Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Produksjon, rensing og kvalitetskontroll for Adeno-assosiert Virus-basert vektorer

Published: January 29, 2019 doi: 10.3791/58960
Automatic Translation
*1,2, *1,2, *1,2, 1,2, 1,2,3
1VIB-KU Leuven Center for Brain and Disease Research, 2Department of Neuroscience, KU Leuven, 3Leuven Brain Institute
* These authors contributed equally

Summary

Her beskriver vi en effektiv og reproduserbar strategi å produsere titer og kvalitetskontroll grupper av adeno-assosiert virus vektorer. Det lar brukeren få en vektor forberedelse med høy-titer (≥1 x 1013 vektor genomer/mL) og en høy renhet, klar til bruk i vitro eller vivo .

Abstract

Gen levering verktøy basert på adeno-assosiert virus (AAVs) er et populært valg for levering av effekter av transgener til sentralnervesystemet (CNS), inkludert gene terapi programmer. AAV vektorer er ikke-replikering, kan infisere både dele og ikke dele celler og gi langsiktig transgene uttrykk. Viktigere, noen serotyper, som nylig beskrevet PHP. B, kan krysse blod-hjerne-barrieren (BBB) i dyremodeller, etter systemisk levering. AAV vektorer kan være effektivt produsert i laboratoriet. Robust og reproduserbar protokoller er imidlertid nødvendig for å hente AAV vektorer med tilstrekkelig renhet nivåer og titer verdiene høy nok for i vivo programmer. Denne protokollen beskriver en effektiv og reproduserbar strategi for AAV vektor produksjon basert på en iodixanol gradient rensing strategi. Iodixanol rensing metoden er egnet for å få grupper av høy-titer AAV vektorer av høy renhet, sammenlignet med andre metoder for rensing. Videre er protokollen raskere enn andre metoder for øyeblikket beskrevet. I tillegg en kvantitativ polymerase kjede reaksjon (qPCR)-basert strategi er beskrevet for en rask og nøyaktig bestemmelse av vektor titer, samt en silver flekker metode å avgjøre renheten av vektor bunken. Til slutt, representant resultatene av genet levering til CNS etter systemisk administrasjon av AAV-PHP. B, presenteres. Slike resultater bør være mulig i alle labs ved hjelp av protokoller som er beskrevet i denne artikkelen.

Introduction

De siste 30 årene, har vill-type AAVs blitt utviklet for å opprette rekombinant AAV vektorer, som har vist seg for å være svært nyttig verktøy for genoverføring til CNS1,2,3,4, 5,6 og gene terapi tilnærminger til sykdom (inkludert FDA - og EMA-godkjent terapi)4,7. Deres egnethet for bruk i CNS stammer hovedsakelig fra deres evne til å infisere ikke dele, etter mitotisk celler, vanligvis finnes i CNS8. Men har AAV-baserte vektorer også fordelen at en langsiktig uttrykk for enhver gitt terapeutiske transgene4,9 mens fremlokkende en mildere immunrespons sammenlignet med andre viral vektorer7, 8,10,11,12.

Hovedelementene i enhver AAV vektor er genomet og kapsid. Vill-type AAVs er enkelt-strandet (ss) DNA virus med et genom omtrent 5 kilobases (kb)13. For produksjon av rekombinant AAV vektorer, rep og cap genene (nødvendig for genomet replikering og montering av viral kapsid) slettes fra genomet av vill-type AAV og gitt i trans, forlater rommet for en uttrykket kassett som inneholder transgene14,15. Invertert terminal gjenta sekvenser (ITRs) av det opprinnelige viral genomet er bare beholdt elementene i en AAV vektor, ettersom disse er avgjørende for replikering og emballasje3,10,14. AAV vektorer kan være konstruert for å forbedre transgene uttrykk. en mutasjon i en av ITRs fører til dannelsen av en hårnål loop som effektivt tillater generering av en komplementære DNA strand3,7,15. Den største fordelen med denne konfigurasjonen kalles en selv-utfyllende (sc) genom, er at det omgår behovet for andre-strand syntese vanlig i AAVs, betydelig øke hastigheten og nivåer av transgene uttrykket konvensjonelle livssyklus 1. likevel bruke en scAAV genomet reduserer lastekapasitet på vektoren til ca 2.4 kb. Dette inkluderer transgene sekvenser, samt noen regulatoriske sekvenser som arrangører eller microRNA bindende områder, for å begrense uttrykk til bestemte cellen typer16.

AAV kapsid bestemmer vektor-verten celle samspillet og gir en grad av celle type eller vev tropism for en AAV serotype, som kan også utnyttes til å begrense transgene uttrykk til bestemte steder. Flere AAV serotyper finnes i naturen, mens andre er produsert i laboratorier gjennom rekombinant tilnærminger (dvs. PHP. B). dessuten noen capsids også gi andre nyttige egenskaper, for eksempel muligheten til å krysse BBB, resulterer i levering av effekter av transgener i CNS når systemisk administrasjon. Dette har vist for AAV9 og nylig beskrevet PHP. B kapsid17. Som en konsekvens, viser disse serotyper seg for å være spesielt relevant for nye gene terapi tilnærminger nevrodegenerative lidelser1,17,18.

Målet med denne protokollen er å beskrive en kostnadseffektiv metode for småskala produksjon av AAV vektorer med høy titer og renhet. Selv om resultatene presenteres her bruk PHP. B kapsid og en scAAV uttrykk kassett, protokollen er egnet for produksjon av flere AAV vektor serotyper og genom konfigurasjoner, slik at eksperimentelle fleksibilitet. Imidlertid kan vektor avkastning og endelige renhet variere avhengig av den valgte serotype.

Protokollen er en variant av klassisk tri-transfection metoden for viral vektor produksjon og omfatter bruk av en iodixanol gradering for vektor opprydning, som, i forhold til den klassiske bruken av cesium chloride (CsCl) graderinger, er rapportert for å produsere AAV vektorer av høyere renhet i en mindre tidkrevende måte19,20,21.

Hva, rensing og konsentrasjon trinnene skal utføres i henhold til god laboratoriepraksis (GLP) i et vev kultur laboratorium vurdert for viral vektor arbeidet. Hver aktivitet må utføres i henhold til relevante lokale og nasjonale lovgivningen om viral vektor produksjon og bruk. Arbeidet må utføres under laminær strømning hette og sterile forhold. Inne vektor anlegget anbefales det å ha en lab forkle, i tillegg til den vanlige vev kultur lab coat. Videre bør et dobbelt par hansker, samt plast overtrekk på, brukes til alle tider.

Før starter vektor produksjon, sikre alt nødvendig utstyr og plasmider er tilgjengelig. 1) pCapsid plasmider inneholder rep genet som koder fire ikke-strukturelle proteiner nødvendig for replikering, nemlig Rep78, Rep68, Rep52 og Rep40, og cap genet som koder tre strukturelle kapsid proteiner, nemlig VP1, VP2 og VP3. 2) pHelper plasmider inneholder genene E4 E2Aog VA fra adenovirus, som letter AAV produksjon i HEK293T celler. 3) pTransgene plasmider inneholder transgene uttrykk kassetten, flankert av to ITRs. Disse plasmider kan være syntetisk de novo i laboratoriet ved hjelp sekvenser tilgjengelig online22. Plasmider laget de novo, er spesielt de som inneholder romanen effekter av transgener, sekvensering nødvendig, sørge for at transgene og ITRs er riktig. Alternativt kan forhåndslagde plasmider være direkte ervervet gjennom online plasmider repositories. Når det er nødvendig, plasmider kan bli forsterket og renset med standard kits, i henhold til produsentens instruksjoner23.

Vector titer og renhet kan påvirke signaltransduksjon evne til vektor. Ytterligere protokoller leveres for å vurdere kvaliteten på produsert vektoren. Siste vektorer vil være nyttig for studier av CNS celle-funksjonen i både i vitro og vivo programmer.

Protocol

Løsning Komposisjon
Cellekultur og hva
DMEM1 DMEM 1 x
1% FBS (v/v)
1% GlutaMAX (v/v)
DMEM10 DMEM 1 x
10% FBS (v/v)
1% GlutaMAX (v/v)
150 mM NaCl 4.380 g NaCl
Opptil 500 mL Ultrapure vann
AAV rensing og avsalte
5 M NaCl 146.1 g NaCl
Opptil 500 mL Ultrapure vann
1 M Tris HCl (pH 8.5) 12.11 g Tris base FORSIKTIG
Opptil 100 mL Ultrapure vann
Legge til 1 M HCl benytter en Pasteur pipette for å nedskrive pH til 8,5
Lyseringsbuffer 15 mL 5 M NaCl
25 mL av 1 M Tris HCl (pH 8.5) FORSIKTIG
Opptil 500 mL Ultrapure vann
10 x fosfat-bufret saltvann (PBS) 80 g NaCl
2 g KCl FORSIKTIG
14.4 g Na2HPO4
2.4 g KH2PO4
Opptil 1 L ddvann
1 M MgCl2 20.33 g MgCl2-6 H2O
Opptil 100 mL Ultrapure vann
1 M KCl 7.45 g KCl FORSIKTIG
Opptil 100 mL Ultrapure vann
5 x PBS Magnesium-kalium (PBS-MK) lagerløsning 250 mL 10 x PBS
2,5 mL 1 M MgCl2
6,25 mL 1 M KCl FORSIKTIG
Opp til 500 mL Ultrapure vann H2O
15% Iodixanol 12.5 mL av Optiprep tetthet gradert medium FORSIKTIG
10 mL av 5 M NaCl
10 mL 5 x PBS-MK
17.5 mL Ultrapure vann
25% Iodixanol 20,8 mL av Optiprep tetthet gradert medium FORSIKTIG
10 mL 5 x PBS-MK
19,2 mL Ultrapure vann
100 µL fenol rød
40% Iodixanol 33.3 mL av Optiprep tetthet gradert medium FORSIKTIG
10 mL 5 x PBS-MK
6,7 mL Ultrapure vann
60% Iodixanol 50 mL av Optiprep tetthet gradert medium FORSIKTIG
100 µL fenol rød FORSIKTIG
AAV renhet kontroll
10 x Tris acetate EDTA (te) buffer 44.8 g Tris base FORSIKTIG
11.4 mL iseddik (17.4M)
3.7 g EDTA
Opptil 1 L Ultrapure vann
Agarose gel 0,8 g Ultrapure agarose
Opptil 100 mL 1 x TEA buffer
Gel buffer 181.7 g Tris base FORSIKTIG
1,5 g SDS FORSIKTIG
Justere pH til 8.45 med 1 M HCl FORSIKTIG
Opptil 500 mL Ultrapure vann
Katode buffer 10 x 121.14 g Tris base FORSIKTIG
179.2 g Tricine FORSIKTIG
1% SDS (w/w) FORSIKTIG
Opptil 1 L Ultrapure vann
Anode buffer 10 x 242.3 g Tris base FORSIKTIG
Opptil 1 L Ultrapure vann
Justere pH til 8,9 med 1 M HCl FORSIKTIG
Eksempel buffer 5 x For 20 mL:
605 mg Tris base FORSIKTIG
4 g SDS FORSIKTIG
10 mg Serva blå G
12 g glyserol
Justere pH til 6,8 med 1 M HCl, aliquot og lagre på 20 ° C FORSIKTIG
Stabling gel For 2 gelé:
400 µL akrylamid FORSIKTIG
750 µL gel buffer
1,85 mL Ultrapure vann
4 ΜL TEMED FORSIKTIG
20 µL 10% APS (v/v) FORSIKTIG
Legge til TEMED og 10% APS like før pouring gel. Bruke både kjemikalier kjemiske hette.
Løse gel For 2 gelé:
3.32 mL akrylamid FORSIKTIG
3,35 mL gel buffer
1.14 mL Ultrapure vann
2.12 mL 50% glyserol
6 ΜL TEMED FORSIKTIG
50 µL 10% APS (w/v) FORSIKTIG
Legge til TEMED og 10% APS like før pouring gel. Bruke både kjemikalier kjemiske hette.
Vann-mettet butanol 10 mL n-butanol FORSIKTIG
1 mL Ultrapure vann
Forsiktig: Se tabellen materialer for retningslinjer for bruk av farlige kjemikalier.

Tabell 1: Sammensetning av de nødvendige løsningene.

1. Tri-hva HEK293T celler

Merk: Se tabell 1 for sammensetningen av buffere og løsningene som brukes i protokollen.
Merk: Ytelsen til denne delen av protokollen tar ca 4 dager.

  1. Tine ampuller med menneskelige embryonale nyre (HEK) 293T celler i et vannbad satt på 37 ° C.
    Merk: Bruk bare celler som har vært passaged mindre enn 20 x garantere optimal transfection effektivitet.
  2. Frø HEK293T celler i en tetthet 2 x 103 til 6 x 103 celler/cm2 i DMEM10 i 15 cm diameter celle kultur retter.
  3. Vokse cellene til 70 – 80% samløpet i en standard inkubator satt på 37 ° C, med 95% fuktighet og 5% CO2.
    Merk: Produksjon av en gruppe med AAV vektorer bruker denne protokollen krever 18 celle kultur retter (15 cm diameter). En celle samløpet av 70% - 80% tilsvarer 6 x 103 til 7 x 103 celler/cm2, vedlikeholdes i 17-20 mL DMEM10 kultur medium.
  4. Forberede polyethylenimine (PEI) / DNA mix i konsentrasjon forholdet 1/3.5 (w/w).
    1. Klargjør DNA blandingen for 18 celle kultur retter i en 50 mL konisk tube ved å blande 360 µg pΔF6, 180 µg for pCapsid og 180 µg av pTransgene i 18 mL 150 mm NaCl.
    2. Distribuere DNA blandingen over tre 50 mL konisk rør (6 mL av DNA blande per konisk rør).
    3. Klargjør PEI blandingen for seks celle kultur retter i en ny 50 mL konisk tube ved å blande 840 µg Pei (1 µg/µL) i 6 mL av 150 mM NaCl.
    4. Klargjør PEI/DNA blandingen ved å legge til 6 mL av PEI mix (forberedt i trinn 1.4.3), dråpe for dråpe, en av koniske rør inneholder DNA mix (forberedt i trinn 1.4.2) og ruge for 20 min ved romtemperatur.
      Merk: Etter 20 min med inkubering blir PEI/DNA blandingen litt grumset.
  5. Ta seks celle kultur retter ut av inkubatoren og helt Sug opp mediet hver kultur parabol i laminær strømning hette. Fjerne spor av mediet ved skylling retter med 5 mL prewarmed Dulbecco fosfat-bufret saltoppløsning (DPBS).
  6. Kontroller distribusjonen av DPBS over hele overflaten ved å vippe forsiktig parabolen.
  7. Forsiktig Sug opp DPBS og legge 12 mL DMEM1 til hver rett.
    Merk: Unngå koble cellene ved å legge til mediet sakte, fra en pipette plassert på kanten av parabolen.
  8. Bland PEI/DNA ved pipettering opp og ned 3 x - 5 x. Legge til 2 mL PEI/DNA blandingen i hver av seks celle kultur retter i en dråpe for dråpe mote, nøye fordele det over hele overflaten. Når blandingen er lagt til hver rett, plassere retter tilbake i inkubator. Gjenta trinn 1.4.3– 1,8 gjenværende kultur rettene.
  9. Inkuber transfekterte celler for 5 h på 37 ° C, med 95% fuktighet og 5% CO2.
  10. Legge til en ekstra 12 mL DMEM10 i hver kultur parabol uten å fjerne eksisterende mediet (totalt middels volum = 25 mL).
  11. Inkuber transfekterte cellene opp til 72 h etter transfection ved 37 ° C, med 95% fuktighet og 5% CO2.

Supplementary Figure
Supplerende figur 1: HEK 293T celle morfologi visualisert ved fase kontrast mikroskopi (venstre) med bekreftelse av GFP uttrykk visualisert ved fluorescens imaging (høyre). (A) vellykket transfection av HEK293T celler med en GFP-koding pTransgene bekreftes av fluorescens tenkelig. (B) HEK293T-cellene behandles utelukkende med transfection reagenser viser ingen GFP uttrykk. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

  1. Høste mediet og celler 72 h etter hva. Bruk cellen skraper nøye fjerne celler fra kultur parabolen. Samle mediet og cellene i en 50 mL konisk tube holdt på is.
    Merk: Innholdet i to celle kultur retter kan samles til en enkelt 50 mL konisk rør. På slutten av dette trinnet, vil hver av de ni rør inneholder ca 50 mL av medium.
  2. Sentrifuge konisk rør 420 x g i 10 min på 4 ° C med akselerasjon og retardasjon av centrifuge sett til maksimum.
  3. Forsiktig kaste nedbryting fra hver rør. Ikke bruk Pipetter for å hindre tap av materiale. I stedet, forsiktig hell nedbryting i en avfallshåndtering beholder og plassere rør som inneholder cellen pellets tilbake på isen.
  4. Resuspend hver celle pellet i 2 mL lyseringsbuffer direkte i 50 mL konisk tube av pipettering opp og ned 5-10 x. Gjør ikke vortex. Basseng lysates fra tre rør sammen.
    Merk: På dette punktet, vil det være tre 50 mL konisk rør, hver en inneholder 6 mL resuspended cellene i lyseringsbuffer.

2. AAV vektor rensing

Merk: Resultatene av denne protokollen delen tar ca 1 dag. Utfør følgende trinn samtidig på hver av de tre 50 mL konisk rør som inneholder cellene resuspended i lyseringsbuffer (se forrige merknad).

  1. Fryse og tine resuspended cellene 3 x til lyse dem og slippe AAV partikler. Utfør frysing trinn ved å plassere rør i en bøtte med tørris blandet med etanol. Utføre tining ved umiddelbart å plassere cellene i et vannbad satt på 37 ° C.
  2. Etter det tredje tiner trinnet sentrifuge 1,167 x g i 15 min på 4 ° C.
    Merk: Merkbar pellets består av celle rusk blir dannet. Ved håndtering av rør, unngå brå bevegelser som disse kan forårsake avdeling av pellet i nedbryting, som vil invadere renheten av siste vektoren.
  3. Nøye overføre supernatants å rengjøre 50 mL konisk rør og deretter legge til nuclease i hver retning, til en siste konsentrasjon av 50 U/mL supernatant.
  4. Inkuber i 30 min på 37 ° C. Virvel 50 mL konisk rør for hånd hvert 10 min for å sikre at nuclease er nøye blandet med nedbryting.
  5. Avklare nedbryting av sentrifugering 13,490 x g for 20 min på 4 ° C.
  6. Knytte filtere 0,45 µm til 10 mL sprøyte og plasser det på et rent 50 mL konisk rør. Nøye fjerne stempelet og fyll sprøyten med nedbryting fra trinn 2.5.
  7. Bruk stempelet for å tvinge den lysate gjennom filteret. Bruk et nytt filter og sprøyte for hver tube nedbryting fikk i trinn 2.5.
    Merk: Innhentet brøkdel er kjent som 'olje lysate'.
  8. Forberede hver av de 15%, 25%, 40% og 60% iodixanol fraksjonene i fire separate 50 mL konisk rør, i henhold til instruksjonene i tabell 1.
  9. Forberede iodixanol graderinger i tre ultracentrifugation rør med følgende rekkefølge av iodixanol fraksjoner: 8 mL 15% iodixanol, 5.5 mL av 25% iodixanol, 5 mL av 40% iodixanol og 4,5 mL 60% iodixanol.
    Forsiktig: Iodixanol kan forårsake irritasjon i øyne, hud og gastrointestinal og luftveier områder. Ved håndtering av iodixanol graderinger, bruk hansker og arbeide under laminær strømning hette.
    1. Pipetter 8 mL 15% iodixanol i hver ultracentrifugation rør.
    2. Pipetter 5,5 mL av 25% iodixanol løsning i en ren 50 mL konisk tube (figur 1A).
    3. Bruk en ikke-utdannet Pasteur pipette (som halsen av ultracentrifugation røret er for smal for konvensjonelle uteksaminert Pipetter) nøye lag 5,5 mL av 25% iodixanol løsningen under 15% iodixanol løsningen (figur 1B).
      Merk: Dette kan bli oppnådd ved å legge til iodixanol i tre trinn siden Pasteur pipette kan bare holde rundt 2 mL.
    4. Legge til 40% og 60% iodixanol løsninger som beskrevet i trinn 2.9.3. Ikke forstyrr de forskjellige iodixanol grensesnittene under lagene.
      Merk: Riktig utarbeidelse av ulike iodixanol fraksjoner kan sikres av visuell bekreftelse takket være den fenol røde lagt til iodixanol fraksjoner (se instruksjonene i tabell 1). Siden hver fraksjon har en bestemt tetthet, vil de ikke intermix under lagdeling trinn, hvis det utføres riktig (se figur 1 c).
  10. Lag råoljen lysate på 15% iodixanol gradient med en Pasteur pipette. Gå innom slipp å unngå å forstyrre grensesnittet mellom råoljen lysate og den iodixanol løsningen.
  11. Fyll ultracentrifugation røret opp med lyseringsbuffer til meniscus når bunnen av røret halsen slik røret ikke skjules under svært høy styrkene genereres under ultracentrifugation (figur 1 c).
  12. Lukk ultracentrifugation rør bruker riktig. Bruke en digital skala alle tre ultracentrifugation rør har samme vekt. Juster vekten, eventuelt ved å legge mer lyseringsbuffer over 'råoljen lysate'.
    Merk: Vekten forskjellen mellom ultracentrifugation rør må være under 0,1 g å sikre sikker drift av ultracentrifuge. Ultracentrifuges er potensielt farlige stykker av utstyr og bør bare brukes av riktig utdannet personell.
  13. Sentrifuge rør 301,580 x g, med en fast vinkel Titan rotor, for 1 h og 40 min ved 12 ° C, med maksimal hastighet på akselerasjon og retardasjon.
  14. Nøye sett en rustfritt stål sløv nål på 40% og 60% iodixanol grensesnitt.
    1. Fest nålen 5 mL sprøyter (figur 1E).
    2. Sug opp bare klart brøkdel, som inneholder vector partikler.
      Merk: Det totale volumet samlet er ca 2,5-3 mL. Unngå samlingen av materiale fra 25-40% grensesnittet, siden dette vil øke nivået på forurensing i final vektor bunke av ikke-ønskelig proteiner.
    3. Behandle samlet brøken (avsalte og konsentrasjon) eller oppbevare den natten på 4 ° C.

Figure 1
Figur 1: oppsett for iodixanol gradient rensing og påfølgende vektor samling. (A) før pipettering forskjellige iodixanol graderinger i ultracentrifugation røret, Pipetter en tilstrekkelig volum på hver iodixanol løsning i et separat konisk rør. (B) så bruk en Pasteur Pipetter sekvensielt overføre hver iodixanol løsning til ultracentrifugation røret: Lag en høy iodixanol konsentrasjon bør legges til nederst i røret under forrige lagene. (C) lag grov vektoren lysate på topp når graderingen er utarbeidet. Denne vektoren samling system bruker ikke skarpe nåler, som presenterer en risikoen for 'needlestick'. (D) en rustfritt stål 316 sprøyten p inn gjennom iodixanol graderingen opp til 40% / 60% iodixanol grensesnittet. (E) vektor partikler finnes i 40% iodixanol fase og er samlet. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

3. avsalte og konsentrasjon av AAV vektoren

Merk: Ytelsen til denne delen av protokollen tar ca 2 timer.

  1. Prerinse filter membran av sentrifugal filteret ved å legge 5 mL 1 x PBS-MK og sentrifuge for 5 min på 4000 x g.
  2. Legge til 5 mL 1 x PBS-MK til samlet AAV vektor brøk, bland og deretter legge det totale volumet til filteret. På tillegg av 1 x PBS-MK, turbiditet er observert. Sentrifuger 4000 x g til volumet på koniske filteret har blitt redusert til 1 mL. Kast gjennomflytsenhet akkumulert i ytre samling røret.
  3. Legge til 13 mL 1 x PBS-MK koniske filter og gjenta sentrifugering trinn så mange ganger som nødvendig (minimum 3 x), til der er ingen mer turbiditet observert når fersk 1 x PBS-MK legges.
  4. I finalen vask trinn, legge til 13 mL PBS + 0,01% (v/v) ikke-ioniske surfactant og sentrifuger 4000 x g til volumet er redusert til 300-350 µL.
  5. Samle de gjenværende del på filteret av pipettering hele volumet i et sterilt skirted microcentrifuge rør.
    Merk: Denne fraksjonen inneholder avsalte og konsentrert AAV vektoren. I de følgende trinnene i denne protokollen, er denne fraksjonen referert til som "primær" brøken. Sørg for å håndtere røret under panseret og lagre den på 4 ° C.
  6. Skyll filteret med 200 µL 1 x PBS-MK å samle gjenværende vektor partikler beholdt på filteret. Samle i et sterilt microcentrifuge rør.
    Merk: Dette er en utvannet vektor lager, som kan være passende for noen programmer krever lavere vektor titers. I fremtidige trinn, er denne fraksjonen referert til som "andre" brøken.
  7. For kortsiktige lagring, kan du lagre vektor-fraction(s) på 4 ° C (mindre enn 2 uker). Aliquot og lager vektoren på ‑20 ° C langtidslagring kreves.
  8. Utføre kvalitetskontroll som beskrevet i Seksjon 4.

4. Serine vektoren som kvantitative polymerasekjedereaksjons

Merk: Ytelsen til denne delen av protokollen tar ca 3 timer.

  1. Standardkurve
    1. Linearize av transgene-uttrykke plasmider (pTransgene) brukes for hva HEK-293T celler i avsnitt 1.
    2. Klargjør begrensning digest blandingen i en 0,5 mL microcentrifuge tube (se tabell 2 for sammensetningen av begrensning digest mix).
      Merk: Justere sammensetningen av begrensning digest mix enzymet brukt og relaterte retningslinjene fra produsenten.
    3. Inkuber begrensning digest mix 1t på 37 ° C.
    4. Kontrollere effektiviteten av begrensning fordøyelsen ved å kjøre den linearisert plasmider på en 0,8% (w/v) agarose gel på 100 V for 1 h. komplett fordøyelsen av plasmider skal produsere et enkelt fragment av definert størrelse.
    5. Rense den lineære plasmider DNA ved å bruke en PCR rensing kit, følger produsentens instruksjoner24, og måle DNA konsentrasjonen med et spektrofotometer ved å måle opptaket på 260 nm. Etter titrering, lagre de resterende aliquot av den lineære plasmider på ‑20 ° C for videre bruk.
    6. Beregne molekyler (i.e. DNA kopier) av plasmider aksjer per mikroliter som følger.
      1. Først beregne molekylvekt av plasmider. Forutsatt at den gjennomsnittlige vekten av en DNA base par (bp) er 650 Daltons (Da), og at en Molo med en bp veie 650 g kan molekylvekt av en double-strandet DNA mal anslås ved å ta produktet av sin lengde (i bp) og vekt per base par.
        Plasmider molekylvekt [g/mol] = plasmider størrelse [bp] x 650 [Da/bp]
      2. Deretter beregne antall mol av plasmider per mikroliter.
        Mol av plasmider per mikroliter = plasmider konsentrasjonen [g/µL] / plasmider molekylvekt [g/mol]
        Merk: Inverse av Molekylvekten er antall mol av plasmider i 1 g av materialet.
      3. Deretter beregne antall plasmider molekyler per mikroliter, bruker Avogadros tall (6.022 x 1023 molekyler/muldvarp).
        Molekyler av plasmider per mikroliter = mol av plasmider per mikroliter [føflekker/µL] x Avogadros antallet [molekyler/muldvarp]
      4. Til slutt, fortynne plasmider lager (molekyler/µL) for å få en 100 µL løsning med ønsket konsentrasjonen av 1 x 109 molekyler (vektor genomer (vg) per mikroliter).
        Plasmider lager (100 µL) = (ønsket konsentrasjon [molekyler/µL] x 100 µL) / plasmider molekyler [molekyler/µL]
    7. Gjør føljetong fortynninger av plasmider lager (1 x 109 vg/µL) i triplicates:
      10 µL av 1 x 109 vg/µL plasmider lager + 90 µL av H2O = 1 x 108 vg/µL løsning
      10 µL av 1 x 108 vg/µL fortynning + 90 µL av H2O = 1 x 107 vg/µL løsning
      10 µL av 1 x 107 vg/µL fortynning + 90 µL av H2O = 1 x 106 vg/µL løsning
      10 µL av 1 x 106 vg/µL fortynning + 90 µL av H2O = 1 x 105 vg/µL løsning
      Fortsette å få en 1 x 101 vg/µL løsning.
    8. Holde de serielle fortynninger av standard plasmider aksjen på is inntil laste dem på qPCR plate (inndelingen 4.3).
Komponent Beløp
10 x begrensning enzym buffer 5 ΜL
Begrensning enzym 2,5 ΜL
Plasmider 5 µg
H2O opptil 50 µL

Tabell 2: Begrensning digest blanding komposisjon.

Tabell 3: lager plasmider volum kalkulator. Klikk her for å laste ned denne tabell.

  1. DNA utvinning fra AAV vektoren
    1. Bland 2 µL av AAV vektor lager (primære brøken fra trinn 3,5) med 198 µL av DNase jeg buffer (1 x) i stripen rør (PCR rør) og legge 2 µL av DNase jeg.
      Merk: DNase jeg vil forringe genetisk materiale som ikke er inneholdt innenfor en vektor kapsid (som vil forvrenge resultatene qPCR). Denne løsningen kalles fortynning 'dil1 x 10-2'.
    2. Inkuber i 30 min ved 37 ° C, etterfulgt av 10 min på 95 ° C.
      Merk: Protokollen kan stoppes på dette punktet og materialet kan lagres på ubestemt tid på 4 ° C, for å unngå produktet.
    3. Legge 2 µL av proteinasen K til dil1 x 10-2 løsningen (trinn 4.2.1) og Inkuber for 60 min ved 50 ° C, etterfulgt av 20 minutter til 95 ° C.
      Merk: Dette trinnet vil demontere AAV vektor kapsid og slipper AAV vektor genomet i løsningen. Legge til proteinasen K i overkant som protein (kapsid) innhold av utvalget ikke er kjent. Legg merke til at det er viktig å sikre at alle proteinasen K aktivitet er fjernet av rødsprit, før qPCR, for å unngå problemer med (delvis) polymerase fornedrelse påvirke sluttresultatet.
    4. Forbered 1:10 føljetong fortynninger av proteinasen K behandlet dil1 x 10-2 løsningen (trinn 4.2.3) i 1,5 mL microcentrifuge rør som følger:
      10 µL dil1 x 10-2 + 90 µL av H2O = dil1 x 10-3 fortynning
      10 µL dil1 x 10-3 + 90 µL av H2O = dil1 x 10-4fortynning
      10 µL of dil1 x 10-4 + 90 µL av H2O = dil1 x 10-5 fortynning
    5. Hold de serielle fortynninger av DNA utvunnet fra vektoren på is inntil laste dem på qPCR plate (inndelingen 4.3).
  2. Titrering av SYBR Green gjenkjenning-basert qPCR
    1. Klargjør qPCR master blandingen i en 1,5 mL microcentrifuge rør, for både prøven og standarder. Bruk 10 µL av SYBR Green Master Mix, 1 µL frem primer (10 µM stock), 1 µL av omvendt primer (10 µM stock) og 3 µL av H2O per reaksjon. Se protokollen i Tabell 4 for primer sekvenser.
    2. Pipetter qPCR master mix opp og ned, men gjør ikke vortex.
    3. Legge til 15 µL av qPCR master mix, etterfulgt av enten 5 µL av standardkurve i kapittel 4.1 eller DNA utvunnet fra AAV vektoren i delen 4.2 i hver brønn. Inkluder tre brønner som inneholder bare qPCR master mix, som en negativ kontroll. Se figur 2 for oppsettet plate.
    4. Seal platen med en forsegling film og kort sentrifuge qPCR platen på 1500 x g for 30 s på 4 ° C.
    5. Kjøre qPCR reaksjonen på en plate-baserte sanntid PCR forsterkning og oppdagelsen instrument, betingelser foreslått i tabell 5.
Primer navn Sekvens
Fremover primer 5-CCCACTTGGCAGTACATCAA-3 "
Omvendt primer 5-GCCAAGTAGGAAAGTCCCAT-3 "

Tabell 4: Primer sekvenser designet mot CBA selskapet.

Figure 2
Figur 2: Plate oppsett for qPCR-basert vektor titrering. Prøvene er fargekodet: grønn = standardkurve; blå = H2O kontroll; grå = primære brøkdel; oransje = sekundær brøkdel. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Trinn Tid Temperatur Sykluser Mål
Pre-inkubering 5 min 95 ° C X1 DNA rødsprit og polymerase Aktivisering (hot-start reaksjon).
Forsterkning 10 min 95 ° C X1 Forsterkning av DNA. Innstillinger kan optimaliseres hvis alternativ primere med forskjellige annealing temperatur brukes.
10 s 95 ° C x40
40 s 60 ° C
1 s 72 ° C
Kjøling 10 s 40 ° C X1 Plate kjøling. Slutten av PCR.

Tabell 5: Termisk protokoll sykling for SYBR green-baserte qPCR titrering.

  1. Dataanalyse for å fastslå AAV vektor titer
    1. Fylle celler i regnearket-data (tabell 6A) med Ct verdiene hentes for de forskjellige fortynninger av standard utvalget utarbeidet i kapittel 4.1 generere en standard kurve.
      Merk: Ligningen av standardkurve vises (y = ln (x) + b) sammen med R2 effektiviteten (tabell 6B). En qPCR må ha en virkningsgrad nær 100% og R2 nær 1.0 (≥ 0.96).
    2. Bruke beregnede verdier og b skal fylles tilsvarende datacellene i regnearket (tabell 6C).
    3. Komplett regnearket med Ct verdiene hentes for de forskjellige fortynninger av AAV eksemplet i delen 4.2.
    4. Beregn den gjennomsnittlige AAV vektor titer i vektor genomer per mikroliter av den primære fraksjon ved hjelp av følgende formel:
      Equation
      Merk: faktoren 400 brukes for enkelt strandet genomer, mens sc genomer bruker en multiplikasjonsfaktor 20025. Faktisk, som DNA mengder dobbel under hver qPCR syklus, oppdaget sc DNA er 2 x i forhold til en ss genom. Målet med titrering er å beregne konsentrasjonen i vektor genomer per mikroliter. En korreksjon er nødvendig for å kjøre qPCR ved 2 µL starter materiale (trinn 4.2.1). Dil representerer fortynning faktorene fra trinn 4.2.4. Titer av den "andre" AAV vektor fraksjon (trinn 3.6) kan beregnes samtidig.

Tabell 6: mal for qPCR dataanalyse. Klikk her for å laste ned denne filen.

5. renhet kontroll av SDS side og sølv flekker

Merk: Ytelsen til denne delen av protokollen tar ca 5 timer.

  1. Bruk 70% (v/v) etanol Rengjør glassplater som brukes til støping geléer.
  2. Samle gel avstøpning systemet. Kontroller at bunnen av glasset platene ikke er kuttet, for å forhindre lekkasje av akrylamid blandingen når avstøpning gel.
  3. Forbered stablingsrekkefølgen og løse gel løsningene i to separate 50 mL konisk rør. Utelat tetramethylethylenediamine (TEMED) og 10% (w/v) ammonium persulfate (APS), som de er ansvarlige for av gel. Legge dem umiddelbart før avstøpning gel.
    Merk: Siste prosenten av akrylamid i gel påvirker separasjon profilen proteiner: vanligvis en 10% (v/v) siste konsentrasjon av akrylamid er tilstrekkelig å teste renheten av en AAV vektor forberedelse.
  4. Bland forsiktig av virvlende røret som inneholder gel komponentene. Gjøre ikke virvelen, siden overdreven oksygenering kan svekke polymerisasjon.
  5. Legge til TEMED og 10% (w/v) APS løse gel løsningen. Bland og hell i gel abonnenten til den når 1-2 cm under toppen av små glassplaten.
  6. Plass et lag med vann-mettet butanol på akrylamid blandingen. Dette vil sikre dannelsen av flate under polymerisasjon. Ikke la gel under alkohol i mer enn 30 min som dette vil tørke gel og svekke dens funksjon.
    FORSIKTIG: Butanol er farlig ved hudkontakt. Det gir også en brann risiko. Håndteres med forsiktighet.
  7. Vent gel danner og så helle av butanol. Tips: Sjekk om overflødig gel blandingen i røret har styrket. Polymerisasjon forekommer i mindre enn 20 min. vask overflaten av gel med H2O og deretter tørke med tørkepapir, ta vare ikke for å forstyrre overflaten av gel.
  8. Legge til TEMED og 10% (w/v) APS til stabling gel og hell gel inn i gel holderen på skiller gel.
  9. Plass det angitte kam i gel. Utfør denne handlingen med en jevn bevegelse for å unngå dannelse av luftbobler i brønnene.
  10. Vent minst 20 min for gel til danner. Tips: Sjekk Hvis overflødig gel bland i konisk røret har styrket.
  11. Forberede to mikser (Tabell 7) for både primært og den sekundære AAV vektor brøker (trinn 3.5 og 3.6, henholdsvis).
Høyt beløp Lite
AAV vektor lager 5 ΜL 1 ΜL
5 x prøve buffer 3 ΜL 3 ΜL
H2O 7 ΜL 11 ΜL

Tabell 7: Sammensetning av utvalg mikser kreves for sølv flekker.

  1. Fullt denature utvalg mikser ved oppvarming dem for 5 min på 95 ° C. Montere geleelektroforese tanken, betaler oppmerksomhet til elektroden retning.
  2. Fyll tanken med 1 x katoden buffer på innsiden av samlingen elektrode og 1 x anode buffer på utsiden.
    Merk: Anode bufferen kan være resirkulert fra Kjør bruk. Frisk katoden buffer må alltid brukes.
  3. Fjern kammen fra gel og rengjør brønnene i gel med 1 x katoden buffer.
  4. Legg 1 µL av protein stigen i en brønn. Laste inn utvalg mikser i forskjellige brønner på samme gel (figur 3). Kjør gel 50 V til prøvene angir løse gel. Deretter øke spenningen til 100 V til fargestoff foran når nedre grense for gel.
  5. Gel nøye fra glassplater og bruker sølv flekker kit (i henhold til produsentens instruksjoner26) for å visualisere virale proteiner (VP1, VP2 og VP3 underenheter) som utgjør AAV kapsid, samt å sjekk for mulige protein forurensning (figur 3).

Figure 3
Figur 3: evaluering av vektor renhet SDS side og sølv farging. Bruker en Tricine-SDS gel, 5 µL av ulike vektor forberedelsene ble skilt. Proteiner ble senere oppdaget av sølv flekker. Vektorer er vurdert ren når VP1 (82 kDa), VP2 (67 kDa), og VP3 (60 kDa) vises i en 1:1:10 forhold (lane 1), uten overdreven bakgrunn (lane 2) eller ikke-spesifikk band (lane 3). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Representative Results

AAV9 ble ansett, inntil nylig, å være den mest effektive AAV vektor serotype i krysset BBB og transducing celler i CNS etter ekstern administrasjon. En betydelig fordel i kapsid design ble oppnådd når Deverman et al. rapportert bruk av en kapsid utvalg metode kalt grobunn rekombinasjon-baserte AAV målrettede utviklingen (Opprett)17. På denne måten, identifiserte de en ny kapsid, kalt PHP. B, som de rapporterte som kunne transduce de fleste av astrocyttene og nerveceller i flere CNS områder, etter systemisk injeksjon17. På dette punktet det bør bemerkes at selv om PHP. B gir positive resultater i C57/Bl6 mus (som var påkjenningen brukes i første isolasjon forsøkene), foreløpige rapporter tyder effektiviteten kan variere på en stamme-avhengige måte. Ytterligere eksperimenter vil uten tvil kaste mer lys over dette problemet31.

Men til tross for disse problemene, PHP. B gir spennende muligheter for noninvasive genet manipulasjon i CNS mus, inkludert proof-of-concept gene terapi eksperimenter i sykdom modeller. Som sådan, valgte vi å vurdere effektiviteten av transgene uttrykk ved hjelp av PHP. B mot AAV9, som har vært 'gull-standard' vektoren for CNS signaltransduksjon etter ekstern administrasjon siden 20092. Hvis du vil utføre en direkte sammenligning av både serotyper, under optimale forhold for transgene uttrykk, brukte vi en sc genomet konfigurasjon32. Både vektorer gjennomført transgene for grønne fluorescerende protein (GFP) under kontroll av allestedsnærværende kylling β-utgangen (CBA) arrangøren. Kvinnelige C57/Bl6 mus på postnatal dag 42 (ca 20 g i vekt) mottok en dose av 1 x 1012 vg per musen enten scAAV2/php. B-CBA-GFP eller scAAV2/9-CBA-GFP. Vector administrasjon ble utført via hale blodåre injeksjon. Eksperimentene ble godkjent av den etiske komiteen KU Leuven.

Tre uker postinjection, mus gjennomgikk transcardial perfusjon med iskald PBS, etterfulgt av 4% (w/v) iskalde paraformaldehyde (PFA). Hjernen ble høstet og gjennomgikk ytterligere postfixation av en overnatting inkubasjon i den samme bindemiddel, før du overfører til 0,01% (w/v) Na-azide/PBS for lagring til videre analyse. Etterpå hjernen ble delt med en vibrerende mikrotom, og immunohistochemistry ble utført på 50 µm tykke snitt.

For å evaluere nivåer av transgene uttrykk, deler var farget med primære antistoffer mot GFP (kanin anti-GFP), med oppdagelsen bruke sekundære antistoffer konjugert til en fluorescerende farge (anti-kanin Alexa Fluor 488) (figur 4A, B ). Fluorescens intensitet målinger (i vilkårlig enheter [au]) bekreftet en betydelig økning i GFP uttrykk når en sc genom og PHP. B kapsid ble brukt i forhold til AAV9. Økning i GFP ble observert i cerebrum (2105 ± 161 vs 1441 ± 99 au; p = 0.0032), lillehjernen (2601 ± 196 vs 1737 ± 135 au; p = 0.0032), og hjernestammen (3082 ± 319 vs 2485 ± 88 au; p = 0.0038) (figur 4C).

Figure 4
Figur 4: systemisk levering av scAAV2/PHP. B-CBA-GFP fører til en høy GFP uttrykk i CNS. scAAV2/PHP. B-CBA-GFP eller scAAV2/9-CBA-GFP (1 x 1012 vg/mus) ble administrert til 6 uker gamle C57/Bl6 mus via hale blodåre injeksjon. GFP ble oppdaget ved hjelp av immunohistochemistry på koronale hjernen deler 3 uker postinjection. (A) cerebrum og (B) av lillehjernen og hjernestammen vises. Skalere barer = 1 mm. (C) kvantifisering av relativ fluorescens intensiteter ble utført for å bestemme nivået av GFP signal med hver vektor (10 deler per musen, tre mus per vektor gruppe). En enveis ANOVA test ble utført, etterfulgt av en tosidige Student t-test; dataene er uttrykt som gjennomsnittlig ± standardavvik; p < 0.01; Au. vilkårlig enheter. pCapsid, brukes for AAV vektor produksjon, inneholder genet rep fra serotype 2 og gene cap fra serotype PHP. B eller AAV9, tilsvarende. Dette tallet har blitt endret fra Rincon et al.32. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Discussion

Produksjon av rekombinant AAV vektorer beskrevet her bruker materialer og utstyr som er felles for de fleste molekylær biologi labs og celle kultur fasiliteter. Det lar brukeren få ren, preklinisk klasse AAV vektorer som kan brukes til å målrette flere celler og vev typer over en rekke i vitro og vivo applikasjoner. En av de største fordelene med denne protokollen, sammenlignet med andre (dvs. CsCl-baserte rensing), er kortere arbeidstid nødvendig. Klar til bruk AAV vektorer er oppnåelig i maksimum 6 virkedager etter den første transfection HEK293T celler.

Flere faktorer kan negativt påvirke den endelige avkastningen eller kvaliteten på AAV vektoren. Dårlig hva effektivitet er en av hovedårsakene til en lav viral yield33. En stor anbefaling er bruken av HEK293T celler som ikke har vært passaged mer enn 20 ganger og ikke har en celle samløpet større enn 90% ved transfection21. Dessuten, har hva metoden valgt stor innvirkning på resultatene. Denne protokollen er basert på bruk av PEI. PEI er en kationisk polymer muligheten til å levere eksogene DNA til cellekjernen gjennom generasjon komplekser av polymer og nucleic acid, kjent som polyplexes, som er tatt opp av celle- og menneskehandel via endosomes34. PEI-baserte hva er enkelt og raskt å utføre, i motsetning til andre brukte metoder, som co nedbør av DNA med kalsium fosfat35. PEI-baserte transfection er også mye billigere sammenlignet med andre nylig introduserte metoder, som bruken av kationisk lipider og magnet-mediert transfection36.

Rensing strategien spiller en nøkkelrolle i protokollen. Sammenlignet med andre metoder, iodixanol-baserte renselser tendens til å inneholde en høyere prosentandel av Tom virus partikler (20%)20. Dette er motvirket, til en grad, for av det faktum at iodixanol-baserte rensing rutinemessig resulterer i AAV vektor preparater med en partikkel-til-infectivity ratio på mindre enn 100. Dette representerer en betydelig forbedring i forhold til konvensjonelle CsCl-baserte prosedyrer, som er betydelige tap av partikkel infectivity rapporterte37. En annen vanlig alternativ metode å rense AAV vektorer er Ture-baserte rensing. Denne metoden har imidlertid den store ulempen at det kreves en bestemt kolonne for hver vektor kapsid brukes: for eksempel mens AAV2 er klassisk isolere benytter heparin kolonner, denne metoden fungerer ikke med AAV4 og AAV5, som ikke har heparin-bindende steder på deres capsids38. Tatt i betraktning at kromatografi rensing er også dyr, er iodixanol-baserte rensing generelt mer egnet for laboratorier som ønsker å produsere høykvalitets grupper av AAV vektorer på en liten skala33,39, 40. imidlertid for å maksimere siste avkastning og renhet av vektoren, forsiktig er nødvendig når du gjør den iodixanol forløpninger. Ulike iodixanol fraksjoner skal overføres til ultracentrifugation røret med en bakteriefri Pasteur pipette som har tipset er rørende veggen av røret: iodixanol bør bli utvist fra pipette sakte og kontinuerlig. Som vektor partikler akkumuleres i 40% iodixanol laget, må omsorg tas for å sikre at gradient grensesnittene ikke blander20. Til slutt, brøkdel inneholder vektoren skal hentes ved innsetting av en rustfritt stål sløv nål med en måler ikke større enn 20 G. For å maksimere vektor utvinning, skal klart brøken hentes i sin helhet. I dette trinnet er timingen kritiske. For å unngå forlegenhet renheten av preparatet, er det viktig å stoppe samlingen før andre (forurensende) faser av graderingen er samlet.

Forskjeller i innhentet vektor titer kan også tilskrives iboende evne til vektoren å produsere pakket partikler. En sammenligning mellom ulike AAV serotyper viste at noen AAV vektorer er vanskeligere å produsere på en høyere titer enn andre (f.eks AAV2)41. Nedbør av vektoren, under det avsalting trinnet kan være en mulig årsak til en lavere titer og forhindret lett ved å unngå overconcentration33. Dessuten, det er også mulig at effektiviteten av iodixanol forløpning-baserte rensing litt forskjellig mellom serotyper, og derfor avvik titer med forskjellige serotyper kan observeres41.

Til slutt må påpekes at selv om qPCR er en svært nøyaktig metode for DNA kvantifisering kan noen iboende variasjon i teknikken observeres. Nøyaktighet i Serine avhenger hovedsakelig nøyaktige pipettering og riktig vortexing for alle løsningene. For å garantere den mest nøyaktige titer lesing, qPCR kan være uavhengig gjentas, og fått verdiene i gjennomsnitt. Valg av primere presentert i denne protokollen er basert på rekkefølgen av CBA arrangøren i pTransgene plasmider brukes i vårt laboratorium. CBA er en sterk syntetisk promoter som er mye brukt i feltet vektor stasjonen uttrykk over flere celletyper. Den inneholder flere elementer, inkludert cytomegalovirus (CMV) tidlig enhancer element; arrangøren, første ekson og den første intron av CBA genet; og skjøte acceptor av kanin β-globin genet. Men kan primere være konstruert for nesten alle elementet ligger uttrykk kassetten (inkludert arrangøren, transgene og regulatoriske elementer). Sammenligning av titer på tvers av grupper er også mulig, gir deg primere brukes mot regioner felles for vektorer i spørsmålet.

Avslutningsvis kan denne protokollen brukes til å produsere AAV vektorer med en rekke capsids, genomet konfigurasjoner, formidler typer og transgene cargos. Dette vil tillate brukere å enkelt tilpasse seg siste kjennetegner deres vektorer som passer eksperimentelle behov. I eksemplet i representant resultatene, bruk av PHP. B kapsid, som effektivt krysser BBB, ga høyeffektive genuttrykk i CNS følgende hale blodåre injeksjon32. Systemisk administrasjonen av CNS penetrant vektorer har betydelige fordeler i form av mulige bivirkninger2,17,32. Et mulig alternativ til eksterne injeksjon, og unngå begrensningene av invasiv teknikker, er intratekal levering, som består av levering av AAV vektoren i spinalvæske. Denne levering ruten er bevist for å være effektive, viser utbredt uttrykket av transgene over CNS mindre off-målet effekter i eksterne organer og lave nivåer av immunrespons42. Imidlertid er intratekal injeksjoner mye mer utfordrende, siden de krever høyere tekniske ferdigheter enn hale blodåre injeksjon.

Kapsid videreutvikling å avgrense denne teknologien vil bli drevet av muligheter for AAV vektor bruk gene terapi. Disse tilbyr attraktive muligheter til å behandle er uhelbredelig CNS lidelser, som amyotrofisk lateral sklerose, Charcot-Marie-Tooth sykdom, Parkinsons og Alzheimers18.

Disclosures

Forfatterne ikke avsløre.

Acknowledgments

Mr støttes av en Fonds voor Wetenschappelijk Onderzoek Vlaanderen (CVE) postdoktorstipend (133722/1204517N) og anerkjenner kontinuerlig Fundación hjerte de Colombia og Administrative Department of Science, Teknologi og innovasjon (gi CT-FP44842-307-2016, prosjektkode 656671250485). Mm støttes av en CVE doktorgrad fellesskap (1S48018N). M.G.H. ble støttet av en VIB institusjonelle grant og ekstern støtte fra Thierry Latran Foundation (TORV-VIP), stiftelsen for Alzheimers forskning (SAO-FRA) (P #14006), CVE (Grant 1513616N) og det europeiske Research Council (ERC) (starter Grant 281961 - AstroFunc; Proof of Concept Grant 713755 - AD-VIP). Forfatterne bekrefter Jeason Haughton for hans hjelp med musen dyrehold, Stephanie Castaldo for hennes hjelp med å hale blodåre injeksjoner og Caroline Eykens for å gi bilder av transfekterte HEK293T celler. M.G.H. erkjenner Michael Dunlop, Peter Hickman og Dean Harrison.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Plasmid production
pTransgene plasmid De novo design or obtained from a plasmid repository N/A See step 1 of main protocol for further details
pCapsid De novo design or obtained from a plasmid repository N/A See step 1 of main protocol for further details
pHelper Agilent 240071
Plasmid Plus maxi kit Qiagen 12963
QIAquick PCR purification Kit Qiagen 28104
AAV Helper-Free System Agilent 240071
Cell culture and transfection
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM), high glucose, no glutamine Life technologies 11960-044 Supplement DMEM with FBS (1% or 10% v/v) and GlutaMAX 200 mM (1% v/v) then filter sterilize the medium using a 0.22 µm filter
Fetal bovine serum (FBS) GIBCO 10500-064
GlutaMAX supplement GIBCO 35050038
(200 mM)
Corning bottle-top vacuum filter system Sigma-Aldrich CLS430769
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (DPBS) with no calcium and no magnesium GIBCO 14190094
HEK293T cells American Tissue Culture Collection CRL3216 Upon receipt, thaw the cells and culture as described in the protocol. After a minimal number of passages, freeze a subfraction for future in aliquots. Always use cells below passage number 20. Once cultured cells have been passaged more than 20 times, restart a culture from the stored aliquots
Cell culture dishes Greiner Cellstar 639160 15 cm diameter culture dishes
Cell scrapers VWR 10062-904
Polyethylenimine (PEI) Polyscience 23966-2 PEI in powder form is dissolved at 1 µg/µL in deionized water (ddwater) at pH=2 (use HCl). Prepare in a beaker and stir for 2-3 h. When dissolved, bring the pH back to 7 with NaOH. Filter sterilize and store the resuspended stock solution in 1 ml aliquots at -20 °C. PEI aliquots can be freeze/thawed multiple times.
Virkon solution Fisher Scientific NC9821357 Disinfect any material that has been in contact with assembled vector particles with Virkon solution
Mutexi long-sleeve aprons Fisher Scientific 11735423 Wear an apron over the top of a regular lab coat
Fisherbrand maximum protection disposable overshoes Fisher Scientific 15401952
AAV Purification and desalting
Optiprep density gradient medium Sigma-Aldrich D1556 Optiprep is a 60% (w/v) solution of iodixanol in water (sterile). CAUTION. Use under a laminar flow hood. Wear gloves
Phenol red Sigma-Aldrich P0290 CAUTION. Use under a laminar flow hood
Pasteur pipette Sigma-Aldrich Z627992 Sterilize before use
OptiSeal Polypropylene tubes Beckman 361625
Benzonase (250 U/µL) Sigma-Aldrich E1014 Supplied as a ready-to-use solution
Acrodisc syringe filter Pall corporation 4614
Omnifix syringe (5 mL) Braun 4617053V
Blunt syringe needle Sigma Aldrich Z261378 Stainless steel 316 syringe needle, pipetting blunt 90° tip gauge 16, L 4 in. Referred to in the text as a blunt-end needle
Aqua Ecotainer B. Braun 0082479E Sterile endotoxin-free water. Referred to as 'Ultrapure water'
Amicon ultra-15 centrifugal filter unit Millipore UFC910024 These filters concentrate the final product by collecting the vector particles in consecutive centrifugation steps
Pluronic F68 (100x) Thermo Fisher 24040032 Non-ionic surfactant. Dilute in sterile PBS to use at 0.01% (v/v)
Fisherbrand Sterile Microcentrifuge Tubes with Screw Caps (2 mL) Fisher Scientific 02-681-374 Use skirted tubes for easy handling
AAV Titration
Restriction enzyme: StuI (10 U/µL) Promega R6421
DNAse I (1 U/µL) Fisher Scientific EN0521
Proteinase K Sigma-Aldrich 3115852001 Reconstitute in ultrapure water and use at a final concentration of 10 mg/mL. Solution can be stored at -20 °C
EasyStrip Plus Tube Strips (with attached caps) Fisher Scientific AB2000
Eppendorf microtube 3810x Sigma-Aldrich Z606340-1000EA
LightCycler 480 SYBR Green I Master Mix Roche 4707516001
LightCycler Multiwell Plates, 96 wells Roche 4729692001 White polypropylene plate (with unique identifying barcode)
Microseal 'A' PCR plate and PCR Plate Sealing Film Bio-Rad msa5001
AAV Purity control
Ammonium persulfate (APS) Sigma-Aldrich A3678 Reconstitute in ultrapure water to 10% (v/v). CAUTION. Use under a laminar flow hood. Wear gloves
Tetramethylethylenediamine (TEMED) Sigma-Aldrich T9281 CAUTION. Use under a laminar flow hood. Wear gloves
Tris Base ULTROL Grade Merck 648311 CAUTION: Use under a laminar flow hood. Wear gloves
UltraPure Agarose Thermo Fisher 16500-500
Rotiphorese® Gel 30 (37,5:1) Carl Roth 3029.3 Aqueous 30% acrylamide and bisacrylamide stock solution at a ratio of 37.5:1. CAUTION: Use under a laminar flow hood. Wear gloves
Serva Blue G Sigma-Aldrich 6104-58-1
Precision Plus prestained marker Bio-Rad 1610374edu
1-Butanol Sigma-Aldrich B7906 CAUTION: Use under a laminar flow hood. Wear gloves
Immunohistochemistry
Rabbit anti-GFP Synaptic Systems 132002 1:300 dilution
Anti-rabbit Alexa Fluor 488 Invitrogen A21206 1:1,000 dilution
Equipment Company Catalog number Comments
Vector production lab
Rotina 380 bench-top centrifuge * Hettich 1701
Optima XPN 80 ultracentrifuge * Beckmann Coulter A95765
Type 50.2 Ti fixed-angle titanium rotor * Beckmann Coulter 337901
Entris digital scale * Sartorius 2202-1S
Warm water bath * Set at 37 °C
Ice bucket * VWR 10146-290 Keep material used in the vector production lab separate from that used in standard lab areas
Pipetboy pro * Integra 156,400
Graduated pipettes: Cell star * Greiner bio-one 606180 Capacity of 5 mL
Graduated pipettes: Cell star * Greiner bio-one 607180 Capacity of 10 mL
Graduated pipettes: Cell star * Greiner bio-one 760180 Capacity of 25 mL
CO2 incubator CB150 * Binder 9040-0038 Set at 37 °C, 5% CO2 and 95% humidity
Nuaire safety cabinet NU 437-400E * Labexchange 31324 Clean all the surfaces with 70% ethanol and Virkon before and after use
Conventional lab
T100 thermal cycler * Bio-Rad 1861096
LightCycler 480 Instrument II * Roche 5015278001
ThermoMixer * Eppendorf C 5382000015
Nanodrop * ThermoFisher Scientific ND 2000
Mini-Protean Tetra Cell* Bio-Rad 1658001FC For use with handmade or precast gels
ProteoSilver silver stain kit Sigma-Aldrich PROTSIL1 High sensitivity protein detection with low background
Centrifuge 5804 R * Eppendorf B1_022628045 High speed centrifuge for medium capacity needs (up to 250 mL)
Graduated pipettes Cell star * Greiner bio-one 606180 5 mL
Graduated pipettes Cell star * Greiner bio-one 607180 25 mL
Graduated pipettes Cell star * Greiner bio-one 760180 25 mL
Filter tips * Greiner bio-one 750257 1250 µL
Filter tips * Greiner bio-one 738257 300 µL
Filter tips * Greiner bio-one 771257 10 µL
Ice bucket with lid * VWR 10146-290
Mini diaphragm vacuum pump, VP 86 * VWR 181-0065
Pipetman P2 Gilson F144801
Pipetman P20 Gilson F123600
Pipetman P100 Gilson F123615
Pipetman P200 Gilson F123601
Pipetman P1000 Gilson F123602
* Materials marked with an asterisk are expensive pieces of equipment and are usually central infrastructure items shared between multiple labs. These items can also be replaced by equivalents if available. Note, when a different ultracentrifuge is used, care must be taken to select the correct rotor and centrifuge tubes.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Daya, S., Berns, K. I. Gene Therapy Using Adeno-Associated Virus Vectors. Clinical Microbiology Reviews. 21 (4), 583-593 (2008).
  2. Duque, S., et al. Intravenous Administration of Self-complementary AAV9 Enables Transgene Delivery to Adult Motor Neurons. Molecular Therapy. 17 (7), 1187-1196 (2009).
  3. Bourdenx, M., Dutheil, N., Bezard, E., Dehay, B. Systemic gene delivery to the central nervous system using Adeno-associated virus. Frontiers in Molecular Neuroscience. 7, (2014).
  4. Kantor, B., McCown, T., Leone, P., Gray, S. J. Clinical Applications Involving CNS Gene Transfer. Advances in Genetics. 87, 71-124 (2014).
  5. Crystal, R. G. Adenovirus: The First Effective In Vivo Gene Delivery Vector. Human Gene Therapy. 25 (1), 3-11 (2014).
  6. Weinberg, M. S., Samulski, R. J., McCown, T. J. Adeno-associated virus (AAV) gene therapy for neurological disease. Neuropharmacology. 69, 82-88 (2013).
  7. Henckaerts, E., Linden, R. M. Adeno-associated virus: a key to the human genome? Future Virology. 5 (5), 555-574 (2010).
  8. Howarth, J. L., Lee, Y. B., Uney, J. B. Using viral vectors as gene transfer tools (Cell Biology and Toxicology Special Issue: ETCS-UK 1 day meeting on genetic manipulation of cells). Cell Biology and Toxicology. 26 (1), 1-20 (2010).
  9. Nathwani, A. C., et al. Adenovirus-Associated Virus Vector-Mediated Gene Transfer in Hemophilia B. The New England Journal of Medicine. 365 (25), 2357-2365 (2011).
  10. Carter, B. J. Adeno-associated virus and the development of adeno-associated virus vectors: a historical perspective. Molecular Therapy. 10 (6), 981-989 (2004).
  11. Schambach, A., Zychlinski, D., Ehrnstroem, B., Baum, C. Biosafety Features of Lentiviral Vectors. Human Gene Therapy. 24 (2), 132-142 (2013).
  12. Van Vliet, K. M., Blouin, V., Brument, N., Agbandje-McKenna, M., Snyder, R. O. The Role of the Adeno-Associated Virus Capsid in Gene Transfer. Methods in Molecular Biology. 437, 51-91 (2008).
  13. Rincon, M. Y., VandenDriessche, T., Chuah, M. K. Gene therapy for cardiovascular disease: advances in vector development, targeting, and delivery for clinical translation. Cardiovascular Research. 108 (1), 4-20 (2015).
  14. Samulski, R. J., Muzyczka, N. AAV-Mediated Gene Therapy for Research and Therapeutic Purposes. Annual Review of Virology. 1 (1), 427-451 (2014).
  15. McCarty, D. M. Self-complementary AAV Vectors; Advances and Applications. Molecular Therapy. 16 (10), 1648-1656 (2008).
  16. Choi, J. H., et al. Optimization of AAV expression cassettes to improve packaging capacity and transgene expression in neurons. Molecular Brain. 7, 17 (2014).
  17. Deverman, B. E., et al. Cre-dependent selection yields AAV variants for widespread gene transfer to the adult brain. Nature Biotechnology. 34 (2), 204-209 (2016).
  18. Jackson, K. L., Dayton, R. D., Deverman, B. E., Klein, R. L. Better Targeting, Better Efficiency for Wide-Scale Neuronal Transduction with the Synapsin Promoter and AAV-PHP.B. Frontiers in Molecular Neuroscience. 9, (2016).
  19. Lock, M., et al. Versatile Manufacturing of Recombinant Adeno-Associated Viral Vectors at Scale. Human Gene Therapy. 21 (10), 1259-1271 (2010).
  20. Strobel, B., Miller, F. D., Rist, W., LamLa, T. Comparative Analysis of Cesium Chloride- and Iodixanol-Based Purification of Recombinant Adeno-Associated Viral Vectors for Preclinical Applications. Human Gene Therapy Methods. 26 (4), 147-157 (2015).
  21. Jungmann, A., Leuchs, B., Katus, H. A., Rommelaere, J., Müller, O. J. Protocol for efficient generation and characterization of adeno-associated viral (AAV) vectors. Human Gene Therapy Methods. , (2017).
  22. Tolmachov, O. Designing Plasmid Vectors. Methods in Molecular Biology. 542, 117-129 (2009).
  23. QIAGEN Plasmid Purification Handbook. , Available from: https://www.qiagen.com/us/resources/download.aspx?id=46205595-0440-459e-9d93-50eb02e5707e&lang=en (2018).
  24. QIAquick PCR Purification Kit Protocol. , Available from: http://2012.igem.org/wiki/images/a/a3/QIAquick_PCR-purification.pdf (2008).
  25. Lock, M., Alvira, M. R., Chen, S. J., Wilson, J. M. Absolute Determination of Single-Stranded and Self-Complementary Adeno-Associated Viral Vector Genome Titers by Droplet Digital PCR. Human Gene Therapy Methods. 25 (2), 115-125 (2014).
  26. Sigma. ProteoSilver Silver Stain Kit (PROTSIL1) - Bulletin, ProteoSilver. , Available from: https://www.sigmaaldrich.com/content/dam/sigma-aldrich/docs/Sigma/Bulletin/protsil1bul.pdf (2018).
  27. Machholz, E., et al. Manual Restraint and Common Compound Administration Routes in Mice and Rats. Journal of Visualized Experiments. (67), e2771 (2012).
  28. Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), e3564 (2012).
  29. Puntel, M., et al. Gene transfer into rat brain using adenoviral vectors. Current Protocols in Neuroscience. 50 (1), (2010).
  30. Bachman, J. Immunohistochemistry on Freely Floating Fixed Tissue Sections. Methods in Enzymology. 533, 207-215 (2013).
  31. Hordeaux, J., et al. The Neurotropic Properties of AAV-PHP.B Are Limited to C57BL/6J Mice. Molecular Therapy. 26 (3), 664-669 (2018).
  32. Rincon, M. Y., et al. Widespread transduction of astrocytes and neurons in the mouse central nervous system after systemic delivery of a self-complementary AAV-PHP.B vector. Gene Therapy. 25 (2), 83-92 (2018).
  33. Crosson, S. M., Dib, P., Smith, J. K., Zolotukhin, S. Helper-free Production of Laboratory Grade AAV and Purification by Iodixanol Density Gradient Centrifugation. Molecular Therapy. Methods & Clinical Development. 10, 1-7 (2018).
  34. Merdan, T., Kunath, K., Fischer, D., Kopecek, J., Kissel, T. Intracellular processing of poly(ethylene imine)/ribozyme complexes can be observed in living cells by using confocal laser scanning microscopy and inhibitor experiments. Pharmaceutical Research. 19 (2), 140-146 (2002).
  35. Meissner, P., et al. Transient gene expression: recombinant protein production with suspension-adapted HEK293-EBNA cells. Biotechnology and Bioengineering. 75 (2), 197-203 (2001).
  36. Reed, S. E., Staley, E. M., Mayginnes, J. P., Pintel, D. J., Tullis, G. E. Transfection of mammalian cells using linear polyethylenimine is a simple and effective means of producing recombinant adeno-associated virus vectors. Journal of Virological Methods. 138 (1-2), 85-98 (2006).
  37. Zolotukhin, S., et al. Recombinant adeno-associated virus purification using novel methods improves infectious titer and yield. Gene Therapy. 6 (6), 973-985 (1999).
  38. Kaludov, N., Handelman, B., Chiorini, J. A. Scalable Purification of Adeno-Associated Virus Type 2, 4, or 5 Using Ion-Exchange Chromatography. Human Gene Therapy. 13 (10), 1235-1243 (2002).
  39. Nass, S. A., et al. Universal Method for the Purification of Recombinant AAV Vectors of Differing Serotypes. Molecular Therapy. Methods & Clinical Development. 9, 33-46 (2017).
  40. Qu, G., et al. Separation of adeno-associated virus type 2 empty particles from genome containing vectors by anion-exchange column chromatography. Journal of Virological Methods. 140 (1-2), 183-192 (2007).
  41. Holehonnur, R., et al. Adeno-associated viral serotypes produce differing titers and differentially transduce neurons within the rat basal and lateral amygdala. BMC Neuroscience. 15, 28 (2014).
  42. Wang, H., et al. Widespread spinal cord transduction by intrathecal injection of rAAV delivers efficacious RNAi therapy for amyotrophic lateral sclerosis. Human Molecular Genetics. 23 (3), 668-681 (2014).

Tags

Nevrovitenskap problemet 143 Adeno-assosiert virus (AAV)-basert vektorer iodixanol gradering gen levering sentralnervesystemet blod-hjerne-barrieren PHP. B kapsid
Produksjon, rensing og kvalitetskontroll for Adeno-assosiert Virus-basert vektorer
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Fripont, S., Marneffe, C., Marino,… More

Fripont, S., Marneffe, C., Marino, M., Rincon, M. Y., Holt, M. G. Production, Purification, and Quality Control for Adeno-associated Virus-based Vectors. J. Vis. Exp. (143), e58960, doi:10.3791/58960 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter