Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

פרוטוקול אל חלד באיכות גבוהה בידוד RNA של לייזר לכידת תאי Microdissected Purkinje המוח האנושי פוסט-מורטם הקטן

Published: January 17, 2019 doi: 10.3791/58953
Automatic Translation
1, 2,3,4, 1
1Department of Pathology and Cell Biology, Columbia University, 2Division of Movement Disorders, Department of Neurology, Yale University, 3Department of Chronic Disease Epidemiology, Yale School of Public Health, Yale University, 4Center for Neuroepidemiology and Clinical Neurological Research, Yale School of Medicine, Yale University

Summary

פרוטוקול זה משתמש בגישה העיניינים להמחיש, בידוד תאי Purkinje ברקמת קפוא טרי מן המח האנושי פוסט-מורטם באמצעות לייזר ללכוד microdissection. המטרה של פרוטוקול זה היא לייצר כמויות מספיקות של RNA באיכות גבוהה עבור רצפי RNA.

Abstract

לייזר לכידת microdissection (LCM) הוא כלי יתרון זה מאפשר עבור האוסף של תאים cytologically או phenotypically רלוונטי או אזורים של רקמות heterogenous. המוצר שנתפסו ניתן להשתמש במגוון של שיטות מולקולריות חלבון, בידוד ה-DNA או RNA. אולם, שימור של RNA מרקמות המוח האנושי לאחר המוות הוא מאתגר במיוחד. טכניקות להדמיה סטנדרטי עבור הפונקציה LCM דורשים היסטולוגית או שגרות מכתימים immunohistochemical אשר יכול לקדם לבזות RNA. לכן, תיכננו פרוטוקול נירוסטה עבור הפריט החזותי LCM עם הייעוד של שמירה על תקינות RNA ברקמת המוח האנושי פוסט-מורטם. התא Purkinje של המוח הקטן הוא מועמד טוב ויזואליזציה אל חלד, עקב בגודל ובמיקום אופיינית. קליפת אסטרוציטומה יש שכבות נפרדות נבדלים צפיפות התאים, הפיכתם של ארכיטיפ טוב לזיהוי תחת בהגדלה מיקרוסקופית. תאי Purkinje הם נוירונים גדול ממוקם בין השכבה תא גרגר, שהינה רשת סלולרית בצפיפות של נוירונים קטן, השכבה המולקולרית, אשר הוא דליל בגוף התא. בגלל זה אדריכלות, השימוש של ויזואליזציה נירוסטה הוא ריאלי. מערכות אחרות איברים או תא המחקים פנוטיפ זה יהיה גם מתאים. פרוטוקול נירוסטה נועד לתקן רקמת קפוא טרי עם אתנול ולהסיר שומנים עם קסילן להמחשת מורפולוגי משופרת תחת מיקרוסקופ אור בהגדלה. פרוטוקול זה אינו חשבון בשביל שיטות קיבוע אחרות, היא תוכננה במיוחד עבור דגימות רקמה מוקפאות שנלכדה באמצעות של אולטרה סגול (UV)-מערכת LCM. כאן, אנו מציגים עבור חלוקתה ותיקון רקמות אנושיות אסטרוציטומה טריים קפואים פוסט-מורטם וטיהור של RNA מתאי Purkinje מבודדת על ידי UV-LCM, תוך שמירה על איכות ה-RNA עבור ה-RNA עוקבות-רצף פרוטוקול מלא. בידיים שלנו, פרוטוקול זה מייצר רמות יוצאות דופן של ויזואליזציה הסלולר ללא צורך מכתים ריאגנטים ותשואות RNA במספרים גבוהים RNA תקינות (≥8) לפי הצורך לניסויים פרופיל תעתיק.

Introduction

לייזר לכידת microdissection (LCM) הוא כלי רב ערך מחקר המאפשרת הפרדת תאים באופן פתולוגי רלוונטי להערכת מולקולרי מונע עוקבות. השימוש של ניתוחים מולקולריים אלו דגימות רקמה הטרוגנית, המתאם עם נתונים פתולוגית וקלינית הוא צעד שנדרש לצורך הערכת המשמעות translational של המחקר הביולוגי1. בעת ניתוח נתוני ביטוי גנים RNA, השימוש של מקטעי רקמת קפוא מומלץ מאוד שכן היא מאפשרת עבור איכות מעולה של RNA וכן מוגדל כמות2. זה הוכח גם כי באיכות גבוהה והן את כמות ה-RNA הם חיוניים עבור נתונים משמעותיים בין רצפי הרנ א3. עם זאת, בעת שימוש RNA מרקמות טריים קפואים פוסט-מורטם עבור הפונקציה LCM, השפלה RNA הוא אתגר גדול, כמו זה מתרחש מיד עם מותו את מימדיו מתווך על ידי גורמים שונים הקשורים עם רקמת אוסף שיטה4,5 . יתר על כן, ה-RNA השפלה היא מתעצמת כאשר טכניקות צביעת נדרשים לזהות פרטים היסטולוגית וזיהוי התא. התמחה מכתים טכניקות, hematoxylin & אאוזין, הכתם Nissl, immunofluorescence ו אימונוהיסטוכימיה מועילים ב המבדילים תאים של משתית שמסביב אבל הוכחו לבזות RNA ולשנות התעתיק ביטוי פרופילים6. לכן, המעבדה שלנו יצרה פרוטוקול נירוסטה שתוכננה במיוחד כדי לשמר RNA המח האנושי פוסט-מורטם למטרות של רצפי RNA לאחר LCM בידוד של נוירונים Purkinje.

עיבוד רקמה קפוא טרי עבור הפונקציה LCM, שיטת קיבוע יכול להשפיע variably RNA וגם רקמות תקינות. קיבוע פורמלין הוא תקן לשימור מורפולוגי, אך גורם cross-linking זה ייתכן קטע RNA ומשבשים RNA הגברה7. קיבוע אתנול הוא חלופה טובה יותר לבידוד RNA, כפי שהוא מקבע coagulative זה לא לגרום cross-linking1. כדי לשפר את החזיית מורפולוגיה רקמות, קסילן היא הבחירה הטובה ביותר, כאשר הוא מסיר שומנים מן הרקמה. עם זאת, שם מוכרים מגבלות כאשר ניצול קסילן ב LCM, כמו הרקמות יכול להתייבש ולהיות שביר-גרימת רקמות פיצול על לייזר לכידת7. קסילן גם רעלן נדיפים, חייבים להיות מטופלים כראוי בשכונה fume. למרות זאת, קסילן הוכח כדי לשפר את רקמת ויזואליזציה תוך גם שמירה על תקינות רנ א8. לכן, פרוטוקול שלנו סובבת, השימוש של 70% אתנול קיבוע והתייבשות אתנול, ואחריו קסילן הדגירה עבור בהירות מורפולוגי.

חשוב לציין סוגים שונים של מערכות microdissection מבוססת לייזר, כפי הם הוכחו נבדלים מהירות, דיוק ואיכות RNA. הלייזר האינפרא-אדום (IR) ללכוד microdissection ומערכות אולטרה סגול (UV) לייזר microbeam microdissection היו שתי פלטפורמות LCM הרומן שצצו כמעט במקביל8. מערכת אינפרא-אדום-LCM מעסיקה "מערכת קשר" באמצעות סרט גומי סינתטי אשר בהתקשותו שקוף וממוקם על סעיף רקמות, תאים עניין באופן סלקטיבי לדבוק הסרט על-ידי פולסים ממוקד של לייזר אינפרא-אדום. לחלופין, מערכת UV-LCM היא "מערכת ללא מגע" לפיה קרן לייזר ממוקדת חותך את התאים או אזורים של עניין בתוך הרקמה; בהתאם לתצורת ב שתי פלטפורמות מסחריות זמין כעת המשתמשות או עיצוב מיקרוסקופ הפוכה או זקוף, רקמות נרכש מכשיר אוסף ע י גל הלחץ לייזר המושרה זה משפד אותו נגד כוח המשיכה או רקמה אסף על-ידי כוח הכבידה, בהתאמה. יתרונות משמעותיים של מערכת UV-LCM כוללים רכישת תא מהר יותר, ללא זיהום אוסף עם גישה ללא מגע, ניתוח מדויק יותר בשל הרבה יותר קטן לייזר קרן בקוטר9. פרוטוקול זה תוכנן במיוחד עבור מערכת UV-LCM, לא נבדק בכל מערכת אינפרא-אדום-LCM. גם עיצוב מערכת UV-LCM, כאשר תאים צבירת לתוך הכיפה איסוף, שימוש coverslip זה משפר את בהירות הסלולר במהלך מיקרוסקופ אינו מתאים, כמו התאים לא יוכל להיכנס לתוך הכיפה אוסף. לכן, כדי לשפר את רקמת ויזואליזציה, בדקנו את השימוש של אוסף אטום caps, אשר נועדו לשמש coverslip להמחשת מיקרוסקופיים מערכות UV-LCM, נגד נוזלי אוסף מלא בקבוקים. אוסף מילוי נוזלי כמוסות עשויה להיות מאתגרת, הנוזל כפוף אידוי, יש להחליפם בתדירות גבוהה תוך כדי עבודה על המיקרוסקופ. הזמן הופך להיות גורם חשוב ליציבות RNA, כפי הרקמה שנתפסו לבישום7.

המעבדה שלנו מחקרים השינויים neuropathologic לאחר המוות הקטן בחולים עם רעד חיוני (ET) והפרעות הקשורות ניווניות של הצרבלום. הראו שינויים מורפולוגיות שבמרכזה תאי Purkinje להבחין בין המקרים ET לעומת פקדים, כולל מספר מופחת של תאי Purkinje, גדל רגרסיה דנדריטים וכן מגוון של שינויים עצב, מוביל אותנו בקביעתו Purkinje הזה ניוון תאים היא תכונה וחיסונים הליבה ET פתוגנזה10,11,12,13. פרופיל תעתיק שימש למחלות רבות נוירולוגיים לחקור את הבסיס המולקולרי שבבסיס של שינויים ניווניים הסלולר. עם זאת, פרופילים תעתיק מדגימות הטרוגנית, כגון אזורים רקמת המוח, ניתן לאשש להסוות את הביטוי של הפרוטוקולים שפע נמוכה ו/או לצמצם את הגילוי של השינויים המולקולריים המתרחשים רק אוכלוסיה קטנה של המושפע תאים, כגון תאי Purkinje בקליפת אסטרוציטומה. למשל, תאי Purkinje במידה רבה יותר על ידי תאים גרגר שופע בקליפת אסטרוציטומה מאת; 1:. כ 3000 לפיכך, למקד בצורה יעילה transcriptome שלהם דורשת בידוד ספציפי של נוירונים אלה. קליפת אסטרוציטומה תחום שכבות נפרדות נבדלים צפיפות התאים, גודל התא. ארכיטקטורה זו הסלולר הוא אידיאלי כדי לדמיין דגימת רקמה קפוא טרי ללא ריאגנטים מכתימים המכילים צבען. בתיאוריה, פרוטוקול זה יכול גם להיות מיושם סוגים אחרים, רקמות כי יש רקמת הייחודי דומה בארגון.

פרוטוקול זה תוכנן לעבוד במיוחד עבור תאי Purkinje הדמיית המוח האנושי פוסט-מורטם הקטן. פרוטוקולים רבים קיימות עבור הקיבעון, צביעת ויזואליזציה ושימור RNA סוגים רבים של רקמות למטרות של שני IR - ו UV-LCM. כשהוא מהרהר בעל עיצוב ניסיוני עבור UV-LCM, אנשים צריך להתאים נהלים שתתאים בצורה הטובה ביותר את הצרכים ואת הדרישות של להתחלה וסיום חומרים. כאן, אנו משלבים היבטים רבים של פרוטוקולים שונים LCM כדי לספק שיטה משופרת להמחשת תאי Purkinje ושההתפתחות האנושי פוסט-מורטם ללא צורך לצבוע המכיל נוגדנים מכתימים להתכונן RNA באיכות גבוהה transcriptome . רצף.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

כל הדגימות אדם מנוצל פרוטוקול זה הושגו עם הסכמה מדעת, אושרו על ידי פנימיות סקירה לוח (IRB) באוניברסיטת קולומביה, אוניברסיטת ייל.

הערה: מכלול של פרוטוקול זה צריך לעקוב קפדנית RNA טיפול הנחיות, לפיה יד בכפפה משמש תמיד, כל המשטחים מנוקים עם decontaminator RNase כל עובד שחומרים RNA/DNA/נוקלאז חינם.

1. בדיקת תקינות RNA של רקמות לפני הפעלת הפונקציה LCM

הערה: בדיקות איכות RNA יכול להיעשות על ידי שיטות רבות. ודא כי RNA מתוך המקטע כולו נבדק לספק מספר שלמות RNA נציג (RIN) עבור המדגם.

  1. בחר בקפידה דגימות רקמה לצורך הכללה שמתאימים בתוך הפרמטר של הנבחנים. אם גזירה-cryostat, לעבור שלב 1.2. אם לא, לעבד את הרקמה בהתאם ולעבור שלב 1.11.
  2. קבל שני מיכלים של קרח יבש. הגודל יהיה תלוי במספר הדגימות.
    1. במקום המכולה הראשונה של קרח יבש, של שפופרת ריק, שכותרתו 2 מ"ל עם הקוד רקמות.
      הערה: זה לוקח 10 דקות עד שהשפופרות להקפיא. צינורות בוודאי קופא לפני הנחת הרקמה לתוכם; אחרת, הרקמה יתמוססו על פני ברכבת התחתית.
    2. במיכל השני של קרח יבש, מקום הרקמה מקפיא-80 ° C הדורשת סימון ה-RNA.
  3. לנקות את cryostat. ראה שלב 4.7 לקבלת מפורט ניקוי בהליך.
  4. להסיר את הרקמה של קרח יבש, לחתוך קטע קטן של רקמה עם סכין גילוח RNase ושוקמו. רקמות צריך להיות כ 1 ס"מ על 1 ס"מ בגודל.
  5. במקום של התל כ 3 מ מ גבוהה של האופטימלית חיתוך טמפרטורה (אוקטובר) המורכב על cryostat "צ'אק" ולאפשר לו להקפיא באופן חלקי. אז, במקום הרקמה מעל OCT — לדחוף לתוך OCT, פשוט לאפשר להם לנוח על העליונה.
  6. ברגע OCT מתקשה למקם את הצ'אק עם רקמת הנטען cryostat חיתוך הזרוע, עמדה מול הלהב cryostat.
  7. לקצץ ב 30 סעיפים μm עד הרקמה אפילו.
  8. לחתוך 300 μm של רקמות, המקום בשפופרת mL 2 קפוא. מקם את הצינור בחזרה לתוך קרח יבש.
  9. להסיר את הרקמה "צ'אק" ומניחים בחזרה לתוך קרח יבש עד מוכן כדי לכלוא.
  10. חזור על הצעדים 1.4 – 1.9 לכל רקמות.
  11. לאחר כל דוגמאות מלאה, לחלץ RNA באמצעות של RNA ערכת חילוץ מסופקים (טבלה של חומרים #15). פרוטוקול מפורט מסופק עם הקיט מיצוי ה-RNA. בצע את הוראות כולל את שלב אופציונלי לייבוש אוסף שפופרת קרום, הצעד אופציונלי לעיכול DNase (טבלה של חומרים #16).
  12. בדוק את התקינות של RNA המחולצים דרך איכות הערכת bioanalyzer14.

2. להתכונן לפני החל חלוקתה LCM

  1. לנקות את מחזיקי שקופיות לפני כל סיבוב של רקמות חלוקתה עבור הפונקציה LCM. בצע את ההליך ניקוי יום לפני השימוש כדי לאפשר מלאה ייבוש למשך הלילה.
    הערה:     שקופית מחזיקי משמשים קיבוע בסעיף רקמות אתנול בתוך קסילן.
    1. שקופית מחזיק ניקוי הליך: לשטוף עם decontaminator RNase ואחריו מים מטופלים pyrocarbonate (DEPC) diethyl. מאפשרים לילה יבש במהופך על השטח חינם ה-DNA/RNA/נוקלאז, הימנעות אבק או אחרים זיהום באוויר.
      התראה: DEPC הוא רעיל מאוד, צריך להיות מטופל. והשמדתי באמצעות פרוטוקול סטנדרטי כימיקלים מסוכנים EH & S.
  2. לנקות מברשות חלוקתה עם RNase decontaminator וגם תאפשר לילה יבש. להימנע כל האבק מזהמים אחרים.
  3. המקום הקרום שקופיות תחת אולטרא סגול למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. לא לחשוף שהשקופיות UV יותר מ 1 – 2 ימים לפני שימוש. זה מגביר את הכריכה של הרקמה אל השקופית ממברנה.
    הערה: 2.3 שלב יכול להיות משולב עם שלב 4, מה שמאפשר עבור שקופיות UV טיפול להתרחש באותו היום כמו רקמות אופטים (ראה צעד 4.4).

3. מכינים קיבוע פתרונות עם מים חינם RNase ואתנול באיכות גבוהה

הערה: כל הפתרונות טריים מוכנים בכל ניסוי. ודא כי המחזיק שקופית ניקוי נוהל מ 1.1 שלב השלמת. כל הפתרונות מוכנות ב מחזיקי שקופיות.

  1. מקום 30 מ של 100% אתנול מחזיק שקופית אחת.
  2. לדלל אתנול עם RNase/DNase/נוקלאז מים חינם. מקום 30 מ"ל אתנול 95% באחד שקופית מחזיק ולשים על קרח.
  3. לדלל אתנול עם RNase/DNase/נוקלאז מים חינם. מקום 30 מ של 70% אתנול באחד שקופית מחזיק ולשים על קרח.
  4. מקום 30 מ ל 100% קסילן לשניים להפריד בין מחזיקי שקופיות, לתייג אותם כמו #1 ו #2.

4. מכינים Cryostat בשביל לרקמות חלוקתה

  1. להביא דלי קרח פתרונות אתנול, מיכל עם קרח יבש על הרקמה.
    התראה: קרח יבש הוא קר מאוד, לכן השתמש כפפות מגן. אין למקם קרח וקרח יבש באותה אריזה. בטמפרטורות שונות קרח, קרח יבש יגרום להם טופס יחד בטמפרטורה לא מוגדר.
  2. להסיר את הרקמה המקפיא-80 ° C והמקום בקרח יבש להובלה כדי cryostat.
  3. הגדרות cryostat:
    1. קבע את עובי סעיף 14 μm.
    2. קבע את עובי החיתוך μm 30 לשמר כמות רקמת.
    3. Cryostats עם תא כפול, הדגימה מחזיק טמפרטורות, להגדיר את טמפרטורת החדר (CT) ל-18 מעלות צלזיוס. Cryostats עם הגדרה אחת, להגדיר את הטמפרטורה ל-17 מעלות צלזיוס.
    4. Cryostats עם תא כפול, הדגימה מחזיק טמפרטורה, להגדיר את הטמפרטורה אובייקט (OT) ל-16 ° C.
      הערה: בשטחים הכבושים צריך להיות חם יותר מאשר ה-CT על מנת להבטיח אפילו חיתוך. אם הרקמה עדיין גורס, ניתן להגדיל בשטחים הכבושים כדי לטאוואנג, ה-CT יכול להיות עלה ל-18 ° C.
  4. מקם את הרקמה cryostat לפחות 20 דקות לאפשר להגיע לטמפרטורה אופטימלית.
    הערה: אם הרקמה אינה בטמפרטורה אופטימלית, זה לגרוס על חיתוך. אין למקם את הרקמה ב-20 ° C בלילה שלפני כדי לשמר את שלמות RNA, כדי למנוע היווצרות גביש קרח. לאפשר את הרקמה כל כך הרבה זמן לפי הצורך equilibrate טמפרטורה אופטימלית לחתוך בצורה חלקה. יישום אופציונלי של דגירה שקופיות תחת UV עלולה להתרחש כאן (ראה צעד 1.3).
  5. מקם את "צ'אק" cryostat לפחות 20 דקות לאפשר לרדת עד הטמפרטורה של cryostat.
  6. מקום נקי המברשות cryostat לפחות 20 דקות לאפשר לרדת עד הטמפרטורה של cryostat.
  7. לנקות את cryostat
    1. לנקות את הבמה עם תערובת 1:1 של RNase decontaminator ו- 70% אתנול מדולל עם מים ללא ה-DNA/RNA/נוקלאז למניעת קיפאון על הבמה.
    2. נקה להב חד פעמיות cryostat חדש עם RNase decontaminator, מקום בעל להב על הבמה. אפשר לפחות 20 דקות על הלהב cryostat לבוא עד הטמפרטורה של cryostat.
    3. נקי גליל נגד צלחת עם RNase decontaminator וצרף לבמה. אפשר לפחות 20 דקות לצלחת גליל נגד לבוא עד הטמפרטורה של cryostat.
      הערה: צלחת אנטי-רול אינו נדרש לחיתוך אך מומלץ בחום. אם צלחת אנטי-רול אינה זמינה, מברשת נקי עובד חלופי. אם הצלחת גליל נגד אינה בטמפרטורה הנכונה, הרקמה להמיס או מקל על חיתוך.

5. חלוקתה רקמות

  1. חותכים חתיכה קטנה של הרקמה (~ 1 ס"מ על 1 ס"מ) על חלוקתה. להחזיר את הרקמה הנותרת קרח יבש /-80 ° C מקפיא.
    הערה: ודא כי סעיף הרקמה cortex אסטרוציטומה ~ 95%, איפה ממוקמים תאי Purkinje.
  2. המקום התל כ 3 מ מ גבוהה של OCT כדי לכסות את "צ'אק". התחל על ידי בניית השכבות על גבי בתנועות מעגליות ואיטיות, עד שיש גבעה קטנה.
  3. ברגע OCT קפוא חלקית, אבל עדיין יש נוזל במרכז, במקום הרקמה מעל OCT. . אל תלחצי הרקמות עמוק לתוך אוקטובר אפשר הרקמה כדי לשבת על אוקטובר עד קפוא לגמרי. זה לוקח 1-2 דקות.
  4. מקם את "צ'אק" עם OCT קפוא ואת הרקמה לתוך הזרוע חיתוך cryostat. התאם את הרקמה כך זה מיושר עם להב חיתוך.
  5. לאפשר את הרקמה לשבת בזרוע חיתוך למשך 15-20 דקות להתאמת טמפרטורה חדש.
    הערה: תלוי בעובי של הרקמה, זמן נדרש עבור טמפרטורה והפיזיולוגי. לאפשר את הרקמה לשבת זמן רב ככל הנדרש כדי לחתוך נקיה. התאם OT ו- CT כדי לסייע עם רקמת טמפרטורה והפיזיולוגי.
  6. לאט הניעו את הרקמה קרוב יותר אל הלהב. ברגע הרקמה הגיעה הלהב, להתחיל תהליך החיתוך. עובי החיתוך צריך להיות מוגדר 30 μm.
  7. קיצוץ 2 – 3 x עד הרבדים קליפת גלויים.
  8. למקם וליישר את הצלחת אנטי-רול מעל הלהב cryostat.
    הערה: סילבר ליין יופיעו מן האור cryostat-הממשק של להב, צלחת אנטי-רול. זה מציין הצלחת גליל נגד ישירות מעל קצה הלהב.
  9. התחילו לחתוך הסעיפים-14 μm. מקטעים חתוכים כראוי יהיה שטוח כתשר אנטי-רול.
    הערה: אם הרקמה תקוע, להבטיח הצלחת גליל נגד מספיק קר. אם נחוץ, הצבת חלק יבש קרח על הרצון החיצוני (צד לא נוגע הבמה) במהירות מקררים את הצלחת אנטי-רול.
  10. סעיפים 4-6 גזורה ליישר אותם בצורה אופקית הבמה cryostat.
  11. לדוג את השקופית, לאסוף את כל החלקים של הרקמה בבת אחת.
    הערה: באמצעות המברשות, הרם את הקצוות של הרקמה כדי להיות זמינים יותר עבור השקופית בעת האיסוף. . אל תרים מקטע אחד בכל פעם. חשיפה לאוויר בטמפרטורת החדר תגרע RNA שלמות.
    התראה: לא נותנים לגעת השלב של cryostat הקרום. אם הקרום נוגע על הבמה, הוא יתחיל לנתק משקופית זכוכית, יגרום שגיאות בעת ניסיון LCM.
  12. מיד לעבור לשלב 6. אל תתמהמה קיבעון.

6. תיקון רקמות/כתם-פחות ויזואליזציה

  1. להעביר מיד פרוטוקול קיבוע אתנול
  2. הכנס את השקופית מחזיק שקופיות עם אתנול 70% למשך 2 דקות — על קרח.
  3. הכנס את השקופית מחזיק שקופיות עם אתנול 95% עבור 45 s – על קרח.
  4. הכנס את השקופית מחזיק שקופיות עם אתנול 100% למשך 2 דקות — ב- RT.
  5. טובלים את השקופית 3 פעמים ב מחזיק שקופיות עם קסילן 1 — ב- RT.
  6. למקם את השקופית מחזיק שקופיות עם קסילן 2 עבור 5 דקות — ב- RT.
  7. אפשר להתייבש באזור נקי מינימלית לפחות 30 פעמים יבש יותר הם אופטימליים, עד כדי 60 דקות.
    התראה: תעמוד שקופיות לייבוש בשכונה fume. קסילן הוא הפכפך. שטוח הנחת שקופיות יגרום קסילן למאגר במקטע רקמות, אשר תגרום רקמת להיות כהה מדי.

7. אופציונלי — אחסון שקופית

  1. מקום שקופיות מיובשים צינורות בודדים 50 מ ל (שקופית אחת למחזור), מקום במקפיא-80 ° C עד 7 ימים.
    הערה: שקופיות חייב להיות יבש לפני הצבת במקפיא-80 ° C. אל תשתמש/י סופג לחות בתוך הצינור כמו חלקיקים יבצע הטבעה של רקמות, ממברנה. להבטיח הצינורית חזק; אם לא, עיבוי תתרחש בשקופית כאשר מפשיר לשימוש.
    התראה: RNA שלמות פוחתת לאחר 7 ימים, כמו גם איכות רקמת להדמיה.

8. מפשיר לאחסן שקופיות לשימוש

  1. הסר את הצינור עם שקופית אחת מהמקפיא-80 ° C h 1 לפני השימוש המיועד.
  2. מיד לפתוח את הצינור. לאפשר את הצינור להגיע לטמפרטורת החדר. עיבוי תתרחש על החלק החיצוני של הצינור בלבד.
  3. לאחר הצינור הגיע לטמפרטורת החדר, עיבוי כל נעלם (כ 30 – 40 דקות), הסירי את הפקק ולחשוף את השקופית באוויר בטמפרטורת החדר.
  4. לאפשר את השקופית להסתגלות לטמפרטורת החדר עבור 15 – 20 דקות לעזוב השקופית בתוך הצינור בפקק הוסר.
    הערה: עכשיו הוא מוכן עבור הפונקציה LCM שקופיות.

9. לייזר Microdissection לכידת תאי Purkinje:

הערה: סעיף זה של הפרוטוקול ידונו רק פרטים הקשורים לכידת תאי Purkinje עבור רצפי RNA עוקבות. סעיף זה מבוסס על ההנחה כי המשתמש הוא מכיר המיקרוסקופ לכידת לייזר UV ואת התוכנה קשורות.

  1. נקי השלב מיקרוסקופ, את אוסף המכסים את זרוע עם RNase decontaminator.
  2. עם ידיים בכפפות, למקם את השקופית על המיקרוסקופ, 500 μL קאפ אטום הזרוע אוסף.
    הערה: תמיד להבטיח RNA טכניקה נכונה על-ידי ניקוי אזור העבודה עם RNase decontaminator ולהשתמש ידיים בכפפות תוך נגיעה את השקופית או מכסה אטום. ניתן להסיר כפפות ברגע השקופית ואת ו לכידת לייזר החלה.
  3. בהגדלה נמוכה, יישר את הכובע אטום על הרקמה אסטרוציטומה, המבטיח כי הכיפה מכסה את האזור כולו דמיינו בחתיכה העין.
    הערה: רק את העין פיסת המיקרוסקופ יראה אם הכובע אטום ממורכזת. המצלמה לא להראות אם הכובע ממורכזת על הרקמה. בהתאם לעיצוב היקף לכידת לייזר, הפריט החזותי דרך הכיפה אטום יהיה גם היצירה העין היחידה או מטמיעים ב עין היצירה והן המצלמה.
  4. לדמיין את הרבדים אסטרוציטומה עם 5 x - 10 x המטרה עדשה, הצב את הסמן מעל המקטע בו שכבה מולקולרית, שכבת תאים גרגר מצטלבים (השכבה Purkinje התא).
  5. לעבור 40 X והמחש תאי Purkinje.
    הערה: ראה איור 1 , איור 2 דוגמה פריטים חזותיים.
  6. להתחיל לכידת תאי Purkinje.
    הערה: כדי לבצע RNA-רצף, לפחות 5 ננוגרם של RNA נדרש. כ 1600-2000 Purkinje תאים התוצאה מספיק חומר RNA רצף. רנ א יהיו יציבים עבור עד 8 שעות-המיקרוסקופ. מבחן UV ומיקוד UV לפני אוסף כדי להבטיח רמות נכונים. לאורך זמן, הרקמה ימשיך להתייבש UV ומיקוד UV יכול ויהיה צורך לשנות.

10. RNA אוסף פוסט LCM

  1. הכנת המאגר פירוק התא (להכין טרי בכל פעם)
    1. לדלל מרקפטואתנול במאגר פירוק-מטריים (10 מ"ל μL:1, בהתאמה). מאגר פירוק (RLT) הינו מסופק טבלה של חומרים (#14 ו- #15).
  2. להוסיף 50 μL תא פירוק מאגר הכיפה אטום, עם הכובע פונה כלפי מעלה. בזהירות לסגור את הצינורית על הכיפה.
  3. להשאיר את הצינור הפוך עבור 1 דקות.
  4. מערבולת הצינור עבור 30 s במהירות ספין המאגר פירוק לתחתית הצינור.
  5. פתח מחדש את הצינור וחזור על שלבים 10.2-10.4.
  6. מקם את הצינור המכיל 100 μL של פירוק מאגר ו- RNA מהמקפיא-80 ° C עד כל הדגימות מוכן לחילוץ RNA (טבלה של חומרים #14).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

פרוטוקול זה מפרט את השלבים להכנת רקמת המוח האנושי טריים קפואים פוסט-מורטם UV-LCM. מפרט יסודית וביאורים ניתנים לחיתוך cryostat, כפי שהוא יכול להיות קשה לחתוך את רקמת המוח קפוא טרי עם רמה גבוהה של דיוק. הנקודה החשובה ביותר שיש לקחת בחשבון הוא כי רקמת קפוא טרי הוא קר מאוד ודורש כמות משמעותית של זמן להתאקלם הטמפרטורה החמים של cryostat. . אי אפשר לזרז את שלב זה, אי-אפשר להגזים איך מרכזי השלב זה ההצלחה או הכישלון של פרוטוקול זה. אם הרקמה אינו מוכן כהלכה-cryostat, כל הניסיונות הבאים על זיהוי תאים או אזורים עניין יהיה קשה מאוד, אם לא בלתי אפשרי.

בעקבות חלוקתה cryostat המוקצב ייבוש, הרקמה מוכן עבור הפונקציה LCM. כשמתכננים את הרקמה מתחת למיקרוסקופ, הרבדים הסלולר של הצרבלום גלויים בקלות עם 5 X ועדשות 10 X אובייקטיבי. איור 1 מראה להחליפן בתמונות של רקמות קבוע אתנול היחידה (איור 1א') ורקמות מודגרות ב קסילן בעקבות קיבוע אתנול (איור 1B). אנחנו נבדק בקפידה אתנול שונים וזמני הדגירה קסילן / הטמפרטורות על שניהם את היכולת לתקן והמחש את הרקמה. אם הרקמה מודגרת לא מספיק זמן, קסילן, התמונה שתיווצר הדוק יותר ידמה איור 1א', יותר מאשר באיור 1ב'. קסילן הדגירה גורם הרקמה להיות כהה יותר וטוב יותר מתארת שכבות סלולרית מאשר עושה אתנול לבד. חיתוך-המיקרוסקופ לכידת לייזר, כאשר העדשה המטרה X 40 נדרש כדי להבטיח לכידת רק תאי Purkinje, ואת לא הרקמה שמסביב. דגירה של קסילן מייצרת איכותית, התמונה קורפוס שלם (איור 1D) לעומת הקיבעון אתנול לבד (איור 1C).

כדי לשפר עוד יותר את הפריט החזותי של רקמות שלנו, בדקנו את יכולת coverslip מכסה אטום. פרוטוקולים אחרים UV-LCM לנצל את כובע מילוי נוזלי של צינור μL 200-500 מתמוסס הרקמה על קשר. כמוסות מילוי נוזלי יכול להפחית את רקמת ויזואליזציה, גורם התמונה המתקבלת תהיה פרטנית, ססגוני תחת המיקרוסקופ (איור 2א). ויזואליזציה רקמות על תוצאות מכסה אטום (איור 2B) מראה רקמת smoothened כי הוא רך יותר וחדה בטופס. ראוי לציין, הכובע אטום מאפשר איסוף עד 8 h ללא צורך חלופי. להחליפן בתמונות של תאי Purkinje נכרת על צריכת חשמל נמוכה (איור 2C) ו בעוצמה גבוהה (איור 2D, E) מראים להסרת מדויק רק תאי Purkinje הגוף. לעיון, איור 2F מציג כחולה Luxol מהיר / Hematoxylin ואאוזין (LH & E) צבעונית אסטרוציטומה cortex, המדגישה במיוחד את הרבדים השונים של הצרבלום, והנחת של תאי Purkinje-מולקולרית שכבה ותא גרגר שכבת סמיכות.

המטרה של פרוטוקול זה הוא לקבל RNA באיכות גבוהה עבור רצפי RNA עוקבות. בדקנו את הפרוטוקול שלנו על שש דגימות המוח האנושי פוסט-מורטם שונים, אשר כל עברו שלושה ימים של הפונקציה LCM לגבות 1500-2000 תאים עבור החילוץ-RNA. כ 6-8 h המיקרוסקופ הפיק 500-700 תאים, אשר היו משולבים מכן במוצרים LCM בימים הקודמים לפני החילוץ-RNA. דוגמאות עברה החילוץ-RNA, היו resuspended ב- 14 μL של מים נטולי RNAse (טבלה של חומרים #14). כל ששת המדגמים ייצרו RNA באיכות גבוהה, עם ה-RNA שלמות מספרים (RINs) ≥8 (איור 3A-F). הליך זה הביא RNA כמויות של 11.5 ng (איור 3א), 8.3 ng (איור 3ב), 13.6 ng (איור 3C), 11.5 ng (איור 3ד'), 14.9 ng (איור 3E) ו- 26.9 ng (איור 3F). הערה הוא כי כל פוסט-מורטם המוח האנושי דוגמאות נבדקו עבור איכות RNA לפני LCM (טבלה 1). אם המדגם ממוצא RNA השפלה, הפונקציה LCM בלבד לבזות את שלמותו.

Figure 1
איור 1 : שכבות אסטרוציטומה והדמיה Purkinje תא עם וללא טיפול קסילן. להחליפן בתמונות עם ובלי קסילן בעקבות אתנול קיבוע והתייבשות. השכבה המולקולרית (ML) ואת שכבת תאים גרגר (שזכתה) מסומנות. תאי Purkinje מסומנים עם החצים. (א) 5 X ייצוג של שכבה אסטרוציטומה ויזואליזציה ללא קסילן. סרגל קנה מידה: 10 מיקרומטר. (B) 5 X ייצוג של שכבה אסטרוציטומה ויזואליזציה עם קסילן. סרגל קנה מידה: 10 מיקרומטר. (ג) 40 X ייצוג שכבה אסטרוציטומה ויזואליזציה ללא קסילן. סרגל קנה מידה: 1 מיקרומטר. (D) 40 X ייצוג חזותי אסטרוציטומה שכבה עם קסילן. סרגל קנה מידה: 1 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 2
איור 2 : תאי Purkinje ויזואליזציה לפני ואחרי LCM. להחליפן בתמונות בגיל 40 X עם קסילן בעקבות אתנול קיבוע והתייבשות. ML ושזכתה מסומנות. תאי Purkinje מסומנים עם החצים. (א) הדמיה-המיקרוסקופ תחת נוזל מילא קאפ-40 x. סרגל קנה מידה: 1 מיקרומטר. (B) הדמיה-מיקרוסקופ תחת אוסף אטום קאפ בגיל 40 X. סרגל קנה מידה: 1 מיקרומטר. (ג) 5 X ויזואליזציה של קליפת אסטרוציטומה מציג את תאי Purkinje נכרת בין ML שזכתה. סרגל קנה מידה: 10 מיקרומטר. (D) 40 X ויזואליזציה של תא Purkinje לפני כריתה. סרגל קנה מידה: 1 מיקרומטר. (E) 40 X ויזואליזציה של לכידת תאי Purkinje מוצלחת. סרגל קנה מידה: 1 מיקרומטר. (F) 20 X נציג LH & E צבעונית המוח הקטן מראה Purkinje תא גופות עם החצים המסומנים. סרגל קנה מידה: 5 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 3
איור 3 : RNA בקרת איכות Bioanalyzer תוצאות של הפונקציה LCM דגימות. לוחות A-F מראים נציג RNA בקרת איכות המפרט. כל לוח הוא מדגם שונים שעברו תהליך LCM באותו קיבעון והדמיה עם אתנול, קסילן בלבד. RNA תקינות מספרי (RINs) הם כל > 8.0. ריכוזי הנציגה [] התוצאה תשואה לפחות 5 ננוגרם של RNA הכולל. כל הדגימות היו eluted ב µL 14 RNAse ללא מים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

מדגם רין - סעיף פרפ רין - LCM [RNA] - LCM PMI קפוא
A 9.2 8.6 עמוד 822/µL מינימום 450
B 9.8 8 עמוד 598/µL 550 מינימום
C 9.1 8.5 עמוד 976/µL 455 min
D 9.8 8.2 עמוד 823/µL 463 min
E 9.8 9.1 1069 pg/µL 1139 min
F 9.6 8.3 1923 pg/µL 1080 דקות

טבלה 1: סיכום של RNA שלמות . מספרים מדגם תואמות התוצאות bioanalyzer המוצג באיור3. סעיף ההכנות מתבצעות לפני LCM על מנת להבטיח כי החל רקמה באיכות טובה. המוצג הרקמה המקורית RINs סעיף preps, הפונקציה LCM RINs, ריכוז של RNA מן הפונקציה LCM, כמו גם את המרווחים פוסט-מורטם כדי מוקפאים (קפוא PMI) על הרקמות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

פרוטוקול המובאת כאן במיוחד משתנים להיות בגישה אל חלד ב להמחיש רקמות מורפולוגית נפרדות עבור UV-LCM שיטה זו נועדה להגדיל RNA שלמות עוקבות רצפי RNA ישיר, תוך שמירה על רמת משופרת של רקמות ויזואליזציה. היכולת להבחין בין סוגי תאים שונים עבור לכידה, כדי ליצור את האוכלוסייה הטהור של תאים אפשרי, חיוני להבנת פרופילים שונים מולקולריים ברקמות אנושיות15. בתוך ההקשר של פרוטוקול זה, רקמת הבחירה הוא בעל חשיבות עליונה, כמו השימוש של אנטיגן או לצבוע ריאגנטים ספציפיים שאינם מנוצלים, ולכן אינה מתאימה ללימודי הדורשים בידול כזה. אמנם זה מגבלה של פרוטוקול זה, וכתוצאה מכך רקמת ויזואליזציה ותקינות RNA עדיפים די ולתחזק רלוונטיות אחרות עיצובים ניסיוניים. פרוטוקולים רבים אחרים קיימות גם מנצלים שיטות אלטרנטיביות מכתימים במיוחד עבור UV - ו -IR-LCM מתוך כוונה RNA שימור. עם זאת, רוב שיטות אחרות מכילות לפחות אחד להכתים או אנטיגן ספציפי ריאגנט6,16,17, נועדו סוג התא או איבר אחד (כי הם לא רקמה אנושית נתיחה שלאחר המוות)18,19, 20, או לדרוש ערכות מיוחדות RNA-seq כדי לשפר את שלמות21. צביעת cresyl, ויולט (Nissl) הוא צבע פופולריים המכיל ריאגנט בשימוש פרוטוקולים רבים, כפי הוא כתמים גרעינים של נוירונים במוח וגורם הסכום של RNA השפלה6לפחות. עם זאת, גרעין גדול של התא Purkinje לא טוב מוכתמת ויולט cresyl, מתן אין יתרון משמעותי להמחשת תאי Purkinje. חשוב, זיהינו אחד בלבד LCM מחקר הספרות לתאר האוסף של תאים Purkinje האנושי, אשר הם בעלי עניין רב בחקר ניוונית אסטרוציטומה והפרעות התפתחותיות. מחקר זה מוכתם רקמות קפוא עם ויולט cresyl, מבודדים תאי Purkinje עם מערכת אינפרא-אדום-LCM; לטעום RINs נמוך כמו 5 היו בשימוש אך ייחשב מקובל עבור ניתוח microarray22. לכן, זהו המחקר הראשון פרוטוקול זה תוכנן במיוחד עבור ה-RNA באיכות גבוהה מתאי Purkinje ושההתפתחות האנושי פוסט-מורטם טוחנות באמצעות UV-LCM.

היציבות של RNA פוסט-מורטם רקמה אנושית היא מכשול ידועים, כמו מולקולות RNA בתוך התאים הם די בכפוף ריקבון טבעי לאחר המוות. באופן ספציפי, mRNA הוכח השפלה חד-תאית5רגישים ביותר. פיקוח על מרווח פוסט-מורטם (PMI) זמן עד קפוא (PMI קפוא) הוא מדד אחד הראה איזה מתאם ה-RNA השפלה24,23,25כמה מחקרים. עם זאת, טבלה 1 מציגה שלנו מרווחי מוקפאים PMI ששת המדגמים שמוצג באיור 3, המציין אין מתאם יחסית עם ערכים PMI ואיכות RNA. לכן, יש צורך לבצע נאותות בדיקת שלמות RNA לפני הפעלת פרוייקט לכידת לייזר. אם שלמות RNA המדגם ההתחלתי הוא באיכות נמוכה, RNA שנוצר מכל מוצר LCM יהיה באיכות נמוכה יותר אפילו. כאשר לא ניתן למנוע שלמות RNA נמוך, שיטות נוספות עבור שיפור RNA עבור רצף יכול להיות מועסק בנוסף זה פרוטוקול21. ראוי לציין, נמוך-קלט או מפורק RNA יכול להוביל עמומים המורכבות ואת התוצאות שיוצרת לעיתים קרובות מחייבים צעדים נוספים הגברה. התוספת של ה-PCR מחזורי עבור הגברה הוכח להגביר את רצפי ושליחותם, כמו גם ליצור כפילויות קריאה על רצף26,27. לכן, ניצול של RNA באיכות גבוהה מדגימות LCM עבור רצף היא הכדאית ביותר.

שיטת הדמיה המועסקים פרוטוקול זה בכבדות מסתמך על המשתמש מומחיות בעת חיתוך טרי מוקפא רקמות על cryostat. הפרוטוקול נכנס פירוט נרחב על איך הכי טוב להכין את הרקמה חלוקתה ולמקם את הרקמה בשקופית. אלה ללא ספק שני השלבים הקריטיים ביותר של פרוטוקול זה. אם הרקמה לא שאמבטיה לטמפרטורה cryostat, גיזום תתרחש, אשר מעכבת באופן משמעותי האיכות המורפולוגית של הרקמה. רטוש הוא התוצאה של כמה בעיות אפשריות; אפשרויות לפתרון בעיות לכלול לחכות זמן רב הרקמה כדי להגיע לטמפרטורה או שינוי cryostat OT ו/או CT של מגוון חם יותר. ברגע הרקמה לחתוך בהצלחה והניח על הבמה, זה חשוב להציב את הרקמה וזה השקופית כראוי כדי להבטיח כל רקמות מתאים במסגרת הקרום והרים יכול להיות מדויק מן הבמה. כאשר מנסים לאסוף את הרקמה מן השלב cryostat, הרקמה. בטח קר, השקופית צריך להיות חם. פרוטוקולים אלטרנטיביים קיימים מומלץ להירגע השקופית לפני אוספת את הרקמה וחיממתי עם האצבע על פני השטח של רקמות השמה28; עם זאת, בידיים שלנו, זה אינו מספק שום תועלת, וגורם לעיתים קרובות הקושי לאסוף את רקמת ואת יתר רקמת קפלי. עם מגלשת בטמפרטורת החדר, הרקמה נמס מיד לאחר יצירת קשר עם השקופית. כדי להבטיח טנדר נקי, יש צורך זווית השקופית כך בא במגע עם הרקמה באזור הממברנה אך לא לכת כדי לגעת על הבמה עצמה. הקרום יתחיל לנתק משקופית זכוכית אם זה נוגע הבמה, אשר פוגעת הקרום, גורם לייזר לכידה קשה. במקרה זה, זה יהיה מורגש ברגע LCM החלה ולא ניתן לבטלם. אפשרויות לפתרון בעיות מוגבלים; אם בכל עת הוא חשב הממברנה או שקופיות נחשף, זה חכם למחוק. מומלץ כדי תרגול רקמות קפוא טרי חלוקתה לפני הפעלת פרוייקט או באמצעות גרעין פתולוגיה יכול לייצר באיכות גבוהה רקמות חלוקתה. עם זאת, אם משתמש בשירות הליבה, להבטיח את הטכניקה הנכונה של RNA מלווה למניעת זיהום RNase. השפלה RNA יכול להתרחש בקלות כאשר משתמשים בטכניקה לא תקין.

הובאו כאן שיטה שלמה להמחשת נירוסטה תאי Purkinje המוח האנושי הקטן פוסט-מורטם לענין UV-LCM. כללנו גם שיטות לשימור RNA תקין וטכניקות כדי להבטיח רמות גבוהות של RNA שלמות. פרוטוקול זה אינה בהכרח ספציפית על כל תא אחד או סוג הרקמה אך האם לשמור על הדרישה כי התא/האזור של עניין הוא באבחנה מורפולוגית stroma שמסביב ללא צורך אנטיגן או צבע זיהוי ספציפיות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים אין לחשוף.

Acknowledgments

המחברים רוצה להכיר בנק בניו-יורק המוח, ד ר ז'אן פול Vonsattel, ד ר אטי קורטס, לסיוע שלהם ב חיתוך ושימור דגימות רקמה את המוח האנושי קפוא לניסויים אלה. המחברים רוצה להכיר את האנשים אשר תרם בנדיבות את המוח שלהם למחקר המשך לתוך רעד חיוני. ד ר פאוסט, ד ר Martuscello רוצה להכיר מחלקת פתולוגיה של אוניברסיטת קולומביה, ביולוגיה של התא על תמיכתם המתמשכת הליבה מחקר שטח. המחברים רוצה להכיר NIH R01 NS088257 לואי/פאוסט...) למימון מחקר עבור פרוייקט זה. תמונות LCM בוצעו ב Confocal ולהעניק התמחה מיקרוסקופ לשתף משאבים של הרברט אירווינג מקיף במרכז לחקר הסרטן באוניברסיטת קולומביה, נתמך על ידי NIH #P30 CA013696 (המכון הלאומי לסרטן). המחברים רוצה להכיר תרזה Swayne, לורה מונטאנו לסיוע המשך שלהם עם מיקרוסקופ מיוחד.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
MembraneSlide NF 1.0 PEN Zeiss 415190-9081-000 Membrane slides for tissue. We do not recommend using glass slides. 
AdhesiveCap 500 Opaque Zeiss 415190-9201-000 Opaque caps are used to enhance visualization on inverted scopes only
RNase Away Molecular BioProducts 7005-11 Other RNase decontamination products are also suitable. Use to clean all surfaces prior to work. 
200 Proof Ethanol Decon Laboratories 2701 If using alternative Ethanol, ensure high quality. Essential for tissue fixation. 
Xylenes (Certified ACS) Fisher Scientific X5P-1GAL If using alternative xylene, ensure high quality. Essential for tissue visualization. 
UltraPure Distilled Water Invitrogen 10977-015 Other RNA/DNA/Nuclease free water also suitable. Utilized in ethanol dilution only. 
Slide-Fix Slide Jars Evergreen 240-5440-G8K Any slide holder/jar is also suitable. Must be cleaned prior to use. Used for fixation following sectioning. 
Anti-Roll Plate, Assy. 70 mm 100 μm Leica Biosystems 14041933980 Anti-roll plate type is determined by type of cryostat and attachment location on stage. All cryostats have differing requirements. 
Diethyl pyrocarbonate (DEPC) Sigma Aldrich D5758-50mL DEPC from any vendor will do. Follow directions for water treatment. 
Kimwipes Fisher Scientific 06-666A Kimwipes can be ordered from any vendor and used at any size. Kimwipes are to be used to clean microscope and cryostat. 
Tissue-Plus O.C.T. Compound Fisher Scientific 23-730-571 Any brand of OCT is acceptable. No tissue will be embedded in the OCT, it is strickly to attach tissue to 'chuck'. 
Edge-Rite Low-Profile Microtome Blades Thermo Scientific 4280L Blade type is determined by type of cryostat. All cryostats have differing requirements. 
Leica Microsystems 3P 25 + 30MM CRYOSTAT CHUCKS Fisher Scientific NC0558768 Chuck type is determined by type of cryostat. All cryostats have different requirements. Either size is suitable. 
RNeasy Micro Kit (50) Qiagen 74004 Required for RNA extraction post LCM. RLT Lysis buffer essential to gather captured cells from opaque cap. 
RNeasy Mini Kit (50) Qiagen 74104 Required for RNA extraction of section preps, which are performed prior to LCM to test RNA integrity of starting tissues. 
RNase-Free DNase Set Qiagen 79254 Dnase will remove any DNA to allow for a pure RNA population. Ensure Dnase is made fresh. 
2-Mercaptoethanol Sigma Aldrich M6250-100ML Purchased volume at user discretion. Necessary for addition to RLT buffer for cell lysis. Prevents RNase activity. 
Globe Scientific Lot Certified Graduated Microcentrifuge Tube (2 mL) Fisher Scientific 22-010-092 Any 2 mL tube that is RNase free, DNase free, human DNA free, and Pyrogen free will do. 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Liu, H., et al. Laser capture microdissection for the investigative pathologist. Veterinary Pathology. 51 (1), 257-269 (2014).
  2. Datta, S., et al. Laser capture microdissection: Big data from small samples. Histology and Histopathology. 30 (11), 1255-1269 (2015).
  3. Romero, I. G., Pai, A. A., Tung, J., Gilad, Y. RNA-seq: impact of RNA degradation on transcript quantification. BMC Biology. 12 (42), 1-13 (2014).
  4. Bevilacqua, C., Ducos, B. Laser microdissection: A powerful tool for genomics at cell level. Molecular Aspects Medicine. 59, 5-27 (2018).
  5. Sidova, M., Tomankova, S., Abaffy, P., Kubista, M., Sindelka, R. Effects of post-mortem and physical degradation on RNA integrity and quality. Biomolecular Detection and Quantification. 5, 3-9 (2015).
  6. Wang, H., et al. Histological staining methods preparatory to laser capture microdissection significantly affect the integrity of the cellular RNA. BMC Genomics. 7, 97 (2006).
  7. Mahalingam, M. Laser Capture Microdissection: Methods and Protocols. Murray, G. I. , Springer. (2018).
  8. Vandewoestyne, M., et al. Laser capture microdissection: should an ultraviolet or infrared laser be used. Analytical Biochemistry. 439 (2), 88-98 (2013).
  9. Graeme, M. I. Laser Capture Microdissection. Third edn. , Humana Press. (2018).
  10. Louis, E. D. Re-thinking the biology of essential tremor: From models to morphology. Parkinsonism & Related Disorders. 20, 88-93 (2014).
  11. Choe, M., et al. Purkinje cell loss in essential tremor: Random sampling quantification and nearest neighbor analysis. Movement Disorders. 31 (3), 393-401 (2016).
  12. Louis, E. D., et al. Neuropathological changes in essential tremor: 33 cases compared with 21 controls. Brain. , Pt 12 3297-3307 (2007).
  13. Louis, E. D., et al. Neuropathologic findings in essential tremor. Neurology. 13 (66), 1756-1759 (2006).
  14. Schroeder, A., et al. The RIN: an RNA integrity number for assigning integrity values to RNA measurements. BMC Molecular Biology. 7, 3 (2006).
  15. Jensen, E. Laser Capture Microdissection. The Anatomical Record. (296), 1683-1687 (2013).
  16. Waller, R., et al. Isolation of enriched glial populations from post-mortem human CNS material by immuno-laser capture microdissection. Journal of Neuroscience Methods. 208 (2), 108-113 (2012).
  17. Lee, S., et al. Laser-capture microdissection and transcriptional profiling of the dorsomedial nucleus of the hypothalamus. Journal of Comparative Neurology. 520 (16), 3617-3632 (2012).
  18. Cummings, M., et al. A robust RNA integrity-preserving staining protocol for laser capture microdissection of endometrial cancer tissue. Analytical Biochemistry. 416 (1), 123-125 (2011).
  19. Sonne, S. B., et al. Optimizing staining protocols for laser microdissection of specific cell types from the testis including carcinoma in situ. PLoS One. 4 (5), 5536 (2009).
  20. Butler, A. E., et al. Recovery of high-quality RNA from laser capture microdissected human and rodent pancreas. Journal of Histotechnology. 39 (2), 59-65 (2016).
  21. Schuierer, S., et al. A comprehensive assessment of RNA-seq protocols for degraded and low-quantity samples. BMC Genomics. 18 (1), 442 (2017).
  22. Kumar, A., et al. Age-associated changes in gene expression in human brain and isolated neurons. Neurobiology of Aging. 34 (4), 1199-1209 (2013).
  23. Sampaio-Silva, F., Magalhaes, T., Carvalho, F., Dinis-Oliveira, R. J., Silvestre, R. Profiling of RNA degradation for estimation of post mortem [corrected] interval. PLoS One. 8 (2), 56507 (2013).
  24. Walker, D. G., et al. Characterization of RNA isolated from eighteen different human tissues: results from a rapid human autopsy program. Cell Tissue Bank. 17 (3), 361-375 (2016).
  25. Birdsill, A. C., Walker, D. G., Lue, L., Sue, L. I., Beach, T. G. Postmortem interval effect on RNA and gene expression in human brain tissue. Cell Tissue Bank. 12 (4), 311-318 (2011).
  26. Adiconis, X., et al. Comparative analysis of RNA sequencing methods for degraded or low-input samples. Nature Methods. 10 (7), 623-629 (2013).
  27. Parekh, S., Ziegenhain, C., Vieth, B., Enard, W., Hellmann, I. The impact of amplification on differential expression analyses by RNA-seq. Scientific Reports. 6, 25533 (2016).
  28. Carl Zeiss Microscopy. , Carl Zeiss. Germany. (2012).

Tags

מדעי המוח גיליון 143 תאי Purkinje המוח הקטן לייזר לכידת microdissection RNA RNAseq רעד חיוני
פרוטוקול אל חלד באיכות גבוהה בידוד RNA של לייזר לכידת תאי Microdissected Purkinje המוח האנושי פוסט-מורטם הקטן
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Martuscello, R. T., Louis, E. D.,… More

Martuscello, R. T., Louis, E. D., Faust, P. L. A Stainless Protocol for High Quality RNA Isolation from Laser Capture Microdissected Purkinje Cells in the Human Post-Mortem Cerebellum. J. Vis. Exp. (143), e58953, doi:10.3791/58953 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter