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Neuroscience

मानव पोस्टमार्टम सेरिबैलम में लेजर कैप्चर Microdissected Purkinje कोशिकाओं से उच्च गुणवत्ता आरएनए अलगाव के लिए एक स्टेनलेस प्रोटोकॉल

Published: January 17, 2019 doi: 10.3791/58953
Automatic Translation
1, 2,3,4, 1
1Department of Pathology and Cell Biology, Columbia University, 2Division of Movement Disorders, Department of Neurology, Yale University, 3Department of Chronic Disease Epidemiology, Yale School of Public Health, Yale University, 4Center for Neuroepidemiology and Clinical Neurological Research, Yale School of Medicine, Yale University

Summary

यह प्रोटोकॉल लेजर कैप्चर microdissection के माध्यम से मानव पोस्टमार्टम सेरिबैलम से ताजा जमे हुए ऊतकों में Purkinje कोशिकाओं को कल्पना और अलग करने के लिए एक दाग-मुक्त दृष्टिकोण का उपयोग करता है । इस प्रोटोकॉल का उद्देश्य आरएनए-अनुक्रमण के लिए उच्च गुणवत्ता आरएनए के पर्याप्त मात्रा में उत्पन्न करने के लिए है ।

Abstract

लेजर कैप्चर microdissection (LCM) heterogenous ऊतकों से cytologically और/या phenotypically प्रासंगिक कोशिकाओं या क्षेत्रों के संग्रह के लिए अनुमति देता है कि एक लाभप्रद उपकरण है । कब्जा कर लिया उत्पाद प्रोटीन, डीएनए या आरएनए अलगाव के लिए आणविक तरीकों की एक किस्म में इस्तेमाल किया जा सकता है । हालांकि, गुजाइश मानव मस्तिष्क ऊतक से आरएनए के संरक्षण विशेष रूप से चुनौतीपूर्ण है । LCM के लिए मानक दृश्य तकनीक histologic या immunohistochemical के लिए आगे शाही सेना नीचा कर सकते है कि प्रक्रियाओं धुंधलाना की आवश्यकता है । इसलिए, हम पोस्ट-मार्टम मानव मस्तिष्क ऊतक में आरएनए अखंडता के संरक्षण के उद्देश्य से LCM में दृश्य के लिए एक स्टेनलेस प्रोटोकॉल तैयार किया । सेरिबैलम के Purkinje कक्ष अपने आकार और विशिष्ट स्थान के कारण, स्टेनलेस दृश्य के लिए एक अच्छा उंमीदवार है । अनुमस्तिष्क प्रांतस्था अलग परतों है कि कोशिका घनत्व में अलग है, उंहें एक अच्छा आदर्श बनाने के लिए उच्च आवर्धन माइक्रोस्कोपी के तहत की पहचान । Purkinje कोशिकाओं बड़े न्यूरॉन्स दाना कोशिका परत के बीच स्थित है, जो छोटे ंयूरॉंस की एक घनी सेलुलर नेटवर्क है, और आणविक परत है, जो कोशिका निकायों में विरल है । इस वास्तुकला के कारण, स्टेनलेस दृश्य का उपयोग संभव है । अंय अंग या सेल सिस्टम है कि इस phenotype नकल भी उपयुक्त होगा । स्टेनलेस प्रोटोकॉल इथेनॉल के साथ ताजा जमे हुए ऊतक तय है और उच्च इज़ाफ़ा प्रकाश माइक्रोस्कोपी के तहत सुधार रूपात्मक दृश्य के लिए xylene के साथ लिपिड को दूर करने के लिए डिज़ाइन किया गया है । इस प्रोटोकॉल अंय निर्धारण विधियों के लिए खाते में नहीं है और विशेष रूप से ताजा जमे हुए ऊतक एक पराबैंगनी (यूवी)-LCM प्रणाली का उपयोग कर कब्जा कर लिया नमूनों के लिए बनाया गया है । यहां, हम खोदी और ताजा जमे हुए पोस्ट-मार्टम मानव अनुमस्तिष्क ऊतक और Purkinje कोशिकाओं यूवी-LCM द्वारा पृथक से आरएनए के शोधन के लिए एक पूर्ण प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं, जबकि बाद में आरएनए-अनुक्रमण के लिए आरएनए गुणवत्ता के संरक्षण । हमारे हाथों में, इस प्रोटोकॉल के रूप में transcriptionalात्मक प्रयोगों के लिए जरूरत के रूप में उच्च आरएनए अखंडता संख्या (≥ 8) के साथ दाग रिएजेंट और पैदावार आरएनए के लिए आवश्यकता के बिना सेलुलर दृश्य के असाधारण स्तर पैदा करता है.

Introduction

लेजर कैप्चर microdissection (LCM) एक मूल्यवान अनुसंधान उपकरण है जो बाद में आणविक रूप से संचालित मूल्यांकन के लिए रोग प्रासंगिक कोशिकाओं के पृथक्करण की अनुमति देता है । इन विषम ऊतक नमूनों में आणविक विश्लेषण का उपयोग और रोग और नैदानिक आंकड़ों के साथ सहसंबंध जैविक अनुसंधान1के शोधों के महत्व का मूल्यांकन करने में एक आवश्यक कदम है । जब आरएनए से जीन अभिव्यक्ति डेटा का विश्लेषण, जमे हुए ऊतक वर्गों का उपयोग अत्यधिक की सिफारिश की है के रूप में यह आरएनए के उत्कृष्ट गुणवत्ता के लिए अनुमति देता है और साथ ही अधिकतम मात्रा2. यह अच्छी तरह से स्थापित किया गया है कि उच्च गुणवत्ता और आरएनए की मात्रा आरएनए अनुक्रमण3से सार्थक डेटा के लिए आवश्यक हैं. हालांकि, LCM के लिए ताजा जमे हुए पोस्टमार्टम ऊतक से आरएनए का उपयोग करते समय, आरएनए क्षरण एक बड़ी चुनौती है, क्योंकि यह तुरंत मौत पर होता है और इसकी सीमा ऊतक संग्रह विधि4,5 के साथ जुड़े विभिन्न कारकों द्वारा मध्यस्थता है . जब धुंधला तकनीक histologic विवरण और सेल पहचान की पहचान करने की जरूरत है इसके अलावा, आरएनए क्षरण बढ़ा है । ऐसे hematoxylin & eosin, Nissl दाग, इम्यूनोफ्लोरेसेंस और immunohistochemistry के रूप में विशेष धुंधला तकनीक, स्ट्रोमा आसपास से कोशिकाओं को अंतर में सहायक हैं, लेकिन शाही सेना नीचा दिखाया गया है और प्रतिलिपि अभिव्यक्ति बदल प्रोफाइल6. इसलिए, हमारी प्रयोगशाला विशेष रूप से Purkinje न्यूरॉन्स के LCM अलगाव के बाद आरएनए अनुक्रमण के प्रयोजनों के लिए पोस्टमार्टम मानव सेरिबैलम में आरएनए को संरक्षित करने के लिए बनाया गया एक स्टेनलेस प्रोटोकॉल बनाया गया है ।

LCM के लिए ताजा जमे हुए ऊतक प्रसंस्करण में, निर्धारण विधि दोनों आरएनए और ऊतक अखंडता को प्रभावित कर सकते हैं । Formalin निर्धारण रूपात्मक संरक्षण के लिए मानक है, लेकिन पार जोड़ने का कारण बनता है कि आरएनए टुकड़ा और आरएनए प्रवर्धन7के साथ हस्तक्षेप कर सकते हैं. इथेनॉल निर्धारण आरएनए अलगाव के लिए एक बेहतर विकल्प है, के रूप में यह एक coagulative निर्धारण है कि पार से जोड़ने के लिए प्रेरित नहीं करता है1. ऊतक आकृति विज्ञान के दृश्य को बढ़ाने के लिए, xylene सबसे अच्छा विकल्प है, के रूप में यह ऊतक से लिपिड निकालता है । हालांकि, वहां जब LCM में xylene उपयोग सीमाओं, ऊतकों बाहर शुष्क और लेजर पर कब्जा7पर ऊतक विखंडन के कारण भंगुर हो सकता है के रूप में जाना जाता है । Xylene भी एक अस्थिर विष है और ठीक से एक धुएं हुड में नियंत्रित किया जाना चाहिए । फिर भी, xylene को ऊतक दृश्य बढ़ाने के लिए दिखाया गया है, जबकि आरएनए अखंडता8संरक्षण । इसलिए, हमारे प्रोटोकॉल ७०% इथेनॉल निर्धारण और इथेनॉल निर्जलीकरण के उपयोग के आसपास केंद्रों, रूपात्मक स्पष्टता के लिए xylene मशीन द्वारा पीछा किया ।

यह लेजर आधारित microdissection प्रणालियों के विभिंन प्रकार के नोट के लिए महत्वपूर्ण है, के रूप में वे गति में अलग दिखाया गया है, परिशुद्धता, और आरएनए गुणवत्ता । अवरक्त (IR) लेजर कैप्चर microdissection और पराबैंगनी (यूवी) लेजर microbeam microdissection सिस्टम दोनों उपंयास LCM प्लेटफार्मों कि लगभग समवर्ती8उभरा था । ir-LCM प्रणाली एक "संपर्क प्रणाली" एक पारदर्शी थर्माप्लास्टिक ऊतक अनुभाग पर सीधे रखा फिल्म का उपयोग कर रोजगार, और ब्याज की कोशिकाओं को चुनिंदा एक IR लेजर से ध्यान केंद्रित दालों से फिल्म का पालन करें । वैकल्पिक रूप से, यूवी-LCM प्रणाली एक "गैर संपर्क प्रणाली" जिससे एक केंद्रित लेजर बीम दूर कोशिकाओं या ऊतक में ब्याज की क्षेत्रों में कटौती; दो वर्तमान में उपलब्ध वाणिज्यिक प्लेटफार्मों में विंयास पर निर्भर करता है कि या तो एक औंधा या ईमानदार माइक्रोस्कोप डिजाइन का उपयोग करें, ऊतक एक लेजर प्रेरित दबाव लहर है कि यह गुरुत्वाकर्षण या ऊतक के खिलाफ गुलेल द्वारा एक संग्रह डिवाइस में अधिग्रहण कर लिया है क्रमशः गुरुत्वाकर्षण द्वारा एकत्र की । यूवी-LCM प्रणाली के महत्वपूर्ण लाभ एक बहुत छोटे लेजर बीम व्यास9के कारण गैर संपर्क दृष्टिकोण और अधिक सटीक विच्छेदन के साथ तेजी से सेल अधिग्रहण, संदूषण मुक्त संग्रह शामिल हैं । इस प्रोटोकॉल विशेष रूप से एक यूवी LCM प्रणाली के लिए बनाया गया था और एक IR-LCM प्रणाली में परीक्षण नहीं किया गया है । या तो यूवी LCM प्रणाली डिजाइन में, जब संग्रह टोपी में कोशिकाओं को जमा, एक coverslip है कि माइक्रोस्कोपी के दौरान सेलुलर स्पष्टता को बढ़ाता है के उपयोग के उपयुक्त नहीं है, के रूप में कोशिकाओं को संग्रह टोपी में प्रवेश करने में असमर्थ होगा । इसलिए, ऊतक दृश्य को बढ़ाने के लिए, हम अपारदर्शी संग्रह टोपियां, जो तरल भरा संग्रह टोपियां के खिलाफ यूवी-LCM सिस्टम में सूक्ष्म दृश्य के लिए एक coverslip के रूप में कार्य करने के लिए डिज़ाइन कर रहे हैं के उपयोग का परीक्षण किया । तरल भरा संग्रह टोपियां चुनौतीपूर्ण हो सकता है, के रूप में तरल वाष्पीकरण के अधीन है और माइक्रोस्कोप पर काम करते हुए अक्सर प्रतिस्थापित किया जाना चाहिए । समय आरएनए स्थिरता के लिए एक महत्वपूर्ण कारक बन जाता है, के रूप में कब्जा कर लिया ऊतक तुरंत भंग7.

हमारी प्रयोगशाला गुजाइश neuropathologic परिवर्तन के साथ रोगियों के सेरिबैलम में आवश्यक कंपन (एट) और सेरिबैलम के संबंधित neurodegenerative विकारों का अध्ययन । हम सुघड़ परिवर्तन Purkinje कोशिकाओं पर केंद्रित है कि एट मामलों बनाम नियंत्रण, Purkinje कोशिकाओं की एक कम संख्या, वृद्धि हुई वृक्ष प्रतिगमन और axonal परिवर्तन की एक किस्म सहित अंतर का प्रदर्शन किया है, हमें मांगना करने के लिए अग्रणी है कि Purkinje सेल अध... एट रोगजनन10,11,12,13में एक कोर जीवविज्ञान सुविधा है । Transcriptional profile कई neurologic रोगों में इस्तेमाल किया गया है अपक्षयी सेलुलर परिवर्तन के अंतर्निहित आणविक आधार का पता लगाने । हालांकि, ऐसे मस्तिष्क ऊतक क्षेत्रों के रूप में विषम नमूनों से transcriptional प्रोफाइल, अमोघ कम बहुतायत टेप की अभिव्यक्ति और/या आणविक परिवर्तन है कि प्रभावित की एक छोटी आबादी में ही हो का पता लगाने कम कर सकते है कक्ष, जैसे अनुमस्तिष्क प्रांतस्था में Purkinje कक्ष । उदाहरण के लिए, Purkinje कोशिकाओं को काफी अनुमस्तिष्क प्रांतस्था में प्रचुर मात्रा में granules कोशिकाओं द्वारा लगभग 1:3000 से अधिक संख्या में हैं; इस प्रकार, प्रभावी ढंग से लक्षित करने के लिए अपने transcriptome इन ंयूरॉंस की विशिष्ट अलगाव की आवश्यकता है । अनुमस्तिष्क प्रांतस्था अलग परतों है कि कोशिका घनत्व और कोशिका के आकार में अलग से delineated है । इस सेलुलर वास्तुकला डाई युक्त दाग एजेंट के बिना एक ताजा जमे हुए ऊतक नमूने में कल्पना करने के लिए आदर्श है । सिद्धांत रूप में, इस प्रोटोकॉल भी अंय प्रकार के ऊतक है कि समान विशिष्ट ऊतक संगठन है के लिए लागू किया जा सकता है ।

यह प्रोटोकॉल मानव पोस्टमार्टम सेरिबैलम में Purkinje सेल विज़ुअलाइज़ेशन के लिए विशेष रूप से काम करने के लिए डिज़ाइन किया गया था. कई प्रोटोकॉल निर्धारण, धुंधला दृश्य और दोनों आईआर-और यूवी-LCM के प्रयोजनों के लिए ऊतकों के कई प्रकार की आरएनए संरक्षण के लिए मौजूद हैं । जब यूवी LCM के लिए एक प्रयोगात्मक डिजाइन पर विचार, व्यक्तियों के लिए सबसे अच्छा आवश्यकताओं और शुरू करने और समाप्त सामग्री की आवश्यकताओं फिट करने के लिए अपने प्रोटोकॉल दर्जी चाहिए । यहां, हम अलग LCM प्रोटोकॉल के कई पहलुओं को जोड़ने के लिए पोस्ट-मार्टम मानव सेरिबैलम में Purkinje कोशिकाओं visualizing युक्त रिएजेंट की आवश्यकता के बिना transcriptome के लिए उच्च गुणवत्ता आरएनए तैयार करने के लिए एक बढ़ाया विधि प्रदान करने के लिए Sequencing.

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Protocol

इस प्रोटोकॉल में उपयोग किए गए सभी मानव नमूनों को सूचित सहमति से प्राप्त किया गया है और कोलंबिया विश्वविद्यालय और येल विश्वविद्यालय में आंतरिक समीक्षा बोर्ड (आईआरबी) द्वारा अनुमोदित किया गया है ।

नोट: इस प्रोटोकॉल की संपूर्णता सख्त आरएनए हैंडलिंग दिशा निर्देशों का पालन करना चाहिए, जिससे एक दस्ताने हाथ हमेशा इस्तेमाल किया जाता है, सभी सतहों एक RNase प्रदूषित और सभी कार्य सामग्री के साथ साफ कर रहे हैं आरएनए/डीएनए/Nuclease मुक्त कर रहे हैं ।

1. परीक्षण LCM शुरू करने से पहले ऊतक के आरएनए अखंडता

नोट: परीक्षण आरएनए गुणवत्ता कई तरीकों से किया जा सकता है । सुनिश्चित करें कि पूरे खंड से आरएनए नमूना के लिए एक प्रतिनिधि आरएनए अखंडता संख्या (रिण) प्रदान करने के लिए परीक्षण किया है.

  1. ध्यान से शामिल है कि प्रयोगात्मक डिजाइन के पैरामीटर के भीतर फिट के लिए ऊतक के नमूनों का चयन करें । यदि cryostat पर काटने, कदम १.२ के लिए कदम । यदि नहीं, तो ऊतक तदनुसार प्रक्रिया और कदम १.११ के लिए कदम ।
  2. सूखी बर्फ के दो कंटेनर जाओ । आकार नमूनों की संख्या पर निर्भर करेगा ।
    1. सूखी बर्फ के पहले कंटेनर में, एक खाली जगह, ऊतक कोड के साथ 2 मिलीलीटर ट्यूब लेबल ।
      नोट: यह ट्यूबों फ्रीज करने के लिए 10 मिनट लगते हैं । ट्यूबों उन में ऊतक रखने से पहले जमे हुए होना चाहिए; अंयथा, ऊतक ट्यूब की सतह पर पिघल जाएगा ।
    2. सूखी बर्फ के एक दूसरे कंटेनर में, एक-८० डिग्री सेल्सियस फ्रीजर कि आरएनए की जांच की आवश्यकता से ऊतक जगह है ।
  3. cryostat को साफ करे । विस्तृत सफाई प्रक्रिया के लिए चरण ४.७ देखें ।
  4. सूखी बर्फ से ऊतक निकालें और एक RNase दूषित उस्तरा ब्लेड के साथ ऊतक के एक छोटे से अनुभाग में कटौती । ऊतक के आकार में लगभग 1 सेमी x 1 सेमी होना चाहिए ।
  5. एक cryostat ' चक पर इष्टतम काटने तापमान (OCT) यौगिक के लगभग 3 मिमी उच्च टीले प्लेस और आंशिक रूप से फ्रीज करने के लिए अनुमति देते हैं । फिर, अक्टूबर के शीर्ष पर ऊतक जगह-अक्टूबर में धक्का नहीं है, बस यह शीर्ष पर आराम करने के लिए अनुमति देते हैं ।
  6. एक बार अक्टूबर सख्त, cryostat काटने हाथ और cryostat ब्लेड के सामने की स्थिति में घुड़सवार ऊतक के साथ चक जगह है ।
  7. 30 माइक्रोन वर्गों में ट्रिम कर दीजिए जब तक ऊतक भी है ।
  8. एक जमे हुए 2 मिलीलीटर ट्यूब में ऊतक और जगह की ३०० माइक्रोन काटें । ट्यूब वापस सूखी बर्फ में प्लेस ।
  9. ' चक ' से ऊतक निकालें और सूखी बर्फ में वापस जगह करने के लिए तैयार जब तक दूर रखा ।
  10. सभी ऊतकों के लिए दोहराएं चरण 1.4 – 1.9 ।
  11. एक बार सभी नमूनों को पूरा कर रहे हैं, शाही आरएनए निष्कर्षण किट (सामग्री #15) प्रदानकी तालिका का उपयोग कर आरएनए निकालें. एक विस्तृत प्रोटोकॉल आरएनए निष्कर्षण किट के साथ प्रदान की जाती है । संग्रह ट्यूब झिल्ली और DNase पाचन (#16सामग्री की तालिका ) के लिए वैकल्पिक कदम सुखाने के लिए वैकल्पिक कदम सहित सभी निर्देशों का पालन करें ।
  12. एक गुणवत्ता आकलन के माध्यम से निकाली गई आरएनए की अखंडता का परीक्षण14.

2. LCM के लिए अनुभागीकरण शुरू करने से पहले तैयार

  1. LCM के लिए प्रत्येक दौर से पहले की स्लाइड धारकों को साफ करें । सफाई प्रक्रिया को पूरा दिन रात भर सुखाने की अनुमति उपयोग करने से पहले प्रदर्शन ।
    नोट:     स्लाइड धारकों इथेनॉल में ऊतक अनुभाग निर्धारण और xylene में समाशोधन के लिए उपयोग किया जाता है ।
    1. स्लाइड धारक सफाई प्रक्रिया: RNase के साथ कुल्ला diethyl pyrocarbonate इलाज (DEPC) पानी के बाद । किसी भी धूल या अन्य हवाई संदूषण से परहेज, एक आरएनए/डीएनए/Nuclease मुक्त सतह पर एक रात उल्टा सूखने की अनुमति दें ।
      सावधानी: DEPC अत्यधिक विषाक्त है और संभाला जाना चाहिए और हां का उपयोग कर के निपटारा & मानक खतरनाक रसायन प्रोटोकॉल एस ।
  2. RNase दूषण के साथ अनुभाग के लिए ब्रश साफ और रात भर सूखी अनुमति देते हैं । किसी भी धूल और अंय पदार्थों से बचें ।
  3. कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए यूवी प्रकाश के तहत झिल्ली स्लाइड प्लेस । उपयोग करने के लिए पहले से अधिक 1-2 दिन यूवी के लिए स्लाइड बेनकाब नहीं. यह झिल्ली स्लाइड करने के लिए ऊतक के बंधन को बढ़ाता है ।
    नोट: चरण २.३ चरण 4, जो स्लाइड यूवी उपचार के लिए अनुमति देता है के साथ संयुक्त किया जा सकता है ऊतक अनुभाग के रूप में एक ही दिन पर होने के लिए (४.४ कदम देखें) ।

3. RNase मुक्त पानी और उच्च गुणवत्ता इथेनॉल के साथ निर्धारण समाधान तैयार

नोट: सभी समाधान हर प्रयोग के लिए ताजा तैयार कर रहे हैं । सुनिश्चित करें कि चरण १.१ से स्लाइड धारक सफाई प्रक्रिया पूर्ण है । सभी समाधान स्लाइड धारकों में तैयार कर रहे हैं ।

  1. एक स्लाइड धारक में १००% इथेनॉल के 30 मिलीलीटर प्लेस ।
  2. RNase/DNase/Nuclease मुक्त पानी के साथ इथेनॉल पतला । एक स्लाइड धारक में ९५% इथेनॉल के 30 मिलीलीटर प्लेस और बर्फ पर डाल दिया ।
  3. RNase/DNase/Nuclease मुक्त पानी के साथ इथेनॉल पतला । एक स्लाइड धारक में ७०% इथेनॉल के 30 मिलीलीटर प्लेस और बर्फ पर डाल दिया ।
  4. दो अलग स्लाइड धारकों में १००% xylene के 30 मिलीलीटर प्लेस और उंहें #1 और #2 के रूप में लेबल ।

4. टिशू सेक्शनिंग के लिए Cryostat तैयार करें

  1. इथेनॉल समाधान के लिए बर्फ की एक बाल्टी और ऊतक के लिए सूखी बर्फ के साथ एक कंटेनर जाओ ।
    सावधानी: सूखी बर्फ बहुत ठंडा है, इसलिए सुरक्षात्मक दस्ताने का उपयोग करें । बर्फ और सूखी बर्फ को एक ही कंटेनर में न रखें । बर्फ और सूखी बर्फ में अलग तापमान उंहें एक अस्पष्ट तापमान पर एक साथ फार्म का कारण होगा ।
  2. -८० डिग्री सेल्सियस फ्रीजर और cryostat के परिवहन के लिए सूखी बर्फ पर जगह से ऊतक निकालें ।
  3. Cryostat सेटिंग्स:
    1. 14 माइक्रोन के लिए खंड मोटाई सेट करें ।
    2. ऊतक मात्रा को संरक्षित करने के लिए 30 माइक्रोन ट्रिम मोटाई सेट करें ।
    3. दोहरे कक्ष और नमूना पकड़े तापमान के साथ cryostats के लिए, चैंबर तापमान (सीटी) के लिए-18 डिग्री सेट । एक सेटिंग के साथ cryostats के लिए, तापमान-17 डिग्री सेल्सियस निर्धारित किया है ।
    4. दोहरे चैंबर और नमूना पकड़े तापमान के साथ cryostats के लिए, वस्तु तापमान (OT) के लिए-16 डिग्री सेल्सियस निर्धारित किया है ।
      नोट: ओटी में भी कटिंग सुनिश्चित करने के लिए सीटी से गर्म करने की जरूरत होती है । यदि ऊतक अभी भी कटा हुआ है, OT-15 डिग्री सेल्सियस के लिए बढ़ाया जा सकता है और सीटी-18 डिग्री सेल्सियस के लिए बढ़ाया जा सकता है ।
  4. cryostat में ऊतक के लिए न्यूनतम 20 मिनट के लिए इष्टतम तापमान पर आने की अनुमति के लिए जगह है ।
    नोट: यदि ऊतक इष्टतम तापमान पर नहीं है, यह काटने पर टुकड़ा होगा । -20 सी में ऊतक जगह नहीं है रात के पहले आरएनए अखंडता को बचाने के लिए और बर्फ क्रिस्टल गठन को रोकने के लिए । ऊतक की अनुमति के रूप में अधिक समय के लिए इष्टतम तापमान को सुचारू रूप से कटौती करने के लिए equilibrate आवश्यक है । यूवी के तहत स्लाइड मशीन का वैकल्पिक कार्यांवयन यहां हो सकता है (चरण १.३ देखें) ।
  5. cryostat के तापमान के नीचे आने के लिए अनुमति देने के लिए cryostat में ' चक ' को न्यूनतम 20 मिनट के लिए रखें ।
  6. cryostat के तापमान के नीचे आने के लिए अनुमति देने के लिए cryostat में साफ ब्रश को कम से 20 मिनट के लिए रखें ।
  7. cryostat को साफ
    1. मंच पर ठंड को रोकने के लिए RNase प्रदूषित और ७०% आरएनए के साथ पतला इथेनॉल/डीएनए/Nuclease मुक्त पानी के एक 1:1 मिश्रण के साथ मंच को साफ करें ।
    2. RNase प्रदूषित और मंच पर ब्लेड धारक में जगह के साथ एक नया डिस्पोजेबल cryostat ब्लेड साफ । cryostat के तापमान के लिए आने के लिए cryostat ब्लेड के लिए न्यूनतम 20 मिनट की अनुमति दें ।
    3. RNase दूषण के साथ विरोधी रोल प्लेट साफ और मंच के लिए देते हैं । cryostat के तापमान पर आने के लिए एंटी-रोल प्लेट के लिए कम से 20 मिनट की अनुमति दें ।
      नोट: एक विरोधी रोल प्लेट काटने के लिए आवश्यक नहीं है, लेकिन अत्यधिक की सिफारिश की है । एक एंटी-रोल प्लेट उपलब्ध नहीं है, तो एक साफ ब्रश एक विकल्प के रूप में काम करता है । यदि विरोधी रोल प्लेट सही तापमान पर नहीं है, ऊतक पिघल जाएगा या काटने पर चिपके रहते हैं ।

5. सेक्शनिंग ऊतक

  1. अनुभाग के लिए ऊतक (~ 1 सेमी x 1 सेमी) का एक छोटा सा टुकड़ा काट । शेष ऊतक सूखी बर्फ/-80 ° c फ्रीजर में लौटें ।
    नोट: यह सुनिश्चित करें कि ऊतक खंड ~ ९५% अनुमस्तिष्क प्रांतस्था, जहां Purkinje कोशिकाओं स्थित हैं ।
  2. अक्टूबर के एक लगभग 3 मिमी उच्च टीले प्लेस को कवर ' चक ' । एक धीमी गति से, परिपत्र गति में शीर्ष पर परतों के निर्माण से शुरू, जब तक वहां एक छोटा सा टीला है ।
  3. एक बार अक्टूबर आंशिक रूप से जमे हुए है, लेकिन अभी भी केंद्र में कुछ तरल है, अक्टूबर के शीर्ष पर ऊतक जगह है । ऊतकों को गहरा धक्का नहीं अक्टूबर में जब तक पूरी तरह से जमे हुए अक्टूबर के शीर्ष पर बैठने के लिए अनुमति ऊतक । यह 1-2 मिनट लगेगा ।
  4. जमे हुए अक्टूबर और cryostat काटने बांह में ऊतक के साथ ' चक ' प्लेस । ऊतक को समायोजित तो यह काटने ब्लेड के साथ फ्लश है ।
  5. ऊतक काटने बांह में 15 के लिए बैठने के लिए अनुमति दें – 20 मिनट नए तापमान को समायोजित करने के लिए.
    नोट: ऊतक की मोटाई पर निर्भर करता है, समय तापमान acclimation के लिए आवश्यक है । ऊतक बैठने के लिए अनुमति देने के रूप में लंबे समय के रूप में सफाई से कटौती की आवश्यकता है । OT और सीटी को समायोजित करने के लिए ऊतक तापमान acclimation के साथ सहायता ।
  6. धीरे ऊतक ब्लेड के करीब ले जाएं । एक बार ऊतक ब्लेड तक पहुंच गया है, ट्रिम प्रक्रिया शुरू करते हैं । ट्रिम मोटाई 30 माइक्रोन के लिए सेट किया जाना चाहिए ।
  7. ट्रिम कर दीजिए 2-3x जब तक प्रांतस्था परतों दिखाई दे रहे हैं ।
  8. प्लेस और cryostat ब्लेड के ऊपर सिर्फ विरोधी रोल प्लेट संरेखित करें ।
    नोट: एक सिल्वर लाइन cryostat में ब्लेड और विरोधी रोल प्लेट के इंटरफेस पर प्रकाश से दिखाई देगा । यह इंगित करता है विरोधी रोल प्लेट ब्लेड के किनारे पर सीधे है ।
  9. 14 माइक्रोन पर वर्गों में कटौती शुरू करते हैं । ठीक से कटौती वर्गों विरोधी रोल प्लेट के तहत फ्लैट होगा ।
    नोट: यदि ऊतक अटक गया है, यह सुनिश्चित करें कि विरोधी रोल प्लेट काफी ठंडा है । यदि आवश्यक हो, बाहर (ओर चरण छू नहीं) पर सूखी बर्फ का एक टुकड़ा रखने तेजी से विरोधी रोल प्लेट ठंडा होगा ।
  10. कट 4 – 6 वर्गों और उन्हें क्षैतिज cryostat चरण भर में संरेखित करें ।
  11. स्लाइड angling, एक समय में ऊतक के सभी टुकड़ों को उठाओ ।
    नोट: ब्रश का उपयोग करना, ऊतक के सिरों को ऊपर उठाने के लिए और अधिक आसानी से लेने पर स्लाइड के लिए उपलब्ध हो । एक बार में एक अनुभाग नहीं उठाओ । कमरे के तापमान हवा के संपर्क में आरएनए अखंडता नीचा होगा ।
    सावधानी: झिल्ली को cryostat के चरण स्पर्श न करने दें । यदि झिल्ली चरण छू, यह गिलास स्लाइड से अलग शुरू हो जाएगा और त्रुटियों का कारण होगा जब LCM का प्रयास ।
  12. तुरंत चरण 6 पर जाएं । विनिर्धारण में विलंब न करें ।

6./दाग-कम दृश्य ऊतक फिक्सिंग

  1. तुरंत इथेनॉल निर्धारण प्रोटोकॉल के लिए कदम
  2. स्लाइड धारक में 2 मिनट के लिए ७०% इथेनॉल के साथ स्लाइड प्लेस-बर्फ पर ।
  3. स्लाइड धारक में ४५ के लिए ९५% इथेनॉल के साथ प्लेस-बर्फ पर ।
  4. स्लाइड धारक में 2 मिनट के लिए १००% इथेनॉल के साथ प्लेस-RT पर ।
  5. xylene 1 के साथ स्लाइड धारक में स्लाइड 3 बार डुबकी-RT पर ।
  6. स्लाइड धारक में xylene 2 के साथ 5 मिनट के लिए-RT पर रखें ।
  7. के लिए एक स्वच्छ क्षेत्र में शुष्क करने की अनुमति दें कम से 30 min. dry समय तक इष्टतम हैं, अप करने के लिए ६० मिनट ।
    सावधानी: एक धुएं डाकू में सुखाने के लिए स्लाइड खड़े हो जाओ । Xylene अस्थिर है । फ्लैट स्लाइड बिछाने ऊतक अनुभाग में पूल के लिए xylene कारण होगा, जो ऊतक भी अंधेरा होने का कारण होगा ।

7. वैकल्पिक — स्लाइड संग्रहण

  1. व्यक्तिगत ५० मिलीलीटर ट्यूबों में सूखे स्लाइड प्लेस (एक स्लाइड प्रति ट्यूब) और में जगह-८० ° c फ्रीजर के लिए 7 दिनों के लिए ।
    नोट: स्लाइड-८० ° c फ्रीजर में रखने से पहले शुष्क होना चाहिए । कण के रूप में ट्यूब के अंदर जलशुष्कक का उपयोग न करें ऊतक और झिल्ली में एंबेड जाएगा । सुनिश्चित करें कि ट्यूब कैप तंग है; यदि नहीं, तो उपयोग के लिए गल जाने पर स्लाइड पर संघनित्र हो जाएगा ।
    सावधानी: आरएनए अखंडता 7 दिनों के बाद कम हो जाती है, के रूप में ऊतक दृश्य की गुणवत्ता करता है.

8. गल उपयोग के लिए स्लाइड संग्रहीत

  1. से एक ही स्लाइड के साथ ट्यूब निकालें-८० ° c फ्रीजर 1 ज इरादा उपयोग करने से पहले.
  2. ट्यूब को तुरंत न खोलें । ट्यूब कमरे के तापमान पर आने के लिए अनुमति देते हैं । संघनित्र केवल ट्यूब के बाहर पर हो जाएगा ।
  3. एक बार ट्यूब कमरे के तापमान पर आ गया है और सभी संघनित्र (लगभग 30-40 मिनट) चला गया है, टोपी को हटाने और कमरे के तापमान हवा के लिए स्लाइड बेनकाब ।
  4. स्लाइड की अनुमति दें करने के लिए कमरे के तापमान के लिए acclimate के लिए 15 – 20 min. स्लाइड हटा टोपी के साथ ट्यूब के अंदर छोड़ दें.
    नोट: स्लाइड अब LCM के लिए तैयार है ।

9. लेजर Purkinje कोशिकाओं के Microdissection पर कब्जा:

नोट: प्रोटोकॉल के इस खंड केवल बाद में आरएनए अनुक्रमण के लिए Purkinje कोशिकाओं पर कब्जा करने से संबंधित विशेष चर्चा करेंगे । इस खंड मानता है कि उपयोगकर्ता यूवी लेजर पर कब्जा माइक्रोस्कोप और संबद्ध सॉफ्टवेयर के साथ परिचित है ।

  1. माइक्रोस्कोप मंच और RNase के साथ कैप संग्रह हाथ साफ ।
  2. दस्ताने हाथों के साथ, माइक्रोस्कोप और संग्रह बांह में ५०० μL अपारदर्शी टोपी पर स्लाइड जगह है ।
    नोट: हमेशा RNase दूषण के साथ कार्य क्षेत्र की सफाई और स्लाइड या अपारदर्शी टोपी को छूने के दौरान दस्ताने हाथों का उपयोग करके उचित आरएनए तकनीक सुनिश्चित करें । दस्ताने एक बार स्लाइड और टोपी जगह में है और लेजर कैप्चर शुरू हो गया है हटाया जा सकता है ।
  3. कम आवर्धन पर, अनुमस्तिष्क ऊतक पर अपारदर्शी टोपी संरेखित करें, सुनिश्चित करना है कि टोपी आंख टुकड़ा में visualized पूरे क्षेत्र को शामिल किया गया ।
    नोट: यदि अपारदर्शी टोपी केंद्रित है तो केवल माइक्रोस्कोप की आँख का टुकड़ा दिखाई देगा । यदि कैप ऊतक के ऊपर केंद्रित है तो कैमरा दिखाई नहीं देगा । लेजर कब्जा गुंजाइश डिजाइन पर निर्भर करता है, अपारदर्शी टोपी के माध्यम से दृश्य या तो आंख टुकड़ा में ही होगा या दोनों आंख टुकड़ा और कैमरे में visualized ।
  4. 5x-10x उद्देश्य लेंस के साथ अनुमस्तिष्क परतों कल्पना और अनुभाग जहां आणविक परत और दाना सेल परत काटना (Purkinje सेल परत) पर कर्सर जगह है ।
  5. Purkinje कक्षों को 40X और विज़ुअलाइज़ करने के लिए ले जाएं ।
    नोट: उदाहरण विज़ुअलाइज़ेशन के लिए चित्र 1 और चित्र 2 देखें.
  6. Purkinje कक्षों पर कैप्चरिंग प्रारंभ करें ।
    नोट: आरएनए-sequencing प्रदर्शन करने के लिए, आरएनए के कम से कम 5 एनजी की आवश्यकता है । लगभग 1600 – 2000 Purkinje कोशिकाओं sequencing के लिए पर्याप्त आरएनए सामग्री में परिणाम. आरएनए माइक्रोस्कोप पर 8 ज तक के लिए स्थिर हो जाएगा । परीक्षण यूवी ऊर्जा और यूवी ध्यान संग्रह करने से पहले स्तर सुनिश्चित करने के लिए सही हैं । समय के साथ, ऊतक बाहर सूखी और यूवी ऊर्जा और यूवी ध्यान बदलने की आवश्यकता हो सकती जारी रहेगा ।

10. आरएनए संग्रह पोस्ट LCM

  1. सेल lysis बफर तैयार (हर बार ताजा तैयार)
    1. पतला 2-mercaptoethanol lysis बफर में 1:100 पर (10 μL: 1 मिलीलीटर, क्रमशः) । Lysis (RLT) बफर सामग्री (#14 और #15) की तालिका में प्रदान की जाती है ।
  2. सेल lysis बफर के ५० μL को अपारदर्शी टोपी में जोड़ें, टोपी का सामना करना पड़ के साथ । ध्यान से टोपी पर ट्यूब बंद करो ।
  3. ट्यूब उल्टा 1 मिनट के लिए नीचे छोड़ दें ।
  4. भंवर 30 एस के लिए ट्यूब और जल्दी ट्यूब के नीचे करने के लिए lysis बफर स्पिन ।
  5. ट्यूब पुन: खोलें और दोहराएँ चरण 10.2 – 10.4.
  6. lysis बफर और आरएनए के १०० μL से युक्त ट्यूब प्लेस-८० ° c फ्रीजर जब तक सभी नमूनों को समाप्त कर रहे हैं और आरएनए निष्कर्षण के लिए तैयार (सामग्री की तालिका #14).

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Representative Results

यह प्रोटोकॉल यूवी-LCM के लिए ताजा जमे हुए पोस्टमार्टम मानव मस्तिष्क ऊतक तैयार करने के लिए कदम विवरण । पूरी तरह से विनिर्देशों और एनोटेशन cryostat काटने के लिए दिया जाता है, क्योंकि यह परिशुद्धता के एक उच्च डिग्री के साथ ताजा जमे हुए मस्तिष्क ऊतक में कटौती करने के लिए मुश्किल हो सकता है । सबसे महत्वपूर्ण बात पर विचार करने के लिए है कि ताजा जमे हुए ऊतक बहुत ठंडा है और समय की एक महत्वपूर्ण राशि के लिए एक cryostat के गर्म तापमान acclimate की आवश्यकता है । यह चरण ले जाया नहीं जा सकता, और यह कैसे केंद्रीय इस चरण इस प्रोटोकॉल की सफलता या विफलता में है नहीं किया जा सकता । यदि ऊतक cryostat पर ठीक से तैयार नहीं है, सभी कोशिकाओं या ब्याज के क्षेत्रों की पहचान पर बाद में प्रयास बहुत मुश्किल हो जाएगा, अगर असंभव नहीं है ।

cryostat के बाद अनुभाग और आवंटित सुखाने समय, ऊतक LCM के लिए तैयार है । जब माइक्रोस्कोप के तहत ऊतक visualizing, सेरिबैलम के सेलुलर परतों 5x और 10x उद्देश्य लेंस के साथ आसानी से दिखाई दे रहे हैं । 1 चित्रा इथेनॉल में तय ऊतक के प्रतिनिधि छवियों से पता चलता है केवल (1 चित्रा) और इथेनॉल निर्धारण के बाद xylene में गर्मी ऊतक (चित्रा 1ख) । हम कड़ाई से दोनों को ठीक करने और ऊतक कल्पना करने की क्षमता पर विभिंन इथेनॉल और xylene मशीन समय/ यदि ऊतक लंबे समय तक xylene में मशीन नहीं है, जिसके परिणामस्वरूप छवि और अधिक बारीकी से चित्र 1A, बजाय चित्र 1बीके समान होगा । Xylene गर्मी ऊतक गहरा और बेहतर रूपरेखा बनाती सेलुलर परतों से अकेले इथेनॉल है बनने के लिए कारण बनता है । जब लेजर पर कब्जा माइक्रोस्कोप काटने, 40X उद्देश्य लेंस केवल Purkinje कोशिकाओं पर कब्जा सुनिश्चित करने के लिए आवश्यक है, और नहीं आसपास के ऊतकों. xylene में मशीन एक उच्च गुणवत्ता, आकृति विज्ञान बरकरार छवि (चित्रा 1डी) इथेनॉल निर्धारण अकेले (चित्रा 1सी) की तुलना में पैदा करता है ।

आगे हमारे ऊतक के दृश्य को बढ़ाने के लिए, हम एक अपारदर्शी टोपी की coverslip क्षमता का परीक्षण किया । अंय यूवी LCM प्रोटोकॉल एक तरल भरी टोपी का उपयोग एक 200 – 500 μL ट्यूब है कि संपर्क पर ऊतक भंग । तरल भरा टोपियां ऊतक दृश्य को कम कर सकते हैं, जिसके परिणामस्वरूप छवि खुर्दबीन के नीचे दानेदार और इंद्रधनुषी हो (चित्रा 2ए) । अपारदर्शी टोपी (चित्रा 2बी) के माध्यम से ऊतक दृश्य एक smoothened ऊतक उपस्थिति है कि मुलायम और फार्म में तेज है में परिणाम है । विशेष रूप से, अपारदर्शी टोपी के लिए संग्रह के लिए अनुमति देता है 8 ज प्रतिस्थापन के लिए की आवश्यकता के बिना । कम बिजली (चित्रा 2सी) पर और उच्च शक्ति (चित्रा 2डी, ई) पर उत्पादेड Purkinje कोशिकाओं के प्रतिनिधि छवियों सिर्फ Purkinje कोशिका शरीर के सटीक हटाने दिखाओ । संदर्भ के लिए, चित्रा 2एफ एक Luxol तेजी से नीले/Hematoxylin और Eosin (LH & ई) सना हुआ अनुमस्तिष्क प्रांतस्था, जो विशेष रूप से सेरिबैलम के विभिंन परतों और Purkinje कोशिकाओं के स्थान पर प्रकाश डाला गया से पता चलता है आणविक परत आणि granules सेल परत मुक़ाबला.

इस प्रोटोकॉल का उद्देश्य बाद में आरएनए अनुक्रमण के लिए उच्च गुणवत्ता आरएनए प्राप्त करने के लिए है । हम छह विभिन्न पोस्ट-मार्टम मानव मस्तिष्क के नमूनों पर हमारे प्रोटोकॉल का परीक्षण किया, जो प्रत्येक LCM के तीन दिन गुजरा आरएनए निष्कर्षण के लिए 1500-2000 कोशिकाओं को इकट्ठा करने के लिए । लगभग 6-8 ज माइक्रोस्कोप पर उत्पादित 500-700 कोशिकाओं है, जो फिर पिछले दिनों LCM के साथ संयुक्त आरएनए निष्कर्षण करने से पहले उत्पादों का उत्पादन किया । नमूने आरएनए निष्कर्षण से गुजरा और RNAse के 14 μL-मुक्त पानी (सामग्री की तालिका #14) में resuspend कर दिया गया । सभी छह नमूनों आरएनए अखंडता संख्या (कुल्ला) ≥ 8 (चित्रा 3ए-एफ) के साथ उच्च गुणवत्ता आरएनए का उत्पादन किया । यह प्रक्रिया ११.५ एनजी (चित्रा 3ए), ८.३ एनजी (चित्रा 3बी), १३.६ एनजी (चित्रा 3सी), ११.५ एनजी (चित्रा 3डी), १४.९ एनजी (चित्रा 3ई) और २६.९ की आरएनए मात्रा में परिणाम एनजी (चित्रा 3एफ) । नोट के सभी पोस्टमार्टम मानव मस्तिष्क के नमूनों LCM (तालिका 1) से पहले आरएनए गुणवत्ता के लिए परीक्षण किया गया है. यदि मूल के नमूने आरएनए गिरावट है, LCM ही आगे अपनी अखंडता नीचा होगा ।

Figure 1
चित्रा 1 : अनुमस्तिष्क परतों और Purkinje सेल दृश्य के साथ और xylene उपचार के बिना । के साथ और इथेनॉल निर्धारण और निर्जलीकरण के बाद xylene बिना प्रतिनिधि छवियां । आणविक परत (एमएल) और दाना सेल परत (GCL) लेबल कर रहे हैं । Purkinje कोशिकाओं तीर के साथ चिह्नित कर रहे हैं । (क) xylene बिना अनुमस्तिष्क परत दृश्य का 5x प्रतिनिधित्व । स्केल बार: 10 µm. (ख) 5x xylene के साथ अनुमस्तिष्क परत दृश्य का प्रतिनिधित्व । स्केल बार: 10 µm (ग) xylene के बिना अनुमस्तिष्क परत विज़ुअलाइज़ेशन का 40X प्रतिनिधित्व । स्केल बार: 1 µm. (D) xylene के साथ अनुमस्तिष्क परत विज़ुअलाइज़ेशन का 40X प्रतिनिधित्व. स्केल बार: 1 µm. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2 : LCM से पहले और बाद में कक्ष विज़ुअलाइज़ेशन Purkinje । 40X में इथेनॉल निर्धारण और निर्जलीकरण के बाद xylene के साथ प्रतिनिधि छवियां । एमएल और GCL लेबल हैं । Purkinje कोशिकाओं तीर के साथ चिह्नित कर रहे हैं । (क) 40x में तरल भरी टोपी के तहत माइक्रोस्कोप पर विज़ुअलाइज़ेशन. स्केल बार: 1 µm. (ख) 40X पर अपारदर्शी संग्रह टोपी के तहत माइक्रोस्कोप पर दृश्य । स्केल बार: 1 µm. (ग) एमएल और GCL के बीच अनुमस्तिष्क Purkinje कोशिकाओं को दिखा प्रांतस्था के 5x दृश्य । स्केल बार: 10 µm. (D) उत् पाद शुल् क से पहले Purkinje कक्ष का 40X दृश्यावलोकन । स्केल बार: 1 µm. (E) सफल Purkinje कक्ष कैप्चर का 40X दृश्यावलोकन । स्केल बार: 1 µm. (च) 20X प्रतिनिधि LH & ई सना हुआ सेरिबैलम चिह्नित तीर के साथ Purkinje सेल निकायों दिखा । स्केल बार: 5 µm. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3 : आरएनए गुणवत्ता नियंत्रण LCM नमूनों के उच्च विश्लेषक परिणाम। पैनलों A-F दिखाएं प्रतिनिधि आरएनए गुणवत्ता नियंत्रण readouts । प्रत्येक पैनल एक अलग नमूना है कि केवल इथेनॉल और xylene के साथ निर्धारण और दृश्य की एक ही LCM प्रक्रिया से गुजरा है । आरएनए वफ़ादारी नंबर (कुल्ला) सभी 8.0 > हैं । प्रतिनिधि सांद्रता [] कुल शाही सेना के एनजी कम 5 की एक उपज में परिणाम । सभी नमूनों को RNAse-मुक्त पानी के १४ µ एल में eluted गया. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

नमूना रिण अनुभाग तैयारी रिण-LCM [आरएनए]-LCM पीएमआई-जम
ए ९.२ ८.६ ८२२ pg/µ एल ४५० मिनट
बी ९.८ 8 ५९८ pg/µ एल ५५० मिनट
सी ९.१ ८.५ ९७६ pg/µ एल ४५५ मिनट
डी ९.८ ८.२ ८२३ pg/µ एल ४६३ मिनट
ई ९.८ ९.१ १०६९ pg/µ एल ११३९ मिनट
एफ ९.६ ८.३ १९२३ pg/µ एल १०८० मिनट

तालिका 1: आरएनए अखंडता का सारांश . नमूना संख्या चित्र 3में प्रस्तुत किए गए विश्लेषक परिणामों के अनुरूप है । अनुभाग तैयार करने से पहले LCM करने के लिए सुनिश्चित करें कि शुरू ऊतक अच्छी गुणवत्ता की है प्रदर्शन कर रहे हैं । दिखाया गया है मूल ऊतक धोने अनुभाग प्रस्तुत करने से, LCM और LCM से आरएनए की एकाग्रता, साथ ही साथ पोस्ट-मार्टम अंतराल जमे हुए (पीएमआई-जमे हुए) ऊतकों के लिए ।

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Discussion

प्रोटोकॉल यहां प्रस्तुत विशेष रूप से यूवी-LCM के लिए आकृति विज्ञान विशिष्ट ऊतकों visualizing में एक स्टेनलेस दृष्टिकोण हो संशोधित किया है । इस विधि ऊतक दृश्य का एक बढ़ाया स्तर को बनाए रखते हुए, बाद में प्रत्यक्ष आरएनए अनुक्रमण के लिए आरएनए अखंडता को अधिकतम करने के लिए बनाया गया है. कब्जा करने के लिए विभिन्न प्रकार के कोशिका भेद करने की क्षमता, संभव कोशिकाओं के शुद्ध जनसंख्या बनाने के लिए, मानव ऊतकों में विभिन्न आणविक प्रोफाइल को समझने के लिए आवश्यक है15. इस प्रोटोकॉल के संदर्भ में, ऊतक चयन सर्वोपरि है, के रूप में प्रतिजन या डाई विशिष्ट रिएजेंट उपयोग नहीं कर रहे है और इसलिए इस तरह के भेदभाव की आवश्यकता है कि अध्ययन के लिए उपयुक्त नहीं है । हालांकि इस प्रोटोकॉल की एक सीमा है, जिसके परिणामस्वरूप ऊतक दृश्य और आरएनए अखंडता काफी बेहतर है और अन्य प्रयोगात्मक डिजाइनों में प्रासंगिकता बनाए रखने. कई अंय प्रोटोकॉल भी मौजूद है कि शाही सेना के संरक्षण के इरादे से विशेष रूप से यूवी और IR-LCM के लिए वैकल्पिक धुंधला तरीकों का उपयोग । हालांकि, अधिकांश अंय विधियों में कम से कम एक धुंधला या antigen विशिष्ट रिएजेंट6,16,17, एक कक्ष या अंग प्रकार के लिए डिज़ाइन किए गए है (कि मानव शव परीक्षण ऊतक नहीं हैं)18,19, 20, या विशेष आरएनए-seq किट अखंडता21को बढ़ाने के लिए की आवश्यकता है । Cresyl वायलेट (Nissl) धुंधला एक लोकप्रिय डाई कई प्रोटोकॉल में इस्तेमाल किया एजेंट युक्त है, के रूप में यह दाग न्यूरॉन्स में मस्तिष्क में नाभिक और आरएनए गिरावट6का सबसे कम राशि का कारण बनता है । हालांकि, Purkinje कोशिका के बड़े नाभिक अच्छी तरह से cresyl वायलेट द्वारा दाग नहीं है, Purkinje कोशिकाओं visualizing के लिए कोई महत्वपूर्ण लाभ प्रदान । महत्वपूर्ण बात, हमने उस साहित्य में केवल एक LCM अध्ययन की पहचान की जिसने मानव Purkinje कोशिकाओं के संग्रह का वर्णन किया है, जो अनुमस्तिष्क अपक्षय और विकास संबंधी विकारों के अध्ययन के लिए काफी रुचि के हैं. यह अध्ययन एक IR-LCM प्रणाली के साथ cresyl बैंगनी और पृथक Purkinje कोशिकाओं के साथ जमे हुए ऊतकों दाग; 5 के रूप में कम के रूप में नमूना कुल्ला लेकिन microarray विश्लेषण के लिए स्वीकार्य22माना जाता था । इसलिए, यह पहला प्रोटोकॉल अध्ययन है कि विशेष रूप से उच्च गुणवत्ता आरएनए Purkinje कोशिकाओं से पोस्ट-मार्टम मानव सेरिबैलम में यूवी-LCM के माध्यम से उत्पाद के लिए बनाया गया है ।

पोस्टमार्टम मानव ऊतक में आरएनए की स्थिरता एक प्रसिद्ध बाधा है, कोशिकाओं के भीतर आरएनए अणुओं के रूप में काफी मौत के बाद प्राकृतिक क्षय के अधीन हैं । विशेष रूप से, mRNA को nucleolytic क्षरण के लिए सबसे अतिसंवेदनशील5दिखाया गया है । पोस्टमार्टम अंतराल (पीएमआई) को जमने के लिए समय की निगरानी (पीएमआई जम) एक मीट्रिक है कि कुछ अध्ययनों में आरएनए क्षरण के लिए कुछ सहसंबंध दिखाया गया है23,24,25. हालांकि, तालिका 1 चित्रा 3में दर्शाए गए छह नमूनों के लिए हमारे पीएमआई-जमे अंतराल को दिखाती है, जो पीएमआई मूल्यों और आरएनए गुणवत्ता के साथ कोई सापेक्ष सहसंबंध इंगित करता है । इसलिए, यह एक लेजर पर कब्जा परियोजना शुरू करने से पहले आरएनए अखंडता की जाँच में कारण परिश्रम प्रदर्शन करने के लिए आवश्यक है । प्रारंभिक नमूना की आरएनए अखंडता कम गुणवत्ता की है, तो एक LCM उत्पाद से परिणामी आरएनए भी कम गुणवत्ता की होगी । जब कम आरएनए अखंडता से बचा नहीं जा सकता है, sequencing के लिए आरएनए बढ़ाने के लिए अन्य तरीकों इस प्रोटोकॉल21के अलावा नियोजित किया जा सकता है. विशेष रूप से, कम निवेश या नीचा आरएनए मौन जटिलता और उपइष्टतम परिणाम है कि अक्सर अतिरिक्त प्रवर्धन कदम जरूरत के लिए नेतृत्व कर सकते हैं । प्रवर्धन के लिए पीसीआर चक्र के अलावा दृश्यों असमान बढ़ाना, साथ ही26,27अनुक्रमण पर पढ़ने के डुप्लिकेट बनाने के लिए दिखाया गया है । इसलिए, sequencing के लिए LCM नमूनों से उच्च गुणवत्ता आरएनए का उपयोग अत्यधिक लाभप्रद है ।

दृश्य इस प्रोटोकॉल में कार्यरत विधि भारी उपयोगकर्ता की विशेषज्ञता पर निर्भर करता है जब एक cryostat पर ताजा जमे हुए ऊतक काटने । प्रोटोकॉल कैसे सबसे अच्छा अनुभाग के लिए ऊतक तैयार करने के लिए और स्लाइड पर ऊतक जगह पर व्यापक विस्तार में चला जाता है । ये निस्संदेह इस प्रोटोकॉल के दो सबसे महत्वपूर्ण कदम हैं । यदि ऊतक cryostat तापमान के लिए आदत नहीं है, कटा हुआ है, जो काफी ऊतक के रूपात्मक गुणवत्ता में बाधा उत्पंन होगी । कटा हुआ कुछ संभावित मुद्दों का परिणाम है; समस्या निवारण संभावनाएं ऊतक तापमान के लिए आते हैं या एक गर्म श्रृंखला के लिए cryostat OT और/या सीटी बदलने के लिए अब इंतजार कर शामिल हैं । एक बार ऊतक सफलतापूर्वक काट दिया गया है और मंच पर रखा गया है, यह ऊतक और स्लाइड ठीक से सुनिश्चित करने के लिए सभी ऊतक झिल्ली के भीतर फिट बैठता है और सही मंच से उठाया जा सकता है के लिए महत्वपूर्ण है । जब cryostat चरण से ऊतक लेने का प्रयास, ऊतक ठंडा होना चाहिए, और स्लाइड गर्म किया जाना चाहिए । वैकल्पिक प्रोटोकॉल मौजूद है कि करने के लिए ऊतक उठा और ऊतक स्थान28के क्षेत्र पर एक उंगली से गरम करने से पहले स्लाइड ठंडा करने की सिफारिश; हालांकि, हमारे हाथों में, यह कोई लाभ प्रदान नहीं करता है, और अक्सर ऊतक और अत्यधिक ऊतक परतों को चुनने में कठिनाई का कारण बनता है । कमरे के तापमान पर एक स्लाइड के साथ, ऊतक स्लाइड के साथ संपर्क पर तुरंत पिघला देता है । एक साफ पिक सुनिश्चित करने के लिए, यह स्लाइड के कोण के लिए आवश्यक है ताकि यह झिल्ली क्षेत्र में ऊतक के संपर्क में आता है लेकिन अब तक के रूप में मंच खुद को छूने के लिए जाना नहीं है । झिल्ली कांच स्लाइड से अलग करने के लिए शुरू हो जाएगा अगर यह चरण है, जो झिल्ली नुकसान और लेजर कब्जा मुश्किल बनाता है छू लेती है । यदि ऐसा होता है, तो यह ध्यान देने योग्य होगा एक बार LCM शुरू हो गया है और पूर्ववत नहीं किया जा सकता है । समस्या निवारण विकल्प सीमित हैं; अगर किसी भी समय यह सोचा है कि झिल्ली या स्लाइड समझौता किया गया है, यह त्याग करने के लिए बुद्धिमान है । यह एक परियोजना शुरू करने या एक विकृति कोर है कि उच्च गुणवत्ता ऊतक अनुभाग का उत्पादन कर सकते हैं का उपयोग करने से पहले खोदी ताजा जमे हुए ऊतक अभ्यास करने के लिए सिफारिश की है । हालांकि, अगर एक कोर सेवा का उपयोग कर, यह सुनिश्चित करें कि उचित आरएनए तकनीक RNase संदूषण को रोकने के लिए पीछा किया है । आरएनए क्षरण आसानी से हो सकता है जब अनुचित तकनीक का इस्तेमाल किया जाता है ।

हम यहां Purkinje कोशिकाओं के स्टेनलेस दृश्य के लिए एक पूरी विधि पोस्ट मार्टम मानव सेरिबैलम में यूवी-LCM के प्रयोजनों के लिए प्रस्तुत किया है । हमने आरएनए अखंडता के उच्च स्तर को सुनिश्चित करने के लिए उचित आरएनए संरक्षण विधियों और तकनीकों को भी शामिल किया है । इस प्रोटोकॉल जरूरी नहीं है किसी एक कोशिका या ऊतक प्रकार के लिए विशिष्ट है, लेकिन आवश्यकता है कि क्षेत्र/ब्याज की कोशिका के लिए की आवश्यकता के बिना आसपास के स्ट्रोमा से अलग आकृति विज्ञान है बनाए रखने प्रतिजन या डाई विशिष्ट मांयता ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

लेखक ंयूयॉर्क ब्रेन बैंक, डॉ जीन पॉल Vonsattel और डॉ Etty Cortés, काटने और इन प्रयोगों के लिए जमे हुए मानव मस्तिष्क ऊतक नमूनों के संरक्षण में उनकी सहायता के लिए स्वीकार करना चाहते हैं । लेखक व्यक्तियों, जो उदारता से आवश्यक कंपन में सतत अनुसंधान के लिए अपने दिमाग दान स्वीकार करना चाहते हैं । dr. Faust और dr. Martuscello कोलंबिया विश्वविद्यालय पैथोलॉजी और सेल जीवविज्ञान के अपने निरंतर समर्थन और कोर अनुसंधान अंतरिक्ष के लिए स्वीकार करना चाहते हैं । लेखक इस प्रोजेक्ट के लिए रिसर्च फंडिंग के लिए NIH R01 NS088257 Louis/Faust) को स्वीकार करना चाहेंगे । LCM छवियों हर्बर्ट Irving व्यापक कैंसर केंद्र में फोकल और विशेष सूक्ष्म साझा संसाधन कोलंबिया विश्वविद्यालय में प्रदर्शन किया, NIH अनुदान #P30 CA013696 (राष्ट्रीय कैंसर संस्थान) द्वारा समर्थित थे । लेखक विशेष माइक्रोस्कोपी के साथ उनके निरंतर सहायता के लिए Theresa Swayne और लौरा Munteanu को स्वीकार करना चाहते हैं ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
MembraneSlide NF 1.0 PEN Zeiss 415190-9081-000 Membrane slides for tissue. We do not recommend using glass slides. 
AdhesiveCap 500 Opaque Zeiss 415190-9201-000 Opaque caps are used to enhance visualization on inverted scopes only
RNase Away Molecular BioProducts 7005-11 Other RNase decontamination products are also suitable. Use to clean all surfaces prior to work. 
200 Proof Ethanol Decon Laboratories 2701 If using alternative Ethanol, ensure high quality. Essential for tissue fixation. 
Xylenes (Certified ACS) Fisher Scientific X5P-1GAL If using alternative xylene, ensure high quality. Essential for tissue visualization. 
UltraPure Distilled Water Invitrogen 10977-015 Other RNA/DNA/Nuclease free water also suitable. Utilized in ethanol dilution only. 
Slide-Fix Slide Jars Evergreen 240-5440-G8K Any slide holder/jar is also suitable. Must be cleaned prior to use. Used for fixation following sectioning. 
Anti-Roll Plate, Assy. 70 mm 100 μm Leica Biosystems 14041933980 Anti-roll plate type is determined by type of cryostat and attachment location on stage. All cryostats have differing requirements. 
Diethyl pyrocarbonate (DEPC) Sigma Aldrich D5758-50mL DEPC from any vendor will do. Follow directions for water treatment. 
Kimwipes Fisher Scientific 06-666A Kimwipes can be ordered from any vendor and used at any size. Kimwipes are to be used to clean microscope and cryostat. 
Tissue-Plus O.C.T. Compound Fisher Scientific 23-730-571 Any brand of OCT is acceptable. No tissue will be embedded in the OCT, it is strickly to attach tissue to 'chuck'. 
Edge-Rite Low-Profile Microtome Blades Thermo Scientific 4280L Blade type is determined by type of cryostat. All cryostats have differing requirements. 
Leica Microsystems 3P 25 + 30MM CRYOSTAT CHUCKS Fisher Scientific NC0558768 Chuck type is determined by type of cryostat. All cryostats have different requirements. Either size is suitable. 
RNeasy Micro Kit (50) Qiagen 74004 Required for RNA extraction post LCM. RLT Lysis buffer essential to gather captured cells from opaque cap. 
RNeasy Mini Kit (50) Qiagen 74104 Required for RNA extraction of section preps, which are performed prior to LCM to test RNA integrity of starting tissues. 
RNase-Free DNase Set Qiagen 79254 Dnase will remove any DNA to allow for a pure RNA population. Ensure Dnase is made fresh. 
2-Mercaptoethanol Sigma Aldrich M6250-100ML Purchased volume at user discretion. Necessary for addition to RLT buffer for cell lysis. Prevents RNase activity. 
Globe Scientific Lot Certified Graduated Microcentrifuge Tube (2 mL) Fisher Scientific 22-010-092 Any 2 mL tube that is RNase free, DNase free, human DNA free, and Pyrogen free will do. 

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References

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तंत्रिका विज्ञान अंक १४३ Purkinje सेल सेरिबैलम लेजर कब्जा microdissection आरएनए RNAseq आवश्यक कंपन
मानव पोस्टमार्टम सेरिबैलम में लेजर कैप्चर Microdissected Purkinje कोशिकाओं से उच्च गुणवत्ता आरएनए अलगाव के लिए एक स्टेनलेस प्रोटोकॉल
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Martuscello, R. T., Louis, E. D.,… More

Martuscello, R. T., Louis, E. D., Faust, P. L. A Stainless Protocol for High Quality RNA Isolation from Laser Capture Microdissected Purkinje Cells in the Human Post-Mortem Cerebellum. J. Vis. Exp. (143), e58953, doi:10.3791/58953 (2019).

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