En rustfri protokol for høj kvalitet RNA isolering fra Laser fange Microdissected Purkinje celler i den menneskelige Post Mortem lillehjernen

Summary

Denne protokol bruger en plet-fri tilgang til at visualisere og isolere Purkinje celler i frisk frosset væv fra menneskelige post mortem lillehjernen via laser fange microdissection. Formålet med denne protokol er at generere tilstrækkelige mængder af høj kvalitet RNA til RNA-sekvens.

Abstract

Laser fange microdissection (LCM) er en fordelagtig værktøj, der giver mulighed for indsamling af cytologically og/eller fænotype relevante celler eller områder fra heterogene væv. Tilfangetagne produkt kan anvendes i en bred vifte af molekylære metoder til protein, DNA eller RNA isolering. Bevarelse af RNA fra postmortem menneskelige hjernevæv er imidlertid især udfordrende. Standard visualiseringsteknikker til LCM kræver histologisk eller immunhistokemisk farvning procedurer, der kan yderligere nedbrydes RNA. Derfor, vi har udviklet et rustfrit protokol for visualisering i LCM med formål at opretholde RNA integritet i post mortem menneskelige hjernevæv. Cellen Purkinje i lillehjernen er en god kandidat til rustfrit visualisering, på grund af sin størrelse og karakteristiske placering. Den cerebellare cortex har adskilte lag, der adskiller sig i celle tæthed, hvilket gør dem en god arketype at identificere under høj forstørrelse mikroskopi. Purkinje celler er store neuroner beliggende mellem granulet cellelag, der er et tæt netværk af små neuroner, og den molekylære lag, som er sparsom i celle organer. På grund af denne arkitektur er brugen af rustfrit visualisering muligt. Andre orgel eller celle-systemer, der efterligner denne fænotype ville også være passende. Rustfrit protokollen er designet til at lave frisk frosset væv med ethanol og fjerne lipider med xylen til forbedret morfologiske visualisering under høj forstørrelse lysmikroskopi. Denne protokol tager ikke højde for andre metoder, fiksering og er specielt designet til frisk frosset vævsprøver taget til fange ved hjælp af en ultraviolet (UV)-LCM-systemet. Vi præsenterer her, en fuld protokol til skæring og fastsættelse af frisk frosset post mortem menneskelige cerebellare væv og oprensning af RNA fra Purkinje celler isoleret af UV-LCM, samtidig bevare RNA kvalitet for efterfølgende RNA-sekvens. I vores hænder denne protokol producerer ekstraordinære niveauer af cellulære visualisering uden behov for farvning reagenser og udbytter RNA med høj RNA integritet numre (≥8), som er nødvendig for transcriptional profilering eksperimenter.

Introduction

Laser fange microdissection (LCM) er en værdifuld forskningsværktøj, der giver mulighed for adskillelse af patologisk relevante celler for efterfølgende molekylemæssigt drevet evaluering. Brugen af molekylære analyser i disse heterogen væv prøver og korrelation med patologiske og kliniske data er et nødvendigt trin i evalueringen translationel betydningen af biologiske forskning¹. Når du analyserer genekspression data fra RNA, brug af frossen væv sektioner er stærkt anbefales, da det giver mulighed for fremragende kvalitet af RNA samt maksimeret mængde². Det har været godt etableret, at høj kvalitet og kvantitet af RNA er afgørende for meningsfulde data fra RNA sekventering³. Ved brug af RNA fra frisk frosset post mortem væv for LCM, er RNA nedbrydning imidlertid en stor udfordring, da det opstår umiddelbart efter døden og dens omfang er medieret af forskellige faktorer i forbindelse med væv samling metode^4,5 . Derudover er RNA nedbrydning forværret, når farvning teknikker er nødvendige for at genkende histologiske detaljer og celle identifikation. Specialiseret farvning teknikker, såsom hæmatoxylin og eosin, Nissl pletten, immunofluorescens og Immunhistokemi er nyttige i at differentiere celler fra omkringliggende stroma men har vist sig at nedbrydes RNA og ændre udskrift udtryk Profiler⁶. Vores laboratorium har derfor lavet en rustfri protokollen specielt designet til at bevare RNA i post mortem menneskelige lillehjernen med henblik på RNA sekventering efter LCM isolation af Purkinje neuroner.

I forarbejdning frisk frosset væv til LCM'EN, kan metoden fiksering trinløst påvirke både RNA og væv integritet. Formalin fiksering er standard for morfologiske bevarelse, men årsagerne cross-linking der kan splitte RNA og forstyrre RNA forstærkning⁷. Ethanol fiksering er et bedre alternativ til RNA isolering, da det er en coagulative fiksativ, der ikke inducerer tværbindingsmidler¹. For at forbedre visualiseringen af væv morfologi, er xylen det bedste valg, da det fjerner lipider fra vævet. Dog er der kendte begrænsninger når udnytte xylen i LCM, som væv kan tørre ud og blive skør forårsager væv fragmentering ved laser capture⁷. Xylen er også en svingende toksin og skal håndteres korrekt i et stinkskab. Ikke desto mindre har xylen vist sig at øge væv visualisering samtidig også bevare RNA integritet⁸. Derfor Centre vores protokol rundt om brugen af 70% ethanol fiksering og ethanol dehydrering, efterfulgt af xylen inkubation i morfologiske klarhed.

Det er vigtigt at bemærke de forskellige typer af laser-baseret microdissection systemer, som de har vist sig at variere i hastighed, præcision og RNA kvalitet. Den infrarøde (IR) laser fange microdissection og ultraviolet (UV) laser microbeam microdissection systemer var begge roman LCM-platforme, der opstod næsten samtidigt⁸. IR-LCM-systemet anvender en "kontakt-system", ved hjælp af en gennemsigtig termoplastisk film placeret direkte på afsnittet væv og celler af interesse overholde selektivt til filmen af fokuseret impulser fra en IR laser. Alternativt, UV-LCM-systemet er en "ikke-kontakt system" hvorved et fokuserede laserstråle skærer væk celler eller områder af interesse i væv; afhængigt af konfigurationen i to i øjeblikket tilgængelige kommercielle platforme, der bruger enten en inverteret eller opretstående mikroskop design, væv er erhvervet i en samling enhed af en laser-induceret trykbølge, der katapulter det mod tyngdekraften eller væv er indsamlet af tyngdekraften, henholdsvis. Betydelige fordele af UV-LCM-systemet omfatter hurtigere celle erhvervelse, forurening-fri samling med ikke-kontakt tilgang og mere præcise dissektion på grund af en meget mindre laser stråle diameter⁹. Denne protokol blev udviklet specielt til en UV-LCM-systemet og er ikke blevet testet i en IR-LCM-systemet. I enten UV-LCM systemdesign, når akkumulere celler ind i samlingen hætten, brug af en coverslip, øger er cellulære klarhed under mikroskopi ikke egnet, da cellerne ville være i stand til at indgå i samling fælles landbrugspolitik. Derfor, for at forbedre væv visualisering, vi har testet brugen af uigennemsigtige samling caps, der er designet til at fungere som en coverslip for mikroskopiske visualisering i UV-LCM systemer, mod flydende fyldt samling caps. Flydende fyldt samling caps kan være udfordrende, da væsken er underlagt fordampning og skal udskiftes ofte mens du arbejder på mikroskopet. Tid bliver en vigtig faktor for RNA stabilitet, som de erobrede væv opløser straks⁷.

Vores laboratorium undersøgelser postmortem neuropathologic ændringerne i lillehjernen af patienter med væsentlige tremor (ET) og relaterede neurodegenerative lidelser i lillehjernen. Vi har demonstreret morfologiske ændringer centreret om Purkinje celler, der adskiller ET tilfælde versus kontrol, herunder et reduceret antal Purkinje celler, øget dendritiske regression og en række cytoskeletale ændringer, der fører os til at postulere at Purkinje celle degeneration er en core biologiske funktion i ET patogenese^10,11,12,13. Transkriptionel profilering er blevet brugt i mange neurologiske sygdomme til at udforske den underliggende molekylære grundlag af degenerative cellulære ændringer. Men, transcriptional profiler fra heterogene prøver, som hjernen væv regioner, kan virkning maske udtryk for lav overflod udskrifter og/eller mindske påvisning af molekylære forandringer, der sker kun i en lille population af berørte celler, såsom Purkinje celler i den cerebellare cortex. For eksempel, er Purkinje celler langt undertal af rigelige granula celler i den cerebellare cortex af ca 1:3000; således, at effektivt målrette deres transkriptom kræver specifikke isolation af disse neuroner. Den cerebellare cortex er afgrænset af forskellige lag, der adskiller sig i celle tæthed og Cellestørrelse. Denne cellulære arkitektur er ideel til at visualisere i en frisk frosset vævsprøve uden dye-holdige farvning reagenser. I teorien, kunne denne protokol også anvendes til andre vævstyper, der har samme karakteristiske væv organisation.

Denne protokol blev designet til at arbejde specifikt for Purkinje celle visualisering i menneskelige post mortem lillehjernen. Mange protokoller findes for fiksering, farvning visualisering og RNA bevarelsen af mange typer af væv med henblik af både IR - og UV-LCM. Når overvejer en eksperimenterende design for UV-LCM, skal enkeltpersoner skræddersy deres protokol bedst passer til de behov og krav af start- og slutdatoer materialer. Her, kombinerer vi mange aspekter af forskellige LCM protokoller til at give en forbedret metode til at visualisere Purkinje celler i post mortem menneskelige lillehjernen uden farvestof indeholdende farvning reagenser skal forberede transkriptom høj kvalitet RNA sekventering.

Protocol

Alle menneskelige prøver udnyttes i denne protokol er blevet tilvejebragt med informeret samtykke og er blevet godkendt af interne Review Board (IRB) ved Columbia University og Yale University.

Bemærk: Helhed af denne protokol skal følge strenge RNA håndtering retningslinjer, hvorved en behandskede hånd bruges altid, alle overflader rengøres med en RNase decontaminator og alle arbejdende materialer er RNA/DNA/nukleasen gratis.

1. test RNA integritet af væv inden start LCM

Bemærk: Testning RNA kvalitet kan gøres af mange metoder. Sikre, at RNA fra hele sektionen er testet for at give en repræsentativ RNA integritet antal (RIN) for prøven.

1. Omhyggeligt vælge vævsprøver for inklusion, der passer ind i parameteren i den eksperimentelle design. Hvis skæring på kryostater, gå til trin 1,2. Hvis ikke, behandle vævet i overensstemmelse hermed og gå til trin 1.11.
2. Få to containere af tøris. Størrelse vil afhænge af antallet af prøver.
   1. Placer en tom, mærket 2 mL tube med koden væv i den første container af tøris.
      Bemærk: Det tager 10 min. rør til at fryse. Rør skal fryses inden markedsføring vævet ind i dem; ellers, vævet vil smelte på tube overflade.
   2. I en anden beholder med tøris, placere væv fra en-80 ° C fryser, der kræver RNA check.
3. Ren kryostaterne. Se trin 4.7 for detaljeret rengøring procedure.
4. Fjern væv fra tøris og skære en lille del af væv med en RNase dekontamineres barberblad. Væv bør være ca 1 cm x 1 cm i størrelse.
5. Placer en ca. 3 mm høj højen for optimal skæring temperatur (OLT) sammensatte på en kryostaten 'chuck' og lad det delvist fryse. Anbring væv på toppen af OLT — ikke skubbe i OCT, simpelthen lade den hvile ovenpå.
6. Når OCT hærder, placere chuck med monteret vævet i kryostaten skæring arm og position foran kryostaten blade.
7. Trim på 30 μm sektioner, indtil væv er endnu.
8. Skåret 300 μm af væv og sted i en frossen 2 mL tube. Læg tuben tilbage i tøris.
9. Fjern væv fra "chuck" og placere tilbage i tøris indtil klar til at lægge væk.
10. Gentag trin 1.4-1.9 for alle væv.
11. Når alle prøver er komplet, udtrække RNA ved hjælp af RNA udvinding kit leveres (Table of Materials #15). En detaljeret protokol er forsynet med RNA udvinding kit. Følg alle instruktioner, herunder de valgfri trin tør collection tube membran og den valgfri skridt for DNase fordøjelsen (Table of Materials #16).
12. Teste integriteten af ekstraheret RNA via en kvalitet vurdering bioanalyzer¹⁴.

2. klargør før start skæring for LCM

1. Ren dias indehavere før hver runde af væv skæring til LCM'EN. Udfør en rengøring dag før brugen for at tillade fuldstændig tørre natten over.
   Bemærk: Slide indehavere bruges til væv afsnit fiksering i ethanol og clearing i xylen.
   1. Skub kortholderen rengøring procedure: Skyl med RNase decontaminator efterfulgt af diethyletheren pyrocarbonate behandlet (DEPC) vand. Lad tørre natten over hovedet på en RNA/DNA/nukleasen frie overflade, undgå støv eller anden luftbåren kontamination.
      Forsigtighed: DEPC er yderst giftigt og bør håndteres og bortskaffes ved hjælp af EH & S standard farlige kemikalier protokol.
2. Ren børster til skæring med RNase decontaminator og lad tørre natten over. Undgå støv og andre forureninger.
3. Sted membranen glider under UV-lys i 30 min. ved stuetemperatur. Må ikke udsætte dias for UV-mere end 1-2 dage før brug. Dette øger binding af væv til diasset membran.
   Bemærk: Trin 2.3 kan kombineres med trin 4, som giver mulighed for dias UV behandling at forekomme på samme dag som væv skæring (Se trin 4.4).

3. Forbered fiksering løsninger med RNase gratis vand og høj kvalitet Ethanol

Bemærk: Alle løsninger er forberedt friske til hvert eksperiment. Sikre at lysbilledholderen rengøring procedure fra trin 1.1 er afsluttet. Alle løsninger er forberedt i dias indehavere.

1. Anbring 30 mL 100% ethanol i en diasholderen.
2. Fortyndet ethanol med DNase-RNase-nukleasen gratis vand. Sted 30 mL 95% ethanol i et skub kortholderen og lagt på is.
3. Fortyndet ethanol med DNase-RNase-nukleasen gratis vand. Sted 30 mL af 70% ethanol i et skub kortholderen og lagt på is.
4. Sted 30 mL 100% xylen i to separate dias indehavere og mærke dem som #1 og #2.

4. Forbered kryostaten for væv skæring

1. Få en spand med is for ethanol løsninger og en beholder med tør is for væv.
   Forsigtighed: Tøris er ekstremt koldt, så brug beskyttelseshandsker. Placer ikke is og tøris i samme beholder. Forskellige temperaturer i isen og tøris vil få dem til at danne sammen ved en ubestemt temperatur.
2. Fjern væv fra-80 ° C fryser og sted på tøris til transport til kryostaterne.
3. Kryostaten indstillinger:
   1. Indstillet snittykkelse til 14 μm.
   2. Angive trim tykkelsen til 30 μm at bevare væv mængde.
   3. For kryostater med dobbelt kammer og modellen holder temperaturer, indstille kammertemperaturen (CT) på – 18 ° C. Kryostater med én indstilling, indstille temperaturen til-17 ° C.
   4. Kryostater med dobbelt kammer og modellen holder temperaturen, sætte objektet temperatur (OT) til-16 ° C.
      Bemærk: OT skal være varmere end CT at sikre selv skære. Hvis væv stadig shredding, OT kan øges til-15 ° C og CT kan øges til – 18 ° C.
4. Placer vævet i kryostaten i mindst 20 min. at komme til optimal temperatur.
   Bemærk: Hvis væv ikke er på optimal temperatur, vil det sønderdele ved skæring. Placer ikke vævet i-20 ° C natten før at bevare RNA integritet og forhindre is krystal formation. Tillad væv så meget tid som nødvendigt til Reagensglasset optimal temperatur at skære jævnt. Valgfri gennemførelse af dias inkubation under UV kan forekomme her (Se trin 1.3).
5. Placere 'chuck' i kryostaten i mindst 20 min. at komme til temperaturen af kryostaterne.
6. Placer de rene pensler i kryostaten i mindst 20 min. at komme til temperaturen af kryostaterne.
7. Ren kryostaterne
   1. Rense scenen med et 1:1 blanding af RNase decontaminator og 70% ethanol fortyndet med RNA/DNA/nukleasen gratis vand for at undgå frysning på scenen.
   2. Rense en ny engangs kryostaten klinge med RNase decontaminator og sted i klingeholderen på scenen. Tillad mindst 20 min for kryostaterne blade til at komme til temperaturen af kryostaterne.
   3. Ren snitstrækkerpladen med RNase decontaminator og vedhæfte til scenen. Tillad mindst 20 min for snitstrækkerpladen at komme til temperaturen af kryostaterne.
      Bemærk: En snitstrækkerpladen er ikke påkrævet for skæring men kan varmt anbefales. Hvis en snitstrækkerpladen ikke er tilgængelig, fungerer en renset børste som et alternativ. Hvis den snitstrækkerpladen ikke er på den korrekte temperatur, vil vævet smelte eller holde fast ved skæring.

5. skæring væv

1. Skær et lille stykke væv (~ 1 cm x 1 cm) for skæring. Returnere det resterende væv til tøris /-80 ° C fryser.
   Bemærk: Sikre, at afsnittet væv ~ 95% cerebellare cortex, hvor Purkinje celler er placeret.
2. Placer en ca. 3 mm høj højen i OLT til at dække "chuck". Start ved at bygge lag på toppen i en langsom, cirkulær bevægelse, indtil der er en lille gravhøj.
3. Når OCT er delvis frosset, men der er stadig nogle væske i midten, placere væv oven på OCT. Skub ikke vævet dybt ind i oktober Tillad væv til at sidde oven på OCT indtil helt frosset. Dette vil tage 1-2 min.
4. Placere chuck med frosne OCT og vævet i kryostaten skæring arm. Justere væv, så det flugter med kniven.
5. Tillad væv til at sidde i skæring arm for 15-20 min til at tilpasse sig nye temperatur.
   Bemærk: Afhængigt af tykkelsen af vævet, er der behov for tid for temperatur akklimatisering. Tillad væv til at sidde så længe påkrævet at skære renlig. Justere OT og CT til at bistå med væv temperatur akklimatisering.
6. Langsomt flytte væv tættere til bladet. Når vævet er bladet, starte trim processen. Trim tykkelse skal angives til 30 μm.
7. Trim 2 – 3 x, indtil cortex lag er synlige.
8. Placer og Juster snitstrækkerpladen lige over kryostaten blade.
   Bemærk: En sølv linje vises fra lyset i kryostaten på grænsefladen af blade og snitstrækkerpladen. Dette angiver den snitstrækkerpladen er direkte over kanten af vingen.
9. Begynd at skære sektioner på 14 μm. Korrekt skåret sektioner vil være flad under den snitstrækkerpladen.
   Bemærk: Hvis væv er fast, sikre at den snitstrækkerpladen er koldt nok. Hvis nødvendigt, placere et stykke tør is på ydersiden (side ikke at røre ved scenen) vil hurtigt chill den snitstrækkerpladen.
10. Skær 4 – 6 sektioner og justere dem vandret på tværs af kryostaterne scenen.
11. Lystfiskeri diasset, samle op alle stykker af væv på én gang.
    Bemærk: Brug af pensler, løft op enderne af væv til at være mere let tilgængelige for dias ved afhentning. Ikke samle op en sektion ad gangen. Eksponering for stuetemperatur luft vil forringe RNA integritet.
    Forsigtighed: Lad ikke membranen røre fase af kryostaterne. Hvis membranen rører fase, det vil begynde at løsne sig fra glas dias og vil forårsage fejl, når du forsøger LCM.
12. Straks gå til trin 6. Forsinke ikke fiksering.

6. fastsættelse af væv/pletten-mindre visualisering

1. Straks flytte til ethanol fiksering protokol
2. Placer diasset i diasholderen med 70% ethanol i 2 min. — på is.
3. Placer diasset i diasholderen med 95% ethanol for 45 s — på is.
4. Placer diasset i diasholderen med 100% ethanol i 2 min. — på RT.
5. Dyp dias 3 gange i diasholderen med xylen 1 — på RT.
6. Placer diasset i diasholderen med xylen 2 i 5 min – på RT.
7. Lad det tørre i et rent område for mindst 30 min. længere tør gange er optimal, op til 60 min.
   Forsigtighed: Stå op dias til tørring i et stinkskab. Xylen er flygtige. Æglæggende dias flad vil forårsage xylen til pool i afsnittet væv, der medfører væv til at være for mørkt.

7. valgfri — Dias opbevaring

1. Placer tørrede dias i individuelle 50 mL rør (ét dias pr. tube) og sted i-80 ° C fryser i op til 7 dage.
   Bemærk: Dias skal være tør før markedsføring i-80 ° C fryser. Brug ikke tørremiddel inde i røret, som partikler vil indlejre i væv og membran. Sikre, at rør cap er stram; Hvis ikke, vil forekomme kondensering på diaset, når optøning til brug.
   Forsigtighed: RNA integritet falder efter 7 dage, ligesom kvaliteten af væv visualisering.

8. optøning gemt dias til brug

1. Fjerne røret med et enkelt dias fra-80 ° C fryser 1 time forud for den tilsigtede anvendelse.
2. Ikke umiddelbart åbne tuben. Give røret til at komme til stuetemperatur. På ydersiden af røret kun vil der forekomme kondensering.
3. Når røret er kommet til stuetemperatur og alle kondens er væk (ca. 30 – 40 min.), fjerne hætten og udsætte dias til stuetemperatur luft.
4. Tillad at acclimate til stuetemperatur i 15-20 min. forlade diaset inde i røret med fælles landbrugspolitik fjernet dias.
   Bemærk: Dias er nu klar til LCM'EN.

9. laser fange Microdissection Purkinje celler:

Bemærk: Dette afsnit af protokollen vil kun diskutere detaljerne relateret til fange Purkinje celler til efterfølgende RNA sekvensering. Dette afsnit antages det, at brugeren er bekendt med UV laser capture mikroskop og det tilknyttede programmel.

1. Ren stadiet mikroskop og samlingen cap arm med RNase decontaminator.
2. Med behandskede hænder, Placer slide på mikroskopet og 500 μL uigennemsigtig cap i samling arm.
   Bemærk: Altid sikre ordentlig RNA teknik ved at rense arbejdsområdet med RNase decontaminator og bruge behandskede hænder samtidig rørende dias eller uigennemsigtig cap. Handsker kan fjernes, når dias og cap er på plads og laser capture er påbegyndt.
3. Ved lav forstørrelse, justere den uigennemsigtige cap over de cerebellare væv, sikrer at hætten dækker hele området visualiseret i øjet brik.
   Bemærk: Kun øjet brik i mikroskop vil vise, hvis den uigennemsigtige cap er centreret. Kameraet vil ikke vise, hvis fælles landbrugspolitik er centreret over væv. Afhængigt af laser capture anvendelsesområde design, vil visualisering gennem den uigennemsigtige cap enten være i øjet brik eneste eller visualiseret i både øjet brik og kamera.
4. Visualisere de cerebellare lag med 5 x - 10 x mål linse og placere markøren over den sektion, hvor molekylære lag og granulet cellelag skærer hinanden (Purkinje cellelag).
5. Flytte til 40 X og visualisere Purkinje celler.
   Bemærk: Se figur 1 og figur 2 for eksempel visualiseringer.
6. Begynde at indfange Purkinje celler.
   Bemærk: At udføre RNA-sekventering, mindst 5 ng af RNA er påkrævet. Ca 1600-2000 Purkinje celler resultere i nok RNA materiale til sekvensering. RNA vil være stabil i op til 8 h på mikroskopet. Test UV energi og UV fokus før samling at sikre niveauer er korrekte. Over tid, vævet vil fortsætte med at tørre ud og UV energi og UV fokus kan skal ændres.

10. RNA samling post LCM

1. Forberede lysisbuffer celle (forberede frisk hver gang)
   1. Fortyndes 2-mercaptoethanol i lysisbuffer på 1: 100 (10 μL:1 mL, henholdsvis). Lysisbuffer (RLT) er fastsat i Tabel af materialer (#14 og #15).
2. Tilsæt 50 μL af celle lysisbuffer til den uigennemsigtige cap, med fælles landbrugspolitik opad. Luk forsigtigt røret over fælles landbrugspolitik.
3. Forlade tube hovedet i 1 minut.
4. Vortex tube for 30 s og hurtigt spin lysisbuffer til bunden af røret.
5. Genåbne røret og Gentag trin 10.2 – 10.4.
6. Sted rør indeholdende 100 μL lysisbuffer og RNA fra-80 ° C fryser, indtil alle prøverne er færdige og klar til RNA udvinding (Table of Materials #14).

Representative Results

Denne protokol detaljer trin for at forberede UV-LCM frisk frosset post mortem menneskelige hjernevæv. Grundig specifikationer og anmærkninger er givet for kryostaterne skæring, da det kan være svært at skære frisk frosset hjernevæv med en høj grad af præcision. Det vigtigste punkt at overveje er, at frisk frosset væv er ekstremt kolde og kræver en betydelig mængde af tid til at acclimate til et kryostaten varmere temperatur. Dette trin kan ikke være forhastet, og det kan ikke være overvurderet hvor centralt dette skridt er i succes eller fiasko i denne protokol. Hvis væv ikke er forberedt korrekt på kryostater, vil alle efterfølgende forsøg på at identificere celler eller områder af interesse være meget vanskeligt, hvis ikke umuligt.

Efter kryostaten skæring og tildelte tørretid er vævet klar til LCM'EN. Når visualisere vævet under mikroskopet, er cellulære lag af lillehjernen let synlige med 5 X og 10 X mål linser. Figur 1 viser repræsentative billeder af væv fast i ethanol eneste (fig. 1A) og væv inkuberes i xylen efter ethanol fiksering (figur 1B). Vi testet grundigt forskellige ethanol og xylen inkuberingstider / temperaturer på evnen til at både lave og visualisere væv. Hvis væv ikke er inkuberes længe nok i xylen, bliver det resulterende billede mere ligner figur 1A, snarere end figur 1B. Xylen inkubation årsager væv til at blive mørkere og bedre skildrer cellulære lag end gør ethanol alene. Når du skærer på laser capture mikroskop, er 40 X mål linsen forpligtet til at sikre, at indfange kun Purkinje celler, og ikke det omgivende væv. Inkubation i xylen producerer høj kvalitet, morfologisk intakt billede (fig. 1D) i forhold til ethanol fiksering alene (figur 1C).

For yderligere at forbedre visualiseringen af vores væv, testede vi coverslip evne til en uigennemsigtig cap. Andre UV-LCM protokoller udnytte en flydende fyldt cap af en 200-500 μL rør, der opløser væv på kontakt. Flydende fyldt caps kan reducere væv visualisering, forårsager det resulterende billede at være kornede og iriserende under mikroskopet (fig. 2A). Væv visualisering gennem uigennemsigtige cap (figur 2B) resulterer i en glittesinden væv udseende, som er blødere og skarpere i formen. Især, den uigennemsigtige cap giver mulighed for samling op til 8 timer uden behov for udskiftning. Repræsentative billeder af skåret Purkinje celler på lav effekt (figur 2C) og høj effekt (figur 2D, E) vise præcis fjernelse af bare Purkinje cellen kroppen. For reference, figur 2F viser en Luxol Fast blå / hæmatoxylin og Eosin (LH & E) farves cerebellare cortex, som specielt understreger de forskellige lag af lillehjernen og placeringen af Purkinje cellerne i de molekylære lag og granulet celle lag sammenstilling.

Formålet med denne protokol er at opnå høj kvalitet RNA til efterfølgende RNA sekvensering. Vi har testet vores protokol på seks forskellige post mortem menneskelige hjerne prøver, som hver undergik tre dage af LCM at indsamle 1500 – 2000 celler for RNA udvinding. Ca 6-8 h på mikroskopet produceret 500 – 700 celler, som blev derefter kombineret med de foregående dage LCM produkter før RNA udvinding. Prøver undergik RNA udvinding og blev genopslemmes i 14 μL af RNAse-fri vand (Table of Materials #14). Alle seks prøver produceret højkvalitets RNA, med RNA integritet numre (Aani) ≥8 (fig. 3A-F). Denne fremgangsmåde resulterede i RNA mængder på 11,5 ng (fig. 3A), 8.3 ng (fig. 3B), 13.6 ng (figur 3C), 11,5 ng (figur 3D), 14,9 ng (figur 3E) og 26,9 NG (figur 3F). At bemærke er at alle post mortem menneskelige hjerne prøver blev testet for RNA kvalitet før LCM (tabel 1). Hvis prøven af oprindelse har RNA nedbrydning, vil LCM kun yderligere forringe dens integritet.

Figur 1 : Cerebellare lag og Purkinje celle visualisering med og uden xylen behandling. Repræsentative billeder med og uden xylen efter ethanol fiksering og dehydrering. Den molekylære lag (ML) og granulet cellelag (GCL) er mærket. Purkinje celler er markeret med pile. (A) 5 X repræsentation af cerebellare lag visualisering uden xylen. Skalalinjen: 10 µm. (B) 5 X repræsentation af cerebellare lag visualisering med xylen. Skalalinjen: 10 µm. (C) 40 X repræsentation af cerebellare lag visualisering uden xylen. Skalalinjen: 1 µm. (D) 40 X repræsentation af cerebellare lag visualisering med xylen. Skalalinjen: 1 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2 : Purkinje celle visualisering før og efter LCM. Repræsentative billeder på 40 X med xylen efter ethanol fiksering og dehydrering. ML og GCL er mærket. Purkinje celler er markeret med pile. (A) visualisering på mikroskop under væske fyldte cap på 40 x. Skalalinjen: 1 µm. (B) visualisering på mikroskop under uigennemsigtige samling cap på 40 X. Skalalinjen: 1 µm. (C) 5 X visualisering af cerebellare cortex viser skåret Purkinje cellerne mellem ML og GCL. Skalalinjen: 10 µm. (D) 40 X visualisering af en Purkinje celle før excision. Skalalinjen: 1 µm. (E) 40 X visualisering af vellykket Purkinje celle capture. Skalalinjen: 1 µm. (F) 20 X repræsentant LH & E farves lillehjernen viser Purkinje celle organer med markant pile. Skalalinjen: 5 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 3 : RNA kvalitetskontrol Bioanalyzer resultater af LCM prøver. Paneler A-F Vis repræsentative RNA kvalitetskontrol udlæsninger. Hvert panel er en anden stikprøve, der undergik samme LCM processen med fiksering og visualisering med ethanol og xylen kun. RNA integritet numre (Aani) er alle > 8.0. Repræsentative koncentrationer [] resultatet i et udbytte på mindst 5 ng af total RNA. Alle prøver blev elueret i 14 µL af RNAse-fri vand. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Stikprøve	RIN - afsnit Prep	RIN - LCM	[RNA] - LCM	PMI-frosset
A	9.2	8.6	822 pg/µL	450 min
B	9,8	8	598 pg/µL	550 min
C	9.1	8.5	976 pg/µL	455 min
D	9,8	8.2	823 pg/µL	463 min
E	9,8	9.1	1069 pg/µL	1139 min
F	9.6	8.3	1923 pg/µL	1080 min

Tabel 1: Resumé af RNA integritet . Prøven numre svarer til bioanalyzer resultaterne præsenteres i fig. 3. Afsnit præparater er udført før LCM'EN til at sikre, at starte væv er af god kvalitet. Vist er det oprindelige væv Aani afsnit preps, LCM Aani og koncentrationen af RNA fra LCM, såvel som post mortem intervaller til frosne (PMI-frosne) for væv.

Discussion

Protokollen præsenteres her er specielt modificeret til at blive en rustfri tilgang i at visualisere morfologisk forskellige væv for UV-LCM. Denne metode er designet til at maksimere RNA integritet for efterfølgende direkte RNA sekventering, samtidig med at en øget niveau af væv visualisering. Evnen til at skelne mellem forskellige celletyper til fange, hvis du vil oprette den reneste befolkning af celler muligt, er afgørende for at forstå forskellige molekylære profiler i humane væv¹⁵. Inden for rammerne af denne protokol, væv udvælgelsen er altafgørende, som brugen af antigen eller farvestof specifikke reagenser er ikke udnyttet og er derfor ikke velegnet til studier, der kræver sådanne differentiering. Mens dette er en begrænsning af denne protokol, den deraf følgende væv visualisering og RNA integritet er ganske overlegen og vedligeholde relevans i andre eksperimentelle design. Mange andre protokoller findes der også udnytte alternative farvning metoder specifikt for UV - og IR-LCM med den hensigt at bevare RNA. Men de fleste andre metoder indeholder mindst én farvning eller antigen specifikke reagens^6,16,17, er designet til en celle eller organ type, (der ikke er menneskelige obduktion væv)^{18,19, 20}, eller kræver specialiserede RNA-seq kits til at forbedre integriteten²¹. Cresyl violet (Nissl) farvning er en populær farvestof indeholdende reagens, der anvendes i mange protokoller, som det pletter kerner i neuroner i hjernen og forårsager et minimum af RNA nedbrydning⁶. Dog er større kernen af cellen Purkinje ikke godt plettet af cresyl violet, giver ingen signifikant fordel til at visualisere Purkinje celler. Vigtigere, identificeret vi kun én LCM undersøgelse i den litteratur, der beskrev samling af humane celler, Purkinje, som er af betydelig interesse for studiet af cerebellare degenerative og udviklingsmæssige forstyrrelser. Denne undersøgelse farves frossen væv med cresyl violet og isoleret Purkinje celler med en IR-LCM-systemet; prøve Aani så lavt som 5 blev brugt, men anses for acceptabel for microarray analyse²². Derfor er den første protokol undersøgelse, der er designet specifikt til høj kvalitet RNA fra Purkinje celler i post mortem menneskelige lillehjernen skåret ud via UV-LCM.

Stabilitet af RNA i post mortem menneskeligt væv er en velkendt forhindring, som RNA molekyler i celler kan ganske naturligt henfald efter døden. Specifikt, har mRNA vist sig at være den mest modtagelige for nucleolytic nedbrydning⁵. Overvågning af post mortem-interval (PMI) er tid til frysning (PMI-frosne) en metrikværdi, der har vist nogle korrelation til RNA nedbrydning i nogle undersøgelser^23,24,25. Tabel 1 viser imidlertid vores PMI-frosne intervaller for seks prøver, vist i figur 3, som angiver nogen relativ sammenhæng med PMI værdier og RNA kvalitet. Derfor er det nødvendigt at udføre due diligence i at kontrollere RNA integritet før du starter en laser fange projekt. Hvis RNA integriteten af den første prøve er af lav kvalitet, bliver den resulterende RNA fra en LCM produkt af endnu ringere kvalitet. Når lavt RNA integritet ikke kan undgås, kan andre metoder til at forbedre RNA til sekvensering anvendes ud over denne protokol²¹. Navnlig, kan lav-input eller nedbrudt RNA føre til dæmpede kompleksitet og suboptimale resultater, som ofte nødvendiggøre yderligere forstærkning trin. Tilsætning af PCR cyklusser for forstærkning har vist sig at forstærke sekvenser ulige, samt oprette Læs dubletter ved sekventering^26,27. Udnyttelse af høj kvalitet RNA fra LCM prøver til sekvensering er derfor meget fordelagtige.

Visualisering metode ansat i denne protokol stærkt afhængig af brugeren er ekspertise når skære frisk frosset væv på en kryostaten. Protokollen går i omfattende detaljer om, hvordan man bedst forberede væv skæring og placere vævet på diaset. Disse er uden tvivl de to mest kritiske trin i denne protokol. Hvis væv ikke er akklimatiseret til kryostaten temperatur, vil neddeling forekomme, som væsentligt hindrer den morfologiske kvalitet af væv. Makulering er resultatet af et par potentielle problemer; fejlfinding muligheder omfatter venter længere for væv til at komme til temperatur eller ændre kryostaten OT og/eller CT til et varmere område. Når vævet er med held skæres og placeret på scenen, er det vigtigt at orientere væv og ordentligt at sikre alle væv dias passer ind i membranen og præcist kan blive afhentet fra scenen. Når du forsøger at afhente væv fra kryostaterne scenen, vævet skal være koldt, og diaset bør blive varm. Alternative protokoller findes der anbefaler for at chill dias forud for opsamle væv og varmes med en finger hen over området af væv placering²⁸; men i vores hænder, det giver ikke nogen fordel, og ofte forårsager vanskeligheder i picking up væv og overdreven væv folder. Med et dias ved stuetemperatur smelter vævet straks ved kontakt med diaset. For at sikre en ren pickup, er det nødvendigt at vinkel diasset, så det kommer i kontakt med væv på området membran men ikke gå så langt at røre fase, selv. Membranen begynder at løsne sig fra glas dias hvis det rører den fase, som skader membranen og gør laser capture vanskeligt. Hvis dette sker, vil det være mærkbar, når LCM er begyndt og kan ikke fortrydes. Fejlfindingsmuligheder er begrænset; Hvis til enhver tid menes membran eller dias er blevet kompromitteret, er det klogt at kassere. Det anbefales at praksis frisk frosset væv skæring før Start et projekt eller ved hjælp af en patologi kerne, der kan producere høj kvalitet væv skæring. Men hvis du bruger en kerneydelse, sørge for at korrekt RNA teknik er fulgt for at forhindre RNase forurening. RNA nedbrydning kan let opstå når forkert teknik bruges.

Vi har præsenteret her en komplet metode til rustfrit visualisering af Purkinje celler i post mortem menneskelige lillehjernen i forbindelse med UV-LCM. Vi har også inkluderet ordentlig RNA bevarelse metoder og teknikker til at sikre et højt niveau af RNA integritet. Denne protokol er ikke nødvendigvis særlig at enhver én celle eller vævstype, men ikke opretholde kravet om, at region/celle af interesse er Morfologisk adskiller sig fra de omkringliggende stroma uden behov for antigen eller farvestof specifikke anerkendelse.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
MembraneSlide NF 1.0 PEN	Zeiss	415190-9081-000	Membrane slides for tissue. We do not recommend using glass slides.
AdhesiveCap 500 Opaque	Zeiss	415190-9201-000	Opaque caps are used to enhance visualization on inverted scopes only
RNase Away	Molecular BioProducts	7005-11	Other RNase decontamination products are also suitable. Use to clean all surfaces prior to work.
200 Proof Ethanol	Decon Laboratories	2701	If using alternative Ethanol, ensure high quality. Essential for tissue fixation.
Xylenes (Certified ACS)	Fisher Scientific	X5P-1GAL	If using alternative xylene, ensure high quality. Essential for tissue visualization.
UltraPure Distilled Water	Invitrogen	10977-015	Other RNA/DNA/Nuclease free water also suitable. Utilized in ethanol dilution only.
Slide-Fix Slide Jars	Evergreen	240-5440-G8K	Any slide holder/jar is also suitable. Must be cleaned prior to use. Used for fixation following sectioning.
Anti-Roll Plate, Assy. 70 mm 100 μm	Leica Biosystems	14041933980	Anti-roll plate type is determined by type of cryostat and attachment location on stage. All cryostats have differing requirements.
Diethyl pyrocarbonate (DEPC)	Sigma Aldrich	D5758-50mL	DEPC from any vendor will do. Follow directions for water treatment.
Kimwipes	Fisher Scientific	06-666A	Kimwipes can be ordered from any vendor and used at any size. Kimwipes are to be used to clean microscope and cryostat.
Tissue-Plus O.C.T. Compound	Fisher Scientific	23-730-571	Any brand of OCT is acceptable. No tissue will be embedded in the OCT, it is strickly to attach tissue to 'chuck'.
Edge-Rite Low-Profile Microtome Blades	Thermo Scientific	4280L	Blade type is determined by type of cryostat. All cryostats have differing requirements.
Leica Microsystems 3P 25 + 30MM CRYOSTAT CHUCKS	Fisher Scientific	NC0558768	Chuck type is determined by type of cryostat. All cryostats have different requirements. Either size is suitable.
RNeasy Micro Kit (50)	Qiagen	74004	Required for RNA extraction post LCM. RLT Lysis buffer essential to gather captured cells from opaque cap.
RNeasy Mini Kit (50)	Qiagen	74104	Required for RNA extraction of section preps, which are performed prior to LCM to test RNA integrity of starting tissues.
RNase-Free DNase Set	Qiagen	79254	Dnase will remove any DNA to allow for a pure RNA population. Ensure Dnase is made fresh.
2-Mercaptoethanol	Sigma Aldrich	M6250-100ML	Purchased volume at user discretion. Necessary for addition to RLT buffer for cell lysis. Prevents RNase activity.
Globe Scientific Lot Certified Graduated Microcentrifuge Tube (2 mL)	Fisher Scientific	22-010-092	Any 2 mL tube that is RNase free, DNase free, human DNA free, and Pyrogen free will do.