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Neuroscience

Adeno-जुड़े वायरस आधारित वैक्टर के लिए उत्पादन, शुद्धिकरण, और गुणवत्ता नियंत्रण

Published: January 29, 2019 doi: 10.3791/58960
Automatic Translation
*1,2, *1,2, *1,2, 1,2, 1,2,3
1VIB-KU Leuven Center for Brain and Disease Research, 2Department of Neuroscience, KU Leuven, 3Leuven Brain Institute
* These authors contributed equally

Summary

यहां, हम एक कुशल और reproducible रणनीति का वर्णन करने के लिए उत्पादन, titer, और adeno के गुणवत्ता नियंत्रण बैचों-जुड़े वायरस वैक्टर । यह उपयोगकर्ता उच्च-titer (≥ 1 x 1013 वेक्टर जीनोम/एमएल) और एक उच्च शुद्धता के साथ एक वेक्टर तैयारी प्राप्त करने के लिए अनुमति देता है, इन विट्रो में या vivo उपयोग में के लिए तैयार है ।

Abstract

adeno-जुड़े विषाणुओं पर आधारित जीन वितरण उपकरण (AAVs) जीन थेरेपी अनुप्रयोगों सहित केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) को transgenes के वितरण के लिए एक लोकप्रिय विकल्प हैं । AAV वैक्टर गैर नकल कर रहे हैं, दोनों विभाजन और गैर विभाजित कोशिकाओं को संक्रमित करने में सक्षम है और दीर्घकालिक transgene अभिव्यक्ति प्रदान करते हैं । महत्वपूर्ण बात, कुछ serotypes, जैसे कि नव वर्णित PHP । बी, रक्त मस्तिष्क बाधा (BBB) पशु मॉडलों में पार कर सकते हैं, प्रणालीगत प्रसव के बाद । AAV वैक्टर कुशलता से प्रयोगशाला में उत्पादन किया जा सकता है । हालांकि, मजबूत और reproducible प्रोटोकॉल पर्याप्त शुद्धता के स्तर के साथ AAV वैक्टर प्राप्त करने के लिए आवश्यक हैं और vivo अनुप्रयोगों में पर्याप्त उच्च titer मान । इस प्रोटोकॉल एक iodixanol ढाल शोधन रणनीति के आधार पर, AAV वेक्टर उत्पादन के लिए एक कुशल और reproducible रणनीति का वर्णन । iodixanol शुद्धिकरण विधि उच्च शुद्धता के उच्च titer AAV वैक्टर के बैचों प्राप्त करने के लिए उपयुक्त है, जब अन्य शोधन विधियों की तुलना में. इसके अलावा, प्रोटोकॉल आम तौर पर तेजी से अंय तरीकों से वर्तमान में वर्णित है । इसके अलावा, एक मात्रात्मक पोलीमरेज़ श्रृंखला प्रतिक्रिया (qPCR) आधारित रणनीति वेक्टर titer का एक तेजी से और सही निर्धारण के लिए, साथ ही एक चांदी धुंधला विधि वेक्टर बैच की पवित्रता का निर्धारण करने के लिए वर्णित है । अंत में, सीएनएस को जीन वितरण के प्रतिनिधि परिणाम, AAV-PHP के प्रणालीगत प्रशासन के बाद । बी, प्रस्तुत कर रहे हैं । इस तरह के परिणाम सभी प्रयोगशालाओं में इस लेख में वर्णित प्रोटोकॉल का उपयोग संभव होना चाहिए ।

Introduction

पिछले 30 वर्षों में, वंय प्रकार AAVs को रिकॉमबिनेंट AAV वैक्टर, जो1,2,3,4सीएनएस में जीन हस्तांतरण के लिए असाधारण उपयोगी उपकरण साबित हो गया है बनाने के लिए इंजीनियर किया गया है, 5,6 और जीन थेरेपी रोग के लिए दृष्टिकोण (एफडीए सहित-और EMA-अनुमोदित चिकित्सा)4,7। सीएनएस में उपयोग के लिए उनकी उपयुक्तता काफी हद तक संक्रमित गैर-विभाजित, पोस्ट-mitotic कोशिकाओं, आम तौर पर8सीएनएस में पाया करने की क्षमता से निकला है । हालांकि, AAV आधारित वैक्टर भी किसी भी चिकित्सीय transgene4,9 की एक लंबी अवधि के अभिव्यक्ति की अनुमति का लाभ है, जबकि अंय वायरल वैक्टर7की तुलना में एक मामूली प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया में लाना, 8,10,11,12.

किसी भी AAV वेक्टर के मुख्य तत्व जीनोम और कैप्सिड हैं । वाइल्ड-टाइप AAVs लगभग 5 kilobases (केबी)13के जीनोम के साथ सिंगल-कतरा (ss) डीएनए वायरस है । रिकॉमबिनेंट AAV वैक्टर के उत्पादन के लिए, प्रतिनिधि और टोपी जीन (जीनोम प्रतिकृति और वायरल कैप्सिड के विधानसभा के लिए आवश्यक) जंगली प्रकार AAV के जीनोम से हटा दिया और ट्रांस मेंप्रदान की जाती हैं, एक के लिए कमरे में जा अभिव्यक्ति कैसेट युक्त transgene14,15. उल्टे टर्मिनल दोहराने अनुक्रम मूल वायरल जीनोम के (ITRs) एक AAV वेक्टर में ही बने तत्वों रहे हैं, के रूप में इन प्रतिकृति और पैकेजिंग के लिए आवश्यक है3,10,14। AAV वैक्टर transgene अभिव्यक्ति बढ़ाने के लिए इंजीनियर जा सकता है; ITRs में से एक में उत्परिवर्तन एक hairpin पाश के गठन की ओर जाता है जो प्रभावी ढंग से एक पूरक डीएनए किनारा3,7,15की पीढ़ी की अनुमति देता है । इस विंयास का मुख्य लाभ, एक आत्म पूरक (अनुसूचित जाति) जीनोम, कि यह AAVs के पारंपरिक जीवन चक्र में ठेठ दूसरा किनारा संश्लेषण की आवश्यकता नजरअंदाज, काफी गति और transgene अभिव्यक्ति के स्तर में वृद्धि 1. फिर भी, एक scAAV जीनोम का उपयोग कर लगभग २.४ kb के लिए वेक्टर के कार्गो क्षमता कम कर देता है । यह transgene अनुक्रम, साथ ही किसी भी नियामक अनुक्रम जैसे प्रवर्तकों या microRNA-बाइंडिंग साइट्स, विशिष्ट कक्ष प्रकारों के लिए अभिव्यक्ति को सीमित करने के लिए16शामिल हैं ।

AAV कैप्सिड वेक्टर-होस्ट सेल इंटरैक्शन निर्धारित करता है और किसी AAV सीरोटाइप के लिए सेल प्रकार या टिशू tropism की डिग्री प्रदान करती है, जिसे विशिष्ट स्थानों पर transgene अभिव्यक्ति को सीमित करने के लिए भी शोषण किया जा सकता है । कई AAV serotypes प्रकृति में पाए जाते हैं, जबकि अंय प्रयोगशालाओं में रिकॉमबिनेंट दृष्टिकोण के माध्यम से उत्पादन किया गया है (यानी, PHP । ख). इसके अलावा, कुछ capsids भी अंय उपयोगी विशेषताओं, इस तरह के BBB पार करने की क्षमता के रूप में, प्रणालीगत प्रशासन के बाद सीएनएस भर transgenes के वितरण में जिसके परिणामस्वरूप । यह AAV9 के लिए दिखाया गया है, के रूप में अच्छी तरह के रूप में हाल ही में PHP वर्णित है । B कैप्सिड17. एक परिणाम के रूप में, इन serotypes neurodegenerative विकारों1,17,18के लिए नए जीन थेरेपी के दृष्टिकोण के लिए विशेष रूप से प्रासंगिक साबित हो रहे हैं ।

इस प्रोटोकॉल का उद्देश्य उच्च titer और शुद्धता के साथ AAV वैक्टर के छोटे पैमाने पर उत्पादन के लिए एक लागत प्रभावी विधि का वर्णन है । हालांकि परिणाम यहां प्रस्तुत PHP का उपयोग करें । बी कैप्सिड और एक scAAV अभिव्यक्ति कैसेट, प्रोटोकॉल कई AAV वेक्टर serotypes और जीनोम विंयास के उत्पादन के लिए उपयुक्त है, अधिकतम प्रयोगात्मक लचीलापन की अनुमति । हालांकि, वेक्टर उपज और अंतिम पवित्रता चुना सीरोटाइप के आधार पर भिंन हो सकते हैं ।

प्रोटोकॉल ही वायरल वेक्टर उत्पादन के लिए शास्त्रीय त्रिकोणीय अभिकर्मक विधि का एक संस्करण है और वेक्टर साफ अप के लिए एक iodixanol ढाल के उपयोग को शामिल किया गया है, जो, सीज़ियम क्लोराइड (CsCl) ढाल के शास्त्रीय उपयोग की तुलना में, गया है अधिक समय में उच्च शुद्धता के AAV वैक्टर उत्पादन करने के लिए रिपोर्ट कुशल तरीके से19,20,21।

अभिकर्मक, शुद्धि और एकाग्रता कदम एक ऊतक संस्कृति वायरल वेक्टर काम के लिए रेटेड प्रयोगशाला में अच्छा प्रयोगशाला अभ्यास (जीएलपी) के अनुसार किया जा करने के लिए इरादा कर रहे हैं । प्रत्येक कार्य के लिए प्रासंगिक स्थानीय और राष्ट्रीय वायरल वेक्टर उत्पादन और उपयोग के विषय में कानून के अनुपालन में किया जाना चाहिए । काम एक लामिना प्रवाह हुड के नीचे और बाँझ स्थितियों में किया जाना चाहिए । वेक्टर सुविधा के अंदर, यह नियमित रूप से ऊतक संस्कृति लैब कोट के अलावा एक प्रयोगशाला एप्रन पहनने के लिए सिफारिश की है । इसके अलावा, दस्ताने की एक डबल जोड़ी, साथ ही प्लास्टिक के जूते, हर समय पर पहना जाना चाहिए ।

वेक्टर उत्पादन शुरू करने से पहले, सुनिश्चित करें कि सभी आवश्यक उपकरण और plasmids उपलब्ध हैं । 1) pCapsid प्लाज्मिड प्रतिनिधि जीन है कि चार गैर संरचनात्मक प्रतिकृति, अर्थात् Rep78, Rep68, Rep52, और Rep40, और टोपी जीन है कि सांकेतिक शब्दों में बदलना तीन संरचनात्मक कैप्सिड प्रोटीन, अर्थात् VP1, VP2, और VP3 के लिए आवश्यक encodings शामिल हैं । 2) pHelper प्लाज्मिड एडीनोवायरस, जो AAV कोशिकाओं में HEK293T उत्पादन की सुविधा से जीन E4, E2A, और VA शामिल हैं । 3) pTransgene प्लाज्मिड transgene अभिव्यक्ति कैसेट, दो ITRs द्वारा पार्श्व शामिल हैं । इन plasmids को प्रयोगशाला में डी नोवो को संश्लेषित किया जा सकता है जो ऑनलाइनउपलब्ध अनुक्रम का उपयोग कर रहा है । plasmids के लिए डी नोवोबनाया, विशेष रूप से उन उपंयास transgenes युक्त, अनुक्रमण, सुनिश्चित करें कि transgene और ITRs सही है बनाने के लिए आवश्यक है । वैकल्पिक रूप से, निर्मित plasmids सीधे ऑनलाइन प्लाज्मिड खजाने के माध्यम से प्राप्त किया जा सकता है । जब आवश्यक हो, plasmids प्रवर्धित और मानक किट का उपयोग कर शुद्ध किया जा सकता है, निर्माता के निर्देश के अनुसार23.

वेक्टर titer और पवित्रता सदिश की transduction क्षमता को प्रतिकूल रूप से प्रभावित कर सकता है । अतिरिक्त प्रोटोकॉल उत्पादित वेक्टर की गुणवत्ता का मूल्यांकन करने के लिए आपूर्ति की जाती है । अंतिम वैक्टर दोनों विट्रो में और vivo अनुप्रयोगों में सीएनएस सेल समारोह के अध्ययन के लिए उपयोगी हो जाएगा ।

Protocol

समाधान संरचना
सेल कल्चर और अभिकर्मक
DMEM1 DMEM 1x
1% FBS (v/
1% GlutaMAX (v/
DMEM10 DMEM 1x
10% FBS (v/
1% GlutaMAX (v/
१५० मिमी NaCl ४.३८० g NaCl
तक ५०० मिलीलीटर Ultrapure पानी
AAV शुद्धि और लवण
५ मीटर NaCl १४६.१ g NaCl
तक ५०० मिलीलीटर Ultrapure पानी
1 मीटर Tris एचसीएल (pH ८.५) १२.११ g Tris आधार सावधानी
तक १०० मिलीलीटर Ultrapure पानी
८.५ करने के लिए पीएच को कम करने के लिए एक पाश्चर पिपेट का उपयोग कर 1 मीटर एचसीएल जोड़ें
Lysis बफर 5 एम NaCl की 15 मिलीलीटर
1 मीटर Tris एचसीएल (pH ८.५) की 25 मिलीलीटर सावधानी
तक ५०० मिलीलीटर Ultrapure पानी
10x फॉस्फेट-खारा (पंजाब) बफर ८० g NaCl
2 जी KCl सावधानी
१४.४ g न2HPO4
२.४ g KH2पो4
1 एल डीडीजल
1 M MgCl2 २०.३३ g MgCl2-6H2हे
तक १०० मिलीलीटर Ultrapure पानी
१ मी KCl ७.४५ g KCl सावधानी
तक १०० मिलीलीटर Ultrapure पानी
5x पंजाबियों मैग्नीशियम-पोटेशियम (पंजाब-एमके) स्टॉक समाधान 10x पंजाब के २५० मिलीलीटर
२.५ एमएल के 1 मीटर MgCl2
६.२५ एमएल के 1 मीटर KCl सावधानी
अप करने के लिए ५०० मिलीलीटर Ultrapure पानी ज2हे
15% Iodixanol Optiprep घनत्व ढाल मध्यम के १२.५ मिलीलीटर सावधानी
5 एम NaCl की 10 मिलीलीटर
5x के 10 मिलीलीटर पंजाबियों-एमके
१७.५ मिलीलीटर के Ultrapure पानी
२५ टक्के Iodixanol Optiprep घनत्व ढाल मध्यम के २०.८ मिलीलीटर सावधानी
5x के 10 मिलीलीटर पंजाबियों-एमके
१९.२ मिलीलीटर के Ultrapure पानी
१०० µ l के phenol लाल
४०% Iodixanol Optiprep घनत्व ढाल मध्यम के ३३.३ मिलीलीटर सावधानी
5x के 10 मिलीलीटर पंजाबियों-एमके
६.७ मिलीलीटर के Ultrapure पानी
६०% Iodixanol Optiprep घनत्व ढाल मध्यम के ५० मिलीलीटर सावधानी
१०० µ l के phenol लाल सावधानी
AAV शुद्धता नियंत्रण
10x Tris एसीटेट EDTA (चाय) बफर ४४.८ g Tris आधार सावधानी
११.४ एमएल हिमनदों एसिटिक एसिड (17.4 मीटर)
३.७ g EDTA
अप करने के लिए 1 L Ultrapure पानी
Agarose जेल ०.८ छ Ultrapure agarose
अप करने के लिए १०० मिलीलीटर 1x चाय बफर
जेल बफर १८१.७ g Tris आधार सावधानी
१.५ g एसडीएस सावधानी
1 मीटर एचसीएल के साथ ८.४५ को समायोजित पीएच सावधानी
तक ५०० मिलीलीटर Ultrapure पानी
कैथोड 10x बफर १२१.१४ g Tris आधार सावधानी
१७९.२ g Tricine सावधानी
1% एसडीएस (w/ सावधानी
अप करने के लिए 1 L Ultrapure पानी
Anode 10x बफर २४२.३ g Tris आधार सावधानी
अप करने के लिए 1 L Ultrapure पानी
1 मीटर एचसीएल के साथ ८.९ को समायोजित पीएच सावधानी
नमूना बफर 5x 20 मिलीलीटर के लिए:
६०५ एमजी Tris बेस सावधानी
4 छ एसडीएस सावधानी
10 मिलीग्राम सर्वजन नीला जी
12 ग्राम ग्लिसरॉल
1 मीटर एचसीएल, aliquot और स्टोर पर-20 डिग्री सेल्सियस के साथ ६.८ को पीएच समायोजित करें सावधानी
स्टैकिंग जेल 2 जैल के लिए:
४०० µ l acrylamide सावधानी
७५० µ एल जेल बफर
१.८५ मिलि Ultrapure पानी
4 µ l TEMED सावधानी
20 µ l 10% अनुप (v/ सावधानी
जेल डालने से पहले TEMED और 10% एपीएस तुरंत जोड़ें । एक रासायनिक डाकू के तहत दोनों रसायनों का प्रयोग करें ।
संपति जेल 2 जैल के लिए:
३.३२ मिलि acrylamide सावधानी
३.३५ एमएल जेल बफर
१.१४ मिलि Ultrapure पानी
२.१२ एमएल ५०% ग्लिसरॉल
6 µ l TEMED सावधानी
५० µ l 10% अनुप (w/ सावधानी
जेल डालने से पहले TEMED और 10% एपीएस तुरंत जोड़ें । एक रासायनिक डाकू के तहत दोनों रसायनों का प्रयोग करें ।
जल-संतृप्त ब्यूटानॉल 10 एमएल एन-ब्यूटानॉल सावधानी
1 मिलीलीटर Ultrapure पानी
सावधानी: खतरनाक रसायनों के उपयोग पर दिशानिर्देशों के लिए सामग्री तालिका का संदर्भ लें ।

तालिका 1: आवश्यक समाधानों की संरचना ।

1. HEK293T कोशिकाओं के त्रिकोणीय अभिकर्मक

नोट: कृपया प्रोटोकॉल में प्रयुक्त बफ़र्स और समाधानों की संरचना के लिए तालिका 1 देखें ।
नोट: प्रोटोकॉल के इस खंड के प्रदर्शन में लगभग 4 दिन लगते हैं ।

  1. गल मानव भ्रूण गुर्दे (HEK) 293T कोशिकाओं की एक शीशी ३७ डिग्री सेल्सियस पर सेट पानी में स्नान ।
    नोट: केवल उन कक्षों का उपयोग करें जो इष्टतम अभिकर्मक दक्षता की गारंटी देने के लिए 20x से कम बीतने वाले हैं ।
  2. बीज HEK293T कोशिकाओं के घनत्व पर 2 x 103 से 6 x 103 कोशिकाओं/DMEM10 में 15 सेमी व्यास सेल संस्कृति व्यंजन में ।
  3. 70 के लिए कोशिकाओं को बढ़ने-एक मानक मशीन में 80% संगम ३७ डिग्री सेल्सियस पर सेट, ९५% आर्द्रता और 5% सह2के साथ ।
    नोट: इस प्रोटोकॉल का उपयोग कर AAV वैक्टर के एक बैच के उत्पादन 18 सेल संस्कृति व्यंजन (15 सेमी व्यास) की आवश्यकता है । ७०%-८०% के एक सेल संगम 6 x 103 से 7 x 103 कोशिकाओं के लिए संगत/DMEM10संस्कृति माध्यम के 17-20 मिलीलीटर में बनाए रखा ।
  4. 1/3.5 (w/w) के एक एकाग्रता अनुपात में polyethylenimine (पी)/DNA मिश्रण तैयार करें ।
    1. १ ५० मिलीलीटर शंकु ट्यूब में 18 सेल संस्कृति व्यंजन के लिए डीएनए मिश्रण तैयार pΔF6 के ३६० µ जी, १८० µ जी के pCapsid, और १८० µ जी के 18 मिलीलीटर में १५० मिमी pTransgene के मिश्रण से ।
    2. डीएनए मिश्रण को ३ ५० एमएल शंकु ट्यूब (6 मिलीलीटर डीएनए मिश्रण के प्रति शंकु ट्यूब) वितरित करें ।
    3. एक नया ५० एमएल शंकु ट्यूब में छह सेल संस्कृति व्यंजन के लिए बेई मिश्रण तैयार पी के ८४० µ जी (1 µ जी/µ एल) मिश्रण से १५० mM NaCl के 6 मिलीलीटर में ।
    4. पी मिश्रण की 6 मिलीलीटर (चरण 1.4.3 में तैयार) जोड़कर पी/डीएनए मिश्रण तैयार करें, ड्रॉप द्वारा ड्रॉप, डीएनए मिश्रण युक्त शंकु ट्यूबों में से एक करने के लिए (चरण 1.4.2 में तैयार) और कमरे के तापमान पर 20 मिनट के लिए मशीन ।
      नोट: मशीन के 20 मिनट के बाद, बेई/डीएनए मिश्रण थोड़ा पंकिल हो जाएगा ।
  5. मशीन से बाहर छह सेल संस्कृति व्यंजन ले लो और पूरी तरह से एक लामिना प्रवाह हूड में प्रत्येक संस्कृति पकवान से मध्यम महाप्राण । Dulbecco के फास्फेट-बफर खारा (DPBS) के 5 मिलीलीटर के साथ बर्तन धोने से मध्यम के निशान निकालें ।
  6. धीरे पकवान झुकने से पूरी सतह पर DPBS के वितरण सुनिश्चित करें ।
  7. धीरे DPBS महाप्राण और प्रत्येक डिश के लिए DMEM1 के 12 मिलीलीटर जोड़ें ।
    नोट: एक डिश के किनारे पर रखा पिपेट से धीरे से, मध्यम जोड़कर कोशिकाओं को अलग करने से बचें ।
  8. pipetting ऊपर और नीचे 3x-5x द्वारा पी/ एक ड्रॉप-बाय-ड्रॉप फैशन में छह सेल संस्कृति व्यंजन में से प्रत्येक के लिए पी/डीएनए मिश्रण के 2 मिलीलीटर जोड़ें, ध्यान से यह पूरी सतह पर वितरण । एक बार मिश्रण एक डिश के लिए जोड़ा है, बर्तन मशीन में वापस जगह है । दोहराएं चरण 1.4.3-१.८ शेष संस्कृति व्यंजन के लिए ।
  9. ३७ डिग्री सेल्सियस पर 5 एच के लिए transfected कोशिकाओं की मशीन, ९५% आर्द्रता और 5% सह 2 के साथ।
  10. पूर्व मौजूदा माध्यम (कुल मध्यम मात्रा = 25 मिलीलीटर) को हटाने के बिना प्रत्येक संस्कृति डिश के लिए DMEM10 के एक अतिरिक्त 12 मिलीलीटर जोड़ें ।
  11. transfected कोशिकाओं को ७२ एच के बाद ३७ डिग्री सेल्सियस पर अभिकर्मक, ९५% आर्द्रता और 5% सह2के साथ मशीन ।

Supplementary Figure
अनुपूरक चित्रा 1: HEK 293T कोशिका आकृति प्रतिदीप्ति इमेजिंग (दाएं) द्वारा visualized GFP अभिव्यक्ति की पुष्टि के साथ चरण कन्ट्रास्ट माइक्रोस्कोपी (बाएँ) द्वारा visualized. (क) प्रतिदीप्ति इमेजिंग द्वारा GFP-एंकोडिंग pTransgene के साथ HEK293T कोशिकाओं की सफल अभिकर्मक की पुष्टि की जाती है । (ख) HEK293T कोशिकाओं अभिकर्मक एजेंट के साथ पूरी तरह से इलाज नहीं GFP अभिव्यक्ति दिखाते हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

  1. मध्यम और कोशिकाओं ७२ एच पोस्ट-अभिकर्मक फसल । एक सेल खुरचनी का उपयोग करने के लिए ध्यान से संस्कृति पकवान से अलग कोशिकाओं । मध्यम और एक ५० मिलीलीटर शंकु ट्यूब में कोशिकाओं को बर्फ पर रखा ले लीजिए ।
    नोट: दो सेल संस्कृति व्यंजन की सामग्री एक एकल ५० मिलीलीटर शंकु ट्यूब में एकत्र किया जा सकता है । इस कदम के अंत में, नौ ट्यूबों के प्रत्येक मध्यम के लगभग ५० मिलीलीटर शामिल होंगे ।
  2. ४२० x g पर 10 मिनट के लिए त्वरण और अधिकतम करने के लिए सेट की मंदी के साथ 4 डिग्री सेल्सियस पर शंकु ट्यूबों के केंद्रापसारक ।
  3. ध्यान से प्रत्येक ट्यूब से supernatant त्यागें । सामग्री की हानि को रोकने के लिए पिपेट का उपयोग न करें । इसके बजाय, धीरे एक अपशिष्ट निपटान कंटेनर में supernatant डालना और बर्फ पर वापस सेल छर्रों युक्त ट्यूबों जगह है ।
  4. ५० मिलीलीटर शंकु ट्यूब में सीधे lysis बफर के 2 मिलीलीटर में प्रत्येक कोशिका गोली resuspend अप और 5-10x नीचे से resuspend । भंवर मत करो । एक साथ तीन ट्यूबों से lysates पूल ।
    नोट: इस बिंदु पर, वहां ३ ५० मिलीलीटर शंकु ट्यूबों, lysis बफर में resuspend कोशिकाओं के 6 मिलीलीटर युक्त हर एक होगा ।

2. AAV वेक्टर शुद्धि

नोट: इस प्रोटोकॉल अनुभाग के प्रदर्शन लगभग 1 दिन लेता है । प्रत्येक ३ ५० मिलीलीटर शंकु ट्यूब lysis बफ़र में resuspend (पिछले नोट देखें) से युक्त प्रत्येक पर एक साथ निम्न चरणों का पालन करें ।

  1. उंहें लाइसे और AAV कणों को रिहा करने के लिए 3x resuspend कोशिकाओं को फ्रीज और गल । एक सूखी इथेनॉल के साथ मिश्रित बर्फ युक्त बाल्टी में ट्यूबों रखकर ठंड कदम प्रदर्शन । ३७ डिग्री सेल्सियस पर सेट एक पानी स्नान में तुरंत कोशिकाओं को रखकर गल प्रदर्शन करते हैं ।
  2. तीसरे गल कदम के बाद, 15 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर १,१६७ x g पर केंद्रापसारक ।
    नोट: एक नजर सेल मलबे से बना गोली का गठन किया जाएगा । जब ट्यूबों हैंडलिंग, अचानक आंदोलनों से बचने के रूप में इन supernatant, जो अंतिम सदिश की पवित्रता समझौता करेंगे में गोली की टुकड़ी पैदा कर सकता है ।
  3. ध्यान से supernatants ५० एमएल शंकु ट्यूबों साफ करने के लिए स्थानांतरण और फिर प्रत्येक ट्यूब के लिए nuclease जोड़ने के लिए, ५० U/एमएल supernatant की एक अंतिम एकाग्रता के लिए ।
  4. ३७ डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए मशीन । भंवर ५० एमएल शंकु ट्यूबों हाथ से हर 10 मिनट के लिए सुनिश्चित करें कि nuclease अच्छी तरह से supernatant के साथ मिलाया जाता है ।
  5. 4 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए १३,४९० x g पर केंद्रापसारक द्वारा supernatant स्पष्ट ।
  6. एक 10 मिलीलीटर सिरिंज के लिए एक ०.४५ µm फिल्टर अनुलग्न करें और यह एक साफ ५० एमएल शंकु ट्यूब के शीर्ष पर जगह है । ध्यान से गोताख़ोर निकालें और २.५ कदम से supernatant के साथ सिरिंज भरें ।
  7. फिल्टर के माध्यम से lysate को बल देने के लिए गोताख़ोर का प्रयोग करें । एक नए फिल्टर का प्रयोग करें और supernatant के प्रत्येक ट्यूब के लिए सिरिंज चरण २.५ में प्राप्त की ।
    नोट: प्राप्त अंश को ' क्रूड lysate ' के नाम से जाना जाता है ।
  8. तालिका 1में दिए गए निर्देशों के अनुसार 15%, 25%, ४०%, और चार अलग ५० मिलीलीटर शंकु ट्यूबों में ६०% iodixanol अंशों में से प्रत्येक तैयार करें ।
  9. iodixanol अंशों के निम्न क्रम का उपयोग करते हुए तीन ultracentrifugation ट्यूबों में iodixanol ग्रैडिएंट तैयार करें: 15% iodixanol की 8 मिलीलीटर, 25% iodixanol की ५.५ मिलीलीटर, ४०% iodixanol की 5 मिलीलीटर, और ६०% iodixanol की ४.५ मिलीलीटर ।
    सावधानी: Iodixanol आंखों, त्वचा, और जठरांत्र और श्वसन तंत्र के लिए जलन पैदा कर सकता है । जब iodixanol ढाल हैंडलिंग, दस्ताने पहनते है और एक लामिना प्रवाह हुड के तहत काम करते हैं ।
    1. पिपेट प्रत्येक ultracentrifugation ट्यूब में 15% iodixanol के 8 मिलीलीटर ।
    2. एक साफ ५० एमएल शंकु ट्यूब (चित्रा 1a) में 25% iodixanol समाधान की पिपेट ५.५ मिलीलीटर ।
    3. एक गैर-स्नातक पाश्चर पिपेट का प्रयोग करें (ultracentrifugation ट्यूब की गर्दन के रूप में भी पारंपरिक स्नातक पिपेट के लिए संकीर्ण है) को ध्यान से 15% iodixanol समाधान (आंकड़ा 1b) के नीचे 25% iodixanol समाधान की परत ५.५ मिलीलीटर ।
      नोट: यह पाश्चर पिपेट केवल 2 मिलीलीटर के आसपास पकड़ कर सकते हैं के बाद से तीन चरणों में iodixanol जोड़कर सफलतापूर्वक प्राप्त किया जा सकता है ।
    4. चरण 2.9.3 में बताए अनुसार ४०% और ६०% iodixanol समाधान जोड़ें । लेयरिंग के दौरान विभिन्न iodixanol इंटरफेस को परेशान न करें ।
      नोट: विभिंन iodixanol भागों की उचित तैयारी phenol लाल iodixanol भागों में जोड़ा करने के लिए दृश्य पुष्टि धंयवाद द्वारा सुनिश्चित किया जा सकता है ( 1 तालिकामें निर्देश देखें) । के बाद से प्रत्येक अंश एक विशिष्ट घनत्व है, वे स्तरीकरण कदम के दौरान intermix नहीं होगा, अगर यह ठीक से किया जाता है (चेक चित्रा 1C).
  10. परत एक पाश्चर पिपेट के साथ 15% iodixanol ढाल के शीर्ष पर कच्चे lysate । ड्रॉप द्वारा छोड़ आगे क्रूड lysate और iodixanol समाधान के बीच इंटरफेस परेशान से बचने के लिए ।
  11. lysis बफर के साथ ultracentrifugation ट्यूब ऊपर भरें जब तक meniscus ट्यूब गर्दन के आधार को सुनिश्चित करने के लिए ट्यूब बहुत उच्च ultracentrifugation (चित्रा 1C) के दौरान उत्पंन बलों के अंतर्गत पतन नहीं पहुंचता है ।
  12. उपयुक्त ढक्कन का उपयोग कर ultracentrifugation ट्यूबों बंद करें । सभी तीन ultracentrifugation ट्यूबों एक ही वजन है सुनिश्चित करने के लिए एक डिजिटल पैमाने का उपयोग करें । वजन समायोजित करें, यदि आवश्यक हो, ' कच्चे lysate ' के शीर्ष पर अधिक lysis बफर जोड़कर ।
    नोट: ultracentrifugation ट्यूबों के बीच वजन का अंतर ०.१ के नीचे होना चाहिए ultracentrifuge के सुरक्षित संचालन सुनिश्चित करने के लिए जी । Ultracentrifuges उपकरणों के संभावित खतरनाक टुकड़े कर रहे है और केवल ठीक से प्रशिक्षित कर्मियों द्वारा इस्तेमाल किया जाना चाहिए ।
  13. ३०१,५८० x gपर ट्यूबों केंद्रापसारक, एक निश्चित कोण टाइटेनियम रोटर का उपयोग कर, के लिए 1 ज और ४० मिनट 12 डिग्री सेल्सियस पर, त्वरण और मंदी की अधिकतम गति का उपयोग कर ।
  14. ध्यान से ४०% और ६०% iodixanol अंतरफलक पर एक स्टेनलेस स्टील कुंद सुई डालें ।
    1. एक 5 मिलीलीटर सिरिंज (चित्रा 1E) सुई संलग्न करें ।
    2. महाप्राण केवल स्पष्ट अंश, वेक्टर कणों से युक्त ।
      नोट: एकत्रित कुल मात्रा लगभग 2.5 – 3 मिलीलीटर है । 25-40% अंतरफलक से सामग्री के संग्रह से बचें, क्योंकि यह अंतिम सदिश बैच में संदूषण के स्तर में वृद्धि होगी, गैर वांछनीय प्रोटीन की उपस्थिति के कारण ।
    3. एकत्र अंश (लवण और एकाग्रता) की प्रक्रिया या यह 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर की दुकान ।

Figure 1
चित्रा 1: iodixanol ढाल शुद्धि और बाद वेक्टर संग्रह के लिए सेटअप । (a) ultracentrifugation ट्यूब में विभिन्न iodixanol ग्रेडिएंट को pipetting करने से पहले, प्रत्येक iodixanol समाधान की पर्याप्त मात्रा को एक पृथक शंकु ट्यूब में पिपेट । (ख) फिर एक पाश्चर पिपेट का उपयोग करने के लिए क्रमिक रूप से ultracentrifugation ट्यूब के लिए प्रत्येक iodixanol समाधान हस्तांतरण: एक तेजी से उच्च iodixanol एकाग्रता की परतों पिछले परत (ओं) के नीचे ट्यूब के नीचे जोड़ा जाना चाहिए । (ग) परत कच्चे वेक्टर lysate शीर्ष पर एक बार ढाल तैयार किया गया है । इस वेक्टर संग्रह प्रणाली तेज सुई, जो ' needlestick ' चोटों का खतरा मौजूद का उपयोग नहीं करता है । (घ) एक स्टेनलेस स्टील ३१६-सिरिंज सुई iodixanol ढाल के माध्यम से 40%/60% iodixanol इंटरफेस करने के लिए डाला जाता है. (ङ) वेक्टर कण ४०% iodixanol चरण में पाए जाते हैं और एकत्र किए जाते हैं. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

3. AAV वेक्टर का लवण और एकाग्रता

नोट: प्रोटोकॉल के इस खंड के प्रदर्शन लगभग 2 एच लेता है ।

  1. ४,००० एक्स जीमें 5 मिनट के लिए 1x पंजाब-एमके के 5 मिलीलीटर जोड़कर और केंद्रापसारक फिल्टर के फिल्टर झिल्ली कुल्ला
  2. 1x पंजाबियों-एमके के 5 मिलीलीटर जोड़ें एकत्र AAV वेक्टर अंश करने के लिए, मिश्रण और फिर फिल्टर करने के लिए कुल मात्रा में जोड़ें । 1x पंजाब-एमके के अलावा, turbidity मनाया जाता है । ४,००० एक्स जी पर केंद्रापसारक जब तक शंकु के आकार का फिल्टर पर मौजूद मात्रा 1 मिलीलीटर को कम किया गया है । प्रवाह के माध्यम से बाहरी संग्रह ट्यूब में संचित त्यागें ।
  3. शंकु के आकार का फिल्टर करने के लिए 1x पंजाबियों-एमके के 13 मिलीलीटर जोड़ें और कई बार के रूप में केंद्रापसारक कदम दोहराने के रूप में आवश्यक (ंयूनतम 3x), जब तक कोई अधिक turbidity मनाया जब ताजा 1x पंजाबियों-एमके जोड़ा है ।
  4. अंतिम धो चरण में, पंजाब के 13 मिलीलीटर + ०.०१% (v/v) गैर ईओण surfactant और ४,००० एक्स जी पर केंद्रापसारक जब तक मात्रा 300 से कम है-350 µ एल जोड़ें
  5. एक बाँझ स्कर्ट microcentrifuge ट्यूब में पूरी मात्रा pipetting द्वारा फिल्टर पर मौजूद शेष अंश इकट्ठा.
    नोट: इस अंश में नमकीन और केंद्रित AAV वेक्टर होता है । इस प्रोटोकॉल के निंन चरणों में, इस अंश को ' प्राथमिक ' भिंन के रूप में संदर्भित किया जाता है । हुड के नीचे ट्यूब संभाल और 4 डिग्री सेल्सियस पर यह स्टोर करने के लिए सुनिश्चित करें ।
  6. २०० µ के साथ फ़िल्टर कुल्ला 1x पंजाबियों के एल-मनोज अवशिष्ट वेक्टर कणों को इकट्ठा करने के लिए फिल्टर पर बनाए रखा । एक बाँझ microcentrifuge ट्यूब में ले लीजिए ।
    नोट: यह एक पतला वेक्टर स्टॉक है, जो कम वेक्टर titers की आवश्यकता होती है कुछ अनुप्रयोगों के लिए उपयुक्त हो सकता है । भविष्य के चरणों में, इस अंश को ' द्वितीयक ' अंश के रूप में संदर्भित किया जाता है.
  7. अल्पकालिक संग्रहण के लिए, 4 ° c (2 सप्ताह से कम) पर वेक्टर भिन्न (ओं) को संग्रहीत करें । Aliquot और ‑ 20 डिग्री सेल्सियस पर वेक्टर की दुकान जब लंबी अवधि के भंडारण की आवश्यकता है ।
  8. अनुभाग 4 में बताए अनुसार गुणवत्ता नियंत्रण निष्पादित करें ।

4. मात्रात्मक पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन द्वारा वेक्टर के अनुमापन

नोट: प्रोटोकॉल के इस खंड के प्रदर्शन लगभग 3 एच लेता है ।

  1. मानक वक्र
    1. Linearize खंड 1 में अभिकर्मक-HEK कोशिकाओं के 293T के लिए प्रयुक्त transgene-एक्सप्रेस प्लाज्मिड (pTransgene) ।
    2. एक ०.५ मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब में प्रतिबंध डाइजेस्ट मिश्रण तैयार (प्रतिबंध डाइजेस्ट मिश्रण की संरचना के लिए तालिका 2 को देखें) ।
      नोट: इस्तेमाल किया एंजाइम और निर्माता से संबंधित दिशानिर्देश के अनुसार प्रतिबंध डाइजेस्ट मिश्रण की संरचना को समायोजित करें ।
    3. ३७ डिग्री सेल्सियस पर 1 एच के लिए प्रतिबंध डाइजेस्ट मिश्रण की मशीन ।
    4. ०.८% (w/v) पर रेखीय प्लाज्मिड चला कर प्रतिबंध पाचन की दक्षता की जांच करें agarose जेल में १०० v के लिए 1 ज. पूर्ण प्लाज्मिड के पाचन निर्धारित आकार का एक टुकड़ा उत्पादन करना चाहिए ।
    5. एक पीसीआर शुद्धि किट का उपयोग कर रैखिक प्लाज्मिड डीएनए शुद्ध, निर्माता के निर्देश24का पालन, और २६० एनएम पर अवशोषण को मापने के द्वारा एक spectrophotometer के साथ डीएनए एकाग्रता उपाय । अनुमापन के बाद, अधिक उपयोग के लिए ‑ 20 ° c पर रेखीय प्लाज्मिड के शेष aliquot को संग्रहीत करें ।
    6. इस प्रकार के रूप में प्रति microliter प्लाज्मिड स्टॉक के अणुओं (यानी डीएनए प्रतियां) की गणना ।
      1. सबसे पहले, प्लाज्मिड के आणविक वजन की गणना । यह मानते हुए कि डीएनए बेस जोड़ी (बीपी) का औसत वजन ६५० Daltons (डीए) है और एक बीपी का एक तिल का वजन ६५० ग्राम है, किसी भी दोहरे-असहाय डीएनए टेम्पलेट के आणविक भार को उसकी लम्बाई के उत्पाद (बीपी में) और आधार जोड़ी के अनुसार वजन लेने से अनुमान लगाया जा सकता है.
        प्लाज्मिड आणविक भार [g/मोल] = प्लाज्मिड आकार [बीपी] x ६५० [Da/
      2. अगले, प्रति microliter प्लाज्मिड के तिल की संख्या की गणना ।
        प्लाज्मिड के तिल प्रति microliter = प्लाज्मिड एकाग्रता [g/µ l]/प्लाज्मिड आणविक भार [g/
        नोट: आणविक वजन का व्युत्क्रम सामग्री के 1 जी में मौजूद प्लाज्मिड के तिल की संख्या है ।
      3. फिर, microliter प्रति प्लाज्मिड अणुओं की संख्या की गणना, अवोगाद्रो की संख्या का उपयोग कर (६.०२२ x 1023 अणुओं/
        प्लाज्मिड के अणु प्रति microliter = प्लाज्मिड के तिल प्रति microliter [तिल/µ एल] एक्स अवोगाद्रो की संख्या [अणु/
      4. अंत में, प्लाज्मिड शेयर (अणुओं/µ एल) पतला 1 x 109 अणुओं (microliter प्रति वेक्टर जीनोम (वी. आर.)) के वांछित एकाग्रता के साथ एक १०० µ एल समाधान प्राप्त करने के लिए ।
        प्लाज्मिड स्टॉक (१०० µ l) = (वांछित एकाग्रता [अणुओं/µ l] x १०० µ l)/प्लाज्मिड अणुओं [अणुओं/µ एल]
    7. प्लाज्मिड शेयर के धारावाहिक कमजोर पड़ने बनाओ (1 x 109 वी. आर./µ एल) triplicates में:
      10 µ l के 1 x 109 वी/µ l प्लाज्मिड स्टॉक + ९० µ एल के एच2ओ = 1 x 108 वी. पी./µ l समाधान
      10 µ l के 1 x 108 वी. ए./µ l कमजोर पड़ने + ९० µ l के ज2ओ = 1 x 107 वी. पी./µ l समाधान
      10 µ l के 1 x 107 वी. आर./µ l कमजोर पड़ने + ९० µ l के एच2ओ = 1 x 106 वी. आर./µ l समाधान
      10 µ l के 1 x 106 वी. आर./µ l कमजोर पड़ने + ९० µ l के एच2ओ = 1 x 105 वी. आर./µ l समाधान
      एक 1x101 वी/µ एल समाधान प्राप्त करने के लिए जारी रखें ।
    8. उंहें qPCR प्लेट (धारा ४.३) पर लोड होने तक बर्फ पर मानक प्लाज्मिड स्टॉक के धारावाहिक कमजोर पड़ने रखें ।
घटक राशि
10x प्रतिबंध एंजाइम बफर 5 µ l
प्रतिबंध एंजाइम 2, 5 µ l
प्लाज्मिड 5 µ g
एच२ओ ५० तक µ l

तालिका 2: प्रतिबंध डाइजेस्ट मिश्रण संरचना ।

तालिका 3: स्टॉक प्लाज्मिड वॉल्यूम कैलक्यूलेटर । कृपया यहां क्लिक करें इस तालिका डाउनलोड करने के लिए ।

  1. AAV वेक्टर से डीएनए निष्कर्षण
    1. मिश्रण 2 µ AAV वेक्टर स्टॉक के एल (३.५ कदम से प्राथमिक अंश) DNase मैं पट्टी ट्यूबों (पीसीआर ट्यूबों में बफर (1x) के १९८ µ एल के साथ) और जोड़ने के 2 µ एल के DNase मैं ।
      नोट: DNase मैं किसी भी आनुवंशिक सामग्री है कि एक सदिश कैप्सिड के अंदर समाहित नहीं है नीचा होगा (जो qPCR परिणाम विकृत) होगा । यह समाधान कमजोर पड़ने के रूप में संदर्भित किया जाता है 'dil1 x 10-2' ।
    2. ३७ डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए मशीन, ९५ डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के बाद ।
      नोट: प्रोटोकॉल इस बिंदु पर रोका जा सकता है और सामग्री 4 डिग्री सेल्सियस पर अनिश्चित काल के लिए संग्रहित किया जा सकता है, उत्पाद गिरावट से बचने के लिए ।
    3. dil1 x 10-2 समाधान (चरण 4.2.1) के लिए proteinase K के 2 µ l जोड़ें और ५० डिग्री सेल्सियस पर ६० मिनट के लिए मशीन, ९५ डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के बाद ।
      नोट: इस कदम AAV वेक्टर कैप्सिड जुदा और समाधान में AAV वेक्टर जीनोम जारी करेंगे । प्रोटीन (कैप्सिड) नमूना की सामग्री ज्ञात नहीं है के रूप में अधिक में proteinase K जोड़ें । ध्यान दें, यह सुनिश्चित करने के लिए आवश्यक है कि सभी proteinase K गतिविधि विकार द्वारा निकाली जाती है, qPCR से पहले, अंतिम परिणाम को प्रभावित करने वाले (आंशिक) पोलीमरेज़ क्षरण के साथ मुद्दों से बचने के लिए.
    4. 1:10 proteinase K इलाज dil1 एक्स 10-2 समाधान (चरण 4.2.3) में १.५ मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूबों के सीरियल कमजोर पड़ने के रूप में तैयार निंनानुसार:
      10 µ l के dil1 x 10-2 + ९० µ l की ज2ओ = dil1 x 10-3 कमजोर पड़ने
      10 µ l के dil1 x 10-3 + ९० µ l की ज2ओ = dil1 x 10-4कमजोर पड़ने
      10 µ l oच dil1 x 10-4 + ९० µ l की ज2o = dil1 x 10-5 कमजोर पड़ने
    5. qPCR प्लेट (धारा ४.३) पर लोड होने तक उन्हें बर्फ पर वेक्टर से निकाले गए डीएनए की सीरियल कमजोरियां रखें ।
  2. अनुमापन द्वारा SYBR ग्रीन डिटेक्शन आधारित qPCR
    1. नमूना और मानकों दोनों के लिए, एक १.५ मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब में qPCR मास्टर मिश्रण तैयार करें । SYBR ग्रीन मास्टर मिक्स, 1 µ एल ऑफ फॉरवर्ड प्राइमरी (10 µ मी स्टॉक), रिवर्स प्राइमरी (10 µ मी स्टॉक) के 1 µ l का उपयोग करें, और 3 µ l के ज2ओ प्रति प्रतिक्रिया के 10 µ l. प्राइमरी जुगाड़ के लिए टेबल 4 में प्रोटोकॉल देखें ।
    2. पिपेट qPCR मास्टर मिश्रण ऊपर और नीचे, लेकिन भंवर नहीं है ।
    3. qPCR मास्टर मिश्रण के 15 µ एल जोड़ें, मानक वक्र के 5 µ एल धारा ४.१ या धारा ४.२ में AAV सदिश से निकाले गए डीएनए के द्वारा पीछा किया, एक अच्छी तरह से । एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में केवल qPCR मास्टर मिश्रण युक्त तीन कुओं को शामिल करें । प्लेट लेआउट के लिए चित्रा 2 का संदर्भ लें ।
    4. एक सील फिल्म के साथ प्लेट सील और संक्षेप में 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 एस के लिए १,५०० x g पर qPCR प्लेट केंद्रापसारक ।
    5. तालिका 5में सुझाए गए शर्तों का उपयोग करते हुए, प्लेट-आधारित रीयल-टाइम पीसीआर प्रवर्धन और डिटेक्शन इंस्ट्रूमेंट पर qPCR रिएक्शन चलाएं ।
प्राइमरी का नाम अनुक्रम
फॉरवर्ड प्राइमर 5 '-CCCACTTGGCAGTACATCAA-3 '
रिवर्स प्राइमर 5 '-GCCAAGTAGGAAAGTCCCAT-3 '

तालिका 4: प्राइमर CBA प्रमोटर के खिलाफ डिजाइन अनुक्रम ।

Figure 2
चित्रा 2: qPCR-आधारित वेक्टर अनुमापन के लिए प्लेट लेआउट । नमूने रंग कोडित रहे हैं: ग्रीन = मानक वक्र; ब्लू = एच2ओ नियंत्रण; धूसर = प्राथमिक अंश; नारंगी = द्वितीयक भिंन । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

चरण समय तापमान चक्र उद्देश्य
पूर्व मशीन 5 min ९५ ° c x1 डीएनए विकार और पोलीमरेज़ सक्रियण (हॉट-स्टार्ट रिएक्शन) ।
प्रवर्धन 10 min ९५ ° c x1 डीएनए के प्रवर्धन । सेटिंग्स अनुकूलित किया जा सकता है अगर अलग एनीलिंग तापमान के साथ वैकल्पिक प्राइमरों का इस्तेमाल कर रहे हैं ।
10 एस ९५ ° c x40
४० s ६० ° c
1 s ७२ ° c
शीतलक 10 एस ४० ° c x1 प्लेट शीतलक । पीसीआर का अंत हो गया ।

तालिका 5: SYBR ग्रीन-आधारित qPCR अनुमापन के लिए थर्मल सायक्लिंग प्रोटोकॉल ।

  1. AAV वेक्टर titer का निर्धारण करने के लिए डेटा विश्लेषण
    1. एक मानक वक्र उत्पंन करने के लिए खंड ४.१ में तैयार मानक नमूने के विभिंन कमजोर पड़ने के लिए प्राप्त सीटी मूल्यों के साथ स्प्रेडशीट डेटा कोशिकाओं (टेबल 6A) भरें ।
      नोट: मानक वक्र के समीकरण (y = एक ln (x) + b) के साथ आर2 दक्षता (तालिका घमण्ड) दिखाया जाएगा । एक qPCR १००% और आर2 करीब १.० (≥ ०.९६) के लिए करीब एक दक्षता होनी चाहिए ।
    2. स्प्रेडशीट (Table 6C) में संगत डेटा कक्षों को भरने के लिए a और b के परिकलित मानों का उपयोग करें ।
    3. खंड ४.२ में तैयार AAV नमूना के विभिन्न कमजोर पड़ने के लिए प्राप्त सीटी मूल्यों के साथ स्प्रेडशीट पूरा करें ।
    4. निम्न सूत्र का उपयोग करके ' प्राथमिक अंश ' के प्रति microliter वेक्टर जीनोम में औसत AAV वेक्टर titer की गणना करें:
      Equation
      नोट: कारक ४०० एकल असहाय जीनोम के लिए प्रयोग किया जाता है, जबकि अनुसूचित जाति के जीनोम २००25का एक गुणा कारक का उपयोग करें । वास्तव में, के रूप में डीएनए मात्रा प्रत्येक qPCR चक्र के दौरान डबल, अनुसूचित जाति डीएनए एक एसएस जीनोम की तुलना में 2x का पता चला है । अनुमापन का उद्देश्य microliter प्रति वेक्टर जीनोम के संदर्भ में एकाग्रता की गणना करने के लिए है । एक सुधार शुरू सामग्री (चरण 4.2.1) के 2 µ एल का उपयोग करते समय qPCR चलाने के लिए आवश्यक है । दिल कदम 4.2.4 से कमजोर पड़ने वाले कारकों का प्रतिनिधित्व करता है । titer ' माध्यमिक ' AAV वेक्टर अंश (चरण ३.६) की गणना एक साथ की जा सकती है ।

तालिका 6: qPCR डेटा विश्लेषण के लिए टेंपलेट । कृपया यहां क्लिक करें इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए ।

5. एसडीएस द्वारा शुद्धता नियंत्रण-पृष्ठ और चांदी धुंधला

नोट: प्रोटोकॉल के इस खंड के प्रदर्शन लगभग 5 एच लेता है ।

  1. उपयोग ७०% (वी/वी) इथेनॉल जैल कास्टिंग के लिए इस्तेमाल कांच प्लेटों को अच्छी तरह से साफ करने के लिए ।
  2. जेल कास्टिंग प्रणाली को इकट्ठा । सुनिश्चित करें कि ग्लास प्लेटों के नीचे से छिल नहीं कर रहे हैं, acrylamide मिश्रण के रिसाव को रोकने के लिए जब जेल कास्टिंग ।
  3. स्टैकिंग और दो अलग ५० मिलीलीटर शंकु ट्यूबों में संपति जेल समाधान तैयार करें । tetramethylethylenediamine (TEMED) और 10% (डब्ल्यू/वी) अमोनियम persulfate (एपीएस), के रूप में वे जेल के बहुलकीकरण के लिए जिंमेदार है चूकना । जेल कास्टिंग से पहले उन्हें तुरंत जोड़ें ।
    नोट: जेल में acrylamide के अंतिम प्रतिशत प्रोटीन की जुदाई प्रोफ़ाइल को प्रभावित करता है: आम तौर पर, एक 10% (v/v) acrylamide की अंतिम एकाग्रता एक AAV वेक्टर तैयारी की शुद्धता का परीक्षण करने के लिए पर्याप्त होगा ।
  4. जेल घटकों युक्त ट्यूब घूमता द्वारा धीरे से मिश्रण । भंवर मत करो, के बाद से अत्यधिक ऑक्सीजन बहुलकीकरण ख़राब कर सकते हैं ।
  5. TEMED और 10% (w/v) अनुप को संपति जेल समाधान में जोड़ें । मिश्रण और फिर जेल धारक में डालना जब तक यह छोटे गिलास प्लेट के ऊपर से नीचे 1-2 सेमी तक पहुंचता है ।
  6. acrylamide मिश्रण के शीर्ष पर पानी-संतृप्त ब्यूटानॉल की एक परत लगाएं । यह बहुलकीकरण के दौरान एक सपाट सतह के गठन को सुनिश्चित करेगा । इस जेल निर्जलीकरण और अपने समारोह ख़राब होगा के रूप में अधिक से अधिक 30 मिनट के लिए शराब के तहत जेल मत छोड़ो ।
    सावधानी: ब्यूटानॉल त्वचा संपर्क के मामले में खतरनाक है । यह भी आग जोखिम प्रस्तुत करता है । देखभाल के साथ संभाल ।
  7. polymerize करने के लिए जेल के लिए रुको और फिर ब्यूटानॉल बंद डालो । सुझाव: ट्यूब में अतिरिक्त जेल मिश्रण जम गया है कि क्या देखने के लिए जाँच करें. बहुलकीकरण से कम 20 मिनट में होता है । एच2ओ के साथ जेल की सतह धो और फिर यह कागज तौलिए का उपयोग कर सूखी, देखभाल लेने के लिए जेल की सतह परेशान नहीं ।
  8. स्टैकिंग जेल के लिए TEMED और 10% (w/v) एपीएस जोड़ें और जेल धारक को अलग जेल में डाल दिया ।
  9. दी गई कंघी को जेल में रखें । एक स्थिर आंदोलन के साथ इस कार्रवाई करने के लिए कुओं के अंदर हवा के बुलबुले के गठन से बचने के लिए ।
  10. polymerize करने के लिए जेल के लिए ंयूनतम 20 मिनट के लिए रुको । सुझाव: अगर शंकु ट्यूब में अतिरिक्त जेल मिश्रण जम गया है की जाँच करें ।
  11. दोनों प्राथमिक और माध्यमिक AAV वेक्टर अंशों (चरण ३.५ और ३.६, क्रमशः) के लिए दो घोला जा सकता है (तालिका 7) तैयार करें ।
उच्च राशि कम राशि
AAV वेक्टर स्टॉक 5 µ l 1 µ l
5x नमूना बफर 3 µ l 3 µ l
एच२ओ 7 µ l 11 µ l

तालिका 7: नमूना के संयोजन चांदी धुंधला के लिए आवश्यक घोला जा सकता है ।

  1. पूरी तरह से प्रकृति ९५ डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए उन्हें हीटिंग से नमूना घोला जा सकता है । ट्रो टैंक इकट्ठा, इलेक्ट्रोड अभिविन्यास के लिए ध्यान दे.
  2. बाहर इलेक्ट्रोड विधानसभा और 1x anode बफर के अंदर पर 1x कैथोड बफर के साथ टैंक भरें ।
    नोट: Anode बफ़र रन-टू-रन से रिसायकल किया जा सकता है । ताजा कैथोड बफर हमेशा इस्तेमाल किया जाना चाहिए ।
  3. जेल से कंघी निकालें और 1x कैथोड बफर के साथ जेल के कुओं को साफ ।
  4. एक अच्छी तरह से में प्रोटीन सीढ़ी के 1 µ एल लोड । एक ही जेल (चित्रा 3) पर विभिन्न कुओं में नमूना घोला जा सकता है लोड । ५० वी पर जेल भागो जब तक नमूने संपति जेल में प्रवेश । तो १०० वी करने के लिए वोल्टेज बढ़ाने डाई सामने जेल की निचली सीमा तक पहुंचता है ।
  5. जेल ध्यान से गिलास प्लेटों से निकालें और चांदी धुंधला किट का उपयोग करें (निर्माता के निर्देशों के अनुसार26) वायरल प्रोटीन कल्पना करने के लिए (VP1, VP2, और VP3 उपइकाईयों) कि AAV कैप्सिड शामिल है, साथ ही साथ के लिए जांच संभव प्रोटीन संदूषण (चित्रा 3) ।

Figure 3
चित्रा 3: वेक्टर शुद्धता का मूल्यांकन एसडीएस का उपयोग-पृष्ठ और चांदी धुंधला । एक Tricine-एसडीएस जेल का प्रयोग, विभिंन वेक्टर तैयारी के 5 µ एल अलग थे । प्रोटीन बाद में चांदी के दाग से पता चला रहे थे । वैक्टर शुद्ध माना जाता है जब VP1 (८२ केडीए), VP2 (६७ केडीए), और VP3 (६० केडीए) एक 1:1:10 अनुपात (लेन 1) में दिख रहे हैं, बिना अत्यधिक पृष्ठभूमि (लेन 2) या गैर विशिष्ट बैंड (लेन 3). कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Representative Results

AAV9, हाल ही में जब तक माना जाता था, BBB और transducing कोशिकाओं सीएनएस के पार करने में सबसे प्रभावी AAV वेक्टर सीरोटाइप, परिधीय प्रशासन के बाद । कैप्सिड डिजाइन में एक महत्वपूर्ण अग्रिम प्राप्त किया गया था जब Deverman एट अल । एक कैप्सिड चयन विधि के उपयोग की सूचना Cre पुनर्संयोजन आधारित AAV-लक्षित विकास (बनाने)17। इस विधि का प्रयोग, वे एक नया कैप्सिड, PHP नाम की पहचान की । बी, जो वे कई सीएनएस क्षेत्रों में astrocytes और न्यूरॉन्स के बहुमत transduce करने में सक्षम के रूप में रिपोर्ट, प्रणालीगत इंजेक्शन17के बाद. इस बिंदु पर, यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि भले ही PHP । बी C57/Bl6 चूहों में सकारात्मक परिणाम प्रदान करता है (जो प्रारंभिक अलगाव प्रयोगों में इस्तेमाल किया तनाव था), प्रारंभिक रिपोर्टों के सुझाव अपनी कार्यकुशलता एक तनाव पर निर्भर तरीके से भिंन हो सकते हैं । इसके अलावा प्रयोगों होगा, कोई संदेह नहीं है, इस मुद्दे पर अधिक प्रकाश डाला31.

हालांकि, इन मुद्दों के बावजूद, PHP । बी चूहों के सीएनएस में इनवेसिव जीन हेरफेर के लिए रोमांचक संभावनाएं प्रदान करता है, सबूत की अवधारणा रोग मॉडल में जीन चिकित्सा प्रयोगों सहित । जैसे, हम PHP का उपयोग कर transgene अभिव्यक्ति की दक्षता का मूल्यांकन करने के लिए चुना है । बी बनाम AAV9 है, जो ' सोने की गई है ' मानक transduction सीएनएस के लिए सदिश के बाद से २००९2परिधीय प्रशासन के बाद । दोनों serotypes की एक सीधी तुलना करने के लिए, transgene अभिव्यक्ति के लिए इष्टतम शर्तों के तहत, हम एक अनुसूचित जाति जीनोम विंयास३२का इस्तेमाल किया । दोनों वैक्टर transgene ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFP) के लिए सर्वव्यापी चिकन β-actin (CBA) प्रवर्तक के नियंत्रण में किया जाता है । Female C57/Bl6 चूहों पर जन्मोत्तर दिवस ४२ (वजन में लगभग 20 ग्राम) 1 x 10 की एक खुराक प्राप्त की या तो scAAV2/PHP के माउस प्रति12 वी. पी । B-CBA-GFP or scAAV2/9-CBA-GFP. वेक्टर प्रशासन पूंछ नस इंजेक्शन के माध्यम से किया गया था । इस प्रयोग को केयू Leuven की नैतिक समिति ने मंजूरी दी थी ।

तीन सप्ताह postinjection, चूहों बर्फ ठंडा पंजाबियों के साथ transcardial छिड़काव, 4% (डब्ल्यू/वी) बर्फ ठंडा paraformaldehyde (पीएफए) के बाद से गुजरा । उनके दिमाग और काटा गया था एक ही निर्धारण में एक रात की गर्मी से आगे postfixation, ०.०१% (डब्ल्यू/वी) Na-azide के लिए स्थानांतरित करने से पहले और आगे विश्लेषण तक भंडारण के लिए/ इसके बाद, दिमाग एक हिल microtome का उपयोग कर खोदी गई, और immunohistochemistry ५० µm मोटी वर्गों पर प्रदर्शन किया गया ।

transgene अभिव्यक्ति के स्तर का मूल्यांकन करने के लिए, वर्गों GFP (खरगोश विरोधी GFP) के खिलाफ प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ दाग रहे थे, एक फ्लोरोसेंट डाई (विरोधी खरगोश Alexa Fluor ४८८) के लिए माध्यमिक एंटीबॉडी संयुग्मित का उपयोग कर पता लगाने के साथ (4a, बी चित्र ). प्रतिदीप्ति तीव्रता माप (मनमाना इकाइयों में [au]) GFP अभिव्यक्ति में एक महत्वपूर्ण वृद्धि की पुष्टि की जब एक अनुसूचित जाति जीनोम और PHP । बी कैप्सिड AAV9 के रिश्तेदार थे । GFP में वृद्धि मस्तिष्क में मनाया गया (२१०५ ± १६१ बनाम १४४१ ± ९९ au; p = ०.००३२), सेरिबैलम (२६०१ ± १९६ बनाम १७३७ ± १३५ au; p = ०.००३२), और brainstem (३०८२ ± ३१९ बनाम २४८५ ± ८८ au; p = ०.००३८) (figure 4c).

Figure 4
चित्रा 4: scAAV2/PHP के प्रणालीगत वितरण । बी-CBA-GFP सीएनएस में एक उच्च GFP अभिव्यक्ति की ओर जाता है । scAAV2/PHP । बी-CBA-GFP या scAAV2/9-CBA-GFP (1 x 1012 वी. पी./माउस) पूंछ नस इंजेक्शन के माध्यम से 6 सप्ताह की उंर C57/Bl6 चूहों के लिए प्रशासित किया गया था । GFP कोरोनरी मस्तिष्क वर्गों पर immunohistochemistry का उपयोग कर पाया गया था 3 सप्ताह postinjection. (क) मस्तिष्क और (ख) सेरिबैलम और brainstem को दिखाया गया है । स्केल पट्टियां = 1 मिमी. (ग) ठहराव के सापेक्ष प्रतिदीप्ति तीव्रता के स्तर का निर्धारण करने के लिए किया गया था GFP संकेत प्रत्येक सदिश के साथ प्राप्त (10 वर्गों के प्रति माउस; तीन चूहों प्रति वेक्टर समूह) । एक-तरफ़ा ANOVA परीक्षण किया गया था, जिसके बाद एक दो पूंछ वाले छात्र का टी-टेस्ट हुआ; डेटा अर्थ ± मानक विचलन के रूप में व्यक्त कर रहे हैं; * *p < ०.०१; Au. मनमानी इकाइयां । pCapsid, AAV वेक्टर उत्पादन के लिए इस्तेमाल किया, 2 सीरोटाइप से जीन प्रतिनिधि और सीरोटाइप PHP से जीन टोपी शामिल हैं । बी या AAV9, तदनुसार । यह आंकड़ा Rincon एट अल.३२से संशोधित किया गया है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Discussion

रिकॉमबिनेंट AAV वैक्टर का उत्पादन यहां वर्णित सामग्री और सबसे आणविक जीवविज्ञान प्रयोगशालाओं और सेल संस्कृति सुविधाओं के लिए आम उपकरण का उपयोग करता है । यह उपयोगकर्ता शुद्ध प्राप्त करने के लिए अनुमति देता है, नैदानिक ग्रेड AAV वैक्टर कि इन विट्रो में और vivo अनुप्रयोगों में की एक श्रृंखला में एकाधिक सेल और ऊतक प्रकार के लक्ष्य के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । इस प्रोटोकॉल का सबसे बड़ा लाभ में से एक, दूसरों की तुलना में (यानी, CsCl आधारित शुद्धि), कम काम समय की जरूरत है । तैयार करने के लिए उपयोग AAV वैक्टर HEK293T कोशिकाओं के प्रारंभिक अभिकर्मक के बाद 6 कार्य दिवसों की एक अधिकतम में प्राप्य हैं ।

कई कारकों नकारात्मक अंतिम उपज या AAV वेक्टर की गुणवत्ता को प्रभावित कर सकते हैं । गरीब अभिकर्मक दक्षता एक कम वायरल उपज३३के लिए मुख्य कारणों में से एक है । एक प्रमुख सिफारिश HEK293T कोशिकाओं है कि 20 से अधिक बार नहीं किया गया है और एक सेल संगम अभिकर्मक21के समय ९०% से अधिक नहीं है का उपयोग है । इसके अलावा, अभिकर्मक विधि चयनित परिणामों पर एक बड़ा प्रभाव पड़ता है । यह प्रोटोकॉल बेई के उपयोग पर आधारित है । पी बेई और न्यूक्लिक एसिड के परिसरों की पीढ़ी के माध्यम से सेल नाभिक को exogenous डीएनए देने की क्षमता के साथ एक cationic बहुलक है, polyplexes, जो सेल द्वारा उठाए गए है और endosomes३४के माध्यम से अवैध रूप से जाना जाता है के रूप में जाना जाता है । पी-आधारित अभिकर्मक आसान और तेजी से प्रदर्शन करने के लिए है, इसके विपरीत में अन्य व्यापक रूप से इस्तेमाल किया तरीकों, जैसे कैल्शियम फॉस्फेट३५के साथ सह डीएनए की वर्षा के रूप में. इसके अलावा, पी आधारित अभिकर्मक बहुत सस्ता है जब अंय नए शुरू तरीकों की तुलना में ऐसे cationic लिपिड और चुंबक के उपयोग के रूप में, अभिकर्मक३६मध्यस्थता ।

शुद्धिकरण रणनीति प्रोटोकॉल में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है । अंय तरीकों की तुलना में, iodixanol आधारित शुद्धि के लिए खाली वायरल कणों का एक उच्च प्रतिशत शामिल करते है (20%)20। यह ऑफसेट है, एक हद तक, तथ्य यह है कि iodixanol आधारित शुद्धि नियमित रूप से एक कण के साथ AAV सदिश की तैयारी में परिणाम-से कम १०० के अनुपात infectivity । यह पारंपरिक CsCl-आधारित प्रक्रियाओं की तुलना में एक महत्वपूर्ण सुधार का प्रतिनिधित्व करता है, जिसके लिए कण infectivity की पर्याप्त हानि३७की सूचना दी है । एक अंय आम वैकल्पिक विधि AAV वैक्टर शुद्ध करने के लिए क्रोमैटोग्राफी आधारित शुद्धि है । हालांकि, इस विधि प्रमुख दोष है कि एक विशिष्ट कॉलम प्रत्येक वेक्टर कैप्सिड इस्तेमाल के लिए आवश्यक है: उदाहरण के लिए, जबकि AAV2 प्रतिष्ठित हेपरिन कॉलम का उपयोग कर अलग है, इस पद्धति AAV4 और AAV5, जो हेपरिन-बाध्यकारी अधिकारी के साथ काम नहीं करता है उनके capsids३८पर साइटें । यह देखते हुए कि क्रोमैटोग्राफी शुद्धि भी महंगा है, iodixanol आधारित शुद्धि आम तौर पर एक छोटे पैमाने३३,३९पर AAV वैक्टर के उच्च गुणवत्ता बैचों का उत्पादन करने के लिए इच्छा है कि प्रयोगशालाओं के लिए अधिक उपयुक्त है, ४०. हालांकि, अंतिम उपज और सदिश की शुद्धता को अधिकतम करने के लिए, चरम देखभाल की जरूरत है जब iodixanol ढाल बनाते हैं । विभिंन iodixanol भिन्न ultracentrifugation ट्यूब करने के लिए स्थानांतरित किया जाना चाहिए एक बाँझ पाश्चर पिपेट जिसका टिप ट्यूब की दीवार को छू रहा है का उपयोग कर: iodixanol धीरे और लगातार पिपेट से निष्कासित कर दिया जाना चाहिए. के रूप में वेक्टर कणों ४०% iodixanol परत में जमा, देखभाल के लिए सुनिश्चित करें कि ढाल इंटरफेस20मिश्रण नहीं है लिया जाना चाहिए । अंत में, सदिश युक्त अंश 20 ग्राम से अधिक नहीं गेज के साथ एक स्टेनलेस स्टील कुंद सुई के सम्मिलन से पुनर्प्राप्त किया जाना चाहिए वेक्टर वसूली को अधिकतम करने के लिए, स्पष्ट अंश अपनी संपूर्णता में प्राप्त किया जाना चाहिए । इस चरण के दौरान, समय महत्वपूर्ण है । तैयारी की पवित्रता समझौता से बचने के लिए, यह आवश्यक है कि संकलन को रोकने के लिए अंय (दूषित) ढाल के चरणों से पहले एकत्र कर रहे हैं ।

प्राप्त वेक्टर titer में अंतर भी वेक्टर के डिब्बाबंद कणों का उत्पादन करने के लिए आंतरिक क्षमता के लिए जिंमेदार ठहराया जा सकता है । विभिंन AAV serotypes के बीच एक तुलना पता चला है कि कुछ AAV वैक्टर अधिक दूसरों की तुलना में एक उच्च titer में उत्पादन मुश्किल है (जैसे, AAV2)४१। वेक्टर की वर्षण के दौरान, एक कम titer के लिए एक संभावित कारण हो सकता है और आसानी से३३एकाग्रता से परहेज द्वारा रोका । इसके अलावा, यह भी संभव है कि iodixanol ढाल आधारित शुद्धि की दक्षता थोड़ा serotypes के बीच अलग है और इसलिए, अलग serotypes के साथ प्राप्त titer में विसंगतियों४१मनाया जा सकता है ।

अंत में, यह कहा जा करने की जरूरत है कि भले ही qPCR डीएनए के लिए एक बहुत ही सटीक तरीका है ठहराव तकनीक में कुछ निहित परिवर्तनशीलता मनाया जा सकता है । अनुमापन में सटीकता मुख्य रूप से सटीक pipetting और सभी समाधानों के उचित भंवर पर निर्भर करता है । सबसे सटीक titer पढ़ने की गारंटी के लिए, qPCR स्वतंत्र रूप से दोहराया जा सकता है, और प्राप्त मूल्यों औसत । इस प्रोटोकॉल में प्रस्तुत प्राइमरों का चुनाव हमारी प्रयोगशाला में प्रयुक्त pTransgene प्लाज्मिड में स्थित CBA प्रवर्तक के अनुक्रम पर आधारित है. CBA प्रमोटर एक मजबूत सिंथेटिक प्रमोटर है कि व्यापक रूप से वेक्टर क्षेत्र में प्रयोग किया जाता है एकाधिक सेल प्रकार के पार अभिव्यक्ति ड्राइव है । यह cytomegalovirus (सीएमवी) जल्दी बढ़ाने तत्व सहित कई तत्वों, शामिल हैं; प्रवर्तक, प्रथम एक्सॉन, और CBA जीन के प्रथम intron; और खरगोश β-ग्लोबिन जीन का ब्याह स्वीकार । हालांकि, प्राइमर वस्तुतः किसी भी अभिव्यक्ति कैसेट (प्रमोटर, transgene, और विनियामक तत्वों सहित) के भीतर स्थित तत्व के लिए डिजाइन किया जा सकता है । बैचों भर में titer की तुलना भी संभव है, प्राइमरों के लिए आम क्षेत्रों के खिलाफ इस्तेमाल किया जाता है सवाल में वैक्टर ।

अंत में, इस प्रोटोकॉल के लिए capsids, जीनोम विंयास, प्रमोटर प्रकार और transgene कार्गो की एक किस्म के साथ AAV वैक्टर उत्पादन किया जा सकता है । यह उपयोगकर्ताओं को आसानी से अपने वैक्टर के अंतिम विशेषताओं के अनुकूलन के लिए सबसे अच्छा प्रयोगात्मक आवश्यकताओं के अनुरूप करने की अनुमति देगा । प्रतिनिधि परिणामों में प्रस्तुत उदाहरण में, PHP का उपयोग करें । बी कैप्सिड, जो कुशलतापूर्वक BBB पार, सीएनएस में अत्यधिक कुशल जीन अभिव्यक्ति दी, निंनलिखित पूंछ नस इंजेक्शन३२। सीएनएस व्याप्ति वैक्टर के प्रणालीगत प्रशासन संभव पक्ष प्रभाव2,17,३२के मामले में काफी लाभ है । परिधीय इंजेक्शन के लिए एक संभव विकल्प है, जबकि आक्रामक तकनीक की निरंतर परहेज, intrathecal वितरण है, जो मस्तिष्कमेरु द्रव में AAV वेक्टर के वितरण के होते हैं । इस वितरण मार्ग को प्रभावी, सीएनएस भर में transgene की व्यापक अभिव्यक्ति दिखा साबित हो रहा है, कम से परिधीय अंगों में लक्ष्य प्रभाव, और प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया४२के निंन स्तर । वे पूंछ नस इंजेक्शन की तुलना में उच्च तकनीकी कौशल की आवश्यकता के रूप में हालांकि, intrathecal इंजेक्शन, बहुत अधिक चुनौतीपूर्ण हैं ।

इसके अलावा कैप्सिड विकास इस प्रौद्योगिकी को परिष्कृत करने के लिए जीन थेरेपी अनुप्रयोगों में AAV वेक्टर उपयोग के लिए अवसरों के द्वारा संचालित किया जाएगा । इस तरह के दृष्टिकोण पेशीशोषी पार्श्व स्केलेरोसिस, Charcot-Marie-टूथ रोग, पार्किंसंस और अल्जाइमर रोग18के रूप में वर्तमान में लाइलाज सीएनएस विकारों के इलाज के लिए आकर्षक संभावनाएं प्रदान करते हैं ।

Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

यूननट एक शौकीनों voor Wetenschappelijk Onderzoek Vlaanderen (FWO) postdoctoral फैलोशिप (133722/1204517N) द्वारा समर्थित है और Fundación हृदय डे कोलंबिया और विज्ञान के प्रशासनिक विभाग के सतत समर्थन स्वीकार करता है, प्रौद्योगिकी और नवाचार (अनुदान सीटी-FP44842-307-2016, परियोजना कोड ६५६६७१२५०४८५). M.M. an FWO डॉक्टरेट फैलोशिप (1S48018N) द्वारा समर्थित है । M.G.H. एक VIB संस्थागत अनुदान और थियरी Latran फाउंडेशन (वतन वीआईपी), अल्जाइमर अनुसंधान (साओ-एफआरए) (पी # 14006), FWO (अनुदान 1513616N), और यूरोपीय अनुसंधान परिषद (ईआरसी) के लिए फाउंडेशन से बाहरी समर्थन द्वारा समर्थित था (शुरू अनुदान २८१९६१-AstroFunc; अवधारणा अनुदान ७१३७५५-विज्ञापन-वीआईपी) का सबूत । लेखक माउस पशुपालन के साथ उनकी मदद के लिए Jeason Haughton स्वीकार करते हैं, उसे पूंछ नस इंजेक्शन प्रदर्शन करने में मदद के लिए स्टेफ़नी Castaldo, और Eykens transfected कोशिकाओं की छवियों को प्रदान करने के लिए कैरोलीन HEK293T । M.G.H. माइकल डनलप, पीटर Hickman, और डीन हैरिसन स्वीकार करता है ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Plasmid production
pTransgene plasmid De novo design or obtained from a plasmid repository N/A See step 1 of main protocol for further details
pCapsid De novo design or obtained from a plasmid repository N/A See step 1 of main protocol for further details
pHelper Agilent 240071
Plasmid Plus maxi kit Qiagen 12963
QIAquick PCR purification Kit Qiagen 28104
AAV Helper-Free System Agilent 240071
Cell culture and transfection
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM), high glucose, no glutamine Life technologies 11960-044 Supplement DMEM with FBS (1% or 10% v/v) and GlutaMAX 200 mM (1% v/v) then filter sterilize the medium using a 0.22 µm filter
Fetal bovine serum (FBS) GIBCO 10500-064
GlutaMAX supplement GIBCO 35050038
(200 mM)
Corning bottle-top vacuum filter system Sigma-Aldrich CLS430769
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (DPBS) with no calcium and no magnesium GIBCO 14190094
HEK293T cells American Tissue Culture Collection CRL3216 Upon receipt, thaw the cells and culture as described in the protocol. After a minimal number of passages, freeze a subfraction for future in aliquots. Always use cells below passage number 20. Once cultured cells have been passaged more than 20 times, restart a culture from the stored aliquots
Cell culture dishes Greiner Cellstar 639160 15 cm diameter culture dishes
Cell scrapers VWR 10062-904
Polyethylenimine (PEI) Polyscience 23966-2 PEI in powder form is dissolved at 1 µg/µL in deionized water (ddwater) at pH=2 (use HCl). Prepare in a beaker and stir for 2-3 h. When dissolved, bring the pH back to 7 with NaOH. Filter sterilize and store the resuspended stock solution in 1 ml aliquots at -20 °C. PEI aliquots can be freeze/thawed multiple times.
Virkon solution Fisher Scientific NC9821357 Disinfect any material that has been in contact with assembled vector particles with Virkon solution
Mutexi long-sleeve aprons Fisher Scientific 11735423 Wear an apron over the top of a regular lab coat
Fisherbrand maximum protection disposable overshoes Fisher Scientific 15401952
AAV Purification and desalting
Optiprep density gradient medium Sigma-Aldrich D1556 Optiprep is a 60% (w/v) solution of iodixanol in water (sterile). CAUTION. Use under a laminar flow hood. Wear gloves
Phenol red Sigma-Aldrich P0290 CAUTION. Use under a laminar flow hood
Pasteur pipette Sigma-Aldrich Z627992 Sterilize before use
OptiSeal Polypropylene tubes Beckman 361625
Benzonase (250 U/µL) Sigma-Aldrich E1014 Supplied as a ready-to-use solution
Acrodisc syringe filter Pall corporation 4614
Omnifix syringe (5 mL) Braun 4617053V
Blunt syringe needle Sigma Aldrich Z261378 Stainless steel 316 syringe needle, pipetting blunt 90° tip gauge 16, L 4 in. Referred to in the text as a blunt-end needle
Aqua Ecotainer B. Braun 0082479E Sterile endotoxin-free water. Referred to as 'Ultrapure water'
Amicon ultra-15 centrifugal filter unit Millipore UFC910024 These filters concentrate the final product by collecting the vector particles in consecutive centrifugation steps
Pluronic F68 (100x) Thermo Fisher 24040032 Non-ionic surfactant. Dilute in sterile PBS to use at 0.01% (v/v)
Fisherbrand Sterile Microcentrifuge Tubes with Screw Caps (2 mL) Fisher Scientific 02-681-374 Use skirted tubes for easy handling
AAV Titration
Restriction enzyme: StuI (10 U/µL) Promega R6421
DNAse I (1 U/µL) Fisher Scientific EN0521
Proteinase K Sigma-Aldrich 3115852001 Reconstitute in ultrapure water and use at a final concentration of 10 mg/mL. Solution can be stored at -20 °C
EasyStrip Plus Tube Strips (with attached caps) Fisher Scientific AB2000
Eppendorf microtube 3810x Sigma-Aldrich Z606340-1000EA
LightCycler 480 SYBR Green I Master Mix Roche 4707516001
LightCycler Multiwell Plates, 96 wells Roche 4729692001 White polypropylene plate (with unique identifying barcode)
Microseal 'A' PCR plate and PCR Plate Sealing Film Bio-Rad msa5001
AAV Purity control
Ammonium persulfate (APS) Sigma-Aldrich A3678 Reconstitute in ultrapure water to 10% (v/v). CAUTION. Use under a laminar flow hood. Wear gloves
Tetramethylethylenediamine (TEMED) Sigma-Aldrich T9281 CAUTION. Use under a laminar flow hood. Wear gloves
Tris Base ULTROL Grade Merck 648311 CAUTION: Use under a laminar flow hood. Wear gloves
UltraPure Agarose Thermo Fisher 16500-500
Rotiphorese® Gel 30 (37,5:1) Carl Roth 3029.3 Aqueous 30% acrylamide and bisacrylamide stock solution at a ratio of 37.5:1. CAUTION: Use under a laminar flow hood. Wear gloves
Serva Blue G Sigma-Aldrich 6104-58-1
Precision Plus prestained marker Bio-Rad 1610374edu
1-Butanol Sigma-Aldrich B7906 CAUTION: Use under a laminar flow hood. Wear gloves
Immunohistochemistry
Rabbit anti-GFP Synaptic Systems 132002 1:300 dilution
Anti-rabbit Alexa Fluor 488 Invitrogen A21206 1:1,000 dilution
Equipment Company Catalog number Comments
Vector production lab
Rotina 380 bench-top centrifuge * Hettich 1701
Optima XPN 80 ultracentrifuge * Beckmann Coulter A95765
Type 50.2 Ti fixed-angle titanium rotor * Beckmann Coulter 337901
Entris digital scale * Sartorius 2202-1S
Warm water bath * Set at 37 °C
Ice bucket * VWR 10146-290 Keep material used in the vector production lab separate from that used in standard lab areas
Pipetboy pro * Integra 156,400
Graduated pipettes: Cell star * Greiner bio-one 606180 Capacity of 5 mL
Graduated pipettes: Cell star * Greiner bio-one 607180 Capacity of 10 mL
Graduated pipettes: Cell star * Greiner bio-one 760180 Capacity of 25 mL
CO2 incubator CB150 * Binder 9040-0038 Set at 37 °C, 5% CO2 and 95% humidity
Nuaire safety cabinet NU 437-400E * Labexchange 31324 Clean all the surfaces with 70% ethanol and Virkon before and after use
Conventional lab
T100 thermal cycler * Bio-Rad 1861096
LightCycler 480 Instrument II * Roche 5015278001
ThermoMixer * Eppendorf C 5382000015
Nanodrop * ThermoFisher Scientific ND 2000
Mini-Protean Tetra Cell* Bio-Rad 1658001FC For use with handmade or precast gels
ProteoSilver silver stain kit Sigma-Aldrich PROTSIL1 High sensitivity protein detection with low background
Centrifuge 5804 R * Eppendorf B1_022628045 High speed centrifuge for medium capacity needs (up to 250 mL)
Graduated pipettes Cell star * Greiner bio-one 606180 5 mL
Graduated pipettes Cell star * Greiner bio-one 607180 25 mL
Graduated pipettes Cell star * Greiner bio-one 760180 25 mL
Filter tips * Greiner bio-one 750257 1250 µL
Filter tips * Greiner bio-one 738257 300 µL
Filter tips * Greiner bio-one 771257 10 µL
Ice bucket with lid * VWR 10146-290
Mini diaphragm vacuum pump, VP 86 * VWR 181-0065
Pipetman P2 Gilson F144801
Pipetman P20 Gilson F123600
Pipetman P100 Gilson F123615
Pipetman P200 Gilson F123601
Pipetman P1000 Gilson F123602
* Materials marked with an asterisk are expensive pieces of equipment and are usually central infrastructure items shared between multiple labs. These items can also be replaced by equivalents if available. Note, when a different ultracentrifuge is used, care must be taken to select the correct rotor and centrifuge tubes.

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References

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तंत्रिका विज्ञान १४३ अंक Adeno-एसोसिएटेड वायरस (AAV) आधारित वैक्टर iodixanol ढाल जीन वितरण केंद्रीय तंत्रिका तंत्र रक्त मस्तिष्क बाधा PHP । B कैप्सिड
Adeno-जुड़े वायरस आधारित वैक्टर के लिए उत्पादन, शुद्धिकरण, और गुणवत्ता नियंत्रण
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Fripont, S., Marneffe, C., Marino, M., Rincon, M. Y., Holt, M. G. Production, Purification, and Quality Control for Adeno-associated Virus-based Vectors. J. Vis. Exp. (143), e58960, doi:10.3791/58960 (2019).

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