脳組織などの異種のサンプルから転写プロファイル効果的低豊富な転写産物の発現をマスクしたり、分子の変更の影響を受ける小集団でのみ発生するの検出を減少させる小脳皮質のプルキンエ細胞などの細胞。例えば、プルキンエ細胞が大幅に劣勢小脳皮質で豊富な顆粒細胞で約 1:3000;したがって、効果的にターゲットへのトランスクリプトームこれらのニューロンの特定の分離が必要です。小脳皮質は、細胞密度とセルのサイズが異なる別個の層で区切られます。この細胞アーキテクチャは、染色試薬の色素添加せず新鮮凍結組織サンプルの可視化に最適です。このプロトコルは、理論的には、同様の特徴的な組織を持つ他の組織型にも適用できる組織。
このプロトコルは、仕事人間死後の小脳プルキンエ細胞の可視化のために特別に設計されました。固定は、赤外線と紫外線の両方 - LCM の目的のための可視化と組織の多くの種類の RNA 保全を染色のため多数のプロトコルが存在します。UV LCM の実験的デザインを考えて、個人はニーズと開始と終了の材料の要件に合わせてプロトコルを調整すべき。ここでは、我々 はトランスクリプトームの高品質 RNA を準備する染色試薬を含む色素を必要とせず死後人間の小脳プルキンエ細胞を可視化するための拡張メソッドを提供するために別の LCM のプロトコルの多くの側面を組み合わせるシーケンス。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
このプロトコルで利用される人間のすべてのサンプルは、インフォームド コンセントを得られているし、コロンビア大学とイェール大学で内部審査委員会 (IRB) によって承認されています。
注:このプロトコルの全体取扱指針、厳密な RNA を従う必要があります常に手袋をはめた手が使用、RNase decontaminator ですべての面がきれいに、すべての作業資材、RNA ・ DNA/ヌクレアーゼ フリーという。
1. LCM の開始の前に組織の RNA の整合性をテストします。
注:RNA の品質をテストは、多くの方法で行うことができます。サンプルの代表的な RNA の整合性数 (鈴) を提供するために全体のセクションからの RNA がテストされていることを確認します。
- 実験的なデザインのパラメーター内に収まる包含のための組織サンプルを慎重に選択します。クリオスタットで切断手順 1.2 に移動します。そうでない場合は、組織を適切に処理し、ステップ 1.11 に移動します。
-
ドライアイスの 2 つのコンテナーを取得します。サイズはサンプルの数によって異なります。
- ドライアイスの最初のコンテナー、組織コードが空の場合、ラベル付きの 2 mL 管を配置します。
注:10 分を凍結する管です。管する必要がそれらに組織を配置する前にフリーズします。そうしないと、組織は、管表面に溶融されます。 - ドライアイスの第二の容器で RNA チェックを必要とする-80 ° C のフリーザーからティッシュを置きます。
- ドライアイスの最初のコンテナー、組織コードが空の場合、ラベル付きの 2 mL 管を配置します。
- クリオスタットをクリーンアップします。洗浄手順の詳細については、ステップ 4.7 を参照してください。
- ドライアイスから、組織を除去し、染 RNase かみそりの刃を持つ組織の小さなセクションをカットします。組織は、約 1 cm × 1 cm サイズをする必要があります。
- クライオスタット「チャック」に最適な切削温度 (10 月) の約 3 mm の高いマウンドの化合物を置き、部分的に凍結することができます。OCT の上にティッシュを入れ、10 月にプッシュしないで、単に上に残りの部分にそれを許可します。
- 10 月は硬く、一度クライオスタット切削アームとクライオスタット ブレードの前の位置にマウントされた組織とチャックを配置します。
- 組織までも 30 μ m のセクションでトリミングします。
- 組織と冷凍 2 mL 管の場所の 300 μ m をカットします。ドライアイスにチューブを配置します。
- 「チャック」から組織を取り外しドライアイスに離れて配置する準備ができるまで。
- すべての組織、手順 1.4-1.9.
- すべてのサンプルが完了したら、RNA 抽出キットを提供 (材料表#15) を使用して RNA を抽出します。詳しいプロトコルは、RNA 抽出キットで提供されます。コレクション チューブ膜と DNase 消化 (材料表#16) にオプションのステップを乾燥する省略可能な手順を含めたすべての命令に従ってください。
- 品質評価バイオアナライザー14を介して抽出した RNA の整合性をテストします。
2. LCM をセクショニングを開始する前に準備します。
-
LCM のティッシュの各ラウンドの前にスライド ホルダーをきれいに。一晩乾燥完了を許可する使用する前に一日掃除の手順を実行します。
注:スライド ホルダーはエタノールでティッシュ セクションの固定およびキシレンの清算用します。- スライド ホルダー洗浄手順: RNase decontaminator ジエチル pyrocarbonate 処理 (DEPC) 水の順ですすいでください。任意のほこりや他の空輸の汚染の回避の RNA、DNA、ヌクレアーゼ自由表面に逆さま一晩乾燥させてください。
注意:DEPC は非常に有毒と処理および EH & S の有害化学物質の標準的なプロトコルを使用して破棄する必要があります。
- スライド ホルダー洗浄手順: RNase decontaminator ジエチル pyrocarbonate 処理 (DEPC) 水の順ですすいでください。任意のほこりや他の空輸の汚染の回避の RNA、DNA、ヌクレアーゼ自由表面に逆さま一晩乾燥させてください。
- きれいな RNase と断面のブラシは decontaminator し、一晩乾燥することができます。任意のほこりや他の汚染物質を避けてください。
- 膜の場所は、室温で 30 分間の紫外線の下でスライドします。さらさないで uv スライドよりも 1-2 日前までに使用をしないでください。これは膜のスライドに組織の結合を向上します。
注:ステップ 2.3 は、スライドの組織断面 (参照手順 4.4) と同じ日に発生する紫外線治療を可能にするステップ 4 と組み合わせることができます。
3. RNase 自由水と高品質のエタノール固定ソリューションを準備します。
注:すべてのソリューションは、すべての実験、新鮮な調理されます。スライド ホルダーの洗浄手順 1.1 から手順が完了したことを確認します。すべてのソリューションは、スライド ホルダーで用意しています。
- 1 つのスライド ホルダーに 100% エタノール 30 mL を配置します。
- RNase、DNase、ヌクレアーゼ フリー水とエタノールで希釈します。1 つの 95% のエタノールの場所 30 mL ホルダーをスライドさせて、氷の上に置きます。
- RNase、DNase、ヌクレアーゼ フリー水とエタノールで希釈します。70% エタノールで 1 つの場所 30 mL ホルダーをスライドさせて、氷の上に置きます。
- 2 つの 100% キシレンの場所 30 mL はスライド ホルダーを分離し、#1 と 2 としてラベルを付けます。
4. ティッシュ用クライオスタットを準備します。
- エタノール溶液および組織のドライアイスとコンテナーの氷のバケツを取得します。
注意:ドライアイスは非常に寒い、ので保護手袋を使用します。同じコンテナーには、氷やドライアイスを置かないでください。氷とドライアイスの異なる温度は中間温度で一緒に形成する原因になります。 - クリオスタットに-80 ° C のフリーザーや輸送用ドライアイスの場所から組織を削除します。
-
クライオスタットの設定:
- 14 μ m の切片厚を設定します。
- 30 μ m 組織量を維持するためにトリムの厚みを設定します。
- デュアルチャンバーと試験片の温度を保持しているクリオスタット、チャンバー内温度 (CT) を-18 ° C に設定します。クリオスタット 1 つの設定で、-17 ° c. に温度を設定します。
- デュアルチャンバーと試料保持温度クリオスタット、設定オブジェクトの温度 (OT)-16 ° c.
注:OT も切断できるように CT よりも暖かくする必要があります。組織はまだシュレッダー、OT は-15 ° C に増加することができます。、CT は-18 ° C を増やすことができます。
- 最適な温度に来るようにすること、少なくとも 20 分用クライオスタットに組織を配置します。
注:組織が最適な温度でない場合、切削時に細断処理されます。組織に置かないで-20 ° C 夜の前に RNA の整合性を維持するために、氷結晶の形成を防ぐために。できる限り組織にスムーズにカットに最適な温度平衡に必要な時間します。紫外線下でインキュベーションをスライドのオプションの実装は、(手順 1.3 参照) ここで発生します。 - クリオスタットの温度に降りてくるように、少なくとも 20 分用クライオスタットの「チャック」を配置します。
- クリオスタットの温度に降りてくるように、少なくとも 20 分用クライオスタットにクリーンなブラシを配置します。
-
クリオスタットをきれい
- ステージ上の凍結を防ぐために RNA、DNA、ヌクレアーゼ フリー水で希釈した RNase の decontaminator と 70% のエタノールの 1:1 混合物とステージをクリーンアップします。
- ステージに RNase decontaminator とブレード ホルダーの場所新しい使い捨てクライオスタット ブレードをきれい。クリオスタットの温度に来てクライオスタット ブレードの少なくとも 20 分を許可します。
- きれいに RNase decontaminator とアンチロール プレート、ステージに取り付けます。クリオスタットの温度に来てアンチロール プレートの少なくとも 20 分を許可します。
注:アンチロール プレート切削には必要ありませんが、強くお勧めします。アンチロール プレートが利用できない場合、洗浄ブラシは代替として動作します。アンチロール プレートが適切な温度でない場合、組織は溶けるか、切削の際に固執します。
5. 断面組織
- 断面の組織 (~ 1 cm × 1 cm) の小さな部分をカットします。残りのティッシュをドライアイス/80 ° C のフリーザーに戻ります。
注:ティッシュ セクションで 〜 95% 小脳プルキンエ細胞があることを確認します。 - 「チャック」をカバーする 10 月の約 3 mm の高い小山を配置します。まず小さなマウンドがあるまで、ゆっくりと、円形の動きで上にレイヤーを構築します。
- 10 月は部分的に凍結されているが、中心部のいくつかの液体はまだ、10 月の上にティッシュを置きます。10 月許可 10 月まで完全に凍結の上に坐る組織に組織を深く押さないでください。1-2 分かかります。
- クライオスタット切削アームに冷凍 10 月を「チャック」と組織を配置します。組織を調整刃の端が揃うようにします。
- 新しい温度に調整する 15-20 分間切削アームで座っている組織を許可します。
注:組織の厚さに応じて温度順応時間が必要です。座っている限り、きれいにカットするために必要な組織を許可します。OT と CT 組織温度馴化に支援するために調整します。 - ブレードに近い組織をゆっくりと移動します。組織に達するとブレード、トリムのプロセスを開始します。トリムの厚みは 30 μ m に設定する必要があります。
- 皮質層が表示されるまでに 2-3 x をトリムします。
- 置き、クライオスタット刃の真上アンチロール プレートを配置します。
注:銀線は、ブレードとアンチロール プレートの界面クライオスタットで光から表示されます。アンチロール プレートがブレードのエッジの上を示します。 - 開始 14 μ m の部分をカットします。正しくカット セクションは、アンチロール プレート下平らになります。
注:組織が詰まっている場合は、アンチロール プレートが十分に寒いことを確認します。急速に (側舞台に触れていない) が外側に氷のドライの作品を配置する必要場合は、アンチロール プレートを冷やします。 - 4-6 節を切り取ってクライオスタット ステージ間で水平方向に揃えること。
- 同時に、組織のすべての部分を拾うスライドを釣りします。
注:ブラシを使用すると、ピックアップ時にスライドより容易に利用できるように組織の両端を持ち上げます。一度に 1 つのセクションを持ち上げないでください。室温の空気への暴露は、RNA の整合性が低下します。
注意:クリオスタットのステージに触れる膜をてはいけないです。ステージを膜に接触した場合は、スライド ガラスからデタッチするが開始され、LCM をしようとしたときにエラーが発生します。 - すぐにステップ 6 に移動します。固定を遅延しないでください。
6. 組織/汚れのない可視化を修正
- すぐにエタノール固定プロトコルに移動します。
- 2 分の 70% エタノールでスライド ホルダーにスライドを配置-氷の上。
- 45 の 95% エタノールでスライド ホルダーにスライドを配置 s-氷の上。
- 2 分間 100% エタノールでスライド ホルダーにスライドを配置-室温
- キシレン 1 でスライド ホルダーに 3 回スライドを浸し、室温
- 5 分の 2 キシレンでスライド ホルダーにスライドを配置-室温
- 少なくとも 30 分より長い乾燥時間は 60 分まで、最適な清潔に乾燥できるようにします。
注意:ヒューム フードの乾燥にスライドに します。キシレンが揮発性です。産卵スライド フラットが暗くなる組織は、組織のセクションでプールにキシレンを発生します。
7. オプション-スライドの記憶
- 7 日前までの個々 の 50 mL の管 (チューブあたり 1 つのスライド) と-80 ° C のフリーザーの場所で乾燥したスライドを配置します。
注:スライドは-80 ° C のフリーザーに配置する前に乾燥する必要があります。微粒子が組織と膜に埋め込むチューブ内の乾燥剤は使用しないでください。チューブ キャップを確実にタイトです。ない場合は、使用するため解凍時スライドで結露が発生します。
注意:RNA の整合性は 7 日後減少するように組織の可視化の品質。
8. 融解用スライドを保存
- -80 ° C のフリーザー使用目的の前に 1 h から単一のスライド管を削除します。
- チューブすぐに開かない。部屋の温度に来るチューブを許可します。だけのチューブの外側に結露が発生します。
- 管、室温に来るし、すべての結露がなくなっている (約 30-40 分) はキャップをはずし、常温空気にスライドを公開します。
- 15-20 分キャップとチューブ内スライドが削除されたまま部屋の温度に順応するためにスライドを許可します。
注:スライドは、LCM の準備が整いました。
9. レーザー キャプチャはプルキンエ細胞のレーザーマイクロダイ セクション:
注:プロトコルのこのセクションはのみ後続の RNA シーケンスのプルキンエ細胞をキャプチャに関連する詳細を説明します。このセクションでは、ユーザーが UV レーザー キャプチャ顕微鏡および関連ソフトウェアに精通していることを前提としています。
- きれいな顕微鏡ステージとキャップ コレクション RNase decontaminator との腕します。
- 手袋をはめた手でコレクション腕に顕微鏡のスライドと 500 μ L 不透明キャップを置きます。
注:常に RNase decontaminator で作業領域を洗浄により適切な RNA 技術を確保し、スライドまたは不透明なキャップに触れる中で、手袋をはめた手を使用します。手袋は、スライドとキャップは、場所とレーザーのキャプチャを開始した後に削除できます。 - 低倍率でキャップが目の部分で視覚化される全体の区域をカバーすることを確認して、小脳組織に不透明なキャップを合わせます。
注:顕微鏡の目の部分だけがかどうか不透明キャップは中央に表示されます。キャップは組織の中央にかどうか、このカメラは表示されません。レーザー キャプチャ範囲の設計によって不透明なキャップを可視化にある目の部分のみまたはアイピースとカメラの両方で可視化しました。 - 5 倍 - 10 倍の対物レンズと小脳のレイヤーを視覚化して、分子層と顆粒細胞層 (プルキンエ細胞層) が交差する部分にカーソルを配置します。
- 40 X に移動し、プルキンエ細胞を可視化します。
注:ビジュアル化の例では、図 1と図 2を参照してください。 - プルキンエ細胞のキャプチャを開始します。
注:少なくとも 5 RNA 塩基配列解読を実行する RNA の ng が必要。約 1600-2000年プルキンエ細胞の配列のため十分な RNA の材料の結果します。RNA は顕微鏡で 8 h までの安定になります。UV エネルギーとコレクション レベルが正しいことを確認する前に UV フォーカスをテストします。時間をかけて、ティッシュが乾く続けます、紫外線のエネルギーと UV のフォーカスを変更する必要があります。
10. RNA コレクション ポスト LCM
-
セル換散バッファーを準備 (たび新鮮な準備)
- 2-メルカプトエタノールで 1: 100 の換散バッファーで希釈 (10 μL:1 mL、それぞれ)。(RLT) 換散バッファーは、材料表(#14 や 15) で提供されます。
- 不透明なキャップ、キャップ上向きにセル換散バッファーの 50 μ L を追加します。慎重にチューブをキャップを閉じます。
- 逆さまに 1 分の管を残します。
- 渦 30 管の管の底に換散バッファーをすぐにスピン。
- チューブを再度開き、10.2-10.4 の手順を繰り返します。
- すべてのサンプルが完成し、RNA の抽出 (材料表#14) の準備ができてまで、-80 ° C のフリーザーからの RNA そして換散バッファーの 100 μ L を含む管を配置します。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
このプロトコルは、UV LCM の新鮮な冷凍死後人間の脳組織を準備するための手順を説明します。徹底した仕様と注釈は、精度の高い、新鮮な冷凍脳組織をカットすることは困難することができますクライオスタット切断するため与えられています。考慮すべき最も重要な点は新鮮凍結するティッシュが非常に寒いし、かなりのクライオスタットの暖かい温度に順応するまで時間が必要です。この手順を急がせることができない、どのようにセントラルこの手順は、このプロトコルの成否で誇張できません。組織は、クリオスタットでは適切に準備されませんが、細胞または関心領域を識別するのすべてのそれに続く試みは不可能ではない場合、非常に困難になります。
クライオスタット切片と割り当てられた乾燥時間、組織が LCM の準備ができて。顕微鏡下で組織を視覚化するとき小脳の細胞の層は 5 倍と 10 倍の対物レンズで簡単に表示されます。キシレン (図 1B) のエタノールの固定の後で孵化する組織の代表的なイメージはエタノールの唯一 (図 1A) および組織の固定図 1を示しています。我々 は、様々 なエタノールとキシレン インキュベーション時間を厳格にテスト/両方の温度を修正し、組織を可視化します。組織が十分な長さ、キシレン培養されていない場合、図 1A図 1Bではなく結果のイメージより密接にようになります。暗くなりより良い組織を形づくる細胞層よりキシレン潜伏原因はエタノールだけで。レーザー キャプチャ顕微鏡で切断、40 X 対物レンズがプルキンエ細胞と周囲の組織ではないだけをキャプチャできるようにです。キシレンのインキュベーションは、形態学的画像 (図 1D) エタノールの固定だけで (図 1C) と比較して、高品質を生成します。
私たちの組織の可視化をさらに高めるためには、我々 は不透明なキャップの coverslip 能力をテストしました。その他 UV LCM のプロトコルは、連絡先の組織を溶解する 200-500 μ L 管の液体充填キャップを利用します。液体充填キャップは、組織の可視化、粒状と顕微鏡 (図 2A) 虹色結果のイメージの原因を減らすことができます。組織は柔らかく、フォームでシャープな滑らか組織外観で不透明なキャップ (図 2B) 結果を可視化。特に、不透明キャップ コレクション最大 8 h の交換を必要とせずことができます。低消費電力 (図 2C) と高出力 (図 2D、 E) で切除のプルキンエ細胞の代表的なイメージは、プルキンエ細胞体だけの正確な除去を表示します。参考のため図 2Fに示しますルクソール高速青ヘマトキシリンとエオシン (LH & E) ステンド小脳皮質、小脳の異なる層と分子プルキンエ細胞の配置を具体的にハイライト/層と顆粒細胞層の並置。
このプロトコルの目的は、後続の RNA シーケンスの高品質 RNA を得るためです。六つの異なる事後人間の脳サンプルを経た各 1500-2000 細胞 RNA の抽出のために収集する LCM の 3 日間で私たちのプロトコルをテストしました。顕微鏡で約 6-8 時間は、RNA の抽出の前に前の日 LCM 製品と結合された、500-700 細胞を作り出した。サンプルは、RNA の抽出を受けたし、あった RNAse フリー水 (材料表#14) の 14 μ L で再停止されます。すべての六つのサンプル生産高品質 RNA、RNA の整合性 (厘) の数字 ≥8 で (図 3A ~ F)。この手順により RNA 量 11.5 ng (図 3A)、8.3 ng (図 3B) 13.6 ng (図 3C) 11.5 ng (図 3D) 14.9 ng (図 3E) と 26.9ng (図 3F)。ノートの死後脳のすべてのサンプルが LCM (表 1) の前に RNA の品質のためにテストされたことです。元のサンプルに RNA の劣化がある場合 LCM はさらにその整合性を低下します。
図 1: 小脳層・ プルキンエ細胞可視化キシレン処理します。代表的な画像キシレンとエタノールの固定、脱水。(ML) 分子層と顆粒細胞層 (GCL) が付きます。プルキンエ細胞は矢印が付いています。(A) 5 X キシレンなし小脳層可視化の表現。スケール バー: 10 μ m. (B) 5 X キシレンと小脳層可視化の表現。スケール バー: 10 μ m. (C) 40 X の表現なしキシレン小脳層可視化。スケール バー: 1 μ m。 (D) 40 X はキシレンと小脳層可視化の表現。スケール バー: 1 μ m.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: プルキンエ細胞の可視化前に、と後 LCM 。キシレンと 40 X で代表的な画像のエタノールの固定、脱水。ML と GCL のラベルです。プルキンエ細胞は矢印が付いています。 (A) 液体の下で顕微鏡で視覚化いっぱい 40 x キャップ。スケール バー: 1 μ m。 40 X キャップ (B) 不透明] コレクションの下顕微鏡で視覚化。スケール バー: 1 μ m. (C) X 5 ML と GCL の摘出のプルキンエ細胞を示す小脳皮質の可視化。スケール バー: 10 μ m (D) 40 X 描出のプルキンエ細胞切除の前に。スケール バー: 1 μ m (E) 40 X 描出の成功したプルキンエ細胞キャプチャ。スケール バー: 1 μ m. (F) 20 X 代表 LH & E 染色マークの矢印と小脳示すプルキンエ細胞体。スケール バー: 5 μ m.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3: RNA 品質管理バイオアナライザー LCM 結果サンプル. パネルA ~ Fは、代表的な RNA 品質管理情報を表示します。各パネルは、同じ LCM 固定とエタノールとキシレンのみ可視化過程を受けた別のサンプルです。RNA の整合性番号 (厘) がすべて > 8.0。5 以上の収率で代表的な濃度結果の総 RNA の ng。すべてのサンプルは、RNAse フリー水の 14 μ L に溶出しました。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
| サンプル | 鈴 - セクションの準備 | 鈴 - LCM | [RNA] - LCM | PMI-冷凍 |
| A | 9.2 | 8.6 | 822 pg/μ l | 450 分 |
| B | 9.8 | 8 | 598 pg/μ l | 550 分 |
| C | 9.1 | 8.5 | 976 pg/μ l | 455 分 |
| D | 9.8 | 8.2 | 823 pg/μ l | 463 分 |
| E | 9.8 | 9.1 | 1069 pg/μ l | 1139 分 |
| F | 9.6 | 8.3 | 1923 pg/μ l | 1080 分 |
表 1:RNA の整合性の概要. サンプル番号は、図 3に示されたバイオアナライザー結果に対応します。セクションの準備、LCM、質の良いが組織を開始ことを確認する前に実行されます。示されているポスト mortem 間隔と同様、セクションの準備、LCM 厘、LCM からの RNA の濃度から元組織厘ため凍結されます (PMI 冷凍) 組織。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ここで提示されたプロトコルは特に UV LCM の形態的に異なる組織の可視化にステンレスのアプローチに変更されます。このメソッドは、組織の可視化の強化されたレベルを維持しながら、その後直接 RNA 配列の RNA の整合性を最大化するために設計されています。ヒト組織の15の異なる分子プロファイルを理解するためのキャプチャ、可能であれば、セルの純粋な人口を作成する異なったセルタイプを区別する能力が欠かせません。このプロトコルのコンテキスト内で組織の選択が最優先、抗原の使用としてまたは染料特定試薬は使用されません、したがってこのような分化を必要とする研究に適したはありません。これは、このプロトコルの制限は、結果組織の可視化と RNA 整合性はかなり優れているし、他の実験的デザインの関連性を維持します。また利用する代替染色法具体的の UV ・ IR-LCM 維持する RNA を意図して他の多くのプロトコルが存在します。しかし、他のほとんどのメソッドの少なくとも 1 つ汚すか、または抗原特定試薬6,16,17を含む、1 つ細胞や臓器のタイプ (人体病理剖検組織ではない) ように設計されています18,19、 20、21の整合性を高めるために特殊な RNA シーケンス キットを必要とするか。クレシル バイオレット (ニッスル) 染色と汚れの脳における神経細胞の核 RNA 分解6の最低限に抑え、多くのプロトコルで使用される試薬を含む人気のある色素です。ただし、プルキンエ細胞の大きい核がクレシル バイオレット、プルキンエ細胞を可視化するための重要な利点を提供しても汚れていません。重要なは、小脳の変性及び発達障害の研究にかなり関心のあるプルキンエ細胞のコレクションを示す文献で 1 つだけの LCM 研究がわかりました。本研究はクレシル バイオレットと凍結するティッシュを染色し、IR LCM システムとプルキンエ細胞を分離厘 5 使用しますが、マイクロ アレイ解析22許容として低をサンプルします。したがって、これは UV LCM によって摘出した死後人間の小脳プルキンエ細胞から高品質の RNA のために特別に設計されている最初のプロトコル研究です。
細胞内 RNA 分子は、かなり自然減衰の死の後、事後ヒト組織における RNA の安定性はよく知られている障害です。具体的には、mRNA は修飾アミノ酸分解5に最も敏感であるために示されています。死後間隔 (PMI) の監視 (PMI 冷凍) を凍結する時間は、いくつか研究23,24,25に RNA の劣化に何らかの相関関係を示す 1 つの指標です。ただし、表 1に示す図 3PMI 値と RNA の品質の相対的な関係がないことを示します六つのサンプルの私達の PMI 冷凍の間隔を示します。したがって、それは実行に必要なデューデリジェンス レーザー キャプチャ プロジェクトを開始する前に RNA の整合性をチェックします。開始のサンプルの RNA の整合性は、低品質は、LCM 製品から生じる RNA はさらに低品質のなります。RNA 整合性の低いを回避できない場合、向上させる RNA の配列のための他の方法はこのプロトコル21に加えて採用でした。特に、低入力または劣化した RNA はミュートの複雑さと追加の増幅の手順を必要とする多くの場合最適ではない結果につながることができます。26,27をシーケンス処理時に読み取り複製を作成し同様に同様に、シーケンスを増幅する PCR 増幅サイクルの追加を示されています。したがって、配列のための LCM のサンプルから高品質 RNA の利用は非常に有利です。
大きくこのプロトコルで採用されている可視化手法は、ユーザーに依存している新鮮なカットするときは専門知識のクライオスタットの組織を冷凍します。プロトコルは最高区分のため、組織の準備、スライドに組織を配置する方法に広範な詳細に入る。これらは、間違いなくこのプロトコルの 2 つの最も重要な手順です。ティッシュないクライオスタット温度に順応され、破砕場合は、組織の形態学的品質が著しく妨げ。シュレッダーはいくつかの潜在的な問題の結果トラブルシューティング可能性は、温度に来て組織を長く待っているまたは暖かい範囲にクライオスタット OT や CT を変更することを含んでいます。組織が正常にカットし、ステージに配置、組織を方向づけることが重要です、すべての組織のためスライドは膜内に収まるし、正確にステージからピックアップすることができます。クライオスタット段階から組織を拾うしようとすると、組織は冷たい、する必要があります、スライドは暖かいはずです。代わりとなる議定書存在組織を拾う前にスライドを寒さにお勧めします、組織配置28のエリアの上を指で温めてただし、私たちの手で任意の利点を提供しない、組織や過剰な組織のひだを拾うの難しさが生じる。室温でのスライド、ティッシュはスライドが付いている接触にすぐに溶けます。きれいなピックアップするように、膜領域における組織と接触しながらステージ自体に触れないようにこれまでのところいかないスライドの角度に必要です。膜は、膜を損傷するステージにふれたし、なりますレーザー キャプチャ難しい場合スライド ガラスからデタッチする開始されます。これが発生した場合に顕著になります一度 LCM が開始され、元に戻すことはできません。トラブルシューティングのオプションが制限されます。いつでも膜またはスライドが侵害されていると考えられる場合、破棄することをお勧めします。練習新鮮凍結組織切片プロジェクトを開始または高品質のティッシュを作り出すことができる病理学のコアを使用する前にすることをお勧めします。ただし、コア サービスを使用している場合は、適切な RNA 技術 RNase の混入を防ぐために後が続くことを確認します。RNA の劣化が発生するは、不適切な手法を使用する場合容易にことができます。
我々 は、UV LCM の目的のため死後の人間の小脳プルキンエ細胞のステンレスの可視化のための完全なメソッドを紹介が。RNA の整合性の高いレベルを確保する適切な RNA 保存方法および技術をご用意しております。このプロトコルは必ずしも任意の 1 つのセルに固有ではないまたは組織型が、関心の領域/セルは色素または抗原の特定の認識を必要とせず周囲の間質からと形態的要件を維持します。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
著者は切削しこれらの実験用冷凍人間の脳組織サンプルの博士ジャン ・ ポール Vonsattel と博士エッティ コルテス、ニューヨーク脳バンクを認めると思います。著者は、本態性振戦に継続的な研究のための彼らの脳を気前よく寄付した個人を認めたいと思います。ファウスト博士と博士 Martuscello の継続的な支援とコア研究領域コロンビア大学病理・細胞生物学を認識したいと思います。著者は NIH R01 NS088257 ルイ/ファウストを認識したい) 研究は、このプロジェクトの資金調達のため。LCM 画像を共焦点で行ったし、コロンビア大学、NIH 支えのハーバート ・ アーヴィング総合がんセンターの専門顕微鏡共有リソースを付与 #P30 CA013696 (国立癌研究所)。著者らは、特殊な顕微鏡を用いた彼らの継続的な支援のテレサ Swayne とローラ Munteanu を認めるみたいと思います。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MembraneSlide NF 1.0 PEN | Zeiss | 415190-9081-000 | Membrane slides for tissue. We do not recommend using glass slides. |
| AdhesiveCap 500 Opaque | Zeiss | 415190-9201-000 | Opaque caps are used to enhance visualization on inverted scopes only |
| RNase Away | Molecular BioProducts | 7005-11 | Other RNase decontamination products are also suitable. Use to clean all surfaces prior to work. |
| 200 Proof Ethanol | Decon Laboratories | 2701 | If using alternative Ethanol, ensure high quality. Essential for tissue fixation. |
| Xylenes (Certified ACS) | Fisher Scientific | X5P-1GAL | If using alternative xylene, ensure high quality. Essential for tissue visualization. |
| UltraPure Distilled Water | Invitrogen | 10977-015 | Other RNA/DNA/Nuclease free water also suitable. Utilized in ethanol dilution only. |
| Slide-Fix Slide Jars | Evergreen | 240-5440-G8K | Any slide holder/jar is also suitable. Must be cleaned prior to use. Used for fixation following sectioning. |
| Anti-Roll Plate, Assy. 70 mm 100 μm | Leica Biosystems | 14041933980 | Anti-roll plate type is determined by type of cryostat and attachment location on stage. All cryostats have differing requirements. |
| Diethyl pyrocarbonate (DEPC) | Sigma Aldrich | D5758-50mL | DEPC from any vendor will do. Follow directions for water treatment. |
| Kimwipes | Fisher Scientific | 06-666A | Kimwipes can be ordered from any vendor and used at any size. Kimwipes are to be used to clean microscope and cryostat. |
| Tissue-Plus O.C.T. Compound | Fisher Scientific | 23-730-571 | Any brand of OCT is acceptable. No tissue will be embedded in the OCT, it is strickly to attach tissue to 'chuck'. |
| Edge-Rite Low-Profile Microtome Blades | Thermo Scientific | 4280L | Blade type is determined by type of cryostat. All cryostats have differing requirements. |
| Leica Microsystems 3P 25 + 30MM CRYOSTAT CHUCKS | Fisher Scientific | NC0558768 | Chuck type is determined by type of cryostat. All cryostats have different requirements. Either size is suitable. |
| RNeasy Micro Kit (50) | Qiagen | 74004 | Required for RNA extraction post LCM. RLT Lysis buffer essential to gather captured cells from opaque cap. |
| RNeasy Mini Kit (50) | Qiagen | 74104 | Required for RNA extraction of section preps, which are performed prior to LCM to test RNA integrity of starting tissues. |
| RNase-Free DNase Set | Qiagen | 79254 | Dnase will remove any DNA to allow for a pure RNA population. Ensure Dnase is made fresh. |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma Aldrich | M6250-100ML | Purchased volume at user discretion. Necessary for addition to RLT buffer for cell lysis. Prevents RNase activity. |
| Globe Scientific Lot Certified Graduated Microcentrifuge Tube (2 mL) | Fisher Scientific | 22-010-092 | Any 2 mL tube that is RNase free, DNase free, human DNA free, and Pyrogen free will do. |
References
- Liu, H., et al. Laser capture microdissection for the investigative pathologist. Veterinary Pathology. 51 (1), 257-269 (2014).
- Datta, S., et al. Laser capture microdissection: Big data from small samples. Histology and Histopathology. 30 (11), 1255-1269 (2015).
- Romero, I. G., Pai, A. A., Tung, J., Gilad, Y. RNA-seq: impact of RNA degradation on transcript quantification. BMC Biology. 12 (42), 1-13 (2014).
- Bevilacqua, C., Ducos, B. Laser microdissection: A powerful tool for genomics at cell level. Molecular Aspects Medicine. 59, 5-27 (2018).
- Sidova, M., Tomankova, S., Abaffy, P., Kubista, M., Sindelka, R. Effects of post-mortem and physical degradation on RNA integrity and quality. Biomolecular Detection and Quantification. 5, 3-9 (2015).
- Wang, H., et al. Histological staining methods preparatory to laser capture microdissection significantly affect the integrity of the cellular RNA. BMC Genomics. 7, 97 (2006).
- Mahalingam, M. Laser Capture Microdissection: Methods and Protocols. Murray, G. I. , Springer. (2018).
- Vandewoestyne, M., et al. Laser capture microdissection: should an ultraviolet or infrared laser be used. Analytical Biochemistry. 439 (2), 88-98 (2013).
- Graeme, M. I. Laser Capture Microdissection. Third edn. , Humana Press. (2018).
- Louis, E. D. Re-thinking the biology of essential tremor: From models to morphology. Parkinsonism & Related Disorders. 20, 88-93 (2014).
- Choe, M., et al. Purkinje cell loss in essential tremor: Random sampling quantification and nearest neighbor analysis. Movement Disorders. 31 (3), 393-401 (2016).
- Louis, E. D., et al. Neuropathological changes in essential tremor: 33 cases compared with 21 controls. Brain. , Pt 12 3297-3307 (2007).
- Louis, E. D., et al.
- Schroeder, A., et al. The RIN: an RNA integrity number for assigning integrity values to RNA measurements. BMC Molecular Biology. 7, 3 (2006).
- Jensen, E.
- Waller, R., et al. Isolation of enriched glial populations from post-mortem human CNS material by immuno-laser capture microdissection. Journal of Neuroscience Methods. 208 (2), 108-113 (2012).
- Lee, S., et al. Laser-capture microdissection and transcriptional profiling of the dorsomedial nucleus of the hypothalamus. Journal of Comparative Neurology. 520 (16), 3617-3632 (2012).
- Cummings, M., et al. A robust RNA integrity-preserving staining protocol for laser capture microdissection of endometrial cancer tissue. Analytical Biochemistry. 416 (1), 123-125 (2011).
- Sonne, S. B., et al. Optimizing staining protocols for laser microdissection of specific cell types from the testis including carcinoma in situ. PLoS One. 4 (5), 5536 (2009).
- Butler, A. E., et al. Recovery of high-quality RNA from laser capture microdissected human and rodent pancreas. Journal of Histotechnology. 39 (2), 59-65 (2016).
- Schuierer, S., et al. A comprehensive assessment of RNA-seq protocols for degraded and low-quantity samples. BMC Genomics. 18 (1), 442 (2017).
- Kumar, A., et al. Age-associated changes in gene expression in human brain and isolated neurons. Neurobiology of Aging. 34 (4), 1199-1209 (2013).
- Sampaio-Silva, F., Magalhaes, T., Carvalho, F., Dinis-Oliveira, R. J., Silvestre, R. Profiling of RNA degradation for estimation of post mortem [corrected] interval. PLoS One. 8 (2), 56507 (2013).
- Walker, D. G., et al. Characterization of RNA isolated from eighteen different human tissues: results from a rapid human autopsy program. Cell Tissue Bank. 17 (3), 361-375 (2016).
- Birdsill, A. C., Walker, D. G., Lue, L., Sue, L. I., Beach, T. G. Postmortem interval effect on RNA and gene expression in human brain tissue. Cell Tissue Bank. 12 (4), 311-318 (2011).
- Adiconis, X., et al. Comparative analysis of RNA sequencing methods for degraded or low-input samples. Nature Methods. 10 (7), 623-629 (2013).
- Parekh, S., Ziegenhain, C., Vieth, B., Enard, W., Hellmann, I. The impact of amplification on differential expression analyses by RNA-seq. Scientific Reports. 6, 25533 (2016).
- Carl Zeiss Microscopy. , Carl Zeiss. Germany. (2012).
