Yüksek kaliteli lazer RNA izolasyonu için paslanmaz bir protokol yakalama insan öldükten sonra beyincik Microdissected Purkinje hücreleri

Summary

Bu iletişim kuralı bir leke içermeyen yaklaşım görselleştirmek ve insan öldükten sonra beyincik lazer yakalama mikrodiseksiyon üzerinden taze donmuş dokudan Purkinje hücreleri izole etmek için kullanır. Bu iletişim kuralının amacını RNA-sıralama için yeterli miktarda yüksek kaliteli RNA üretmektir.

Abstract

Lazer yakalama mikrodiseksiyon (LCM) ve cytologically/veya phenotypically ilgili hücreleri veya hànzú doku bölgelerden topluluğu için sağlayan avantajlı bir araçtır. Yakalanan ürün-ebilmek var olmak kullanılmış içinde çeşitli protein, moleküler Yöntemler DNA veya RNA izolasyon. Ancak, ölüm sonrası insan beyin dokusundan RNA'ın koruma özellikle meydan okuyor. LCM için standart görselleştirme teknikleri histolojik gerektirmez veya RNA immunohistokimyasal boyama işlemleri daha da fazla bozulmasına yol açar. Bu nedenle, biz paslanmaz bir protokol RNA bütünlük öldükten sonra insan beyin dokusu içinde korunması amacı ile LCM içinde görüntüleme için tasarlanmıştır. Beyincik Purkinje hücre boyutu ve karakteristik konumu nedeniyle paslanmaz görselleştirme için iyi bir adaydır. Serebellar korteksin hücre yoğunluğu, yapım onları yüksek büyütme mikroskobu altında tanımlamak için iyi bir güzel örneği farklı farklı katmanları vardır. Purkinje hücreleri küçük nöronlar yoğun hücresel ağdır, granül hücre katmanı ve hücre gövdelerinde seyrek moleküler katmanı arasında yer alan büyük nöronlar vardır. Bu mimarisi nedeniyle, paslanmaz görselleştirme kullanımı mümkün olduğunu. Bu fenotip taklit diğer organ veya hücre sistemleri de uygun olacaktır. Paslanmaz Protokolü taze donmuş doku etanol ile düzeltmek ve lipidler yüksek büyütme ışık mikroskobu altında geliştirilmiş morfolojik görselleştirme için ksilen ile kaldırmak için tasarlanmıştır. Bu iletişim kuralı için diğer fiksasyon yöntemleri hesaba katmaz ve bir ultraviyole (UV) kullanarak yakalanan taze donmuş doku örnekleri için özel olarak tasarlanmıştır-LCM sistem. Burada, kesit ve taze donmuş öldükten sonra insan serebellar dokusu ve arıtma RNA'ın UV-LCM tarafından sonraki RNA-sıralama için RNA kalitesini koruyarak izole Purkinje hücrelerinden sabitleme için tam bir iletişim kuralı mevcut. Bizim ellerde bu protokolü reaktifler boyama gerek kalmadan hücresel görselleştirme olağanüstü düzeyde üretir ve RNA yüksek RNA bütünlük sayılarla (≥8) transkripsiyon profil oluşturma denemeleri için gerektiği gibi verimleri.

Introduction

Lazer yakalama mikrodiseksiyon (LCM) sonraki tatlı tahrik değerlendirme için patolojik olarak ilgili hücreleri ayırma verir bir değerli araştırma aracıdır. Moleküler analiz bu türdeş olmayan doku örnekleri ve korelasyon patolojik ve klinik verilerle biyolojik araştırma¹translasyonel önemini değerlendirmek gerekli bir adım kullanmaktır. Gen ifadesi verileri RNA üzerinden analiz ederken, donmuş doku bölümleri kullanımını RNA mükemmel kalitesi için verdiğinden önerilir yanı sıra miktar²ekranı kaplamış. Evet yüksek kalite ve RNA miktarı RNA sıralama³den anlamlı veriler için gerekli olan kurulmuştur. Ancak, RNA LCM için taze donmuş post-mortem doku kullanırken, RNA bozulması büyük bir sorun, ölümü üzerine hemen gerçekleşir ve ölçüde kendi doku toplama Yöntem⁴ile^{,5 ilişkili çeşitli faktörler tarafından aracılık ettiği gibi olduğunu} . Ayrıca, boyama teknikleri histolojik ayrıntıları ve hücre kimliğini tanımak için gerektiğinde RNA bozulması şiddetlenir. Hematoksilen ve eozin, Nisl leke gibi teknikleri boyama İhtisas ayirt ve immünhistokimya çevreleyen stroma hücreleri ayırt yararlı ama RNA aşağılamak ve transkript ifade değiştirmek için gösterilen profilleri⁶. Bu nedenle, bizim laboratuvar RNA öldükten sonra insan beyincik LCM yalıtım Purkinje nöronların sonra RNA sıralama amaçları için korumak için özel olarak tasarlanmış bir paslanmaz protokol yarattı.

Taze donmuş doku LCM için işleme, fiksasyon yöntemi degisken RNA ve doku bütünlüğü etkileyebilir. Formalin fiksasyon morfolojik korunması için standart, ancak bu cross-linking nedenleri RNA parçası ve RNA amplifikasyon⁷ile müdahale. ¹cross-linking teşvik değil koagülatif bir sabitleştirici olarak etanol fiksasyon RNA izolasyonu için daha iyi bir alternatiftir. Lipidler dokudan kaldırır gibi doku morfoloji görselleştirme, ksilen en iyi seçenek, artırmaktır. Ancak, orada sınırlamalar ne zaman belgili tanımlık doku kurumasına ve kırılgan neden doku parçalanma üzerine lazer yakalama⁷haline LCM, ksilen kullanan denir. Ksilen da uçucu bir toksin ve düzgün bir duman mahallede ele alınması gerekir. Yine de, ksilen doku görselleştirme Ayrıca RNA bütünlük⁸koruma sırasında artırmak için gösterilmiştir. Bu nedenle, bizim iletişim kuralı kullanımı % 70 etanol fiksasyon ve etanol dehidratasyon, ksilen kuluçka morfolojik netlik için ardından etrafında merkezleri.

Onlar hızlı, hassas ve RNA kalite farklı gösterildiği gibi farklı türde mikrodiseksiyon lazer tabanlı sistemleri, unutmamak önemlidir. Kızılötesi (IR) lazer yakalama mikrodiseksiyon ve ultraviyole (UV) lazer microbeam mikrodiseksiyon sistemleri neredeyse aynı anda⁸ortaya her iki roman LCM platform olduğunu. IR-LCM sistem "doğrudan doku bölümüne yerleştirilen bir şeffaf termoplastik film kullanarak bir iletişim sistemi" istihdam ve ilgi hücreleri seçerek film tarafından odaklı bakliyat bir IR Lazer uygun. Alternatif olarak, UV-LCM sistemidir "bir temassız sistem sayede odaklı lazer ışını uzakta hücreleri ya da doku; ilgi bölgelerinde keser" bir ters veya dik mikroskop tasarımı kullanma iki mevcut ticari platformlarda yapılandırmasına doku içine bir koleksiyon aygıt yerçekimine karşı mancınık bir lazer kaynaklı basınç dalgası tarafından kazanılır veya doku sırasıyla yerçekimi tarafından toplanan. UV-LCM sisteminin önemli avantajı daha hızlı hücre satın alma, temassız yaklaşım ve daha kesin diseksiyon nedeniyle bir çok küçük lazer ışın çapı⁹ile kirlenme ücretsiz toplama içerir. Bu iletişim kuralı bir UV-LCM sistemi için özel olarak tasarlanmıştır ve bir IR-LCM sisteminde test edilmemiştir. Koleksiyon kap içine biriken hücreler, bir coverslip kullanımını artırır hücreleri toplama kap girmek mümkün olacak gibi ya da UV-LCM sistem tasarımı, hücresel netlik mikroskobu sırasında uygun, değildir. Bu nedenle, doku görselleştirme geliştirmek için karşı sıvı dolgulu koleksiyonu kapaklar UV-LCM sistemlerindeki mikroskobik görüntüleme için bir coverslip olarak hareket için tasarlanmıştır opak koleksiyonu büyük harf kullanımını test ettik. Sıvı buharlaşma tabidir ve mikroskop çalışırken sık sık değiştirilmesi gerekir gibi sıvı dolgulu koleksiyonu kapaklar, zor olabilir. Yakalanan doku hemen⁷çözülür gibi zaman RNA istikrar için önemli bir faktör haline gelir.

Beyincik esansiyel tremor (ET) hastalarda ve beyincik ilgili nörodejeneratif bozuklukları öldükten sonra neuropathologic değişimler bizim laboratuvar çalışmaları. Biz morfolojik değişiklikler ET durumlarda denetimleri, Purkinje hücreleri, azaltılmış bir dizi de dahil olmak üzere karşı ayırt Purkinje hücreleri merkezli arttı dendritik regresyon ve çeşitli aksonal değişikliklere, bize önermeyi önde gelen göstermiştir bu Purkinje hücre dejenerasyonu çekirdek biyolojik ET Patogenez^10,11,12,13özelliğidir. Transkripsiyon profil oluşturma birçok nörolojik hastalıklarda dejeneratif hücresel değişiklikler temel alınan moleküler temeli keşfetmek için kullanılmıştır. Ancak, beyin doku bölgeleri gibi heterojen örnekleri transkripsiyon profillerden effectually düşük bereket transkript ifade maske ve/veya etkilenen, sadece küçük bir nüfus içinde moleküler değişiklikler tespiti azaltmak serebellar korteksin Purkinje hücreleri gibi hücrelerin. Örneğin, Purkinje hücreleri büyük ölçüde serebellar korteksin bol granül hücrelerde tarafından yaklaşık 1:3000 tarafından sayıca; Böylece, etkili bir şekilde hedef için onların transcriptome bu nöronların belirli yalıtımı gerektirir. Serebellar korteksin farklı hücre yoğunluğu ve hücre boyutu farklı katmanları tarafından belirlendi. Bu hücresel mimarisi boyama reaktif boya içeren olmadan taze donmuş doku örneği görselleştirmek idealdir. Teorik olarak, bu iletişim kuralını da benzer farklı doku var diğer doku türlerine uygulanabilir organizasyon.

Bu protokol insan öldükten sonra beyincik Purkinje hücre görselleştirme için özel olarak çalışmak üzere tasarlanmıştır. Görselleştirme ve dokuların birçok türde RNA koruma, her iki IR - ve UV-LCM amaçlı boyama fiksasyon için çok sayıda protokoller bulunmaktadır. Ne zaman UV-LCM için deneysel bir tasarım düşünürken, bireylerin ihtiyaçları ve başlangıç ve bitiş malzeme gereksinimlerini en iyi sığacak şekilde onların Protokolü terzi. Burada, biz öldükten sonra insan beyincik boya boyama reaktifler içeren yüksek kaliteli RNA transcriptome için hazırlamak gerek kalmadan Purkinje hücreleri görüntülenmesi için geliştirilmiş bir yöntem sağlamak için farklı LCM iletişim kuralları, bir çok yönünü birleştirmek sıralama.

Protocol

Bu protokol için kullanılan tüm insan örneklerini onam ile elde edilen ve Columbia Üniversitesi ve Yale Üniversitesi İç İnceleme Kurulu (IRB) tarafından onaylanmıştır.

Not: Bu iletişim kuralının tamamı katı RNA yönergeleri, işleme takip etmeli sayede eldivenli elini her zaman kullanıldığında, tüm yüzeyler RNase decontaminator ile temizlenir ve RNA/DNA/nükleaz ücretsiz tüm çalışma malzemelerdir.

1. doku başlayan okek önce RNA bütünlüğünü test

Not: RNA kalite test tarafından pek çok yöntem yapılabilir. RNA tüm bölümünden bir temsilcisi RNA bütünlük sayı (RIN) için örnek sağlamak için test emin olun.

1. Dikkatle doku örneği deneysel tasarım parametre içinde uygun dahil etmek üzere seçin. Cryostat kesme, adım 1.2 için taşıyın. Aksi takdirde, doku buna göre işlemek ve adım 1.11 için hareket.
2. Kuru buz iki kapsayıcı olsun. Boyutu örnek sayısına bağlıdır.
   1. Kuru buz ilk kapsayıcısına doku koduyla bir boş, etiketli 2 mL tüp getirin.
      Not: Dondurmak tüpler için 10 dakika sürer. Tüpler doku yerleştirerek önce dondurulmuş olması; yoksa, doku boru yüzey üzerinde eriyecek.
   2. Kuru buz ikinci bir kap içinde doku RNA onay gerektiren bir-80 ° C dondurucudan yerleştirin.
3. Cryostat temiz. Adım 4.7 ayrıntılı yordam Temizleme için bkz.
4. Kuru buz dokuyu ve doku dekontamine RNase jilet ile küçük bir bölümünü kesti. Doku yaklaşık 1 cm x 1 cm boyutunda olmalıdır.
5. Bir cryostat 'chuck' bileşik bir yaklaşık 3 mm yüksek höyüğün en uygun kesme sıcaklık (OCT) yerleştirin ve kısmen dondurmak sağlar. Sonra doku OKT üstüne yerleştirin — bas OCT, sadece üzerine dinlenmek izin değil.
6. OCT sertleşince, chuck bağlı doku ile cryostat kesim kol ve pozisyon cryostat bıçak önünde yerleştirin.
7. Doku bile olana 30 mikron bölümleri trim.
8. Doku ve donmuş 2 mL tüp yerde 300 mikron kesilmiş. Tüp kuru buza koyun.
9. 'Chuck'tan' dokuyu ve hazır kadar hapse geri Kuru buz yerleştirin.
10. 1.4-1.9 tüm dokular için yineleyin.
11. Tüm örneklerini tamamlandıktan sonra sağlanan RNA ekstraksiyon kiti (Malzemeler tablo #15) kullanarak RNA ayıklayın. Detaylı bir protokol RNA ayıklama kit ile sağlanır. Toplama tüp membran ve DNaz sindirim (Malzemeler tablo #16) için isteğe bağlı adım kuru için isteğe bağlı bir adım de dahil olmak üzere tüm yönergeleri izleyin.
12. Kalite değerlendirme bioanalyzer¹⁴üzerinden ayıklanan RNA bütünlüğünü sınayın.

2. başlangıç kesit önce hazırlamak için LCM

1. Slaytlar sahipleri doku LCM için kesit, her turdan önce temiz. Gün gece kurutma tam izin kullanmadan temizlik yordamı gerçekleştirin.
   Not: slayt sahipleri doku bölümü fiksasyonu etanol ve Ksilen takas için kullanılır.
   1. Tutucu yordam Temizleme slayt: RNase decontaminator dietil tedavi pyrocarbonate (DEPC) su tarafından takip ile durulayın. Herhangi bir toz veya diğer hava kirliliği önleme baş aşağı bir RNA/DNA/nükleaz ücretsiz yüzeyi kuru gecede olanak sağlar.
      Uyarı: DEPC çok zehirli ve ele ve gereken EH & S Standart tehlikeli kimyasalların protokolünü kullanarak bertaraf.
2. Temiz RNase ile kesit için fırçalar decontaminator ve kuru gece kalmak için izin verir. Herhangi bir toz ve diğer kirletici kaçının.
3. UV ışığı, oda sıcaklığında 30 dakika altında yer membran slaytlar. UV slaytlara daha--dan 1-2 gün önce kullanmak maruz yapmak. Bu bağlama membran slayda dokusunun artırır.
   Not: Adım 2.3 slayt için doku parça (bkz. Adım 4.4) aynı günde gerçekleşmesi UV tedavi sağlar adım 4 ile kombine edilebilir.

3. RNase Free su ve yüksek kaliteli etanol ile fiksasyon çözümleri hazırlayın

Not: Tüm çözümler her deneme için taze hazırlanır. Adım 1.1 yordam Temizleme slayt tutucu tamamlanmasını sağlamak. Tüm çözümler slayt sahipleri içinde hazırlanır.

1. 30 mL % 100 etanol bir slayt tutucuya yerleştirin.
2. Etanol RNase/DNaz/nükleaz ücretsiz suyla seyreltik. Yer 30 mL % 95 etanol bir tutucu slayt ve buza koy.
3. Etanol RNase/DNaz/nükleaz ücretsiz suyla seyreltik. Yer 30 mL % 70 etanol bir tutucu slayt ve buza koy.
4. Yer 30 mL % 100 ksilen iki slayt sahipleri ayırmak ve #1 ve #2 etiket.

4. Cryostat doku kesit için hazırlayın

1. Bir kova dolusu buz etanol çözümleri ve doku için Kuru buz ile bir kapsayıcı için olsun.
   Uyarı: Kuru buz son derece soğuk, bu yüzden koruyucu eldiven kullanın. Aynı kapta buz ve kuru buz şey koymayın. Farklı sıcaklıklarda buz ve kuru buz onları forma belirsiz bir sıcaklıkta birlikte neden olur.
2. Doku-80 ° C dondurucu ve yer taşıma için kuru buzda cryostat için kaldırın.
3. Cryostat ayarları:
   1. Bölüm kalınlığı 14 mikron için ayarlayın.
   2. Döşeme kalınlığı 30 mikron doku miktarını korumak için ayarlayın.
   3. Çift odası ve sıcaklıklar tutan numune ile Kriyostaz için-18 ° C'ye Oda sıcaklığı (CT) ayarla Bir ayar ile Kriyostaz için-17 ° c sıcaklık ayarla
   4. Çift odası ve sıcaklık tutan numune ile Kriyostaz için nesne sıcaklık (OT)-16 ° c için ayarlayın.
      Not: OT bile kesme emin olmak için CT sıcak olması gerekir. Doku hala parçalama, OT-15 ° C ile arttırılabilir ve CT-18 ° C'ye artırılabilir
4. Doku cryostat için en uygun sıcaklık gelmek için izin vermek en az 20 dakika yerleştirin.
   Not: Doku en uygun sıcaklıkta değilse, kesme üzerine parça. Doku, RNA bütünlüğünün korunması ve buz kristal oluşumu engellemek için önceki gece-20 ° C'de koymayın. Doku olduğu kadar izin zamanı gerektiği gibi sorunsuz kesmek için en uygun sıcaklık equilibrate. İsteğe bağlı uygulama, UV altında slayt kuluçka burada (bkz. Adım 1.3) ortaya çıkabilir.
5. 'Chuck' cryostat cryostat sıcaklığa gelmesini sağlamak en az 20 dakika yerleştirin.
6. Temiz fırçalar cryostat cryostat sıcaklığa gelmesini sağlamak en az 20 dakika yerleştirin.
7. Cryostat temiz
   1. Sahne sahne alanı'nda donma önlemek için RNA/DNA/nükleaz boş su ile seyreltilmiş RNase decontaminator ve % 70 etanol 1:1 karışımı ile temizleyin.
   2. Sahne Alanı'nda RNase decontaminator ve bıçak tutucu yerde yeni bir tek kullanımlık cryostat bıçak temiz. En az 20 dk cryostat blade cryostat sıcaklık için gelmek için izin verir.
   3. Anti-roll plaka RNase decontaminator ile temiz ve sahne alanı'na ekleyebilirsiniz. En az 20 dk anti-roll plaka cryostat sıcaklık için gelmek için izin verir.
      Not: Bir anti-rulo levha kesme için gerekli değildir ancak şiddetle tavsiye edilir. Anti-roll plaka yoksa, temiz bir fırça alternatif olarak çalışır. Anti-roll plaka doğru sıcaklıkta değilse, doku eritebilir veya kesme üzerine sopa.

5. doku kesit

1. (~ 1 cm x 1 cm) dokusunun kesit için küçük bir parça kes. Kalan doku Kuru buz /-80 ° C dondurucu için dönmek.
   Not: Doku bölümü Purkinje hücreleri konumlandırıldığı ~ %95 serebellar korteksin olduğundan emin olun.
2. Bir yaklaşık 3 mm yüksek Höyük, Ekim 'chuck' kapsayacak şekilde yerleştirin. Küçük bir höyük kadar yavaş, dairesel bir hareketle, üst katmanları kurarak başlayın.
3. OCT kısmen donmuş, ancak yine de bazı sıvı ortasında kez doku OCT üstüne yerleştirin. Doku, derin Ekim izin ver tamamen donmuş kadar OCT üstüne oturmak için doku içine itmeyin. Bu 1-2 dk sürer.
4. Donmuş OCT ile chuck ve doku cryostat kesim kol yerleştirin. Kesici bıçağın ile aynı hizada doku ayarlayın.
5. Doku kesim kol için yeni sıcaklığı ayarlamak 15-20 dakika oturmak izin.
   Not: Doku kalınlığına bağlı olarak, sıcaklık calıştıkları için zamana ihtiyacım vardı. Temiz bir şekilde kesmek için gerekli sürece oturup doku sağlar. OT ve CT doku sıcaklık calıştıkları ile yardımcı olmak için ayarlayın.
6. Yavaş yavaş daha yakın doku için bıçak taşımak. Doku bıçak ulaştı sonra kırpma işlemini başlatmak. Döşeme kalınlığı 30 mikron için ayarlamanız gerekir.
7. Korteks katmanlar görünür hale gelene kadar 2-3 x kırpın.
8. Yer ve hemen cryostat bıçak üzerinde anti-roll plaka hizalayın.
   Not: Gümüş bir çizgi üzerinden arayüz bıçak ve anti-roll plaka cryostat ışıkta görünür. Bu bıçak kenarına doğrudan anti-roll plaka olduğunu gösterir.
9. 14 mikron bölümleri kesmeye başlayın. Düzgün kesme bölümleri düz anti-roll plaka altında olacak.
   Not: Doku takılırsa anti-roll plaka yeterince soğuk olduğundan emin olun. Eğer gerekli, Kuru bir parça yerleştirerek dış (yan sahne değil müessir) isteği üzerine hızla buz anti-roll plaka chill.
10. 4-6 Bölüm kesin ve cryostat sahne alanı boyunca yatay hizalamadan.
11. Slayt olta balıkçılığı, doku tüm parçaları aynı anda toplamak.
    Not: Fırçaları kullanma, doku slayt üzerine almak için kullanıma hazır olur biter kaldırın. Teker teker bir bölüm seçme. Oda sıcaklığında havaya maruz RNA bütünlük düşer.
    Uyarı: Cryostat aşaması touch membran izin vermeyin. Membran sahne dokunursa, cam slayttan ayırmak başlayacak ve LCM girişimi sırasında hatalara neden olur.
12. Hemen adım 6 için hareket. Fiksasyon gecikme yok.

6. doku/leke-daha az görselleştirme sabitleme

1. Hemen etanol fiksasyon protokolü için hareket
2. Slayt 2 min için % 70 etanol ile slayt sahibi yerleştirin — buz üzerinde.
3. 45 için % 95 etanol ile slayt sahibi slayt yer s — buz üzerinde.
4. Slayt 2 min için % 100 etanol ile slayt sahibi yerleştirin —, RT.
5. Slayt slayt tutucu ksilen 1 ile 3 kez daldırma —, RT.
6. Ksilen 2 5 min için ile slayt sahibi slayt yer —, RT.
7. İçin en az 30 dk. daha uzun kuru kere 60 dk için en uygun kadar temiz bir alanda kurumasını sağlar.
   Uyarı: Slaytlar bir duman mahallede kurutma için ayağa kalk. Ksilen kırılgandır. Döşeme slaytlar düz ksilen havuzuna doku çok karanlık olmak neden olur doku bölümünde neden olur.

7. isteğe bağlı — Slayt depolama

1. Kurutulmuş slaytları tek tek 50 mL tüpler (tüp başına bir slayt düzeninde) ve-80 ° C dondurucu yerde 7 gün için yerleştirin.
   Not: Slaytların-80 ° C dondurucuya koyarak önce kuru olması gerekir. Parçacıklar doku ve membran embed kurutucu tüpü içinde kullanmayın. Tüp kap sıkı olduğundan emin olun; Eğer değilse, yoğunlaşma slayt üzerinde kullanım için çözdürme ortaya çıkar.
   Uyarı: Doku görselleştirme kalitesini yaptığı gibi RNA bütünlük 7 gün sonra azalır.

8. çözdürme kullanılmak üzere slaytlar depolanabilir

1. Tek bir slayt ile tüp-80 ° C dondurucu 1s kullanım amacı önce kaldırın.
2. Hemen tüp açmayın. Tüp oda sıcaklığına gelmesini sağlar. Yoğunlaşma tüp sadece dış tarafında ortaya çıkar.
3. Bir kez tüp oda sıcaklığına gelmiş ve tüm yoğunlaşma öldü (yaklaşık 30-40 dk), kapağını çıkarın ve oda sıcaklığında hava slayta bulaşmasına neden.
4. Slayt 15-20 dk. kapaklı tüp içinde slayt kaldırıldı bırakmak için oda sıcaklığında alışmana izin.
   Not: Slayt şimdi LCM için hazırdır.

9. lazer yakalama mikrodiseksiyon Purkinje hücre:

Not: Bu bölüm iletişim kuralının yalnızca Purkinje hücreleri sonraki RNA sıralama için yakalama için ilgili özelliklerini ele alınacak. Bu bölüm Kullanıcı UV Lazer yakalama mikroskop ve bağlı yazılım hakkında bilginiz olduğunu varsayar.

1. Temiz mikroskop sahne ve kap koleksiyonu RNase decontaminator ile kol.
2. Eldivenli elleriyle, mikroskop slaytta ve 500 μL opak kap koleksiyonu kolundan yerleştirin.
   Not: Her zaman uygun RNA tekniği RNase decontaminator ile çalışma alanını temizleyerek sağlamak ve slayt veya opak kap dokunmadan süre eldivenli elini kullan. Eldiven-ebilmek var olmak çıkarmak bir kez slayt ve kap gidiyoruz ve lazer yakalama başladı.
3. Düşük büyütme oranında opak kap kap göz parça halinde görüntülenir tüm alanı kaplamaktadır sağlanması serebellar doku üzerinde hizalayın.
   Not: Sadece mikroskop göz parça opak kap merkezli olduğunu gösterir. Kamera kapağı doku üzerinde ortalanmış göstermez. Lazer yakalama kapsam tasarımına bağlı olarak, opak kap ile görselleştirme ya tek veya göz parça ve kamera görüntülenmeyecektir göz parça olacak.
4. 5 x - 10 x objektif lens ile serebellar katmanlar görselleştirmek ve moleküler katman ve granül hücre katmanı (Purkinje hücre katmanı) kesiştiği bölümünün üzerine imleci getirin.
5. 40 X taşımak ve Purkinje hücreleri görselleştirin.
   Not: İçin örnek görsel bkz: Şekil 1 ve Şekil 2 .
6. Purkinje hücreleri yakalamaya başla.
   Not: RNA-sıralama, en az 5 gerçekleştirmek için ng RNA'ın gereklidir. Yaklaşık 1600-2000 Purkinje hücreleri yeterli RNA malzeme sıralama için neden. RNA istikrarlı için mikroskop, en fazla 8 saat olacak. UV enerji ve UV odak toplama düzeyleri doğru olduğundan emin olmak için önce sınayın. Zamanla, doku kurumaya devam edecek ve UV enerji ve UV odak değiştirilmesi gerekebilir.

10. RNA koleksiyonu yazı LCM

1. Hücre lizis arabellek hazırlamak (her zaman taze hazırlamak)
   1. 2-mercaptoethanol lizis tampon 1: 100, seyreltik (10 μL:1 mL, sırasıyla). Lizis (RLT) arabellek Malzemeler tablo (#14 ve #15) sağlanır.
2. Hücre lizis arabelleği 50 μL yukarı dönük olacak şekilde kap ile opak kap ekleyin. Dikkatle tüp üzerinde kapağı kapatın.
3. 1 dk. için baş aşağı tüp bırakın.
4. Girdap tüp 30 s ve hızlı bir şekilde lizis tampon tüp altına spin.
5. Tüp yeniden açın ve 10.2-10,4 arasındaki adımları yineleyin.
6. Tüm örneklerini bitmiş ve RNA çıkarılması (Malzemeler tablo #14) için hazır olana 100 μL lizis arabellek ve-80 ° C dondurucu gelen RNA içeren tüp yerleştirin.

Representative Results

Bu iletişim kuralı taze donmuş öldükten sonra insan beyin dokusu UV-LCM için hazırlanması için gereken adımları ayrıntılı. Taze donmuş beyin dokusu duyarlık yüksek düzeyde kesmek zor olabilir gibi ayrıntılı özellikleri ve ek açıklamaları cryostat kesme için verilir. En önemli nokta göz önünde taze donmuş doku aşırı soğuk ve bir cryostat daha sıcak sıcaklık alışmana için zaman önemli miktarda gerektirir olmasıdır. Bu adımı aceleye gelmez ve nasıl bu adım başarılı veya başarısız bu protokol merkezidir abartılı olamaz. Doku düzgün cryostat hazır değil ise, tüm sonraki girişimler hücreleri veya bölgelerde ilgi belirlemekte çok zor, imkansız olmasa olacak.

Cryostat kesit ve ayrılan kuruma süresi aşağıdaki doku LCM için hazırdır. Ne zaman mikroskop altında doku görüntülenmesi, beyincik hücresel katmanları kolayca 5 X ve 10 X objektif lens ile görülebilir. Şekil 1 gösterir etanol tek (Şekil 1A) ve doku doku temsilcisi görüntüleri sabit etanol fiksasyon (Şekil 1B) takip ksilen içinde inkübe. Biz titizlikle çeşitli etanol ve Ksilen kuluçka kez test / sıcaklık her ikisi de yeteneğine düzeltmek ve doku görselleştirmek. Eğer doku yeterince ksilen inkübe değil, ortaya çıkan görüntü daha yakından Şekil 1Byerine resim 1Abenzer. Ksilen kuluçka nedenleri hücresel katmanları daha koyu ve daha iyi olmak için doku delineates etanol tek başına yapar. Lazer yakalama mikroskop kesme, 40 X objektif lens sadece Purkinje hücreleri ve çevresindeki doku olmadığı yakalamak sağlamak için gereklidir. Kuluçka ksilen içinde kaliteli morfolojik sağlam resim (resim 1D) için etanol fiksasyon yalnız (Şekil 1C) karşılaştırıldığında üretir.

Daha bizim doku görselleştirme geliştirmek için opak bir kap coverslip yeteneğini test ettik. Diğer UV-LCM protokolleri temas doku çözülür bir 200-500 μL tüp bir sıvı dolu kap kullanmaktadır. Sıvı dolgulu kapaklar doku görselleştirme, taneli ve (Şekil 2A) mikroskop altında yanardöner olmak ortaya çıkan görüntü neden azaltabilir. Opak kap (Şekil 2B) sonuçları daha yumuşak ve daha net biçimde bir smoothened doku görünüm doku görselleştirme. Özellikle, opak kap koleksiyonu en fazla 8 saat ezelî belgili tanımlık lüzum için yenisiyle değiştirme için izin verir. Eksize Purkinje hücre düşük güç (Şekil 2C) ve yüksek güç (Şekil 2D, E) temsilcisi görüntüler sadece Purkinje hücre vücut kesin kaldırılmasını göstermektedir. Başvuru için Şekil 2F Luxol hızlı mavi gösterir / Hematoksilen ve eozin (LH & E) lekeli özellikle olayları beyincik farklı katmanları ve moleküler Purkinje hücreleri yerleşimini serebellar korteksin yan yana katman katman ve granül hücre.

Bu iletişim kuralının amacı kaliteli RNA sonraki RNA sıralama için elde etmektir. Bizim iletişim kuralı olan her LCM RNA çıkarılması için 1500-2000 hücreleri toplamak için üç gün uygulanan altı farklı öldükten sonra insan beyni örnekleri üzerinde test ettik. Yaklaşık 6 – 8 h mikroskop, sonra önceki gün LCM ürünleri önce RNA çıkarma ile kombine edilmiştir 500-700 hücreler üretti. Örnekleri RNA ayıklama uygulandı ve RNAse free su (Malzemeler tablo #14) 14 μL içinde resuspended. Tüm altı örnekleri kaliteli RNA, RNA bütünlük numaraları (RINs) ≥8 ile üretilen (Şekil 3A-F). Bu yordamı 11,5 RNA miktarlarda sonuçlandı ng (Şekil 3A), 8.3 ng (Şekil 3B), 13,6 ng (Şekil 3C), 11,5 ng (Şekil 3D), 14,9 ng (Şekil 3E) ve 26,9 NG (Şekil 3F). Not Tüm öldükten sonra insan beyni örnekleri LCM (Tablo 1) önce RNA kalite için test edildi olduğunu. Örnek kökenli RNA bozulma varsa, LCM bütünlüğünü sadece daha fazla düşer.

Resim 1 : Serebellar katmanları ve Purkinje hücre görselleştirme ve Ksilen tedavi olmadan. Temsili resim ve Ksilen olmadan aşağıdaki etanol fiksasyon ve dehidrasyon. Moleküler katmanı (ML) ve granül hücre katmanı (un) etiketlenir. Purkinje hücreleri oklarla işaretlenmiş. (A) 5 X serebellar katman görselleştirme ksilen olmadan gösterimi. Ölçek çubuğu: 10 µm. (B) 5 X serebellar katman görselleştirme ksilen ile gösterimi. Ölçek çubuğu: 10 µm. (C) 40 X gösterimi serebellar katman görselleştirme ksilen olmadan. Ölçek çubuğu: 1 µm. (D) 40 X temsil serebellar katman görselleştirme ksilen ile. Ölçek çubuğu: 1 µm. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Resim 2 : Purkinje hücre görselleştirme öncesi ve sonrası okek. 40 X ksilen ile temsilcisi görüntüleri aşağıdaki etanol fiksasyon ve dehidrasyon. ML ve un etiketlenmiştir. Purkinje hücreleri oklarla işaretlenmiş. (A)görselleştirme, mikroskop altında sıvı dolu kap 40 x. Ölçek çubuğu: 1 µm. (B) görselleştirme mikroskop altında opak koleksiyonu, cap X 40 at. Ölçek çubuğu: 1 µm. (C) 5 X eksize Purkinje hücreleri ML ve un arasında gösterilen serebellar korteksin görselleştirme. Ölçek çubuğu: 10 µm. (D) 40 X görselleştirme Purkinje hücre eksizyon önce. Ölçek çubuğu: 1 µm. (E) 40 X görselleştirme başarılı Purkinje hücre yakalama. Ölçek çubuğu: 1 µm. (F) 20 X temsilcisi LH & E lekeli beyincik gösteren Purkinje hücre organları ile işaretli oklar. Ölçek çubuğu: 5 µm. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Şekil 3 : RNA kalite kontrol Bioanalyzer okek sonuçları örnekleri. Paneller A-F temsilcisi RNA kalite kontrol dökümanları göster. Her panel aynı LCM sürecin fiksasyon ve görselleştirme ile etanol ve Ksilen sadece uygulanan farklı bir örneğidir. RNA bütünlük numaraları (RINs) tüm > 8.0. Temsilcisi konsantrasyonları [] Sonuç bir verim en az 5 ng toplam RNA'ın. Tüm örneklerini RNAse free su 14 µL içinde eluted. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Örnek	RIN - bölümüne hazırlık	RIN - OKEK	[RNA] - OKEK	PMI-dondurulmuş
A	9.2	8.6	822 pg/µL	450 min
B	9,8	8	598 pg/µL	550 dk
C	9.1	8.5	976 pg/µL	455 min
D	9,8	8.2	823 pg/µL	463 min
E	9,8	9.1	1069 pg/µL	1139 min
F	9.6	8.3	1923 pg/µL	1080 min

Tablo 1: RNA bütünlük özetini . Örnek sayılar Şekil 3' te sunulan bioanalyzer sonuçlarına karşılık gelir. Bölüm hazırlıklar LCM doku başlayan iyi bir kaliteye sahip olduğundan emin olmak için önce gerçekleştirilir. Gösterilen özgün doku RINs bölüm preps, OKEK RINs ve konsantrasyon LCM gelen RNA'ın yanı sıra öldükten sonra aralıkları için doku (PMI-dondurulmuş) dondu.

Discussion

Burada sunulan Protokolü özellikle morfolojik farklı dokuların UV-LCM için görselleştirme Paslanmaz bir yaklaşım olarak değiştirilir. Bu yöntem doku görselleştirme geliştirilmiş bir düzeyde muhafaza süre sonraki doğrudan RNA sıralama, RNA bütünlüğü en üst düzeye çıkarmak için tasarlanmıştır. İnsan doku¹⁵farklı moleküler profilde anlamak için gerekli hücrelerin en saf nüfus mümkün oluşturmak için farklı hücre tipleri için yakalama, ayırt etmek için yeteneğidir. Bu protokol kapsamında doku seçimi, antijen olarak kullanmak her şeyden önemlidir veya boya belirli reaktifler değil kullanılmaktadır ve bu nedenle böyle farklılaşma gerektiren çalışmalar için uygun değildir. Bu bir sınırlama bu protokol olmakla birlikte, ortaya çıkan doku görselleştirme ve RNA bütünlük oldukça üstündür ve alaka diğer Deneysel tasarımlar korumak. Diğer birçok protokolün de alternatif boyama yöntemleri özellikle için UV - ve IR-LCM konserve RNA niyetiyle kullanmak yok. Ancak, çoğu diğer yöntemleri içeren en az bir boyama ya da antijen belirli reaktif^6,16,17, (insan otopsi doku are değil) bir hücre veya organ türü için tasarlanmış^{18,19, 20}, veya bütünlük²¹geliştirmek için özel RNA-seq kitleri gerektirir. Kresil menekşe (Nisl) boyama beyindeki nöronların çekirdeği lekeleri ve RNA Bozulması⁶en az miktarda neden olur gibi birçok Protokoller'de kullanılan reaktif içeren popüler bir boya olduğunu. Ancak, daha büyük Purkinje hücre çekirdeği de Purkinje hücreleri görüntülenmesi için hiç önemli bir yarar sağlayan kresil violet tarafından lekeli değil. Önemlisi, biz sadece bir LCM çalışmada serebellar dejeneratif ve gelişimsel bozukluklar çalışmanın önemli ilgi insan Purkinje hücre koleksiyonu açıklanan edebiyat tespit. Bu çalışmada kresil mor donmuş kurcalayarak lekeli ve IR-LCM sistemle Purkinje hücreleri izole; RINs 5 kullanılan ama Mikroarray analiz²²için kabul edilebilir olarak kabul gibi düşük örnek. Bu nedenle, bu yüksek kaliteli RNA UV-LCM yolu ile eksize öldükten sonra insan beyincik Purkinje hücrelerinden için özel olarak tasarlanmış ilk Protokolü çalışma.

RNA molekülleri hücre içinde oldukça doğal çürüme tabi ölümünden sonra RNA istikrardır öldükten sonra insan dokusu iyi bilinen bir engel olmasıdır. Özellikle, mRNA nucleolytic bozulma⁵en duyarlı olduğu gösterilmiştir. Öldükten sonra aralığı (PMI) izleme bazı korelasyon RNA bozulması için bazı çalışmalar^23,24,25göstermiştir bir ölçüm (PMI-dondurulmuş) dondurma vakti geldi. Ancak, Tablo 1 bizim PMI donmuş aralıkları için PMI değerleri ve RNA kalitesi ile göreli hiçbir korelasyon gösteren Şekil 3' te gösterilen altı örnekleri gösterir. Bu nedenle, bunu gerçekleştirmek için gerekli olan bir lazer yakalama proje başlamadan önce RNA bütünlük denetimi içinde durum tespiti. Başlangıç örnek RNA bütünlüğünü düşük kalitede ise, bir LCM üründen elde edilen RNA daha düşük kalitede olacak. RNA tümleşiklik düzeyi düşük kaçınamayız zaman sıralama için artırılması RNA için diğer yöntemleri bu protokolü²¹ek olarak istihdam olabilir. Özellikle, düşük-girdili veya bozulmuş RNA sessiz karmaşıklığı ve genellikle ek yükseltme adımları gerektiren suboptimal sonuçlar yol açabilir. Amplifikasyon ÇSYİ devredir ilavesi dizileri unequally yükseltmek gibi^26,27sıralama üzerine okuma çiftleri oluşturmak gösterilmiştir. Bu nedenle, yüksek kaliteli RNA LCM örneklerinden sıralama için kullanımı son derece avantajlıdır.

Bu protokol için ağır istihdam görselleştirme yöntemi kullanıcı dayanır ne zaman taze kesme uzmanlık doku üzerinde bir cryostat dondu. İletişim kuralı en iyi doku kesit için hazırlamak ve doku slaytta yer konusunda kapsamlı ayrıntılı anlatır. Bu hiç şüphesiz bu protokol iki en önemli adım vardır. Doku cryostat sıcaklık iklime alıştırılacağı değil, parçalama, hangi doku morfolojik kalitesini önemli ölçüde yavaşlattığını gerçekleşir. Parçalama birkaç olası sorunları sonucudur; sorun giderme olanakları bekleyen uzun süre sıcaklığa gelmesini doku veya cryostat OT ve/veya CT için sıcak bir aralığı değiştirme içerir. Doku edilmiş başarıyla kesilmiş ve sahne alanı'nda yerleştirilir sonra doku yönlendirmek önemlidir ve düzgün tüm doku sağlamak için slayt membran içinde uygun ve doğru bir şekilde sahne alanı'ndan alınabilir. Doku cryostat sahne alanı'ndan almaya çalışırken, doku soğuk olmalı ve slayt sıcak olmalıdır. Alternatif protokoller kadar doku toplama önce slayt sakinleşmesini tavsiye ve doku yerleşim²⁸alan üzerinde bir parmak ile ısıttı bulunmaktadır; Ancak, bizim ellerde Bu herhangi bir yarar sağlamaz ve sık sık doku ve aşırı doku kıvrımlar zorluk neden oluyor. Oda sıcaklığında bir slayt ile doku slayt ile temas üzerine hemen erir. Temiz bir pikap emin olmak için böylece membran alanı doku temas geliyor ama defa sahne kendisi dokunmatik olarak gitmez slayt açı gereklidir. Membran membran zarar sahne dokunduğu ve geçici yakalama zor Lazer cam slayttan ayırmak başlayacak. Bu durumda, bir kez LCM başladı ve geri alınamaz fark olacak. Sorun giderme seçenekleri sınırlıdır; Eğer herhangi bir zamanda bu membran veya slayt uzlaşma düşünülmektedir, atmak akıllıca olacaktır. Bu uygulama bir proje başlatma veya yüksek kaliteli doku kesit üretebilir bir patoloji çekirdek kullanarak önce taze donmuş doku kesit için tavsiye edilir. Ancak, çekirdek hizmeti kullanıyorsanız, uygun RNA tekniği RNase kontaminasyonu önlemek için takip emin olun. Yanlış tekniği kullanıldığında RNA bozulması kolayca oluşabilir.

Biz burada Purkinje hücre öldükten sonra insan beyincik Paslanmaz görselleştirme için tüm yöntem UV-LCM amaçlar için sundu. Biz de uygun RNA koruma yöntemleri ve teknikleri RNA bütünlük yüksek düzeyde sağlamak için dahil ettik. Bu iletişim kuralı mutlaka bir herhangi bir hücreye özgü değildir ya da doku türü ama bölge/hücre ilgi belirli tanıma antijen veya boya gerek kalmadan çevreleyen stroma üzerinden morfolojik ayırt gereksinimi korumak.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
MembraneSlide NF 1.0 PEN	Zeiss	415190-9081-000	Membrane slides for tissue. We do not recommend using glass slides.
AdhesiveCap 500 Opaque	Zeiss	415190-9201-000	Opaque caps are used to enhance visualization on inverted scopes only
RNase Away	Molecular BioProducts	7005-11	Other RNase decontamination products are also suitable. Use to clean all surfaces prior to work.
200 Proof Ethanol	Decon Laboratories	2701	If using alternative Ethanol, ensure high quality. Essential for tissue fixation.
Xylenes (Certified ACS)	Fisher Scientific	X5P-1GAL	If using alternative xylene, ensure high quality. Essential for tissue visualization.
UltraPure Distilled Water	Invitrogen	10977-015	Other RNA/DNA/Nuclease free water also suitable. Utilized in ethanol dilution only.
Slide-Fix Slide Jars	Evergreen	240-5440-G8K	Any slide holder/jar is also suitable. Must be cleaned prior to use. Used for fixation following sectioning.
Anti-Roll Plate, Assy. 70 mm 100 μm	Leica Biosystems	14041933980	Anti-roll plate type is determined by type of cryostat and attachment location on stage. All cryostats have differing requirements.
Diethyl pyrocarbonate (DEPC)	Sigma Aldrich	D5758-50mL	DEPC from any vendor will do. Follow directions for water treatment.
Kimwipes	Fisher Scientific	06-666A	Kimwipes can be ordered from any vendor and used at any size. Kimwipes are to be used to clean microscope and cryostat.
Tissue-Plus O.C.T. Compound	Fisher Scientific	23-730-571	Any brand of OCT is acceptable. No tissue will be embedded in the OCT, it is strickly to attach tissue to 'chuck'.
Edge-Rite Low-Profile Microtome Blades	Thermo Scientific	4280L	Blade type is determined by type of cryostat. All cryostats have differing requirements.
Leica Microsystems 3P 25 + 30MM CRYOSTAT CHUCKS	Fisher Scientific	NC0558768	Chuck type is determined by type of cryostat. All cryostats have different requirements. Either size is suitable.
RNeasy Micro Kit (50)	Qiagen	74004	Required for RNA extraction post LCM. RLT Lysis buffer essential to gather captured cells from opaque cap.
RNeasy Mini Kit (50)	Qiagen	74104	Required for RNA extraction of section preps, which are performed prior to LCM to test RNA integrity of starting tissues.
RNase-Free DNase Set	Qiagen	79254	Dnase will remove any DNA to allow for a pure RNA population. Ensure Dnase is made fresh.
2-Mercaptoethanol	Sigma Aldrich	M6250-100ML	Purchased volume at user discretion. Necessary for addition to RLT buffer for cell lysis. Prevents RNase activity.
Globe Scientific Lot Certified Graduated Microcentrifuge Tube (2 mL)	Fisher Scientific	22-010-092	Any 2 mL tube that is RNase free, DNase free, human DNA free, and Pyrogen free will do.