Summary
ここでは、生成する効率的かつ再現性のある戦略、力価、およびアデノ随伴ウイルスベクターの品質管理バッチについて述べる。それは高価にベクトル準備を取得するユーザーをことができます (1013ベクトル ゲノム/mL x ≥ 1) と高純度、生体外でまたは生体内で使用する準備ができて。
Abstract
アデノ随伴ウイルス (通気) に基づく遺伝子配信ツールは、遺伝子療法アプリケーションを含む中枢神経系 (CNS) に transgenes の配信するための人気のある選択肢です。AAV のベクトルは非複製、分割、非分割の細胞に感染して長期的な遺伝子発現を提供することができます。重要なは、いくつかの血清型、新しく記述された PHP など。B、血液脳関門 (BBB) 動物モデルでクロスすることができます以下の全身配信。研究室での AAV のベクトルを効率的に生成できます。しかし、堅牢かつ再現性のあるプロトコルが十分な純度のレベルと十分な体内用高価値の AAV のベクトルを取得する必要です。このプロトコルでは、iodixanol の勾配浄化戦略に基づいて、AAV のベクトル生産の効率的かつ再現可能な戦略について説明します。Iodixanol の浄化方法は、他の浄化方法と比較した場合の高純度、高価 AAV ベクターのバッチを取得に最適です。さらに、プロトコルは一般に現在記載されている他の方法よりも高速です。さらに、量的なポリメラーゼの連鎖反応 (qPCR)-ベクトルの純度を決定するベクトル力価として銀染色法の迅速かつ正確な定量ベースの戦略を説明。最後に、AAV PHP の全身投与、中枢神経系への遺伝子導入の代表の結果。B が表示されます。このような結果は、この資料に記載されているプロトコルを使用してすべてのラボでできるはずです。
Introduction
過去 30 年間、野生型通気は、中枢神経系1,2,3,4への遺伝子導入のための非常に便利なツールであると証明、組換え AAV のベクトルを作成する設計されています 5,6遺伝子治療に病気 (fda と EMA 療法を含む)4,7に近づきます。中枢神経系で使用するための適合性は主として非分裂、分裂後の細胞に感染、通常8CNS で発見する能力から派生します。ただし、AAV を用いたベクトルも他のウイルスのベクトルの7、に比べて穏やかな免疫応答を惹起しながら任意の特定の治療遺伝子4,9長期的な表現を許可する利点があります。 8,10、11,12。
任意の AAV のベクトルの主な要素は、ゲノムとキャプシドです。野生型の通気は、一本鎖 (ss) 約 5 kilobases (kb)13のゲノム DNA ウイルス。組換え AAV のベクトル生産のため担当者とキャップの遺伝子 (ゲノム複製とウイルスのキャプシドのアセンブリに必要) が野生型 AAV のゲノムから削除されトランスのための部屋を去る、transgene14,15を含む式カセット。元のウイルスのゲノムの倒立ターミナル繰り返しシーケンス (ITRs) は、レプリケーションおよび包装の3、10,14必須では、AAV ベクターの残留要素だけです。AAV のベクトルは、遺伝子発現の; を高めるよう設計されてすることができます。ITRs の 1 つの突然変異は、相補的な DNA ストランド3,7,15の生成を効果的にできるヘアピン ループの形成に します。自己補対 (sc) ゲノムと呼ばれる、この構成の主な利点はそれがの第 2 鎖合成さ、速度および遺伝子発現のレベルをかなり増加の従来のライフ サイクルの一般的な必要性をバイパスします。1. それにもかかわらず、scAAV ゲノムを使用するベクターの貨物容量約 2.4 kb に減少します。これにより、遺伝子のシーケンス、プロモーターやマイクロ Rna 結合部位、特定のセルの種類16の式を制限するなど、規制のシーケンスが含まれます。
AAV キャプシド ベクトル ホスト細胞間相互作用を決定し、遺伝子発現の特定の場所への制限にも使える AAV 血清タイプのセル型や組織トロピズムの学位を与えます。他は遺伝子組換え手法 (つまり、PHP 研究所で生産されているに対し、自然にいくつかの AAV の血清型があります。B). さらに、いくつかのカプシドも全身投与後遺伝子中枢神経系全体の配信の結果、BBB を交差する機能など、他の有用な特性を与えます。これは、AAV9 のためだけでなく、最近は、PHP のために示されています。B キャプシド17。結果として、これらの血清型は神経変性疾患1,17,18の新しい遺伝子療法のアプローチのために特に関連する証明します。
このプロトコルの目的は、AAV のベクトルを高価と純度の小規模生産のためコスト効果の高い方法の説明です。ただし、ここで示された結果は、PHP を使用します。B キャプシドと scAAV 式カセット、プロトコルはいくつかの AAV ベクター血清型とゲノム構成では、最大の実験的柔軟性の生産に適しています。ただし、ベクトルの収量および最終的な純度、選択した血清型によって異なります。
プロトコル自体ウイルスのベクトル生産のため古典的なトライ トランスフェクション法の変種で、ベクトル クリーンアップ、セシウム塩化 (CsCl) グラデーションの古典的な使用と比較して、あるされての iodixanol の勾配の使用が組み込まれています時間効率の良い方法19,20,21の高い純度の AAV のベクトルを生産するとされます。
トランスフェクション ・精製・濃縮の手順は、ウイルスのベクトルの作品評価組織培養室で試験実施基準 (GLP) に従って行われなければならないものです。各タスクは、ウイルスのベクトル生産に関する関連の地域および国の法律に準拠して実行し、使用する必要があります。層流フードの下で、無菌状態で、この作業を実施する必要があります。ベクトルの施設内は、通常の組織培養研究室コートに加えて、ラボのエプロンを着用することをお勧めします。さらに、すべての回で、手袋だけでなく、プラスチック製のシューカバーのダブルのペアを着用ください。
前にすべての必要な機器を確保するベクトル生産を開始、プラスミドがあります。1) pCapsid プラスミドには、レプリケーション、Rep78、Rep68、Rep52、および Rep40、すなわちに必要な 4 つの非構造タンパク質をエンコードrep遺伝子には 3 構造キャプシド蛋白質、すなわち VP1、VP2 と VP3 をエンコードキャップ遺伝子が含まれています。2) pHelper プラスミド遺伝子を含んでE4、E2AとVAからアデノ ウイルス、AAV HEK293T 細胞の生産を促進します。3) pTransgene プラスミドには、2 つの ITRs が並ぶ transgene 式カセットが含まれています。これらのプラスミッドはシーケンスの利用可能なオンラインの22を使用して実験室で合成・ デ ・ ノボをすることができます。プラスミド・ デ ・ ノボを作られて、新規遺伝子を含む特にそれらシーケンス必要です、遺伝子と ITRs が正しいことを確認します。また、オンライン プラスミド リポジトリを通じてあらかじめ作られたプラスミドを直接取得できます。必要に応じて、プラスミドは増幅することができ、製造元の手順23によると標準的なキットを使用して精製します。
ベクトル力価、純度は、ベクトルの伝達能力は悪影響があります。追加のプロトコルは、作り出されたベクトルの品質評価に供給されます。最終的なベクトルの in vitroとin vivoの両方で中枢神経系細胞機能の研究に有用であります。
Protocol
| ソリューション | 組成 | |
| 細胞培養とトランスフェクション | ||
| DMEM1 | DMEM 1 x | |
| 1 %fbs (v/v) | ||
| 1% (v/v) GlutaMAX | ||
| DMEM10 | DMEM 1 x | |
| 10 %fbs (v/v) | ||
| 1% (v/v) GlutaMAX | ||
| 150 mM の NaCl | 4.380 g 塩化ナトリウム | |
| 500 mL の超純水まで | ||
| AAV の精製と脱塩 | ||
| 5 M の NaCl | 146.1 g 塩化ナトリウム | |
| 500 mL の超純水まで | ||
| 1 M トリス塩酸 (pH 8.5) | 12.11 g トリス基地 | 注意 |
| 100 mL の超純水まで | ||
| 8.5 に pH を減らすためにパスツール ピペットを使用して 1 M 塩酸を追加します。 | ||
| 換散バッファー | 5 M の NaCl の 15 mL | |
| 1 M トリス塩酸 (Ph8.5) 25 mL | 注意 | |
| 500 mL の超純水まで | ||
| リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) x 10 | 塩化ナトリウム 80 g | |
| 2 g KCl | 注意 | |
| 14.4 g Na2HPO4 | ||
| 2.4 g KH2PO4 | ||
| Dd水 1 L まで | ||
| 1 M MgCl2 | 20.33 g MgCl2-6 H2O | |
| 100 mL の超純水まで | ||
| 1 M KCl | 7.45 g KCl | 注意 |
| 100 mL の超純水まで | ||
| マグネシウム カリウム PBS (PBS MK) 原液 x 5 | 10 x PBS の 250 mL | |
| 1 M MgCl2の 2.5 mL | ||
| 1 M の KCl の 6.25 mL | 注意 | |
| 500 mL の超純水水 H2O | ||
| 15 %iodixanol | Optiprep 密度勾配媒体の 12.5 mL | 注意 |
| 5 M の NaCl を 10 mL | ||
| 5 の 10 mL PBS MK x | ||
| 超純水の 17.5 mL | ||
| 25 %iodixanol | Optiprep 密度勾配媒体の 20.8 mL | 注意 |
| 5 の 10 mL PBS MK x | ||
| 19.2 mL の超純水水 | ||
| フェノールレッドの 100 μ L | ||
| 40 %iodixanol | Optiprep 密度勾配媒体の 33.3 mL | 注意 |
| 5 の 10 mL PBS MK x | ||
| 超純水の 6.7 mL | ||
| 60 %iodixanol | Optiprep 密度勾配媒体の 50 mL | 注意 |
| フェノールレッドの 100 μ L | 注意 | |
| AAV 純度制御 | ||
| トリス酢酸 EDTA (茶) バッファー x 10 | 44.8 g トリス基地 | 注意 |
| 11.4 mL の氷酢酸 (17.4M) | ||
| 3.7 g EDTA | ||
| 1 L の純水まで | ||
| Agarose のゲル | 超高純度のアガロースを 0.8 g | |
| 最大 100 mL 1 x 茶バッファー | ||
| ゲルのバッファー | 181.7 g トリス基地 | 注意 |
| 1.5 g SDS | 注意 | |
| 8.45 1 M 塩酸で pH を調整します。 | 注意 | |
| 500 mL の超純水まで | ||
| 陰極バッファー 10x | 121.14 g トリス基地 | 注意 |
| 179.2 g トリシン | 注意 | |
| 1 %sds (w/w) | 注意 | |
| 1 L の純水まで | ||
| 陽極バッファー 10x | 242.3 g トリス基地 | 注意 |
| 1 L の純水まで | ||
| 8.9 1 M 塩酸で pH を調整します。 | 注意 | |
| サンプル バッファー 5 x | 20 ml: | |
| 605 mg トリス基地 | 注意 | |
| 4 g SDS | 注意 | |
| 10 mg に Serva ブルー G | ||
| 12 g グリセロール | ||
| 6.8 1 M HCl、分注で pH を調整し、-20 ° C で保存 | 注意 | |
| スタッキングのゲル | 2 ゲル。 | |
| 400 μ L アクリルアミド | 注意 | |
| 750 μ L のゲルのバッファー | ||
| 1.85 mL 純水 | ||
| 4 Μ L TEMED | 注意 | |
| 20 μ L の 10 %ap (v/v) | 注意 | |
| TEMED と 10% 追加すぐにゲルを注入する前に AP。化学のフードの下で両方の化学物質を使用します。 | ||
| 解決のゲル | 2 ゲル。 | |
| 3.32 mL アクリルアミド | 注意 | |
| 3.35 mL ゲル バッファー | ||
| 1.14 mL 純水 | ||
| 2.12 mL 50% グリセロール | ||
| 6 Μ L TEMED | 注意 | |
| 50 μ L の 10% (w/v) APS | 注意 | |
| TEMED と 10% 追加すぐにゲルを注入する前に AP。化学のフードの下で両方の化学物質を使用します。 | ||
| 水飽和ブタノール | n-ブタノール 10 mL | 注意 |
| 1 mL の超純水 | ||
| 注意:危険な化学物質の使用に関するガイドラインについては表を参照してください。 | ||
表 1: 必要なソリューションの成分。
1. トライ - HEK293T 細胞のトランスフェクション
注:バッファーおよび解決プロトコルで使用の構成のための表 1を参照してください。
注:プロトコルのこのセクションのパフォーマンスは、約 4 日間かかります。
- 37 ° C で設定水浴の人間の萌芽期の腎臓 (HEK) 293 t 細胞のバイアルを解凍します。
注:20 x では未満継代されているセルのみを使用して、最適なトランスフェクション効率を保証します。 - 2 x 103 6 x 103セル/cm2 DMEM10 で直径 15 cm の密度でシード HEK293T 細胞は細胞培養皿です。
- 70-80% 95% 湿度と 5% CO2の 37 ° C で設定標準のインキュベーターで合流するセルを育てなさい。
注:このプロトコルを使用しての AAV のベクトルの 1 つのバッチの生産 18 細胞培養皿 (直径 15 cm) が必要です。セルの合流点の 70%-80% は 6 × 103 7 x 103セル/cm2DMEM10 培地の 17-20 mL で維持するに対応します。 -
ポリエチレンイミン (PEI) を準備/1/3.5 (w/w) の濃度比で DNA がミックスします。
- PΔF6、pCapsid、180 μ g、150 mM の NaCl の 18 mL で pTransgene の 180 μ g の 360 μ g を混合することによって 1 つの 50 mL の円錐管に 18 の細胞培養皿の DNA ミックスを準備します。
- (DNA の 6 mL の円錐管あたりミックス) 3 つの 50 mL の円錐管に DNA ミックスを分散します。
- PEI の 840 μ g を混合することによって新しい 50 mL の円錐管に培養皿の携帯 6 用ペイ ミックスを準備 (1 μ g/μ L) 150 mM の NaCl の 6 mL の。
- 一滴ずつ (1.4.3 の手順で準備) ペイ ミックスの 6 mL を追加してペイ/DNA ミックスを準備、(1.4.2 の手順で準備) DNA のミックスを含む円錐管の 1 つに、室温で 20 分間インキュベートします。
注:インキュベーションの 20 分後、ペイ/DNA ミックスはわずかに濁ったになります。
- インキュベーター外 6 細胞培養皿を取るし、完全に層流フードの各培養皿から培地を吸引します。Prewarmed ダルベッコ リン酸緩衝生理食塩水 (DPBS) 5 mL で皿を洗浄によって媒体の痕跡を削除します。
- 軽く皿を傾けることによって確実に表面全体に DPBS 配布。
- 優しく、DPBS を吸引、DMEM1 の 12 mL をそれぞれの料理に追加します。
注:皿の端に置かれたピペットからゆっくりと、メディアを追加することによって、細胞をデタッチしないでください。 - 3 倍 - 5 倍上下ピペッティングでペイ/DNA をミックスします。慎重に表面全体に分散滴ずつファッションで 6 細胞培養皿のそれぞれにペイ/DNA ミックス 2 mL を追加します。それぞれの皿にミックスを追加すると、一度は、インキュベーターに料理を配置します。手順 1.4.3– を繰り返して残りの培養皿の 1.8。
- 37 ° C、湿度 95% と 5% で 5 時間 transfected セルを孵化させなさい CO2.
- 既存メディアを削除せず各培養皿に 12 mL の追加 DMEM10 を追加 (中容量 25 mL を =)。
- 95% 湿度と 5% CO2の 37 ° C で 72 時間後トランスフェクションするを transfected セルを孵化させなさい。
補足図 1: HEK 293 t 細胞の形態 (右) 蛍光で可視化した GFP 発現の確認と位相差顕微鏡 (左) で可視化した。(A) 成功したトランスフェクション GFP エンコーディング pTransgene HEK293T 細胞の蛍光イメージングにより確認しています。(B) HEK293T 細胞トランスフェクション試薬とのみは GFP 発現を示さない。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
- 培地、細胞 72 h 後トランスフェクションを収穫します。慎重に培養皿からセルをデタッチするのに細胞スクレーパーを使用します。媒体および氷で保たれる 50 mL のコニカル チューブに細胞を収集します。
注:2 つの細胞培養皿の内容は、単一の 50 mL の円錐管に収集できます。この手順の最後に、9 つのチューブの各媒体の約 50 mL が含まれます。 - 420 x gの加速度と減速度を最大に設定する遠心分離機の 4 ° C で 10 分間で円錐管を遠心します。
- 慎重に各チューブから上澄みを廃棄します。材料の損失を防ぐためには、ピペットを使用しないでください。代わりに、そっと廃棄物処理容器に上清を注ぎ、氷の上に戻って細胞ペレットを含むチューブを置きます。
- 5-10 x 上下ピペッティングで 2 mL の 50 mL の円錐管に直接換散バッファーの各細胞ペレットを再懸濁します。ボルテックスにかけないでください。一緒に 3 つの管から溶解液をプールします。
注:この時点で 3 つ 50 mL コニカル チューブ、再懸濁細胞の換散バッファーの各 1 つ含む 6 mL があります。
2. AAV ベクター精製
注:このプロトコル セクションのパフォーマンスは、約 1 日かかります。換散バッファーで再停止されるセルを含む 3 つの 50 mL の円錐管のそれぞれに同時に次の手順に従います (上述のメモを参照してください)。
- 凍結し、解凍再懸濁細胞 3 x それらし、AAV 粒子を解放します。ドライアイスとエタノール混合を含むバケツにチューブを配置することによって凍結の手順を実行します。すぐに 37 ° C で設定水浴のセルを配置することによって解凍実行します。
- 3 番目の解凍手順後 4 ° C で 15 分間 1,167 × gで遠心分離機
注:細胞の残骸で構成される顕著なペレットに形成されます。チューブを処理する場合は、これらは最終的なベクトルの純度を妥協培養上清にペレットの剥離を引き起こす可能性がある急な動きを避けてください。 - 50 mL の円錐管をきれいに清を慎重に転送し、50 U/mL の培養上清中の最終的な集中に、各チューブにヌクレアーゼを追加します。
- 37 ° C で 30 分間インキュベートします。旋回 50 mL の円錐管手で 10 分毎、ヌクレアーゼは上清に徹底的に混ぜ、ように。
- 4 ° C で 20 分間 13,490 × gで遠心分離して上澄みを明らかにします。
- 10 mL のシリンジに 0.45 μ m フィルターを付けるし、きれいな 50 mL の円錐管の上に配置。慎重にプランジャーを取り外します、ステップ 2.5 から上清と注射器を埋めます。
- フィルターを通してライセートを強制的にプランジャーを使用します。手順 2.5 で得られた上清の各チューブの新しいフィルターと注射器を使用します。
注:得られた画分は、'原油ライセート' と呼ばれます。 - 表 1の指示に従って各 4 つの別の 50 mL の円錐管で 15%、25%、40%、60 %iodixanol の分数を準備します。
-
Iodixanol の分数の次の順序を使用して 3 つの遠心管の iodixanol の勾配の準備: 60 %iodixanol の 4.5 mL、5 mL 40 %iodixanol の 5.5 mL 25 %iodixanol の 15 %iodixanol の 8 mL。
注意:Iodixanol は、目、皮膚、消化管や呼吸器管に炎症を引き起こすことができます。Iodixanol の勾配を処理する場合は、手袋を着用し、層流フードの下で動作します。- 各遠心チューブに 15 %iodixanol の 8 mL のピペットします。
- きれいな 50 mL の円錐管 (図 1 a) に 25 %iodixanol 溶液 5.5 mL のピペットします。
- 慎重に 5.5 mL 15 %iodixanol ソリューション (図 1 b) 以下 25 %iodixanol ソリューションのレイヤー (遠心管の首が従来のピペットの狭すぎる) と非卒業のパスツール ピペットを使用します。
注:これは正常にパスツール ピペット 2 mL 程度保持できるので、3 つのステップで、iodixanol を追加することによって実現できます。 - 40% と 60% の iodixanol ソリューション 2.9.3 の手順で説明するように追加します。レイヤーの中に異なる iodixanol のインターフェイスが不可でした。
注:異なる iodixanol 分数の適切な準備は、(表 1の指示を参照してください) iodixanol の分数に追加フェノールレッドのおかげで視覚的に確認して確保できます。各分画は特定の密度があるので彼らが混ぜ合わせないように階層化段階では、それが正しく実行される場合 (図 1をチェック)。
- パスツール ピペット 15 %iodixanol の勾配上に lysate の原油を層します。ライセートの原油と iodixanol ソリューション間のインターフェイスを脅かさないよう滴ずつを進みます。
- 半月板に達する超遠心法 (図 1) の中に生成された非常に高い力の下でチューブがつぶれないように管首の付け根まで、遠心管を換散バッファーでいっぱい。
- 適切な蓋を用いた遠心管を閉じます。すべての 3 つの遠心管が同じ重みを持っていることを確認するデジタル スケールを使用します。'原油ライセート' の上に多くの換散バッファーを追加して、必要に応じて重量を調整します。
注:遠心チューブの重量の違いは、超遠心機の安全な操作を確保するため 0.1 g 以下なりません。Ultracentrifuges は機器の危険性のある部分を適切に訓練された人員のみが使用する必要があります。 - 301,580 x でg加速と減速の最大速度を使用して 12 の ° C で 1 時間 40 分の固定角度チタン ロータを使用してチューブを遠心します。
-
慎重に 40% と 60 %iodixanol インターフェイスでステンレス鋼の鈍針を挿入します。
- 針を 5 mL シリンジ (図 1E) に接続します。
- ベクトル粒子を含む明確な一部分だけを吸い出しなさい。
注:収集総体積は約 2.5-3 mL です。これにより、非望ましい蛋白質の存在のための最終的なベクトルのバッチで汚染のレベル以来の 25-40% インターフェイスからの材料のコレクションを避けてください。 - フラクション (脱塩および濃度) を処理または一晩 4 ° C で保存
図 1: iodixanol の勾配の精製とその後のベクトル コレクションのセットアップ。(A) 別の円錐管にピペット iodixanol の各ソリューションの適切なボリュームの異なる iodixanol の勾配遠心管にピペットで移す前、に。パスツールを使用 (B)、ピペットの順番に各 iodixanol のソリューションを遠心管に転送する: 前のレイヤーの下にチューブの下部に iodixanol のますます高い濃度のレイヤーを追加する必要があります。(C) 層原油ベクトル上一度グラデーション lysate を準備されています。このベクトル コレクション システムでは、' 針刺しのリスクが発生する鋭い針は使用しません。(D) A ステンレス鋼 316 注射針が 40/60 %iodixanol インターフェイスまで iodixanol の勾配によって挿入されます。(E) ベクトル粒子 40 %iodixanol の段階で発見され、収集されます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
3. 脱塩、AAV ベクターの濃度
注:プロトコルのこのセクションのパフォーマンスは約 2 時間かかります。
- 4,000 x gで 5 mL の PBS MK と 5 分間遠心する x 1 を追加することによって遠心フィルターのフィルター膜を prerinse します。
- 1 つの x の 5 mL を追加し AAV ベクター フラクションに PBS MK ミックスし、フィルターに総量を追加。1 x の添加によって PBS-MK、濁度が観察されます。円錐形フィルターの現在のボリュームまで 4,000 x gで遠心は 1 mL に削減されています。外部コレクションの管に蓄積された流れを破棄します。
- (最小 3 x) を必要な回数として円錐形フィルターと遠心分離の繰り返しに PBS MK ステップ 1 x の 13 mL を追加、そこまでがより多く濁りのない観察されたとき新鮮な 1 × PBS MK が追加されます。
- 最終的にステップを洗って、300-350 μ L にボリュームが小さくなるまで、4,000 x gで PBS + 0.01% (v/v) 非イオン性界面活性剤および遠心分離機の 13 mL を追加します。
- フィルターの存在の残りの部分を収集するには、ボリューム全体を滅菌スカート微量遠心チューブにピペッティングします。
注:この画分には、脱塩、濃縮 AAV のベクトルが含まれています。このプロトコルの次の手順では、この割合を「プライマリ」の割合と呼びます。フードの下で管を処理して 4 ° C で保存することを確認します。 - 1 の 200 μ L でフィルターを洗浄フィルターに保持, 残差ベクトル粒子を収集する PBS MK x。滅菌遠心チューブに収集します。
注:これは下ベクトル抗体を必要とするいくつかのアプリケーションに適した希釈ベクトル在庫です。今後の手順では、この割合を 'セカンダリ分数と呼びます。 - 短期的なストレージ 4 ° C (2 週間以内) でのベクトル fraction(s) に格納します。因数とストア-20 ° C の長期保存が必要な場合のベクトル。
- セクション 4 で説明されているように、品質管理を実行します。
4 量的なポリメラーゼの連鎖反応によるベクトルの滴定
注:プロトコルのこのセクションのパフォーマンスは、約 3 時間かかります。
-
標準曲線
- セクション 1 の HEK 293 t 細胞のトランスフェクションに使用される遺伝子発現プラスミド (pTransgene) をリニア化します。
- 0.5 mL 遠心チューブに制限のダイジェスト ミックスを準備 (制限のダイジェスト ミックスの組成について表 2を参照)。
注:使用される酵素および製造業者から関連のガイドラインによると制限のダイジェスト ミックスの組成を調整します。 - 37 ° C で 1 時間制限のダイジェスト ミックスを孵化させなさい
- プラスミドの 1 h. 完全な消化のため 100 V で 0.8% (w/v) agarose のゲルの線形プラスミッドを実行して、制限の消化力の効率は、定義されたサイズの 1 つのフラグメントを作り出すべきであるを確認します。
- 線形プラスミッド DNA PCR 精製キットを使用して次の製造元の手順24を浄化し、分光光度計で 260 で吸収を測定することによって DNA 濃度の測定 nm。滴定後、さらに使用するための-20 ° C で線形プラスミッドの残りの因数を格納します。
- 1 マイクロリットルあたりプラスミド ストックの分子 (すなわち DNA コピー) を次のように計算します。
- まず、プラスミッドの分子の重量を計算します。DNA 塩基対 (bp) の平均体重は 650 ダルトン (Da)、bp の 1 モルの重さ 650 g と仮定すると、製品長さ (bp) の塩基対あたりの重量で二本鎖 DNA テンプレートの分子量を推定できます。
プラスミッドの分子の重量 [g/mol] = プラスミド サイズ [bp] x 650 [ダ/bp] - 次に、プラスミド 1 マイクロリットルあたりのモル数を計算します。
1 マイクロリットルあたりプラスミドのモル = プラスミド濃度 [g/μ L]/プラスミッドの分子の重量 [g/mol]
注:分子量の逆は、プラスミド 1 g の原料に存在のモル数です。 - アボガドロ数 (6.022 × 1023分子/ほくろ) を使用して、1 マイクロリットルあたりプラスミッドの分子数を計算します。
1 マイクロリットルあたりプラスミッドの分子プラスミド アボガドロ数 [分子/ほくろ] x [モル/μ L] 1 マイクロリットルあたりのモルを = - 最後に、1 x 109分子 (1 マイクロリットルあたりゲノム (vg) ベクトル) の必要な濃度 100 μ L のソリューションを取得するプラスミド ストック (分子/μ L) を希釈します。
プラスミド ストック (100 μ L) = (望ましい集中 [分子/μ L] × 100 μ L)/プラスミッドの分子 [分子/μ L]
- まず、プラスミッドの分子の重量を計算します。DNA 塩基対 (bp) の平均体重は 650 ダルトン (Da)、bp の 1 モルの重さ 650 g と仮定すると、製品長さ (bp) の塩基対あたりの重量で二本鎖 DNA テンプレートの分子量を推定できます。
- トリプリケートでプラスミド ストック (1 x 10 の9英領バージン諸島/μ L) のシリアル希薄を行います。
1 x 109英領バージン諸島/μ L プラスミド ストック + H2O の 90 μ L の 10 μ L = 1 × 108 vg/μ L ソリューション
1 x 108 vg/μ L 希釈 + H2O の 90 μ L の 10 μ L = 1 × 107英領バージン諸島/μ L ソリューション
1 x 107英領バージン諸島/μ L 希釈 + H2O の 90 μ L の 10 μ L = 1 × 106 vg/μ L ソリューション
1 x 106 vg/μ L 希釈 + H2O の 90 μ L の 10 μ L = 1 × 105 vg/μ L ソリューション
1 x 101英領バージン諸島/μ L ソリューションを取得し続けます。 - QPCR プレート (セクション 4.3) にそれらを読み込むまで氷の上標準プラスミド ストックのシリアル希薄を保ちます。
| コンポーネント | 量 |
| 制限酵素バッファー x 10 | 5 Μ L |
| 制限酵素 | 2, 5 Μ L |
| プラスミド | 5 μ g |
| H2O | 50 μ L まで |
表 2: 制限のダイジェストのミックスの組成物。
テーブル 3: 在庫プラスミド巻電卓。この表をダウンロードするにはここをクリックしてください。
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AAV ベクターからの DNA 抽出
- ミックス 2 μ L、AAV のベクトル ストック (ステップ 3.5 からプライマリ、分数) DNase の 198 μ L で私はストリップ管 (PCR チューブ) (1 x) をバッファーし、DNase の 2 μ L を追加私。
注:DNase (これは qPCR 結果を歪める) ベクトル カプシド内に含まれていない任意の遺伝物質を低下します。このソリューションは、希釈 '10-2x dil1' と呼ばれます。 - 95 ° C で 10 分間続いて、37 ° C で 30 分間インキュベートします。
注:プロトコルをこの時点で停止することができます、4 ° C で無期限に材料を格納する製品劣化を避けるためにすることができます。 - 10-2 x dil1ソリューション (ステップ 4.2.1) にプロティナーゼ K の 2 μ L を追加し、95 ° C で 20 分続いて 50 ° C で 60 分間インキュベート
注:この手順は、AAV ベクター キャプシドを分解、ソリューションに AAV ベクター ゲノムがリリースされます。蛋白質のサンプルの内容 (カプシド) は知られていない、過剰にプロテイナーゼ K を追加します。注意してください、確実にプロティナーゼ K のすべての活動が最終的な結果に影響を及ぼす (部分的な) ポリメラーゼ劣化との問題を避けるために変性、qPCR、前にによって削除が不可欠です。 - 1:10 1.5 mL 遠心チューブにプロテイナーゼ K 処理10-2 x dil1ソリューション (ステップ 4.2.3) のシリアル希薄とおりの準備します。
10-2 x dil1 + H2O の 90 μ L の 10 μ L = x 10-3 dil1希釈
10-3 x dil1 + H2O の 90 μ L の 10 μ L = 10-4x dil1希釈
10 μ L of 10-4 x dil1 + H2O の 90 μ L = 10-5 x dil1希釈 - QPCR プレート (セクション 4.3) にそれらを読み込むまで氷の上ベクトルから抽出した DNA のシリアル希薄を維持します。
- ミックス 2 μ L、AAV のベクトル ストック (ステップ 3.5 からプライマリ、分数) DNase の 198 μ L で私はストリップ管 (PCR チューブ) (1 x) をバッファーし、DNase の 2 μ L を追加私。
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SYBR グリーン検出ベース qPCR による滴定
- サンプルおよび標準の両方の 1.5 mL 遠心チューブに qPCR マスター ミックスを準備します。SYBR グリーン マスター ミックス、前方プライマー (在庫 10 μ M)、逆プライマー (10 μ M 株式) の 1 μ L と H2O 反応あたり 3 μ L の 1 μ L の 10 μ L を使用します。表 4のプライマー シーケンスのプロトコルを参照してください。
- QPCR マスター ミックスを上下、ピペットしますが、ボルテックスにかけないでください。
- セクション 4.1 で作製した標準曲線のいずれかの 5 μ L またはセクション 4.2、各ウェルに AAV のベクトルから抽出した DNA に続いて、qPCR マスター ミックスの 15 μ L を追加します。のみ、qPCR マスター ミックス、ネガティブ コントロールとしてを含む 3 つの井戸があります。プレート レイアウト、図 2を参照してください。
- シール フィルムでプレートを封印し、遠心分離機で 1,500 × g 30 qPCR プレートの簡潔に 4 ° C で s
- QPCR 反応をプレート ベース リアルタイム PCR 増幅と検出の計測器で、表 5に提案した条件を使用して実行します。
| プライマー名 | シーケンス |
| 前方のプライマー | 5'-CCCACTTGGCAGTACATCAA-3' |
| 逆プライマー | 5'-GCCAAGTAGGAAAGTCCCAT-3' |
表 4: プライマー シーケンス CBA プロモーターに対して設計されています。
図 2: qPCR のベクターの滴定用プレート レイアウトします。サンプルが色分けされている: 緑 = 標準曲線青 = H2O 制御;グレー = プライマリ端数オレンジ = 二次分数。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
| ステップ | 時間 | 温度 | サイクル | 目的 |
| 中古インキュベーション | 5 分 | 95 ° C | x1 | DNA の変性およびポリメラーゼの活性 (ホット スタート反応)。 |
| 増幅 | 10 分 | 95 ° C | x1 | DNA の増幅。異なる熱処理温度で代替のプライマーを使用している場合、設定を最適化可能性があります。 |
| 10 s | 95 ° C | x40 | ||
| 40 s | 60 ° C | |||
| 1 s | 72 ° C | |||
| 冷却 | 10 s | 40 ° C | x1 | プレートの冷却します。PCR の終わり。 |
表 5: SYBR グリーン ベースの qPCR の滴定のための熱サイクリングのプロトコル。
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AAV ベクター価を決定するためのデータ分析
- 標準的な曲線を生成するセクション 4.1 で調製した標準試料の異なる希釈率で得られた Ct 値をスプレッドシートのデータ セル (表 6 a) を入力します。
注意: 標準の曲線の方程式が表示されます (y = ln (x) + b) 一緒にR2効率 (表 6 b)。100% に近い効率と R2 1.0 (≥ 0.96) に近い、qPCR が必要です。 - Aとbの計算値を使用して、スプレッドシート (表 6) に対応するデータのセルに記入します。
- セクション 4.2 で調製した AAV 試料の異なる希釈率で得られた Ct 値をスプレッドシートを完了します。
- 次の数式を使用してベクトル ゲノム '一次分数' の 1 マイクロリットルあたり平均の AAV ベクター価を計算します。
注: 係数 400 は単一の孤立したゲノム用が sc のゲノムを使用して 200 の倍率25。実際、DNA 量各 qPCR サイクル中にダブル DNA は sc は、ss のゲノムと比較して 2 倍を検出しました。滴定の目的は 1 マイクロリットルあたりベクトル ゲノムの観点から濃度を計算します。補正は、qPCR の実行開始材料 (ステップ 4.2.1) の 2 μ L を使用するときに必要です。ディルは、4.2.4 のステップから希釈倍率を表します。'セカンダリ AAV ベクター画分 (ステップ 3.6) の抗体価を同時に計算できます。
- 標準的な曲線を生成するセクション 4.1 で調製した標準試料の異なる希釈率で得られた Ct 値をスプレッドシートのデータ セル (表 6 a) を入力します。
表 6: qPCR データ分析のテンプレート。このファイルをダウンロードするここをクリックしてください。
5. 純度制御 SDS-PAGE および銀製の汚損
注:プロトコルのこのセクションのパフォーマンスは、約 5 時間かかります。
- エタノール 70% (v/v) を使用して、ゲルを鋳造に使用するガラス板を徹底的にきれいにします。
- ゲルの鋳造システムを組み立てます。ゲルをキャストするときにアクリルアミドの混合物の漏洩を防ぐため、ガラス板の底を欠損なくことを確認します。
- スタッキング、2 つの別の 50 mL の円錐管に解決のゲル ソリューションを準備します。彼らはゲルの重合に関与、テトラメチルエチレンジアミン (TEMED) と 10% (w/v) アンモニウムの過硫酸塩 (APS) を省略します。すぐにゲルを鋳造する前にそれらを追加します。
注:ゲル中のアクリルアミドの最終的な割合に影響を与えるタンパク質の分離プロファイル: 通常、アクリルアミド濃度 10% (v/v) 最後は AAV ベクター準備の純度をテストするのに十分になります。 - ゲル成分を含むチューブを旋回で優しく混ぜます。過剰な酸素は、重合を損なうことができるので、ない渦を行います。
- TEMED と 10% (w/v) APS 解決のゲル ソリューションに追加します。ミックスし、1-2 cm 以下の小さなガラス プレートの上部に到達するまで、その後ゲル ホルダーに注ぐ。
- アクリルアミドの混合物の上に水飽和ブタノール層を配置します。これは重合中に平らな面の形成になります。これはゲルを脱水し、その機能を損なうよう 30 分以上アルコールの下でゲルを放置しないでください。
注意: ブタノールは皮膚に接触した場合危険です。また、火災リスクを生じます。取り扱いに注意。 - ゲル重合し、その後、ブタノールを注ぐを待ちます。ヒント: は、チューブで余分なジェル ミックスが凝固したかどうかを確認します。重合は H2O とゲルの未満 20 分洗浄表面で発生し、ゲルの表面を邪魔しないように世話ペーパー タオルを使って乾かします。
- TEMED と 10% (w/v) APS にスタッキングのゲルを加えて分離ゲルの上にゲル ホルダーにゲルを注ぎなさい。
- ゲルに付属の櫛を配置します。井戸の中の空気の泡の形成を避けるために 1 つの安定した動きで操作を実行します。
- ゲル重合に少なくとも 20 分待ちます。ヒント: 円錐管が凝固した余分なジェルに混ぜる場合チェックしてください。
- (表 7) の 2 つのミックスを備えると、プライマリとセカンダリの AAV ベクター画分 (ステップ 3.5、3.6、それぞれ)。
| 高い金額 | 量が少ない | |
| AAV ベクター素材 | 5 Μ L | 1 Μ L |
| サンプル バッファー x 5 | 3 Μ L | 3 Μ L |
| H2O | 7 Μ L | 11 Μ L |
表 7: 組成は銀染色に必要なサンプル ミックス。
- 完全にそれらを 95 ° C で 5 分間加熱することによってサンプル ミックスを変化させなさい。電極の向きに注意を払って、電気泳動槽を組み立てます。
- 1 x 電極アセンブリの中の陰極バッファーと外側に陽極バッファー x 1 タンクを埋めます。
注: 陽極バッファーは実行するからリサイクルすることができます。新鮮な陰極バッファーは、常に使用する必要があります。 - ゲルから櫛を削除し、1 x 陰極バッファーでゲルの井戸を清掃します。
- 井戸の中の蛋白質の梯子の 1 μ L をロードします。同じゲル (図 3) でさまざまな坑井でサンプル ミックスをロードします。サンプル解決のゲルを入力まで 50 V でゲルを実行します。染料前ゲルの下限に達するまで 100 V に電圧を増やしてください。
- ゲルをガラス板から慎重に抽出して銀染色キット (製造元の指示26) によると AAV キャプシドを構成するウイルス蛋白質 (VP1、VP2 と VP3 サブユニット) 可能なを確認します。蛋白質の汚染 (図 3)。
図 3: SDS-PAGE および銀製の汚損を使用してベクトルの純度評価します。トリシン SDS ゲルを使用すると、様々 なベクトルの準備の 5 μ L を分離しました。タンパク質はその後銀染色により検出されました。ベクトル純粋と見なされますとき VP1 (82 kDa)、VP2 (67 kDa) と VP3 (60 kDa) が 1:1 で表示されます: 10 比 (1 車線)、過剰な背景 (2 車線) または無指定バンド (3 車線) なし。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
Representative Results
AAV9 が最近まで考慮された BBB を交差し、中枢神経系、末梢投与の細胞を伝達に最も効果的な AAV ベクターの血清型にします。カプシドの設計で重要な進歩が達成されたとき Devermanらは Cre 組換えベース AAV をターゲットとした進化 (作成)17と呼ばれるキャプシドの選択メソッドを使用。このメソッドを使用して、それらは、PHP という名前新しいキャプシドを識別しました。B: 彼らは全身噴射17に続く複数の中枢神経系領域のニューロンとアストロ サイトの大半を変換することができると報告しました。この時点で、それはする必要があります指摘したにもかかわらず PHP。B (これは最初の分離の実験で使用されるひずみ) C57/Bl6 マウスで肯定的な結果を提供します、速報を示唆その効率はひずみ依存的に異なる場合があります。さらに実験は間違いなく、この問題31光を当てるが。
しかし、にもかかわらず、これらの問題は、PHP。B では、疾患モデルの概念実証の遺伝子治療実験を含むマウスの中枢神経系の非侵襲的遺伝子操作のためのエキサイティングな可能性を提供しています。そのため、PHP を使用して遺伝子発現の効率を評価にしました。B対AAV9、2009年2以来末梢投与中枢神経系伝達の 'ゴールド スタンダード' ベクトルをされています。遺伝子発現により、最適な条件の下で、両方の血清型の直接比較を実行するには、sc ゲノム構成32を使用しました。両方のベクトルは、ユビキタス鶏 β-アクチン (CBA) プロモーターの制御下で緑色蛍光タンパク質 (GFP) の遺伝子を運んだ。生後 42 (重量約 20 g) で雌の C57/Bl6 マウスは、1 x 1012 vg scAAV2/PHP のいずれかのマウスごとの線量を受け取った。B CBA GFP または scAAV2/9-CBA-GFP。ベクトル管理だった尾静脈注射を介して実行されます。実験は、ルーヴェンの倫理委員会で承認されました。
3 週間これらマウスは 4% (w/v) 冷たいパラホルムアルデヒド (PFA) に続いて、氷冷 pbs transcardial 潅流を施行しました。自分の脳は収穫され、さらに詳細な分析まで 0.01% (w/v) Na-アジ化/PBS のストレージに転送する前に同じ固定液で一晩インキュベートして産を施行しました。その後、脳が振動ミクロトームを使用して切断された、50 μ m 厚いセクションを免疫組織染色を行った。
遺伝子発現のレベルを評価するセクション GFP (ウサギ抗 GFP) に対して一次抗体に蛍光色素 (抗家兎 Alexa Fluor 488) 二次抗体を用いる検出染まっていた (図 4 a、B).蛍光強度測定 (任意の単位 [au]) で GFP 発現時 sc の大幅な増加を確認したゲノムと PHP。B キャプシドは、AAV9 に対して使用されました。大脳 (2105 ± 161対1441 ± 99 au; GFP の増加を認めたp = 0.0032)、小脳 (2601 ± 196対1737 ± 135 au;p = 0.0032)、および脳幹 (3082 ± 319対2485 ± 88 au;p = 0.0038) (図 4)。
図 4: scAAV2/PHP の全身配信。B CBA GFP は、中枢神経系における高 GFP 発現に します。scAAV2/PHP。B CBA GFP または scAAV2/9 CBA GFP (1 x 1012英領バージン諸島/マウス) は、6 週間旧 C57/Bl6 マウス尾静脈注射で投与されました。GFP は、コロナの脳のセクション 3 週間これらの免疫組織化学を使用して検出されました。(A) 大脳および小脳と脳幹が表示されます (B)。スケール バー = 1 ミリメートル。 (C) GFP シグナル (10 のセクションごとにマウス; ベクトル グループごとの 3 つのマウス) 各ベクトルで達成のレベルを決定する相対蛍光強度の数量化を行った。一方通行 ANOVA テストを行った、続いて 2 尾スチューデントのt-テスト;データは、平均 ± 標準偏差; として表されます。p < 0.01;au。任意の単位。pCapsid、AAV のベクトル生産用には、血清型 2 型から遺伝子担当者および血清型 PHP から遺伝子キャップが含まれています。B または AAV9、それに応じて。この図は、リンコンから変更されているら32。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
Discussion
使用材料および装置のほとんどの分子生物学実験室および細胞培養設備に共通、組換え AAV のベクトル生産はここで説明します。純粋な前臨床等級 AAV のベクトルを生体外でそして生体内のアプリケーションの範囲を渡る複数の細胞・組織の種類を対象とする使用することができますを取得するユーザーをことができます。このプロトコルは、(すなわち、cscl 浄化)、他の人に比べての最大の利点の 1 つは、必要な作業時間の短縮です。AAV のベクトルを使用する準備ができて、最大 HEK293T 細胞の初期のトランスフェクション後 6 営業日で得られる。
最終的な収量や AAV ベクターの品質にいくつかの要因が影響悪影響。貧しいトランスフェクション効率は低ウイルス収量33のための主な理由の 1 つです。主要な推薦がなく 20 回以上継代されて、トランスフェクション21の時に 90% を超えるセル合流していない HEK293T 細胞の使用であります。さらに、選択したトランスフェクション法では、結果が大きな影響を与える。このプロトコルは、PEI の使用に基づいています。プリンスエド ワード島はカチオン性ポリマー高分子核酸、セルと人身売買によるエンドソーム34によってとられる polyplexes として知られている複合体の生成を介して細胞核に外因性 DNA を提供する能力を持つ。プリンスエド ワード島ベースのトランスフェクションは、簡単かつ迅速に実行、リン酸カルシウム35DNA の共沈殿など、他の広く使用されている方法とは対照的です。また、PEI ベースのトランスフェクションは、カチオン性脂質と磁石を介したトランスフェクション36の使用などの他の新たに導入された方法と比較するとはるかに安いです。
浄化戦略は、プロトコルの重要な役割を果たしています。他の方法と比較して、iodixanol ベース浄化は空ウイルス粒子 (20%)20の割合が高いが含まれて傾向があります。これは、ある程度事実によって相殺 iodixanol ベース浄化は日常的に 100 未満の粒子の感染性比 AAV ベクターの準備の結果します。これは従来の cscl のプロシージャは、対象粒子の感染性のかなりの損失が報告された37と比較して大幅に改善を表します。AAV のベクトルに別の一般的な方法は、クロマトグラフィーによる浄化です。ただし、このメソッドは、特定の列が使用される各ベクトル キャプシドに必要な主な欠点: たとえば、AAV2 はヘパリンの列を使用して古典的な分離が、この方法で動かない AAV4 と AAV5、ヘパリン結合を所有していません。その縁どら38のサイト。クロマトグラフィー精製も高価であることを考えると、浄化の iodixanol ベースは一般的に小規模な33,39,の AAV のベクトルの高品質のバッチを生成したい所に適して40。 ただし、最終的な収量とベクトルの純度を最大限に細心の注意が必要 iodixanol の勾配を作るとき。様々 な iodixanol の分画は、先端部が管の壁に触れて滅菌パスツール ピペットを用いて遠心管に転勤: iodixanol は、ゆっくりと継続的にピペットから追放する必要があります。ベクトル粒子は 40 %iodixanol 層に蓄積、ケア グラデーション インターフェイスが20を混在させないようにする必要があります。最後に、ベクターを含む分数の計 20 g. よりも大きくしないとステンレス鋼の鈍針の挿入によって復旧すべきベクトルの回復を最大にするには、明確な割合がそのままの状態で取得されます。この手順では、タイミングが重要です。準備の純度を損なうことを避けるため、それはグラデーションの他 (汚染) の段階を収集する前に、コレクションを停止することが欠かせません。
得られたベクトル力価の違いはパッケージ化された粒子を生成するベクトルの固有の能力にまた帰することができます。それぞれ異なる AAV の血清型の比較を示したいくつかの AAV のベクトルが他の (例えば、AAV2) よりも高価で生産が難しく41。ベクトルの脱塩のステップの間に沈殿物は低力価の可能な理由をすることができ、一極33を回避することによって簡単に防ぐ。また、それも iodixanol の勾配に基づく精製の効率とはちょっと違う血清型間や、異なる血清型で得られる抗体価の不一致したがって、41を観察することができます可能です。
最後に、それにもかかわらず、qPCR は非常に正確な DNA の定量化法手法でいくつかの自然な可変性が観察された指摘される必要があります。滴定の精度は、主に精密分注とすべてのソリューションの適切なボルテックスに依存します。読んで最も正確な価を保証するため、qPCR 繰り返すことができます独立していない、し、得られた値の平均します。このプロトコルでプライマーの選択は、私たちの研究室で使用される pTransgene プラスミドである CBA プロモーターの順序に基づきます。CBA のプロモーターは、複数の細胞のタイプ間でドライブ式にベクトル分野で広く使用されている強力な合成プロモーターです。サイトメガロ ウイルス (CMV) 初期エンハンサー要素を含む複数の要素が組み込まれていますプロモーター、最初のエクソンと CBA 遺伝子のイントロンが最初ウサギ β グロビン遺伝子のスプライスのアクセプター。ただし、(プロモーター、遺伝子、および規制要素含む) 式カセット内にあるあらゆる要素のプライマーを設計することができます。問題のベクトルに共通の地域に対してプライマーが使用される提供する、バッチ間で抗体価の比較も可能です。
結論としては、このプロトコルは、カプシド、ゲノム構成、プロモーター型および遺伝子貨物の様々 な AAV ベクターを生成する使用できます。これはユーザーを簡単に実験ニーズに合わせて自分のベクトルの最終的な特性を適応になります。代表的な結果の提示例 PHP の使用。効率的に BBB を交差させる、B のキャプシドは、中枢神経系、次尾静脈注射32の高効率遺伝子発現を与えた。CNS 浸透ベクトルの全身投与には、可能性のある副作用2,17,32面でかなりの利点があります。侵襲の警告を回避しながら、末梢注入に可能な選択肢は、脳脊髄液に AAV ベクターの配達から成っている髄腔内配信です。この配信ルートは、周辺臓器や免疫応答42の低レベルで少ないオフターゲット効果、中枢神経系の広範な導入遺伝子発現を示す有効性が証明されます。ただし、髄腔内注射ははるかに難しく、尾静脈注射より高い技術的なスキルが必要なのでです。
カプシドの更なる開発でこの技術を絞り込むは、AAV ベクター使用では遺伝子療法のための機会によって駆動されます。このようなアプローチは、筋萎縮性側索硬化症、シャルコー ・ マリー ・ トゥース病、パーキンソン病、アルツハイマー病18など、現在不治の中枢神経系疾患を治療するために魅力的な可能性を提供しています。
Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
原産地は、フォン フォール Wetenschappelijk Onderzoek フランデレン (FWO) ポスドク研究員プログラム (133722/1204517N) に支えられて、フンダシオン心血管・ デ ・ コロンビアと管理科学科の継続的なサポートが認めています。技術と技術革新 (グラント CT-FP44842-307-2016、プロジェクト コード 656671250485)。MM は、FWO 博士フェローシップ (1S48018N) によってサポートされます。M.G.H. は、VIB 制度助成金とアルツハイマー病研究 (サンパウロ-FRA) (P #14006)、FWO (グラント 1513616N)、欧州研究会議 (ERC) (開始のグラントにティエリー Latran 財団 (SOD VIP)、財団から外部のサポートによって支持されました。281961-AstroFunc;コンセプト グラント 713755 - 広告-VIP の証拠)。著者は、マウス飼育でご支援 Jeason ・ ホートン、ステファニー Castaldo の尾静脈注射を実行する助け、キャロライン Eykens transfected HEK293T 細胞の画像を提供するためにご了承ください。M.G.H. には、マイケル ・ ダンロップ、ピーター ・ ヒックマン、ディーン ・ ハリソンが認めています。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plasmid production | |||
| pTransgene plasmid | De novo design or obtained from a plasmid repository | N/A | See step 1 of main protocol for further details |
| pCapsid | De novo design or obtained from a plasmid repository | N/A | See step 1 of main protocol for further details |
| pHelper | Agilent | 240071 | |
| Plasmid Plus maxi kit | Qiagen | 12963 | |
| QIAquick PCR purification Kit | Qiagen | 28104 | |
| AAV Helper-Free System | Agilent | 240071 | |
| Cell culture and transfection | |||
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM), high glucose, no glutamine | Life technologies | 11960-044 | Supplement DMEM with FBS (1% or 10% v/v) and GlutaMAX 200 mM (1% v/v) then filter sterilize the medium using a 0.22 µm filter |
| Fetal bovine serum (FBS) | GIBCO | 10500-064 | |
| GlutaMAX supplement | GIBCO | 35050038 | |
| (200 mM) | |||
| Corning bottle-top vacuum filter system | Sigma-Aldrich | CLS430769 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (DPBS) with no calcium and no magnesium | GIBCO | 14190094 | |
| HEK293T cells | American Tissue Culture Collection | CRL3216 | Upon receipt, thaw the cells and culture as described in the protocol. After a minimal number of passages, freeze a subfraction for future in aliquots. Always use cells below passage number 20. Once cultured cells have been passaged more than 20 times, restart a culture from the stored aliquots |
| Cell culture dishes | Greiner Cellstar | 639160 | 15 cm diameter culture dishes |
| Cell scrapers | VWR | 10062-904 | |
| Polyethylenimine (PEI) | Polyscience | 23966-2 | PEI in powder form is dissolved at 1 µg/µL in deionized water (ddwater) at pH=2 (use HCl). Prepare in a beaker and stir for 2-3 h. When dissolved, bring the pH back to 7 with NaOH. Filter sterilize and store the resuspended stock solution in 1 ml aliquots at -20 °C. PEI aliquots can be freeze/thawed multiple times. |
| Virkon solution | Fisher Scientific | NC9821357 | Disinfect any material that has been in contact with assembled vector particles with Virkon solution |
| Mutexi long-sleeve aprons | Fisher Scientific | 11735423 | Wear an apron over the top of a regular lab coat |
| Fisherbrand maximum protection disposable overshoes | Fisher Scientific | 15401952 | |
| AAV Purification and desalting | |||
| Optiprep density gradient medium | Sigma-Aldrich | D1556 | Optiprep is a 60% (w/v) solution of iodixanol in water (sterile). CAUTION. Use under a laminar flow hood. Wear gloves |
| Phenol red | Sigma-Aldrich | P0290 | CAUTION. Use under a laminar flow hood |
| Pasteur pipette | Sigma-Aldrich | Z627992 | Sterilize before use |
| OptiSeal Polypropylene tubes | Beckman | 361625 | |
| Benzonase (250 U/µL) | Sigma-Aldrich | E1014 | Supplied as a ready-to-use solution |
| Acrodisc syringe filter | Pall corporation | 4614 | |
| Omnifix syringe (5 mL) | Braun | 4617053V | |
| Blunt syringe needle | Sigma Aldrich | Z261378 | Stainless steel 316 syringe needle, pipetting blunt 90° tip gauge 16, L 4 in. Referred to in the text as a blunt-end needle |
| Aqua Ecotainer | B. Braun | 0082479E | Sterile endotoxin-free water. Referred to as 'Ultrapure water' |
| Amicon ultra-15 centrifugal filter unit | Millipore | UFC910024 | These filters concentrate the final product by collecting the vector particles in consecutive centrifugation steps |
| Pluronic F68 (100x) | Thermo Fisher | 24040032 | Non-ionic surfactant. Dilute in sterile PBS to use at 0.01% (v/v) |
| Fisherbrand Sterile Microcentrifuge Tubes with Screw Caps (2 mL) | Fisher Scientific | 02-681-374 | Use skirted tubes for easy handling |
| AAV Titration | |||
| Restriction enzyme: StuI (10 U/µL) | Promega | R6421 | |
| DNAse I (1 U/µL) | Fisher Scientific | EN0521 | |
| Proteinase K | Sigma-Aldrich | 3115852001 | Reconstitute in ultrapure water and use at a final concentration of 10 mg/mL. Solution can be stored at -20 °C |
| EasyStrip Plus Tube Strips (with attached caps) | Fisher Scientific | AB2000 | |
| Eppendorf microtube 3810x | Sigma-Aldrich | Z606340-1000EA | |
| LightCycler 480 SYBR Green I Master Mix | Roche | 4707516001 | |
| LightCycler Multiwell Plates, 96 wells | Roche | 4729692001 | White polypropylene plate (with unique identifying barcode) |
| Microseal 'A' PCR plate and PCR Plate Sealing Film | Bio-Rad | msa5001 | |
| AAV Purity control | |||
| Ammonium persulfate (APS) | Sigma-Aldrich | A3678 | Reconstitute in ultrapure water to 10% (v/v). CAUTION. Use under a laminar flow hood. Wear gloves |
| Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Sigma-Aldrich | T9281 | CAUTION. Use under a laminar flow hood. Wear gloves |
| Tris Base ULTROL Grade | Merck | 648311 | CAUTION: Use under a laminar flow hood. Wear gloves |
| UltraPure Agarose | Thermo Fisher | 16500-500 | |
| Rotiphorese® Gel 30 (37,5:1) | Carl Roth | 3029.3 | Aqueous 30% acrylamide and bisacrylamide stock solution at a ratio of 37.5:1. CAUTION: Use under a laminar flow hood. Wear gloves |
| Serva Blue G | Sigma-Aldrich | 6104-58-1 | |
| Precision Plus prestained marker | Bio-Rad | 1610374edu | |
| 1-Butanol | Sigma-Aldrich | B7906 | CAUTION: Use under a laminar flow hood. Wear gloves |
| Immunohistochemistry | |||
| Rabbit anti-GFP | Synaptic Systems | 132002 | 1:300 dilution |
| Anti-rabbit Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A21206 | 1:1,000 dilution |
| Equipment | Company | Catalog number | Comments |
| Vector production lab | |||
| Rotina 380 bench-top centrifuge * | Hettich | 1701 | |
| Optima XPN 80 ultracentrifuge * | Beckmann Coulter | A95765 | |
| Type 50.2 Ti fixed-angle titanium rotor * | Beckmann Coulter | 337901 | |
| Entris digital scale * | Sartorius | 2202-1S | |
| Warm water bath * | Set at 37 °C | ||
| Ice bucket * | VWR | 10146-290 | Keep material used in the vector production lab separate from that used in standard lab areas |
| Pipetboy pro * | Integra | 156,400 | |
| Graduated pipettes: Cell star * | Greiner bio-one | 606180 | Capacity of 5 mL |
| Graduated pipettes: Cell star * | Greiner bio-one | 607180 | Capacity of 10 mL |
| Graduated pipettes: Cell star * | Greiner bio-one | 760180 | Capacity of 25 mL |
| CO2 incubator CB150 * | Binder | 9040-0038 | Set at 37 °C, 5% CO2 and 95% humidity |
| Nuaire safety cabinet NU 437-400E * | Labexchange | 31324 | Clean all the surfaces with 70% ethanol and Virkon before and after use |
| Conventional lab | |||
| T100 thermal cycler * | Bio-Rad | 1861096 | |
| LightCycler 480 Instrument II * | Roche | 5015278001 | |
| ThermoMixer * | Eppendorf | C 5382000015 | |
| Nanodrop * | ThermoFisher Scientific | ND 2000 | |
| Mini-Protean Tetra Cell* | Bio-Rad | 1658001FC | For use with handmade or precast gels |
| ProteoSilver silver stain kit | Sigma-Aldrich | PROTSIL1 | High sensitivity protein detection with low background |
| Centrifuge 5804 R * | Eppendorf | B1_022628045 | High speed centrifuge for medium capacity needs (up to 250 mL) |
| Graduated pipettes Cell star * | Greiner bio-one | 606180 | 5 mL |
| Graduated pipettes Cell star * | Greiner bio-one | 607180 | 25 mL |
| Graduated pipettes Cell star * | Greiner bio-one | 760180 | 25 mL |
| Filter tips * | Greiner bio-one | 750257 | 1250 µL |
| Filter tips * | Greiner bio-one | 738257 | 300 µL |
| Filter tips * | Greiner bio-one | 771257 | 10 µL |
| Ice bucket with lid * | VWR | 10146-290 | |
| Mini diaphragm vacuum pump, VP 86 * | VWR | 181-0065 | |
| Pipetman P2 | Gilson | F144801 | |
| Pipetman P20 | Gilson | F123600 | |
| Pipetman P100 | Gilson | F123615 | |
| Pipetman P200 | Gilson | F123601 | |
| Pipetman P1000 | Gilson | F123602 | |
| * Materials marked with an asterisk are expensive pieces of equipment and are usually central infrastructure items shared between multiple labs. These items can also be replaced by equivalents if available. Note, when a different ultracentrifuge is used, care must be taken to select the correct rotor and centrifuge tubes. |
References
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