Summary
이 프로토콜 얼룩 없는 접근을 사용 하 여 시각화 하 고 레이저 캡처 서 통해 인간의 사후 뇌에서 신선한-냉동 조직에서 Purkinje 세포를 분리. 이 프로토콜의 목적은 RNA 시퀀싱에 대 한 높은-품질 RNA의 충분 한 양을 생성 하는 것입니다.
Abstract
레이저 캡처 기정 (LCM) cytologically 또는 phenotypically 관련 셀 또는 이기종 조직에서 영역에 대 한 수 있는 유리한 도구입니다. 캡처된 사용할 수 있습니다 다양 한 단백질, 분자 방법에에서 DNA 또는 RNA 격리. 그러나, 인간의 사후 뇌 조직에서 RNA의 보존은 특히 도전적 이다. LCM에 대 한 표준 시각화 기술을 더 또는 추가 수 immunohistochemical 얼룩 절차 RNA 저하 됩니다. 따라서, 우리는 사후 뇌 조직에서 RNA 무결성을 보존 하기의 용도와 LCM에 시각화를 위한 스테인리스 프로토콜 설계 되었습니다. 소 뇌의 Purkinje 세포 크기 및 특성 위치 스테인리스 시각화에 대 한 좋은 후보입니다. 소 뇌 피 질의 세포 밀도, 그들 고배율 현미경에서 식별 하는 좋은 상을 만드는 다른 독특한 레이어 있다. Purkinje 세포는 큰 신경 작은 신경의 밀도가 셀룰러 네트워크는과 립 세포 레이어 및 셀 시체에 스파스는 분자 층 사이 위치. 이 건축 때문에 스테인레스 시각화의 사용은 가능 합니다. 이 표현 형을 모방 하는 다른 기관 또는 셀 시스템도 적합 한 것입니다. 에탄올과 신선한 냉동 조직 수정 하 고 높은 확대 가벼운 현미경 검사 법에서 향상 된 형태학 시각화를 위한 크 실 렌과 지질 제거 스테인리스 프로토콜 설계 되었습니다. 이 프로토콜 다른 고정 방법을 고려 하지 않습니다 하 고 자외선 (UV)를 사용 하 여 캡처한 신선한 냉동 조직 샘플에 대 한 특별히 설계 된-LCM 시스템. 여기, 선물이 단면화 및 후속 RNA 시퀀싱에 대 한 RNA 품질을 유지 하면서 UV LCM에 의해 분리 하는 Purkinje 세포에서 신선한 냉동된 사후 인간 소 뇌 조직 및 RNA의 정화를 해결에 대 한 전체 프로토콜. 우리의 손에이 프로토콜 착 색 시 약을 위한 필요 없이 세포 시각화의 뛰어난 수준을 생산 하 고 transcriptional 프로 파일링 실험에 대 한 필요에 따라 높은 RNA 무결성 번호 (≥8)와 RNA를 생성 합니다.
Introduction
레이저 캡처 기정 (LCM)는 후속 분자로 제어 평가 대 한 병 적 관련 세포의 분리 수 있습니다 귀중 한 연구 도구입니다. 이러한 다른 유형의 조직 표본 및 병리학 및 임상 데이터와 상관 관계에 분자 분석의 사용 생물 학적 연구1의 변환의 평가에 필요한 단계입니다. RNA 유전자 표현 데이터를 분석할 때 언된 조직 단면도의 사용이 좋습니다 RNA의 우수한 품질에 대 한 수 뿐 아니라 수량2최대화. 그것은 잘 설립 되었습니다 높은 품질과 수량 RNA의 RNA 시퀀싱3에서 의미 있는 데이터에 대 한 필수적입니다. 그러나, LCM에 대 한 신선한 냉동된 사후 조직에서 RNA를 사용 하 여 때 RNA 강 직은 주요 도전, 죽음에 즉시 발생 하 고 그 범위는 조직의 컬렉션 방법4,5와 관련 된 다양 한 요인에 의해 중재 . 또한, RNA 저하 얼룩 기법 인식 더 세부 사항 및 셀 식별 하는 데 필요한 때 악화 됩니다. 전문 기술 되며 & 오신, Nissl 얼룩, 얼룩 면역 형광 및 immunohistochemistry 주변 기질에서 세포를 차별화 하는 데 도움이 하지만 RNA 저하 고 사본 식 변경 표시 되었습니다. 프로필6. 따라서, 우리의 실험실 스테인리스 프로토콜 Purkinje 신경의 LCM 격리 후 RNA 시퀀싱의 목적에 대 한 사후 인간 소 뇌에 RNA를 보존 하기 위해 특별히 만들었습니다.
LCM에 대 한 신선한 냉동된 조직 처리, 고정 방법 변함없이 RNA와 조직의 무결성을 발생할 수 있습니다. 포 르 말린 고정 형태 보존을 위한 표준 이지만 원인 있는 cross-linking RNA 수 있습니다 그리고 RNA 증폭7방해. 그것은 상호1을 유도 하지 않는 coagulative 정착 액 에탄올 고정 RNA 격리에 대 한 더 나은 대안입니다. 조직 형태학의 시각화를 향상 시키기 위해, 크 실 렌은 조직에서 지질 제거로 최고의 선택 이다. 그러나, 조직 수 밖으로 건조 하 고 레이저 캡처7시 취 일으키는 조직 조각화 되 LCM, 자일 렌을 활용 하면 제한 알려져 있습니다. 크 실 렌은 또한 휘발성 독 소 하 고 증기 두건에서 제대로 처리 되어야 합니다. 그럼에도 불구 하 고, 크 실 렌은 또한 RNA 무결성8을 유지 하면서 조직 시각화를 향상을 보였다. 따라서, 우리의 프로토콜 70% 에탄올 고정 및 에탄올 탈수, 크 실 렌 외피 형태학 선명도 대 한 다음의 사용 주위 센터.
그것은 그들은 속도, 정밀도, 및 RNA 품질 표시 되었습니다로 서 레이저 기반 시스템의 종류를 주의 하는 것이 중요. 적외선 (IR) 레이저 캡쳐 서 자외선 (UV) 레이저 microbeam 기정 시스템8을 거의 동시에 등장 하는 두 소설 LCM 플랫폼을 했다. IR-LCM 시스템 사용 조직 섹션에 투명 열가 소성 필름을 사용 하 여 "연락처 시스템" 그리고 관심사의 세포 선택적으로 준수 영화 집중된 펄스에 의해 IR 레이저에서. 또는, UV LCM 시스템은 세포 또는 조직;에 대 한 관심의 영역이 그것에 의하여 초점된 레이저 빔을 멀리 인하 "비 접촉 시스템" 거꾸로 또는 똑바로 현미경 디자인 중 하나를 사용 하는 두 현재 사용 가능한 상용 플랫폼에서 구성에 따라 조직 중력에 대 한 투 석기는 레이저 유도 압력 파에 의해 수집 장치로 인수 또는 조직 중력에 의해 각각 수집. UV LCM 시스템의 중요 한 장점 빠른 세포 수집, 비 접촉 방식 및 많은 더 작은 레이저 빔 직경9인 더 정확한 해 부 오염 무료 컬렉션을 포함합니다. 이 프로토콜은 UV LCM 시스템을 위해 설계 된 고 IR LCM 시스템에서 테스트 되지 않았습니다. 어느 UV LCM 시스템 설계에 컬렉션 모자에 축적 셀는 coverslip의 사용을 향상 하는 때 현미경 중 세포 선명도가 아니다 적합, 셀 컬렉션 모자에 입력 수 없습니다. 따라서, 조직 시각화를 향상 시키기 위해, 액체 채워진된 컬렉션 모자에 대 한 UV LCM 시스템에 미세한 시각화 coverslip로 행동 하도록 설계 된 불투명 컬렉션 모자를 사용 하 여 테스트 했습니다. 액체는 증발 하 고 현미경에서 작업 하는 동안 자주 교체 해야 합니다 액체 채워진된 컬렉션 모자, 도전적 일 수 있다. 캡처된 조직을 녹이 고 즉시7시간 RNA 안정성에 대 한 중요 한 요소가 된다.
우리의 실험실 연구 진전 (동부)을 가진 환자의 소 뇌 및 소 뇌의 신경 관련된 질환에 사후 neuropathologic 변경 합니다. 우리는 시연 대 컨트롤, Purkinje 세포의 감소 된 수를 포함 하 여 동부 표준시 경우를 구별 하는 Purkinje 셀에 중심 형태 론 적 변화 증가 수지상 회귀 및 axonal 변화의 다양 한 공준을 선도 그 Purkinje 세포 변성은 외 병10,11,,1213에 핵심 생물 학적 기능입니다. Transcriptional 프로 파일링은 세포 퇴행 성 변화의 기본 분자 단위로 탐구에 많은 신경학 상 질병에 사용 되었습니다. 그러나, 뇌 조직 영역 같은 다른 유형의 샘플에서 transcriptional 프로필 수 effectually 낮은 풍부 성적 표현의 마스크 또는 감소의 영향을 받는 작은 인구에서 서만 발생 하는 분자 변화 감지 소 뇌 피 질에서 Purkinje 세포와 같은 세포. 예를 들어, Purkinje 세포는 훨씬 숫 적 소 뇌 피 질에 풍부한과 립 세포에 의해 약 1:3000; 따라서, 효과적으로 대상에 자신의 transcriptome 이러한 뉴런의 특정 격리가 필요합니다. 소 뇌 피 질 세포 밀도 및 셀 크기 고유 층에 의해 구분 된입니다. 이 세포질 건축 착 색 시 약 염료를 포함 하지 않고 신선한 냉동 조직 샘플에서 시각화 이상적입니다. 이론적으로,이 프로토콜 또한에 적용할 수 있는 비슷한 독특한 조직 다른 조직 유형 조직.
이 프로토콜은 인간의 사후 소 뇌의 Purkinje 세포 시각화를 위해 특별히 작동 하도록 설계 되었습니다. 수많은 프로토콜 고정, 시각화 및 조직의 많은 종류의 RNA 보존 목적의 두 IR-와 UV-LCM에 대 한 얼룩을 위한 존재 한다. UV LCM에 대 한 실험 설계를 고민 하는 경우 개인 필요와 시작 및 끝 재료의 요구 사항에 가장 적합 하 그들의 프로토콜에 맞게 해야 합니다. 여기, 우리가 transcriptome 수준 높은 RNA 준비 착 색 시 약을 포함 하는 염료의 필요 없이 사후 인간의 뇌에서 Purkinje 세포를 시각화에 대 한 향상 된 방법을 제공 하기 위해 다른 LCM 프로토콜의 여러 측면을 결합 시퀀싱.
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Protocol
이 프로토콜에서 사용 하는 모든 인간의 샘플 동의를 얻은 고 컬럼비아 대학과 예일 대학에서 내부 검토 위원회 (IRB)에 의해 승인 되었습니다.
참고: 이 프로토콜의 전체 처리 지침, 엄격한 RNA를 따라야 한다 그것에 의하여 gloved 손을 항상 사용, 모든 서피스는 RNase decontaminator로 청소는 모든 작동 물질이 RNA/DNA/Nuclease 무료.
1. 시작 LCM 이전 조직의 RNA 무결성 테스트
참고: RNA 품질을 테스트 하는 것은 많은 방법으로 할 수 있습니다. 전체 섹션에서 RNA에 대 한 대표적인 RNA 무결성 번호 (린)을 제공 하는 샘플에 대 한 테스트를 확인 합니다.
- 신중 하 게 조직 샘플 실험 디자인의 매개 변수 내에 적합 포함을 선택 합니다. cryostat에서 절단, 1.2 단계도 이동 합니다. 그렇지 않으면, 조직을 적절 하 게 처리 하 고 단계 1.11로 이동.
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드라이 아이스의 두 개의 컨테이너를 얻을. 크기는 샘플의 수에 따라 달라 집니다.
- 드라이 아이스의 첫 번째 컨테이너에서 조직 코드와 빈, 레이블 2 mL 튜브를 놓습니다.
참고: 그것은 동결 튜브에 대 일 분 걸립니다. 튜브; 그들에 조직 배치 하기 전에 동결 해야 합니다. 그렇지 않으면, 조직 관 표면에 녹아 것입니다. - 드라이 아이스의 두 번째 컨테이너에서 RNA 검사를 필요로 하는-80 ° C 냉동 고에서 조직을 놓습니다.
- 드라이 아이스의 첫 번째 컨테이너에서 조직 코드와 빈, 레이블 2 mL 튜브를 놓습니다.
- cryostat 청소. 자세한 절차를 청소 단계 4.7을 참조 하십시오.
- 드라이 아이스에서 조직을 제거 하 고 소독 RNase 면도날으로 조직의 작은 부분을 잘라. 조직에는 대략 1 cm × 1 cm 크기에 해야 합니다.
- 최적의 절삭 온도 (10 월)의 약 3 m m 높은 마운드 복합 cryostat '척'에 놓고 부분적으로 고정을 합니다. 그런 다음 OCT의 위에 조직 배치-10 월에, 간단 하 게 상단에 그것을 허용 하지.
- 일단 10 월 견고, cryostat 절단 팔과 cryostat 블레이드 앞 위치에 탑재 된 조직으로 척을 놓습니다.
- 조직 될 때까지 심지어 30 μ m 섹션에서 트림.
- 조직 및 냉동된 2 mL 튜브에서 300 μ m를 잘라. 드라이 아이스로 다시 튜브를 놓습니다.
- '척'에서 조직을 제거 하 고 멀리 넣어 준비까지 드라이 아이스로 다시 배치.
- 모든 조직에 대 한 1.4-1.9 단계를 반복 합니다.
- 모든 샘플 완료 되 면 RNA는 RNA 추출 키트 제공 (테이블의 자료 #15)를 사용 하 여 추출. 자세한 프로토콜 RNA 추출 키트와 함께 제공 됩니다. 컬렉션 튜브 멤브레인과 DNase 소화 (재료의 테이블 #16)에 대 한 선택적 단계 건조 선택 단계를 포함 한 모든 지침을 따릅니다.
- 품질 평가 bioanalyzer14을 통해 추출 된 RNA의 무결성을 테스트 합니다.
2. LCM에 대 한 단면 시작 전에 준비
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LCM에 대 한 조직 단면 각 라운드 전에 슬라이드 홀더를 청소 하십시오. 하룻밤 건조 완료 수 있도록 사용 하기 전에 하루 청소 절차를 수행 합니다.
참고: 슬라이드 홀더 에탄올에 조직 섹션 고정 및 개간 자일 렌에 사용 됩니다.- 슬라이드 홀더 절차를 청소: RNase decontaminator diethyl pyrocarbonate 치료 (DEPC) 물 다음 씻어 내어 주세요. 어떤 먼지 또는 다른 공 수 오염 피하는 RNA/DNA/Nuclease 무료 표면에 거꾸로 하룻밤 건조를 허용 합니다.
주의: DEPC는 매우 독성 처리 및 어 & S 표준 유해 화학 물질 프로토콜을 사용 하 여 삭제 해야 합니다.
- 슬라이드 홀더 절차를 청소: RNase decontaminator diethyl pyrocarbonate 치료 (DEPC) 물 다음 씻어 내어 주세요. 어떤 먼지 또는 다른 공 수 오염 피하는 RNA/DNA/Nuclease 무료 표면에 거꾸로 하룻밤 건조를 허용 합니다.
- 청소 브러쉬 RNase와 단면에 대 한 decontaminator과 하룻밤 건조 수 있습니다. 모든 먼지와 다른 오염 물질을 피하십시오.
- 장소는 막 실 온에서 30 분 동안 자외선 아래 슬라이드. 폭로 UV 슬라이드 보다 더 많은 1-2 일 이전에 사용 하지 마십시오. 이 막 슬라이드에 조직의 바인딩을 향상 시킵니다.
참고: 단계 2.3 슬라이드 조직 단면 (참조 단계 4.4)으로 같은 날에 자외선 치료 수 있는 4 단계 결합 될 수 있다.
3. 준비 RNase 무료 물과 높은-품질 에탄올 고정 솔루션
참고: 모든 솔루션은 모든 실험에 대 한 신선한 준비. 슬라이드 홀더 단계 1.1에서 절차를 청소 완료 확인 합니다. 모든 솔루션은 슬라이드 홀더에 준비 된다.
- 한 슬라이드 홀더에 100% 에탄올 30 mL를 배치 합니다.
- RNase/DNase/Nuclease 무료 물과 에탄올을 희석. 하나에 95% 에탄올의 장소 30 mL 홀더 슬라이드와 얼음에 넣어.
- RNase/DNase/Nuclease 무료 물과 에탄올을 희석. 하나에 70% 에탄올의 장소 30 mL 홀더 슬라이드와 얼음에 넣어.
- 두 자일 렌 100%의 장소 30 mL 슬라이드 홀더 고 # 1과 # 2로 레이블을 지정 합니다.
4. Cryostat 조직 단면에 대 한 준비
- 에탄올 솔루션 및 컨테이너는 조직에 대 한 드라이 아이스와 얼음 양동이 얻을.
주의: 드라이 아이스는 매우 춥고, 너무 보호 장갑을 사용. 같은 컨테이너에 얼음과 드라이 아이스를 배치 하지 마십시오. 얼음과 드라이 아이스에 각기 다른 온도 함께 불확정 온도에서 형태를 그들을 일으킬 것입니다. - -80 ° C 냉장고를 전송에 대 한 드라이 아이스에 장소는 cryostat 조직을 제거 합니다.
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Cryostat 설정:
- 섹션 두께 14 μ m으로 설정 합니다.
- 조직 수량을 유지 하기 위해 30 μ m을 트림 두께 설정 합니다.
- Cryostats 듀얼 챔버와 견본 온도 들고,-18 ° c.에 챔버 온도 (CT) 설정 한 설정 cryostats-17 ° c 온도 설정
- Cryostats 듀얼 챔버와 견본 온도 잡고에 대 한 설정 개체 온도 (OT)-16 ° c
참고: OT도 절단 되도록 CT 보다 따뜻한 될 필요가 있다. 조직을 분쇄 여전히 OT-15 ° C에 증가 될 수 있다 고 CT-18 ° c 증가 될 수 있다
- 최적의 온도에 올 수 있도록 적어도 20 분 동안 cryostat 조직을 놓습니다.
참고: 조직 되지 않은 경우 최적의 온도에서 그것은 절단 시 분쇄기 것입니다. 배치 하지 마십시오 조직-20 ° C에서 전날 밤 RNA 무결성을 유지 하 고 얼음 결정 형성을 방지. 많은 조직 허용 필요에 따라 최적의 온도 원활 하 게 잘라 equilibrate 시간. 자외선 아래 슬라이드 외피의 선택적 구현 (1.3 단계 참조) 여기 발생할 수 있습니다. - cryostat의 온도를 내려 올 수 있도록 적어도 20 분 동안 cryostat에 '척'을 배치 합니다.
- 깨끗 한 브러쉬는 cryostat의 온도를 내려 올 수 있도록 적어도 20 분 동안 cryostat에 놓습니다.
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청소는 cryostat
- 무대에서 동결을 방지 하기 위해 RNA/DNA/Nuclease 무료 물으로 희석 RNase decontaminator와 70% 에탄올의 1:1 혼합물으로 무대를 청소.
- 무대에서 RNase decontaminator와 블레이드 홀더에서 새로운 일회용 cryostat 블레이드를 청소. Cryostat 블레이드는 cryostat의 온도에 대 일 분 이상 허용 합니다.
- RNase decontaminator와 안티 롤 접시를 청소 하 고 무대에 연결 합니다. 안티 롤 접시는 cryostat의 온도에 서 20 분 이상 허용 합니다.
참고: 안티 롤 플레이트 절단을 위한 필요 하지 않습니다 하지만 좋습니다. 안티 롤 접시를 사용할 수 없는 경우 청소 브러시 대신 작동 합니다. 올바른 온도에서 안티 롤 접시 없으면 조직을 녹여 또는 절단 시 스틱.
5. 단면 조직
- 단면에 대 한 조직 (~ 1 cm × 1 cm)의 작은 조각 잘라. 드라이 아이스-80 ° C 냉동 고에 남은 조직을 반환 합니다.
참고: 조직 섹션 ~ 95% 소 뇌 피 질, Purkinje 세포 있는 위치 인지 확인 합니다. - '척'을 충당 하기 위해 10 월의 약 3 m m 높은 마운드를 놓습니다. 작은 마운드까지 느린, 원형 모션에 위에 레이어를 구축 하 여 시작 합니다.
- 일단 10 월이 부분적으로 고정 하 고, 그러나 아직도 센터에서 약간 액체는, 위에 10 월 조직을 놓습니다. 마십시오 하지 조직 깊이에 밀어 10 월 허용 10 월 완전히 고정 될 때까지 위에 앉아 조직. 이 1-2 분 소요 됩니다.
- '척' 냉동 oct와 조직 cryostat 절단 팔에 놓습니다. 그것은 플러시 절단 블레이드와 조직을 조정 합니다.
- 새로운 온도 조정에 15-20 분에 대 한 절단 팔에 앉아 조직을 수 있습니다.
참고: 직물의 두께 따라 시간 온도 새 환경 순응 필요 합니다. 으로 깔끔하게 잘라 하는 데 필요한 앉아 조직을 수 있습니다. OT 및 CT 조직 온도 새 환경 순응을 지원 하기 위해 조정 합니다. - 천천히 블레이드 조직 가까이 이동합니다. 조직에는 칼 날에 도달 했습니다, 일단 손질 과정을 시작 합니다. 트림 두께 30 μ m로 설정 합니다.
- 피 질 레이어는 표시 될 때까지 2-3 배를 잘라.
- 배치와 안티 롤 플레이트 바로 위에 cryostat 블레이드를 맞춥니다.
참고: 실버 라인 블레이드와 안티 롤 접시의 인터페이스에서 cryostat에 빛에서 나타날 것 이다. 이 안티 롤 플레이트 바로 위에 잎의 가장자리는 나타냅니다. - 14 μ m에 섹션을 시작 합니다. 제대로 컷된 섹션 평면 안티 롤 접시 아래 있을 것입니다.
참고: 조직이 붙어있다 면 안티 롤 접시 충분히 감기 인지 확인 합니다. 드라이의 조각을 배치 하는 데 필요한 외부 (안 만질 무대 쪽)에 빠르게 얼음 안티 롤 접시를 침착 해. - 4-6 섹션을 잘라내어 cryostat 무대를 가로질러 그들을 수평으로 정렬.
- 조직의 모든 부분을 한 번에 선택 슬라이드, 낚시.
참고: 픽업 시 슬라이드에 대 한 더 쉽게 사용할 수 있도록 조직의 끝을 들어올려 브러쉬를 사용 하 여. 한 번에 한 부분을 선택 하지 마십시오. 실내 온도 공기에 노출에는 RNA 무결성을 저하 됩니다.
주의: 터치는 cryostat의 무대 막을 게 하지 마십시오. 막 감동 무대, 그것은 유리 슬라이드에서 분리 예정 하 고 LCM을 시도할 때 오류가 발생 합니다. - 즉시 단계 6으로 이동 합니다. 고정을 지연 하지 않습니다.
6. 고정 조직/얼룩 없는 시각화
- 에탄올 기정 프로토콜 즉시 이동
- 슬라이드에 슬라이드 홀더 2 분 동안 70% 에탄올과 장소-얼음에.
- 45에 대 한 95% 에탄올과 슬라이드 홀더 슬라이드 에서도 s-얼음에.
- 슬라이드에 슬라이드 홀더 2 분 100% 에탄올과 장소-실시간에
- 3 번에 크 실 렌 1와 슬라이드 홀더 슬라이드를 찍어-실시간에
- 에 자일 렌 2 5 분 동안 함께 슬라이드 홀더 슬라이드 배치-실시간에
- 적어도 30 분 이상 건조 시간 최적, 최대 60 분에 대 한 깨끗 한 지역에 건조를 허용 합니다.
주의: 증기 두건에서 건조에 대 한 슬라이드를 서 있다. 크 실 렌은 휘발성 이다. 누워 슬라이드 플랫 너무 어두운 것을 조직 하면 조직 섹션에 풀에 크 실 렌을 발생 합니다.
7. 옵션-슬라이드 저장
- 최대 7 일 동안 말린된 슬라이드-80 ° C 냉동 실에 개별 50 mL 튜브 (한 슬라이드 튜브 당)에 놓습니다.
참고: 슬라이드-80 ° C 냉장고에 배치 하기 전에 건조 되어야 합니다. 로 미 립 자 조직에 막 포함 됩니다 튜브 내부 방 습 제를 사용 하지 마십시오. 튜브 캡 꽉; 인지 확인 그렇지 않은 경우에 사용 하기 위해 해빙 때 슬라이드에 응축 발생 합니다.
주의: 마찬가지로 조직 시각화의 품질 RNA 무결성, 7 일 후 감소 합니다.
8. 사용 하기 위해 슬라이드를 저장 해빙
- -80 ° C 냉동 고 사용 전에 1 h에서 단일 슬라이드 튜브를 제거 합니다.
- 즉시 열지 마십시오 튜브. 실내 온도에 서 관을 허용 한다. 응축 관만의 외부에 발생 합니다.
- 일단 튜브 실내 온도에 그리고 모든 응축은 사라 졌 어 요 (약 30-40 분) 모자를 제거 하 고 상 온 공기를 폭로.
- 15-20 분 두고 모자와 튜브 안쪽 슬라이드 제거에 대 한 실내 온도에 적응을 슬라이드를 수 있습니다.
참고: 슬라이드는 이제 LCM에 대 한 준비가 되었습니다.
9. 레이저 Purkinje 세포의 서를 캡처:
참고: 이 섹션은 프로토콜의 캡처 이후 RNA 시퀀싱 Purkinje 세포와 관련 된 구체적인 설명만. 이 섹션은 사용자 UV 레이저 캡처 현미경 및 제휴 소프트웨어에 익숙한 가정 합니다.
- 깨끗 한 현미경 단계와 모자 컬렉션 RNase decontaminator와 팔.
- 장갑 낀 손으로 컬렉션 팔에서 현미경에 슬라이드 및 500 μ 불투명 뚜껑을 놓습니다.
참고: 항상 RNase decontaminator로 작업 영역을 정리 하 여 적절 한 RNA 기술을 확인 하 고 슬라이드 또는 불투명 모자를만 지는 동안 gloved 손을 사용. 장갑은 슬라이드와 캡 자리에 되 고 레이저 캡처 시작 되 면 제거할 수 있습니다. - 낮은 확대율에서 불투명 모자는 모자 전체 면적 눈 조각에서 시각 확인 소 뇌 조직에 맞춥니다.
참고: 현미경의 눈 조각만 불투명 캡 중심으로 하는 경우 표시 됩니다. 카메라는 경우 뚜껑은 가운데 조직에 표시 되지 않습니다. 레이저 캡처 범위 디자인에 따라 불투명 모자를 통해 시각화가 됩니다 눈 조각만 또는 눈 조각 및 카메라에서 시각에. - 5 배-10 배 대물 렌즈와 소 뇌 레이어를 시각화 하 고 분자 층 및과 립 세포 층이 교차 (Purkinje 세포 층) 섹션에 커서를 놓습니다.
- 40 X 이동한 Purkinje 세포를 시각화 합니다.
참고: 예를 들어 시각화에 대 한 그림 1 과 그림 2 참조. - Purkinje 세포 캡처를 시작 합니다.
참고: 적어도 5 RNA 시퀀싱을 수행 하려면 RNA의 ng가 필요. 약 1600-2000 Purkinje 세포 시퀀싱에 대 한 충분 한 RNA 자료 귀 착될. RNA는 현미경에서 최대 8 h에 대 한 안정 될 것입니다. 컬렉션 수준 보장 하기 전에 테스트 자외선 에너지와 UV 올바른지. 시간이 지남에, 조직을 계속 건조 하 고 자외선 에너지와 UV 초점 변경 해야 할 수 있습니다.
10. RNA 컬렉션 게시물 LCM
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세포 세포의 용 해 버퍼를 준비 (신선한 준비 때마다)
- 1: 100에 세포의 용 해 버퍼에서 2-mercaptoethanol 희석 (10 μL:1 mL, 각각). 세포 (RLT) 버퍼 테이블의 자료 (#14, #15)에 제공 됩니다.
- 세포 세포의 용 해 버퍼의 50 μ 향하도록 모자와 불투명 한 모자를 추가 합니다. 조심 스럽게 뚜껑을 통해 튜브를 닫습니다.
- 거꾸로 1 분에 대 한 튜브를 둡니다.
- 소용돌이 관 30 s 신속 하 게 세포의 용 해 버퍼 튜브의 아래쪽에 회전.
- 튜브를 다시 하 고 반복 단계 10.2-10.4.
- 모든 샘플 완료 및 RNA 추출 (재료의 테이블 #14)에 대 한 준비가 될 때까지 세포의 용 해 버퍼 및-80 ° C 냉동 고에서 RNA의 100 μ를 포함 하는 튜브를 놓습니다.
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Representative Results
이 프로토콜 UV LCM에 대 한 신선한 냉동된 사후 뇌 조직 준비 하는 단계를 자세히 설명 합니다. 철저 한 사양 및 주석 받는다 cryostat 절단, 정밀도의 고차를 가진 신선한 냉동된 뇌 조직을 절단 하는 것이 어려울 수 있습니다 대로. 고려해 야 할 가장 중요 한 포인트가입니다 신선한 냉동된 조직 매우 추운 이며 상당한은 cryostat의 따뜻한 온도에 적응 하는 시간이 필요 합니다. 이 단계를 급하게 수 없습니다, 그리고 어떻게 중앙이 단계는이 프로토콜의 실패 또는 성공에 그것 overstated 수 없습니다. 조직에는 cryostat 제대로 준비 하지 않습니다, 경우 셀 또는 관심 영역 식별에 모든 후속 시도 매우 어려운, 불가능 한 것입니다.
Cryostat 단면화 및 할당 된 건조 시간, 조직 LCM에 대 한 준비입니다. 현미경 조직 시각화 때 소 뇌의 세포 층 렌즈 10 X 5 X와 쉽게 볼 수 있습니다. 그림 1 보여줍니다 에탄올만그림 1(A) 및 조직에서 조직의 대표 이미지 고정 자일 렌 에탄올 고정 (그림 1B) 다음에 인 큐베이 팅. 우리는 엄격 하 게 테스트 다양 한 에탄올과 자일 렌 보육 시간/온도 둘 다에 능력에 수정 조직 시각화. 조직 충분히 크 실 렌에서에서 incubated 하지, 그림 1B보다는 오히려 그림 1A, 결과 이미지 더 밀접 하 게 닮은 것 이다. 크 실 렌 외피 원인을 어둡게 하 고 더 나은 될 조직 보다 세포 레이어를 구분지 않습니다 에탄올 혼자. 레이저 캡처 현미경에서 절단 하는 경우 40 X 객관적 렌즈는 Purkinje 세포와 주변 조직을 하지만 캡처를 보장 합니다. 크 실 렌에서 부 화, 형태학 상으로 그대로 이미지 (그림 1D) 에탄올 고정 혼자 (그림 1C)에 비해 높은 품질을 생성 합니다.
더욱 우리의 조직의 시각화를 향상 시키기 위해, 불투명 한 cap의 coverslip 능력 테스트. 다른 UV LCM 프로토콜 접촉에 조직을 녹이 고 200-500 μ 튜브의 액체 채워진된 모자를 활용 합니다. 액체 채워진된 모자 조직 시각화, 결과 이미지를 세밀 하 고 (그림 2A) 현미경 무지개 빛깔의 발생을 줄일 수 있습니다. 부드럽고 선명한 형태로 흐려져 조직 외관에서 불투명 캡 (그림 2B) 결과 통해 조직 시각화. 특히, 불투명 캡 교체에 대 한 필요 없이 h 8까지 컬렉션에 대 한 수 있습니다. 낮은 전력 (그림 2C) 및 높은 전력 (그림 2D, E)에서 삭제 Purkinje 세포의 대표 이미지는 그냥 Purkinje 세포 체의 정확한 제거를 표시합니다. 참고로, 그림 2F 는 Luxol 빠른 블루 / Hematoxylin과 오신 (LH & E) 스테인드 소 뇌 피 질, 소 뇌의 다른 레이어와 분자에서 Purkinje 세포의 배치를 특히 강조 하 레이어 및과 립 세포 층 나란히.
이 프로토콜의 목적은 후속 RNA 시퀀싱에 대 한 고품질의 RNA를 얻을 것입니다. 6 다른 사후 인간의 두뇌 샘플, 각 3 일 1500-2000 셀 RNA 추출에 대 한 수집에 LCM의 수술에 우리의 프로토콜 테스트. 현미경에서 대략 6-8 h 생산 500-700 셀, RNA 추출 전에 전날 LCM 제품 함께 했다. 샘플은 RNA 추출 수술 하 고 14 μ RNAse 무료 물 (재료의 테이블 #14)에서 resuspended 했다. 모든 6 개의 샘플 생산 고품질 RNA, RNA 무결성 ≥8 숫자 (신장)와 (그림 3A-F). 이 절차 결과 11.5 RNA 수량 ng (그림 3A), 8.3 ng (그림 3B), 13.6 ng (그림 3C), 11.5 ng (그림 3D), 14.9 ng (그림 3E) 및 26.9 ng (그림 3F). 메모의 모든 사후 인간의 두뇌 샘플 LCM (표 1) 이전 RNA 품질에 대 한 테스트 되었습니다입니다. 경우 원래 샘플 RNA 저하, LCM의 무결성을 저하만 추가 됩니다.
그림 1 : 소 뇌 레이어 및 Purkinje 세포 시각화와 자일 렌 치료 없이. 대표 이미지와 자일 렌 없이 에탄올 고정 및 탈수. 분자 층 (ML) 및과 립 세포 층 (GCL) 표시 되어 있습니다. Purkinje 세포는 화살표와 함께 표시 됩니다. (A) 5 X 크 실 렌 없이 소 뇌 레이어 시각화의 표현. 눈금 막대: 10 µ m. (B) 5 X 크 실 렌과 소 뇌 레이어 시각화의 표현. 눈금 막대: 10 µ m. (C) 40 X의 표현 없이 자일 렌 소 뇌 레이어 시각화. 눈금 막대: 1 µ m입니다. (D) 40 X 크 실 렌과 소 뇌 레이어 시각화의 표현. 눈금 막대: 1 µ m입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2 : Purkinje 세포 시각화 LCM 전후. 40 X 크 실 렌에서 대표 이미지 에탄올 고정 및 탈수. ML와 GCL 레이블이 지정 됩니다. Purkinje 세포는 화살표와 함께 표시 됩니다. 액체에서 현미경에 (A) 시각화 가득 40 x 모자. 눈금 막대: 1 µ m. 불투명 컬렉션에서 현미경에 (B) 시각화 40 X 모자. 눈금 막대: 1 µ m. (C) X 5 ML와 GCL 사이 삭제 Purkinje 세포를 보여주는 소 뇌 피 질의 시각화. 눈금 막대: 10 µ m. (D) 40 X 시각화 절단 전에 Purkinje 세포의. 눈금 막대: 1 µ m입니다. (E) 40 X 시각화는 성공적인 Purkinje 세포 캡처의. 눈금 막대: 1 µ m입니다. (F) 20 X 대표 LH 및 전자 얼룩 소 뇌 표시 Purkinje 세포 시체 표시 된 화살표와 함께. 눈금 막대: 5 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3 : LCM의 RNA 품질 관리 Bioanalyzer 결과 샘플. 패널 A-F 는 대표적인 RNA 품질 관리 정보를 표시 합니다. 각 패널은 서로 다른 샘플입니다 고정 및 시각화 에탄올과 자일 렌만의 동일한 LCM 과정을 겪었다. RNA 무결성 번호 (신장)은 모두 > 8.0. 적어도 5의 수확량에 대표 농도 결과 총 RNA의 ng. 모든 샘플 했다 eluted RNAse 무료 물 14 µ L에서. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
| 샘플 | 린-섹션 준비 | 린-LCM | [RNA]-LCM | PMI-냉동 |
| A | 9.2 | 8.6 | 822 pg / µ l | 450 분 |
| B | 9.8 | 8 | 598 페이지 / µ l | 550 분 |
| C | 9.1 | 8.5 | 976 페이지 / µ l | 455 분 |
| D | 9.8 | 8.2 | 823 pg / µ l | 463 분 |
| E | 9.8 | 9.1 | 1069 pg / µ l | 1139 분 |
| F | 9.6 | 8.3 | 1923 pg / µ l | 1080 분 |
표 1: RNA 무결성의 요약 . 샘플 번호 bioanalyzer 결과 그림 3에 표시에 해당 합니다. 섹션 준비 되도록 조직 시작 좋은 품질의 LCM 전에 수행 됩니다. 표시는 섹션 preps LCM 신장, LCM에서 RNA의 농도에서 원래 조직 신장 뿐만 아니라 사후 간격 고정 (PMI-냉동) 조직에 대 한.
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Discussion
여기에 제시 된 프로토콜 특히 UV LCM에 대 한 시각화 하는 형태학 상으로 다른 조직에 스테인리스 접근 하도록 수정 됩니다. 이 메서드는 후속 직접 RNA 시퀀싱, 조직 시각화의 향상 된 수준을 유지 하면서 RNA 무결성을 최대화 하기 위해 설계 되었습니다. 가능한, 셀의 순수한 인구를 만드는 캡처, 다른 세포 유형 구별 하는 기능 이해 하는 인간의 조직15다른 분자 프로 파일에 대 한 필수적입니다. 이 프로토콜의 컨텍스트 내에서 조직 선택은 중요 하 고, 항 원의 사용으로 또는 염료 특정 시 약 활용 되지 및 따라서 이러한 차별화를 요구 하는 연구에 적합 하지 않습니다. 이이 프로토콜의 한계, 결과 조직 시각화 및 RNA 무결성 꽤 우수한 있으며 다른 실험적인 디자인에 관련성을 유지. 다른 많은 프로토콜 대체 얼룩 방법을 구체적으로 대 한 UV-및 IR-LCM 보존 RNA는 의도로 사용 하는 존재. 그러나, 대부분의 다른 메서드와 적어도 하나의 얼룩 또는 항 원 특정 시 약6,16,17를 포함, 하나의 셀 또는 기관 유형 (하지 않은 인간의 부검 조직)를 위한18,19, 20, 또는 전문된 RNA-seq 키트21무결성 향상 시키기 위해 필요. Cresyl 바이올렛 (Nissl) 얼룩이 많은 프로토콜에서 사용 하는 뇌의 신경 세포에는 핵 얼룩 하 고 RNA 저하6의 최소 금액을 발생 시 약을 포함 하는 인기 있는 염료 이다. 그러나, Purkinje 세포의 더 큰 핵은 잘 cresyl 바이올렛, Purkinje 세포를 시각화에 대 한 상당한 혜택을 제공 하 여 얼룩이 되지. 중요 한 것은, 우리 인간의 Purkinje 세포, 소 뇌 퇴행 성 발달 장애의 연구에 상당한 관심의 컬렉션을 설명 하는 문학에 하나의 LCM 연구 발견. 이 연구 cresyl 바이올렛 냉동된 조직 얼룩이 지 고는 IR LCM 시스템 Purkinje 세포 격리 신장 5 사용 했지만 microarray 분석22적합 간주 낮은 샘플. 따라서, 이것은 높은 품질 UV LCM 통해 excised 사후 인간의 뇌의 Purkinje 세포에서 RNA를 위해 특별히 설계 된 첫 번째 프로토콜 연구 이다.
사후 인간의 조직에서 RNA의 안정성은 잘 알려진 장애물 세포 내 RNA 분자 받습니다 꽤 자연 스러운 감퇴 죽음 후. 특히, mRNA nucleolytic 저하5에 가장 취약 되도록 표시 되었습니다. 사후 간격 (PMI)의 모니터링 시간 (PMI-냉동) 동결을 일부 연구23,,2425에 RNA 저하에 어떤 상관 관계를 표시 한 통계입니다. 그러나, 표 1 표시 된 그림 3, PMI 값 및 RNA 품질 상대 아무 상관 관계를 나타내는 6 개의 샘플에 대 한 우리의 PMI 고정 간격 보여준다. 따라서, 그것은 수행 하는 데 필요한 레이저 캡처 프로젝트를 시작 하기 전에 RNA 무결성 검사에 실사. 시작 샘플의 RNA 무결성 낮은 품질의 인 경우에, LCM 제품에서 결과 RNA 더 낮은 품질의 것입니다. 낮은 RNA 무결성을 피할 수 없다 때 강화 RNA 시퀀싱에 대 한 다른 방법이 프로토콜21이외에 채택 될 수 있습니다. 특히, 낮은 입력 또는 저하 RNA 음소거 복잡성과 자주 추가 증폭 단계를 필요로 하는 차선의 결과 발생할 수 있습니다. PCR 증폭에 대 한 사이클의 추가 동등 하 게, 순서를 증폭 하 고26,27시퀀싱 시 읽기 중복을 만드는 표시 되었습니다. 따라서, 높은-품질 RNA 시퀀싱 LCM 샘플에서의 활용도 매우 유리 하다.
이 프로토콜에서 무 겁 게 사용 된 시각화 방법 사용자에 의존의 전문 지식을 때 신선한 절단 냉동 한 cryostat에 조직. 프로토콜 최고의 조직 단면에 대 한 준비를 슬라이드에 조직 하는 방법에 대 한 광범위 한 세부 사항으로 갑니다. 이들은 의심할 여 지 없이이 프로토콜의 2 개의 가장 중요 한 단계입니다. 조직 되지 cryostat 온도에 acclimated가, 분쇄 발생 합니다, 크게는 조직의 형태학 품질을 방해. 몇 가지 잠재적인 문제;의 결과 분쇄 문제 해결 가능성에는 대기 온도에 서 조직에 대 한 더 이상 또는 cryostat OT 및 CT 따뜻한 범위를 변경 포함 됩니다. 일단 조직을 성공적으로 절단 되었으며 스테이지에 배치, 조직 하는 것이 중요 하다 고 제대로 모든 조직 되도록 슬라이드 막 내 고 무대에서 정확 하 게 선택 될 수 있습니다. Cryostat 무대에서 조직을 선택 하 때, 조직, 감기 이어야 하며 슬라이드 따뜻하게 해야. 조직을 따기 전에 슬라이드를 진정 하는 것이 좋습니다 하 고 조직 배치28;의 영역을 통해 손가락으로 예 열을 존재 하는 다른 프로토콜 그러나, 우리의 손에서이 어떤 혜택을 제공 하지 않습니다 하 고 조직 및 과도 한 조직의 주름을 따기에 어려움은 종종 발생. 실 온에서 슬라이드, 조직 슬라이드와 접촉 시 즉시 녹는 다. 깨끗 한 픽업을 보장 하기 위해, 그것은 막 지역에서 조직 접촉으로 온다 하지만 무대 자체를 터치에 관해서는 지금까지 가지 않는 슬라이드 각도 필요가 있다. 막 막 손상 무대 감동 만드는 레이저 캡처 어려운 경우 유리 슬라이드에서 분리 되기 시작 합니다. 이 경우, 그것은 눈에 띄는 면 됩니다 LCM 시작 및 취소할 수 없습니다. 문제 해결 옵션은 제한; 경우 언제 든 지 그것은 막 또는 슬라이드 손상 된 생각, 그것은 삭제 하는 것이 현명입니다. 연습 신선한 냉동된 조직 단면 또는 고품질 조직 단면을 생산할 수 있는 병리학 코어를 사용 하 여 프로젝트를 시작 하기 전에 하는 것이 좋습니다. 그러나, 핵심 서비스를 사용 하는 경우 적절 한 RNA 기술을 RNase 오염을 방지 하기 위해 뒤를 확인 합니다. 부적 절 한 기술을 사용 하는 경우에 쉽게 RNA 저하가 발생할 수 있습니다.
우리 UV LCM의 목적에 대 한 사후 인간의 뇌에서 Purkinje 세포의 스테인리스 시각화에 대 한 완전 한 방법 여기 제시 했습니다. 우리는 또한 적절 한 RNA 보존 방법과 RNA 무결성의 높은 수준을 보장 하는 기술을 포함. 이 프로토콜은 반드시 특정 한 셀에 또는 조직 유형 하지만 관심의 영역/셀 항 원 또는 염료 특정 인식에 대 한 필요 없이 주변 기질에 형태학 상으로 구별은 요구 사항이 유지.
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Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
저자 절단 고이 실험에 대 한 냉동된 인간의 뇌 조직 샘플에서 그들의 지원에 대 한 박사 장 폴 Vonsattel와 박사 Etty 코르테스, 뉴욕 두뇌 은행을 인정 하 고 싶습니다. 저자 진전으로 지속적인 연구에 대 한 그들의 두뇌를 아낌없이 기부 하는 개인을 인정 하 고 싶습니다. 닥터 파우스트와 박사 Martuscello 그들의 지속적인된 지원 및 핵심 연구 공간에 대 한 컬럼비아 대학 학과 병리학 및 세포 생물학을 인정 하 고 싶습니다. 저자 NIH R01 NS088257 루이/파우스트를 인정 하 고 싶습니다)이이 프로젝트에 대 한 연구 자금에 대 한. LCM 이미지는 Confocal에서 수행 하 고 전문 현미경 공유 리소스 컬럼비아 대학, NIH에서 지원에서 허버트 어 빙 종합 암 센터의 #P30 CA013696를 부여 (국립 암 연구소). 저자 특수 현미경으로 그들의 지속적인된 지원에 대 한 테레사 Swayne로 라 Munteanu를 인정 하 고 싶습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MembraneSlide NF 1.0 PEN | Zeiss | 415190-9081-000 | Membrane slides for tissue. We do not recommend using glass slides. |
| AdhesiveCap 500 Opaque | Zeiss | 415190-9201-000 | Opaque caps are used to enhance visualization on inverted scopes only |
| RNase Away | Molecular BioProducts | 7005-11 | Other RNase decontamination products are also suitable. Use to clean all surfaces prior to work. |
| 200 Proof Ethanol | Decon Laboratories | 2701 | If using alternative Ethanol, ensure high quality. Essential for tissue fixation. |
| Xylenes (Certified ACS) | Fisher Scientific | X5P-1GAL | If using alternative xylene, ensure high quality. Essential for tissue visualization. |
| UltraPure Distilled Water | Invitrogen | 10977-015 | Other RNA/DNA/Nuclease free water also suitable. Utilized in ethanol dilution only. |
| Slide-Fix Slide Jars | Evergreen | 240-5440-G8K | Any slide holder/jar is also suitable. Must be cleaned prior to use. Used for fixation following sectioning. |
| Anti-Roll Plate, Assy. 70 mm 100 μm | Leica Biosystems | 14041933980 | Anti-roll plate type is determined by type of cryostat and attachment location on stage. All cryostats have differing requirements. |
| Diethyl pyrocarbonate (DEPC) | Sigma Aldrich | D5758-50mL | DEPC from any vendor will do. Follow directions for water treatment. |
| Kimwipes | Fisher Scientific | 06-666A | Kimwipes can be ordered from any vendor and used at any size. Kimwipes are to be used to clean microscope and cryostat. |
| Tissue-Plus O.C.T. Compound | Fisher Scientific | 23-730-571 | Any brand of OCT is acceptable. No tissue will be embedded in the OCT, it is strickly to attach tissue to 'chuck'. |
| Edge-Rite Low-Profile Microtome Blades | Thermo Scientific | 4280L | Blade type is determined by type of cryostat. All cryostats have differing requirements. |
| Leica Microsystems 3P 25 + 30MM CRYOSTAT CHUCKS | Fisher Scientific | NC0558768 | Chuck type is determined by type of cryostat. All cryostats have different requirements. Either size is suitable. |
| RNeasy Micro Kit (50) | Qiagen | 74004 | Required for RNA extraction post LCM. RLT Lysis buffer essential to gather captured cells from opaque cap. |
| RNeasy Mini Kit (50) | Qiagen | 74104 | Required for RNA extraction of section preps, which are performed prior to LCM to test RNA integrity of starting tissues. |
| RNase-Free DNase Set | Qiagen | 79254 | Dnase will remove any DNA to allow for a pure RNA population. Ensure Dnase is made fresh. |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma Aldrich | M6250-100ML | Purchased volume at user discretion. Necessary for addition to RLT buffer for cell lysis. Prevents RNase activity. |
| Globe Scientific Lot Certified Graduated Microcentrifuge Tube (2 mL) | Fisher Scientific | 22-010-092 | Any 2 mL tube that is RNase free, DNase free, human DNA free, and Pyrogen free will do. |
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