Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Produktion, oprensning og kvalitetskontrol for Adeno-associeret Virus-baseret vektorer

Published: January 29, 2019 doi: 10.3791/58960
Automatic Translation
*1,2, *1,2, *1,2, 1,2, 1,2,3
1VIB-KU Leuven Center for Brain and Disease Research, 2Department of Neuroscience, KU Leuven, 3Leuven Brain Institute
* These authors contributed equally

Summary

Her, beskriver vi en strategi for effektiv og reproducerbar til at producere, titer og kvalitetskontrol partier af adeno-associeret virus vektorer. Det giver brugeren mulighed for opnå en vektor forberedelse med høj titer (≥ 1 x 1013 vektor genomer/mL) og en høj renhed, klar til in vitro- brug eller i vivo .

Abstract

Gen leveringsværktøjer baseret på adeno-associeret virus (AAVs) er et populært valg for levering af transgener til centralnervesystemet (CNS), herunder gen terapi programmer. AAV vektorer er ikke-replikering, kan inficere både delende og ikke-dividere celler og yde langsigtet transgen udtryk. Vigtigere, nogle serotyper, som den nyligt beskrevne PHP. B, kan krydse blod-hjerne-barrieren (BBB) i dyremodeller, efter systemisk levering. AAV vektorer kan fremstilles effektivt i laboratoriet. Robust og reproducerbare protokoller er dog forpligtet til at indhente AAV vektorer med tilstrækkelig renhed niveauer og titer værdier højt nok til i vivo applikationer. Denne protokol beskriver en effektiv og reproducerbare strategi for AAV vektor produktion, baseret på en iodixanol gradient rensning strategi. Metoden iodixanol rensning er velegnede til at opnå partier af høj-titer AAV vektorer af høj renhed, sammenlignet med andre metoder, rensning. Protokollen er desuden generelt hurtigere end andre i øjeblikket beskrevne metoder. Derudover en kvantitativ polymerase kæde reaktion (qPCR)-baseret strategi er beskrevet for en hurtig og præcis bestemmelse af vektor titer, samt en sølvfarvning metode til at bestemme renheden af vektor batch. Endelig, repræsentative resultater af genet levering til CNS, efter systemisk indgift af AAV-PHP. B, præsenteres. Sådanne resultater bør være muligt i alle laboratorier ved hjælp af de protokoller, der er beskrevet i denne artikel.

Introduction

I de sidste 30 år, er wild-type AAVs blevet manipuleret til at oprette rekombinant AAV vektorer, som har vist sig for at være usædvanligt nyttige værktøjer til genoverførsel i CNS1,2,3,4, 5,6 og gen terapi tilgange til sygdom (herunder godkendt af FDA og EMA terapier)4,7. Deres egnethed til brug i CNS stammer i vid udstrækning fra deres evne til at inficere ikke dividere, post mitotiske celler, der typisk findes i CNS8. Men AAV-baserede vektorer har også fordelen, at en langsigtet udtryk for enhver given terapeutiske transgen4,9 mens fremkalde en mildere immunrespons i forhold til andre virale vektorer7, 8,10,11,12.

De vigtigste elementer i enhver AAV vektor er genomet og kapsid. Wild-type AAVs er enkeltstrenget (ss) DNA virus med en genom ca 5 kilobases (kb)13. For produktion af rekombinant AAV vektorer, rep og cap gener (nødvendigt for genom replikering og samling af viral kapsid) er slettet fra genomet af vildtype AAV og leveres i trans, forlader plads til en udtrykket kassette indeholdende transgen14,15. De inverted terminal gentagne sekvenser (ITRs) af den oprindelige virale genom er de eneste opbevarede elementer i en AAV vektor, da disse er afgørende for replikation og pakning3,10,14. AAV vektorer kan være udviklet til at forbedre transgen udtryk; en mutation i et af ITRs fører til dannelsen af en hårnål loop, der effektivt gør det muligt for generation af en supplerende DNA strand3,7,15. Den største fordel ved denne konfiguration, kaldes en selv-supplerende (sc) genom, er, at det omgår behovet for anden-strand syntese typisk i AAVs, betydeligt øge hastighed og niveauer af transgenet udtryk konventionelle livscyklus 1. ikke desto mindre, ved hjælp af en scAAV genom reducerer lasteevne vektorens til ca. 2,4 kb. Dette omfatter transgen sekvenser, samt eventuelle lovgivningsmæssige sekvenser som projektledere eller mikroRNA-bindingssteder, at begrænse udtryk til specifikke celle typer16.

AAV kapsid bestemmer vektor-vært celle interaktion og giver en grad af celle type eller væv tropisme for en AAV serotype, som også kan udnyttes til at begrænse transgen udtryk til bestemte steder. Flere AAV serotyper findes i naturen, mens andre har været produceret i laboratorier gennem rekombinant fremgangsmåder (dvs. PHP. B). Derudover nogle capsids også skænke andre nyttige egenskaber, såsom evne til at krydse BBB, resulterer i levering af transgener i hele CNS efter systemisk indgift. Dette har vist sig for AAV9 og for nylig beskrevet PHP. B kapsid17. Som følge heraf disse serotyper viser sig for at være særlig relevant for nye gen terapi tilgange for neurodegenerative lidelser1,17,18.

Formålet med denne protokol er at beskrive en omkostningseffektiv metode til mindre produktion af AAV vektorer med høj titer og renhed. Selvom resultaterne præsenteres her bruge PHP. B kapsid og et scAAV udtryk kassette, protokollen er egnet til fremstilling af flere AAV vektor serotyper og genom konfigurationer, hvilket giver maksimal eksperimentelle fleksibilitet. Dog kan vektor udbytte og endelige renhed variere afhængigt af den valgte serotype.

Selve protokollen er en variant af metoden klassisk tri-Transfektion for viral vektor produktion og omfatter brug af en iodixanol gradient vektor oprydning, som i forhold til den klassiske brug af cæsium chlorid (CsCl) forløb, har været rapporteret for at producere AAV vektorer af højere renhed i et mere tid-effektive måde19,20,21.

Trinene Transfektion, rensning og koncentration er beregnet til at udføres efter god laboratoriepraksis (GLP) i en vævskultur laboratorium normeret til viral vektor arbejde. Hver opgave skal udføres i overensstemmelse med de relevante lokale og nationale lovgivning vedrørende viral vektor produktion og brug. Arbejde skal udføres under en laminar flow hætte og i sterile forhold. Inde i funktionen vektor anbefales det at bære en lab forklæde, ud over den regelmæssige vævskultur laboratoriekittel. Desuden bør et dobbelt par handsker samt plast overtrækssko, blive båret på alle tidspunkter.

Før start vektor produktion, sikre alt nødvendigt udstyr og plasmider er tilgængelige. 1) pCapsid plasmid indeholder rep genet, der koder fire nonstrukturelle proteiner nødvendige for replikering, nemlig Rep78, Rep68, Rep52 og Rep40, og fælles landbrugspolitik gen, der koder tre strukturelle kapsid proteiner, nemlig VP1, VP2 og VP3. 2) pHelper plasmid indeholder gener E4, E2Aog VA fra adenovirus, som letter AAV produktion i HEK293T celler. 3) pTransgene plasmid indeholder transgen udtryk kassette, flankeret af to ITRs. Disse plasmider kan være syntese de novo i laboratoriet ved hjælp af sekvenser tilgængelige online22. For plasmider gjort de novo, er især dem der indeholder roman transgener, sekventering påkrævet, for at sikre, at de transgene og ITRs er korrekte. Alternativt, premade plasmider kan erhverves direkte igennem online plasmid repositories. Når det er nødvendigt, plasmider kan forstærkes og renset ved hjælp af standard kits, ifølge producentens instruktioner23.

Vektor titer og renhed kan påvirke transduktion evne til vektor. Supplerende protokoller leveres for at vurdere kvaliteten af den producerede vektor. De endelige vektorer vil være nyttig for studier af CNS cellefunktion i både in vitro- og i vivo applikationer.

Protocol

Løsning Sammensætning
Cellekultur og Transfektion
DMEM1 DMEM 1 x
1% FBS (v/v)
1% GlutaMAX (v/v)
DMEM10 DMEM 1 x
10% FBS (v/v)
1% GlutaMAX (v/v)
150 mM NaCl 4.380 g NaCl
Op til 500 mL ultrarent vand
AAV rensning og afsaltning
5 M NaCl 146.1 g NaCl
Op til 500 mL ultrarent vand
1 M Tris HCl (pH 8,5) 12.11 g Tris base FORSIGTIGHED
Op til 100 mL ultrarent vand
Tilføj 1 M HCl ved hjælp af Pasteurs pipette til at reducere pH 8,5
Lysisbuffer 15 mL 5 M NaCl
25 mL 1 M Tris HCL (pH 8,5) FORSIGTIGHED
Op til 500 mL ultrarent vand
10 x fosfatbufferet saltopløsning (PBS) 80 g NaCl
2 g KCl FORSIGTIGHED
14,4 g Na2HPO4
2,4 g KH2PO4
Op til 1 L ddvand
1 M MgCl2 20.33 g MgCl2-6 H2O
Op til 100 mL ultrarent vand
1 M KCl 7,45 g KCl FORSIGTIGHED
Op til 100 mL ultrarent vand
5 x PBS Magnesium-kalium (PBS-MK) stamopløsning 250 mL 10 x PBS
2,5 mL 1 M MgCl2
6,25 mL 1 M KCl FORSIGTIGHED
Op til 500 mL Ultrapure vand H2O
15% Iodixanol 12,5 mL af Optiprep tæthed gradient medium FORSIGTIGHED
10 mL af 5 M NaCl
10 mL af 5 x PBS-MK
17,5 mL i ultrarent vand
25% Iodixanol 20,8 mL af Optiprep tæthed gradient medium FORSIGTIGHED
10 mL af 5 x PBS-MK
19.2 mL i ultrarent vand
100 µL af phenol rød
40% Iodixanol 33.3 mL af Optiprep tæthed gradient medium FORSIGTIGHED
10 mL af 5 x PBS-MK
6.7 mL i ultrarent vand
60% Iodixanol 50 mL af Optiprep tæthed gradient medium FORSIGTIGHED
100 µL af phenol rød FORSIGTIGHED
AAV renhed kontrol
10 x Tris acetat EDTA (te) buffer 44,8 g Tris base FORSIGTIGHED
11,4 mL iseddike (17.4M)
3,7 g EDTA
Op til 1 L ultrarent vand
Agarosegel 0,8 g ultrarent Agarosen
Op til 100 mL 1 x te buffer
Gel buffer 181.7 g Tris base FORSIGTIGHED
1,5 g SDS FORSIGTIGHED
Justere pH til 8.45 med 1 M HCl FORSIGTIGHED
Op til 500 mL ultrarent vand
Katode buffer 10 x 121.14 g Tris base FORSIGTIGHED
179.2 g Tricine FORSIGTIGHED
1% SDS (w/w) FORSIGTIGHED
Op til 1 L ultrarent vand
Anode buffer 10 x 242.3 g Tris base FORSIGTIGHED
Op til 1 L ultrarent vand
Justere pH til 8,9 med 1 M HCl FORSIGTIGHED
Prøven buffer 5 x For 20 mL:
605 mg Tris base FORSIGTIGHED
4 g SDS FORSIGTIGHED
10 mg Serva blå G
12 g Glycerol
Justere pH 6,8 med 1 M HCl, alikvot og opbevares ved-20 ° C FORSIGTIGHED
Stabling gel For 2 geler:
400 µL acrylamid FORSIGTIGHED
750 µL gel buffer
1.85 mL ultrarent vand
4 ΜL TEMED FORSIGTIGHED
20 µL 10% APS (v/v) FORSIGTIGHED
Tilsæt TEMED og 10% APS umiddelbart før hælde gel. Brug både kemikalier under en kemisk hætte.
Løse gel For 2 geler:
3,32 mL acrylamid FORSIGTIGHED
3,35 mL gel buffer
1.14 mL ultrarent vand
2.12 mL 50% glycerol
6 ΜL TEMED FORSIGTIGHED
50 µL 10% APS (w/v) FORSIGTIGHED
Tilsæt TEMED og 10% APS umiddelbart før hælde gel. Brug både kemikalier under en kemisk hætte.
Vand-mættede butanol 10 mL n-butanol FORSIGTIGHED
1 mL ultrarent vand
Forsigtighed: Der henvises til tabellen materialer til retningslinjer for brugen af farlige kemikalier.

Tabel 1: Sammensætningen af de nødvendige løsninger.

1. Tri-Transfektion af HEK293T celler

Bemærk: Henvises til tabel 1 til sammensætningen af buffere og løsninger, der anvendes i protokollen.
Bemærk: Udførelsen af denne del af protokollen tager ca. 4 dage.

  1. Optø et hætteglas af menneskelige embryonale nyre (HEK) 293T celler i vandbad indstillet på 37 ° C.
    Bemærk: Brug kun celler, der har været passaged mindre end 20 x til at sikre optimal Transfektion effektivitet.
  2. Seed HEK293T celler med en tæthed på 2 x 103 til 6 x 103 celler/cm2 i DMEM10 i 15 cm diameter celle kultur retter.
  3. Vokse celler til 70-80% sammenløbet i en standard inkubator, indstillet på 37 ° C, med 95% fugtighed og 5% CO2.
    Bemærk: Produktionen af én batch af AAV vektorer ved hjælp af denne protokol kræver 18 celle kultur retter (15 cm i diameter). En celle sammenløbet af 70-80% svarer til 6 x 103 til 7 x 103 celler/cm2, opretholdes i 17-20 mL af DMEM10 næringssubstratet.
  4. Forberede polyethylenimine (PEI) / DNA blandes i forholdet koncentration af 1/3.5 (w/w).
    1. Forberede DNA mix til 18 celle kultur retter i en 50 mL konisk slange ved at blande 360 µg pΔF6, 180 µg for pCapsid og 180 µg for pTransgene i 18 mL af 150 mM NaCl.
    2. Distribuere DNA mix over tre 50 mL konisk rør (6 mL af DNA mix pr. koniske rør).
    3. Forberede PEI mix seks celle kultur retter i en ny 50 mL konisk slange ved at blande 840 µg af PEI (1 µg/µL) i 6 mL af 150 mM NaCl.
    4. Forbered PEI/DNA mix ved at tilføje 6 mL af PEI mix (udarbejdet i trin 1.4.3), dråbe for dråbe, til en af de koniske rør indeholdende DNA mix (udarbejdet i trin 1.4.2) og Ruger i 20 min. ved stuetemperatur.
      Bemærk: Efter 20 min inkubation bliver PEI/DNA mix lidt grumset.
  5. Tage seks celle kultur retter ud af rugemaskinen og helt Aspirér medium fra hver kultur fad i en laminar flow hætte. Fjerne spor af mediet ved at skylle retter med 5 mL af forvarmet Dulbecco fosfatbufferet saltopløsning (DPBS).
  6. Sikre udbredelse af DPBS over hele overfladen af forsigtigt vippe fadet.
  7. Forsigtigt Opsug DPBS og 12 mL DMEM1 tilsættes til hvert fad.
    Bemærk: Undgå afmontering cellerne ved at tilføje medium langsomt, fra en pipette, placeret på kanten af skålen.
  8. Bland PEI/DNA af pipettering op og ned 3 x - 5 x. Tilsættes 2 mL af PEI/DNA-mix til hver af seks celle kultur retter i en dråbe for dråbe mode, omhyggeligt fordele det over hele overfladen. Når blandingen er tilføjet til hvert fad, placere retterne tilbage i inkubatoren. Gentag trin 1.4.3– 1.8 for de resterende kultur retter.
  9. Inkuber de transfected celler i 5 timer ved 37 ° C, med 95% fugtighed og 5% CO2.
  10. Tilføje en ekstra 12 mL af DMEM10 til hver kultur parabol uden at fjerne de eksisterende medium (total medium volumen = 25 mL).
  11. Inkubér transfected cellerne op til 72 h efter Transfektion ved 37 ° C, med 95% fugtighed og 5% CO2.

Supplementary Figure
Tillægs figur 1: HEK 293T celle morfologi visualiseret ved fase kontrast mikroskopi (venstre) med bekræftelse af normal god landbrugspraksis udtryk visualiseret ved fluorescens imaging (højre). (A) vellykket Transfektion af HEK293T celler med en normal god landbrugspraksis-kodning pTransgene bekræftes af fluorescens billeddannelse. (B) HEK293T celler behandles udelukkende med Transfektion reagenser viser ingen normal god landbrugspraksis udtryk. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

  1. Høste medium og celler 72 h efter Transfektion. Bruge en celle skraber omhyggeligt Adskil celler fra kultur parabol. Indsamle medium og celler i en 50 mL konisk røret holdes på is.
    Bemærk: Indholdet af to celle kultur retter kan indsamles i en enkelt 50 mL konisk slange. I slutningen af dette trin, vil hver af de ni rør indeholder ca. 50 mL medium.
  2. Der centrifugeres de koniske rør på 420 x g i 10 min. ved 4 ° C med acceleration og deceleration af centrifuge sat til maksimum.
  3. Omhyggeligt supernatanten fra hver tube. Brug ikke pipetter til at forhindre tab af materiale. I stedet forsigtigt hæld supernatanten til en beholder, bortskaffelse af affald og placere de rør, der indeholder de celle pellets tilbage på isen.
  4. Resuspend hver celle pellet i 2 mL af lysisbuffer direkte i 50 mL konisk røret af pipettering op og ned 5-10 x. Gør ikke vortex. Pool lysates fra tre rør sammen.
    Bemærk: På dette tidspunkt, vil der være tre 50 mL konisk rør, hver en indeholdende 6 mL resuspenderet celler i lysisbuffer.

2. AAV vektor rensning

Bemærk: Udførelsen af denne protokoltjenesten tager ca 1 dag. Udfør følgende trin samtidig på hver af de tre 50 mL konisk rør indeholdende cellerne genopslemmes i lysisbuffer (se den tidligere note).

  1. Fryse og optø de resuspenderede celler 3 x til lyse dem og frigive AAV partikler. Udføre trinnet frysning ved at placere rør i en spand, der indeholder tøris iblandet ethanol. Udføre optøning af straks placerer cellerne i et vandbad indstillet på 37 ° C.
  2. Efter det tredje optøningen skridt, centrifugeres ved 1.167 x g i 15 min. ved 4 ° C.
    Bemærk: En mærkbar pellet sammensat af celle debris vil blive dannet. Når du håndterer rør, undgå pludselige bevægelser, da disse kan forårsage udstationering af toerstoffet i supernatanten, som vil forringe renheden af den endelige vektor.
  3. Omhyggeligt overføre analysere for at rense 50 mL koniske rør og derefter tilføje nukleasen til hvert rør, til en slutkoncentration på 50 U/mL supernatanten.
  4. Inkuber i 30 minutter ved 37 ° C. Swirl 50 mL konisk rør i hånden hver 10 min for at sikre, at nukleasen grundigt blandet med supernatanten.
  5. Klarlægge supernatanten ved centrifugering ved 13,490 x g i 20 min. ved 4 ° C.
  6. Vedhæft et 0,45 µm filter til en 10 mL sprøjte og placere den på toppen af en ren 50 mL konisk slange. Forsigtigt fjerne stemplet og fyld sprøjten med supernatanten fra trin 2,5.
  7. Bruge stemplet til at tvinge de lysate gennem filteret. Brug et nyt filter og sprøjte for hver tube supernatanten fremstillet i trin 2,5.
    Bemærk: Den opnåede brøkdel er kendt som 'rå lysate'.
  8. Forberede hver af 15%, 25%, 40% og 60% iodixanol fraktioner i fire separate 50 mL konisk rør, ifølge vejledningen i tabel 1.
  9. Forberede iodixanol forløb i tre ultracentrifugering rør ved hjælp af følgende rækkefølge af iodixanol brøker: 8 mL af 15% iodixanol, 5,5 mL 25% iodixanol, 5 mL 40% iodixanol og 4,5 mL 60% iodixanol.
    Forsigtighed: Iodixanol kan forårsage irritation af øjne, hud og mave og respiratorisk skrifter. Når du håndterer iodixanol forløb, handsker og arbejde under en laminar flow hætte.
    1. 8 mL af 15% iodixanol afpipetteres i hver ultracentrifugering tube.
    2. 5,5 mL 25% iodixanol opløsning pipetteres i et rent 50 mL konisk røret (figur 1A).
    3. Bruge en ikke-uddannet Pasteur pipette (som halsen af ultracentrifugering tube er for snæver for konventionelle gradueret pipetter) at omhyggeligt lag 5,5 mL 25% iodixanol løsning under 15% iodixanol løsning (figur 1B).
      Bemærk: Dette kan opnås med held ved at tilføje iodixanol i tre trin, da Pasteur-pipette kan kun rumme ca 2 mL.
    4. Tilføj 40% og 60% iodixanol løsningerne, som beskrevet i trin 2.9.3. Forstyr ikke de forskellige iodixanol grænseflader under lagdeling.
      Bemærk: En god forberedelse af de forskellige iodixanol fraktioner kan sikres ved visuel bekræftelse takket være phenol rød tilføjet til iodixanol brøker (Se vejledningen i tabel 1). Da hver fraktion har en specifik densitet, de ikke vil intermix under trinnet lagdeling, hvis det udføres korrekt (Se figur 1 c).
  10. Lag af rå lysate oven på 15% iodixanol gradient med Pasteur pipette. Fortsætte drop af drop at forhindre forstyrrelser på grænsefladen mellem den rå lysate og iodixanol løsningen.
  11. Fylde ultracentrifugering tube med lysisbuffer indtil menisken når bunden af røret halsen at sikre røret ikke skjuler under de meget høje styrker genereret under ultracentrifugering (figur 1 c).
  12. Luk ultracentrifugering rør ved hjælp af passende låg. Bruge en digital skala for at sørge for alle tre ultracentrifugering rør har samme vægt. Justere vægt, hvis det er nødvendigt, ved at tilføje mere lysisbuffer oven på den rå lysate.
    Bemærk: Vægtforskel mellem ultracentrifugering rør skal være under 0,1 g at sikre sikker drift af ultracentrifuge. Ultracentrifuger er potentielt farlige stykker udstyr og bør kun anvendes af ordentligt uddannet personale.
  13. Der centrifugeres rør på 301,580 x g, ved hjælp af en fast vinkel titanium rotor, for 1 timer og 40 min på 12 ° C, ved hjælp af maksimale hastighed acceleration og deceleration.
  14. Omhyggeligt indsætte en rustfrit stål stump nål på 40% og 60% iodixanol interface.
    1. Tillægge en 5 mL sprøjte (figur 1E) nålen.
    2. Opsug kun den klare brøkdel, indeholdende vektor partikler.
      Bemærk: Den samlede mængde indsamlet er ca 2,5-3 mL. Undgå indsamling af materiale fra grænsefladen 25-40%, da dette vil øge niveauet for forurening i den endelige vektor parti, på grund af tilstedeværelsen af ikke-ønskeligt proteiner.
    3. Behandle de indsamlede brøkdel (afsaltning og koncentration) eller opbevare det natten over ved 4 ° C.

Figure 1
Figur 1: opsætningen for iodixanol gradient rensning og efterfølgende vektor samling. (A) før pipettering forskellige iodixanol forløb ind i ultracentrifugering rør, afpipetteres en passende volumen af hver iodixanol opløsning i et separat koniske rør. (B) derefter bruge en Pasteur afpipetteres sekventielt overføre hver iodixanol løsning til ultracentrifugering tube: lag af en mere og mere høj iodixanol koncentration skal tilføjes nederst på tube nedenunder den foregående lag. (C) lag rå vektor lysate på toppen når gradueringen, der er blevet udarbejdet. Denne vektor samling system bruger ikke skarpe nåle, som udgør en risiko for «nålestiksskader». (D) A rustfrit stål 316-sprøjte nål indsættes gennem iodixanol gradient op til 40% / 60% iodixanol interface. (E) vektor partikler er fundet i 40% iodixanol fase og indsamles. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

3. afsaltning og koncentration af AAV vektor

Bemærk: Udførelsen af denne del af protokollen tager ca 2 h.

  1. Prerinse filter membranen af centrifugal filteret ved at tilføje 5 mL 1 x PBS-MK og centrifugeres i 5 min på 4.000 x g.
  2. Der tilsættes 5 mL af 1 x PBS-MK til de indsamlede AAV vektor brøkdel, mix og derefter tilføje det samlede volumen til filteret. Ved tilsætning af 1 x PBS-MK, turbiditet er observeret. Centrifuge på 4.000 x g indtil diskenheden findes på filteret kegle-formet er blevet reduceret til 1 mL. Kassér den flow-gennem akkumuleret i ydre collection tube.
  3. Tilføj 13 mL af 1 x PBS-MK konisk filter og Gentag centrifugeringen trin så mange gange som nødvendigt (minimum 3 x), indtil der er ingen mere turbiditet observeret når frisk 1 x PBS-MK er tilføjet.
  4. I finalen vask skridt, tilføje 13 mL PBS + 0,01% (v/v) nonionisk overfladeaktivt stof og centrifugeres ved 4.000 x g indtil volumen er reduceret til 300-350 µL.
  5. Indsamle de resterende brøkdel stede på filteret af pipettering hele mængden ind i en steril med nederdel microcentrifuge rør.
    Bemærk: Denne fraktion indeholder den afsaltede og koncentreret AAV vektor. I de følgende trin i denne protokol omtales denne fraktion som det «primære» brøkdel. Sørg for at håndtere rør under kølerhjelmen og opbevares ved 4 ° C.
  6. Skyl filteret med 200 µL 1 x PBS-MK til at indsamle de resterende vektor partikler bevaret på filteret. Indsamle i en steril microcentrifuge tube.
    Bemærk: Dette er en fortyndet vektor bestand, som kan være egnet for nogle programmer, der kræver lavere vektor titers. I fremtidige skridt omtales denne fraktion som "sekundære" brøken.
  7. Kortvarig oplagring, gemme vektor fraction(s) ved 4 ° C (mindre end 2 uger). Alikvot og store vektor ved ‑20 ° C når langtidsopbevaring er påkrævet.
  8. Udføre kvalitetskontrol, som beskrevet i afsnit 4.

4. titreringen af vektor af kvantitative Polymerase Chain Reaction

Bemærk: Udførelsen af denne del af protokollen tager ca 3 timer.

  1. Standardkurven
    1. Linearize den transgene-udtrykker plasmid (pTransgene) anvendes til Transfektion af HEK-293T celler i afsnit 1.
    2. Forberede begrænsning digest mix i 0,5 mL microcentrifuge rør (Se tabel 2 for sammensætningen af begrænsning digest mix).
      Bemærk: Justere sammensætningen af begrænsning digest mix enzym brugt og de tilknyttede retningslinjer fra producenten.
    3. Inkuber begrænsning digest mix for 1 timer ved 37 ° C.
    4. Kontroller effektiviteten af begrænsning fordøjelsen ved at køre den lineariseret plasmid på en 0,8% (w/v) agarosegel på 100 V til 1 h. komplet foraskning af plasmidet skal producere en enkelt fragment af definerede størrelse.
    5. Rense den lineære plasmid DNA ved hjælp af en PCR rensning kit, efter producentens anvisninger24, og måle DNA-koncentrationen med et spektrofotometer ved at måle absorption på 260 nm. Efter titrering, gemme den resterende alikvot af den lineære plasmid ved ‑20 ° C til yderligere brug.
    6. Beregne molekyler (dvs DNA kopier) af plasmid materiel per microliter som følger.
      1. Først beregne molekylvægt af plasmidet. Antages det, at den gennemsnitlige vægt af en DNA-basepar (bp) er 650 Dalton (Da), og at en muldvarp af en bp vejer 650 g kan molekylvægt af en dobbelt-strenget DNA skabelon estimeres ved at tage produktet af sin længde (i bp) og vægt pr. basepar.
        Plasmid molekylvægt [g/mol] = plasmid størrelse [bp] x 650 [Da/bp]
      2. Næste, beregne antallet af modermærker på plasmidet pr. microliter.
        Muldvarpe af plasmidet pr. microliter = plasmid koncentration [g/µL] / plasmid molekylvægt [g/mol]
        Bemærk: Inverse af molekylvægt er antallet af modermærker af plasmid stede i 1 g af materialet.
      3. Derefter beregne antallet af plasmid molekyler pr. microliter, ved hjælp af Avogadro's tal (6.022 x 1023 molekyler/mol).
        Molekyler af plasmidet pr. microliter = modermærker af plasmidet pr. microliter [muldvarpe/µL] x Avogadros tal [molekyler/mol]
      4. Endelig, fortyndes plasmid stock (molekyler/µL) for at opnå en 100 µL løsning med den ønskede koncentration af 1 x 109 molekyler (vektor genomer (vg) pr. microliter).
        Plasmid stock (100 µL) = (ønskede koncentration [molekyler/µL] x 100 µL) / plasmid molekyler [molekyler/µL]
    7. Gøre serielle fortyndinger af plasmid materiel (1 x 109 vg/µL) i tre:
      10 µL 1 x 109 vg/µL plasmid lager + 90 µL af H2O = 1 x 108 vg/µL løsning
      10 µL 1 x 108 vg/µL fortynding + 90 µL af H2O = 1 x 107 vg/µL løsning
      10 µL 1 x 107 vg/µL fortynding + 90 µL af H2O = 1 x 106 vg/µL løsning
      10 µL 1 x 106 vg/µL fortynding + 90 µL af H2O = 1 x 105 vg/µL løsning
      Fortsætte med at opnå en 1 x 101 vg/µL løsning.
    8. Holde de serielle fortyndinger af standard plasmid bestanden på is indtil indlæse dem på qPCR plade (afsnit 4.3).
Komponent Beløb
10 x begrænsning enzym buffer 5 ΜL
Begrænsning enzym 2,5 ΜL
Plasmid 5 µg
H2O op til 50 µL

Tabel 2: Begrænsning digest mix sammensætning.

Tabel 3: Stock plasmid volumen lommeregneren. Venligst klik her for at downloade denne tabel.

  1. DNA-ekstraktion fra AAV vektor
    1. Bland 2 µL af AAV vektor stock (den primære fraktion fra trin 3.5) med 198 µL af DNase jeg buffer (1 x) i strip rør (PCR rør) og Tilføj 2 µL af DNase jeg.
      Bemærk: DNase jeg vil forringe genetiske materiale, der ikke er indeholdt inde en vektor kapsid (hvilket fordrejer qPCR resultater). Denne løsning omtales som fortynding «dil1 x 10-2».
    2. Inkuber i 30 minutter ved 37 ° C, efterfulgt af 10 min. ved 95 ° C.
      Bemærk: Protokollen kan stoppes på dette punkt og materialet kan gemmes på ubestemt tid ved 4 ° C, for at undgå forringelse på produktet.
    3. Tilføj 2 µL af proteinase K til dil1 x 10-2 -løsning (trin 4.2.1) og Inkuber i 60 minutter ved 50 ° C, efterfulgt af 20 min. ved 95 ° C.
      Bemærk: Dette trin vil adskille AAV vektor kapsid og frigive AAV vektor genom i løsningen. Tilføje proteinase K i overskud, som den protein (kapsid) indhold af prøven ikke er kendt. Bemærk, det er vigtigt at sikre, at alle proteinase K aktivitet er fjernet ved denaturering, før qPCR, for at undgå problemer med (delvis) polymerase nedbrydning påvirke det endelige resultat.
    4. Forberede 1:10 serielle fortyndinger af proteinase K behandlet dil1 x 10-2 løsning (trin 4.2.3) i 1,5 mL microcentrifuge rør som følger:
      10 µL af dil1 x 10-2 + 90 µL af H2O = dil1 x 10-3 fortynding
      10 µL af dil1 x 10-3 + 90 µL af H2O = dil1 x 10-4fortynding
      10 µL of dil1 x 10-4 + 90 µL af H2O = dil1 x 10-5 fortynding
    5. Holde de serielle fortyndinger af DNA ekstraheret fra vektor på is indtil indlæse dem på qPCR plade (afsnit 4.3).
  2. Titrering af SYBR Green opdagelse-baseret qPCR
    1. Forberede qPCR master mix i 1,5 mL microcentrifuge rør, for både prøven og standarder. Anvendes 10 µL af SYBR Green Master Mix, 1 µL af fremad primer (10 µM lager), 1 µL af reverse primer (10 µM materiel) og 3 µL af H2O pr. reaktion. Se protokol i tabel 4 for primer sekvenser.
    2. Afpipetteres qPCR master mix op og ned, men gør ikke vortex.
    3. Tilføj 15 µL af qPCR master mix, efterfulgt af enten 5 µL af standardkurven forberedt i afsnit 4.1 eller DNA udvundet fra AAV vektor i afsnit 4.2, i hver brønd. Omfatte tre brønde som indeholder kun qPCR master mix, som en negativ kontrol. Henvises til figur 2 for plade layout.
    4. Forsegle pladen med en forsegling film og kortvarigt centrifugeres qPCR pladen på 1.500 x g for 30 s ved 4 ° C.
    5. Køre qPCR reaktion på en plade-baseret real-time PCR forstærkning og påvisning instrument, ved hjælp af de betingelser, der er foreslået i tabel 5.
Primer navn Sekvens
Fremad primer 5'-CCCACTTGGCAGTACATCAA-3'
Omvendt primer 5'-GCCAAGTAGGAAAGTCCCAT-3'

Tabel 4: Primer sekvenser designet mod CBA promotor.

Figure 2
Figur 2: plade layout for qPCR-baserede vektor titrering. Prøverne er farvekodet: grøn = standardkurven; blå = H2O kontrol; grå = primære fraktion; orange = sekundære brøkdel. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Trin Tid Temperatur Cykler Mål
Præ-inkubation 5 min 95 ° C x1 DNA denaturering og polymerase aktivering (hot start reaktion).
Forstærkning 10 min 95 ° C x1 Forstærkning af DNA. Indstillinger kan optimeres, hvis alternative primere med forskellige udgloedning temperatur bruges.
10 s 95 ° C x40
40 Sørensen 60 ° C
1 s 72 ° C
Køling 10 s 40 ° C x1 Plade køling. Slutningen af PCR.

Tabel 5: Termisk cykling protokol for SYBR green-baserede qPCR titrering.

  1. Dataanalyse til at bestemme AAV vektor titer
    1. Udfylde data regnearksceller (tabel 6A) med Ct-værdier opnået for de forskellige fortyndinger af standardprøven parat i punkt 4.1 til at generere en standardkurve.
      Bemærk: Ligning af standardkurven bliver vist (y = en ln (x) + b) samt Rasmussen2 effektivitet (tabel 6B). En qPCR skal have en virkningsgrad på 100% og R2 tæt på 1,0 (≥ 0,96).
    2. Bruge de beregnede værdier af a og b til at udfylde de tilsvarende dataceller i regnearket (tabel 6 c).
    3. Komplet regnearket med Ct-værdier opnået for de forskellige fortyndinger af AAV prøve, der tilberedes i afsnit 4.2.
    4. Beregn den gennemsnitlige AAV vektor titer i vektor genomer pr. microliter i den primære brøk ved hjælp af følgende formel:
      Equation
      Bemærk: faktor 400 bruges til enkelt strandede genomer, mens sc genomer bruge en multiplikationsfaktor på 20025. I virkeligheden, som DNA mængder dobbelt under hver qPCR cyklus, registreret sc DNA er 2 x i forhold til en ss genom. Formålet med titreringen er til at beregne koncentrationen i vektor genomer pr. microliter. En korrektion er nødvendigt for at køre qPCR, når du bruger 2 µL for at starte materiale (trin 4.2.1). Dil repræsenterer fortynding faktorer fra trin 4.2.4. Titer af den "sekundære" AAV vektor fraktion (trin 3.6) kan beregnes samtidig.

Tabel 6: skabelon til qPCR dataanalyse. Venligst klik her for at downloade denne fil.

5. renhed kontrol af SDS-PAGE og sølv farvning

Bemærk: Udførelsen af denne del af protokollen tager ca 5 h.

  1. Brug 70% (v/v) ethanol til grundigt rene glasplader bruges til støbning af geler.
  2. Samle gel casting system. Sikre, at bunden af glasplader ikke er tilhugget, for at forhindre udsivning af acrylamid blanding, når støbning gel.
  3. Forberede den stabling og løse gel løsningerne i to separate 50 mL konisk rør. Udelade tetramethylethylenediamine (TEMED) og 10% (w/v) ammonium persulfat (APS), da de er ansvarlige for polymerisering af gelen. Tilføje dem umiddelbart før støbning gel.
    Bemærk: Den endelige procentdel af akrylamid i gelen påvirker profilen adskillelse af proteiner: typisk en 10% (v/v) endelig koncentration af acrylamid vil være tilstrækkeligt til at teste renheden af en AAV vektor forberedelse.
  4. Bland forsigtigt af hvirvlende røret indeholder gel-komponenter. Gør ikke vortex, da overdreven iltning kan forringe polymerisering.
  5. Tilsæt TEMED og 10% (w/v) APS til den løse gelopløsning. Bland og hæld derefter i gel indehaveren, indtil den når 1-2 cm under toppen af den lille glasplade.
  6. Læg et lag af vand-mættede butanol på toppen af acrylamid blanding. Dette sikrer dannelsen af en jævn overflade under polymerisation. Efterlad ikke gel under alkohol i mere end 30 min, da dette vil dehydrere gel og forringe dets funktion.
    Forsigtig: Butanol er sundhedsskadeligt ved hudkontakt. Det præsenterer også en brandrisiko. Håndterer med omhu.
  7. Vente på gel til at polymerisere og derefter hælde ud butanol. Tip: Kontroller, om overskydende gel blandingen i røret er størknet. Polymerisering forekommer hos mindre end 20 min. vask overfladen af gel med H2O og derefter tørre det ved hjælp af papirhåndklæder, pas på ikke for at forstyrre overfladen af gelen.
  8. Tilsæt TEMED og 10% (w/v) APS til stabling gel og hæld gel i gel holderen på toppen af den adskillende gel.
  9. Placer de medfølgende kam i gelen. Udføre denne handling med en støt bevægelse for at undgå dannelsen af luftbobler inde i brøndene.
  10. Vent i mindst 20 min. for gel til at polymerisere. Tip: Tjek, hvis den overskydende gel blandes konisk røret er størknet.
  11. Forberede de to blandinger (tabel 7), for både primære og den sekundære AAV vektor fraktioner (trin 3.5 og 3.6, henholdsvis).
Høj mængde Lavt beløb
AAV vektor lager 5 ΜL 1 ΜL
5 x prøvebuffer 3 ΜL 3 ΜL
H2O 7 ΜL 11 ΜL

Tabel 7: Sammensætningen af stikprøven blander kræves for sølv farvning.

  1. Fuldt denaturere prøve blandinger af varme dem i 5 min. ved 95 ° C. Samle elektroforese tank, være opmærksom på elektrode orientering.
  2. Fyld tanken med 1 x katode buffer på indersiden af elektrode samling og 1 x anode buffer på ydersiden.
    Bemærk: Anode bufferen kan genbruges fra Kør-hen til-opstille. Frisk katode buffer skal altid bruges.
  3. Fjern kammen fra gel og rense brønde af gel med 1 x katode buffer.
  4. Indlæse 1 µL af protein stigen i en brønd. Læg prøven blander i forskellige brønde på samme gel (figur 3). Kør gelen på 50 V indtil prøverne angiver den løsning gel. Derefter øge spændingen til 100 V indtil farvestof foran når den nedre grænse af gelen.
  5. Uddrag gel omhyggeligt fra glasplader og bruge sølvfarvning kit (ifølge producentens instruktioner26) til at visualisere virale proteiner (VP1, VP2 og VP3 underenheder) der omfatter AAV kapsid, samt at kontrollere, om muligt protein forurening (figur 3).

Figure 3
Figur 3: evaluering af vektor renhed ved hjælp af SDS-PAGE og sølv farvning. Ved hjælp af en Tricine-SDS gel 5 µL af forskellige vektor præparater blev adskilt. Proteiner blev efterfølgende detekteres af sølv farvning. Vektorer betragtes som ren når VP1 (82 kDa), VP2 (67 kDa), og VP3 (60 kDa) er synlige i en 1:1:10 ratio (lane 1), uden overdreven baggrund (lane 2) eller ikke-specifikke bands (lane 3). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Representative Results

AAV9 blev betragtet som, indtil for nylig, at være den mest effektive AAV vektor serotype i krydser BBB og transducing celler i CNS, efter perifer administration. Et betydeligt fremskridt i kapsid design blev opnået når Deverman et al. rapporterede anvendelsen af en kapsid udvalg metode kaldet Cre rekombination-baserede AAV-målrettet udvikling (Opret)17. Brug denne metode, identificeret de en ny kapsid, opkaldt PHP. B, som de rapporteret som stand til at transduce størstedelen af astrocytter og neuroner i flere regioner, CNS, efter systemisk injektion17. På dette tidspunkt, det bør bemærkes, at selv om PHP. B giver positive resultater i C57/Bl6 mus, (som var den stamme, de oprindelige isolering forsøgsdyr), foreløbige rapporter tyder på dets effektivitet kan variere i en stamme-afhængige måde. Yderligere eksperimenter vil uden tvivl kaste mere lys over denne sag31.

Trods disse problemer, PHP. B giver spændende muligheder for noninvasiv genmanipulation i CNS af mus, herunder proof-of-concept gen terapi eksperimenter i sygdomsmodeller. Som sådan, valgte vi at evaluere effektiviteten af transgenet udtryk ved hjælp af PHP. B versus AAV9, som har været den 'gyldne' vektor for CNS transduktion efter perifer administration siden 20092. Hvis du vil udføre en direkte sammenligning af både serotyper, under optimale betingelser for transgen udtryk, brugte vi en sc genom konfiguration32. Begge vektorer transporteres transgen til grøn fluorescerende proteiner (NGL) under kontrol af den allestedsnærværende kylling β-actin (CBA) promotor. C57/Bl6 hunmus på postnatal dag 42 (ca 20 g i vægt) modtaget en dosis af 1 x 1012 vg pr. mus enten scAAV2/php. B-CBA-NGL eller scAAV2/9-CBA-NGL. Vektor administration blev udført via hale vene injektion. Forsøgene blev godkendt af det etiske udvalg af KU Leuven.

Tre uger postinjection, mus undergik transcardial perfusion med iskold PBS, efterfulgt af 4% (w/v) iskold PARAFORMALDEHYD (PFA). Deres hjerner er høstet og undergik yderligere postfixation af en natten inkubation i den samme fiksativ, før du overfører til 0,01% (w/v) Na-indeholder/PBS for opbevaring indtil videre analyse. Bagefter, hjerner var sektionerede ved hjælp af en vibrerende mikrotom, og Immunhistokemi blev udført på 50 µm tykt sektioner.

For at vurdere niveauet af transgenet udtryk, afsnit var plettet med primære antistoffer mod normal god landbrugspraksis (kanin anti-NGL), med påvisning af sekundære antistoffer konjugeret med et fluorescerende farvestof (anti-kanin Alexa Fluor 488) (figur 4A, B ). Fluorescens intensitet målinger (i arbitrære enheder [au]) bekræftede en betydelig stigning i normal god landbrugspraksis udtryk når en sc genom og PHP. B kapsid blev brugt i forhold til AAV9. Stigninger i normal god landbrugspraksis var overholdt i cerebrum (2105 ± 161 vs 1441 ± 99 au; p = 0.0032), lillehjernen (2601 ± 196 vs 1737 ± 135 au; p = 0.0032), og hjernestammen (3082 ± 319 vs 2485 ± 88 au; p = 0.0038) (fig. 4 c).

Figure 4
Figur 4: systemisk levering af scAAV2/PHP. B-CBA-NGL fører til en høj normal god landbrugspraksis udtryk i CNS. scAAV2/PHP. B-CBA-NGL eller scAAV2/9-CBA-normal god landbrugspraksis (1 x 1012 vg/mus) blev administreret til 6 uger gamle C57/Bl6 mus via hale vene injektion. Normal god landbrugspraksis var opdaget ved hjælp af Immunhistokemi på koronale hjernen afsnit 3 uger postinjection. (A) Den cerebrum og (B) lillehjernen og hjernestammen er vist. Skalere barer = 1 mm. (C) kvantificering af relative fluorescens intensiteter blev udført for at bestemme niveauerne for normal god landbrugspraksis signal opnåede med hver vektor (10 dele pr mus; tre mus hver vektor gruppe). En en-vejs ANOVA test blev udført, efterfulgt af en tosidede Student's t-test; dataene, der er udtrykt i gennemsnit ± standardafvigelse; p < 0,01; AU. arbitrære enheder. pCapsid, brugt til AAV vektor produktion, indeholder genet rep fra serotype 2 og gen cap fra serotype PHP. B eller AAV9, i overensstemmelse hermed. Dette tal er blevet ændret fra Rincon et al.32. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Discussion

Produktionen af rekombinant AAV vektorer beskrevet her bruger materialer og udstyr, der er fælles for de fleste molekylærbiologiske laboratorier og celle kultur faciliteter. Det tillader brugeren at få ren, prækliniske grade AAV vektorer, der kan bruges til at målrette flere celle og væv typer på tværs af en vifte af in vitro- og i vivo applikationer. En af de største fordele af denne protokol, i forhold til andre (dvs. CsCl-baserede rensning), er kortere arbejdstid behov. Klar-til-brug AAV vektorer er opnåelige i højst 6 arbejdsdage efter den indledende Transfektion af HEK293T celler.

Flere faktorer kan negativt påvirke det endelige udbytte eller kvaliteten af AAV vektor. Dårlig Transfektion effektivitet er en af hovedårsagerne til en lav viral udbytte33. En stor anbefaling er brugen af HEK293T celler, der ikke har været passaged mere end 20 gange og har ikke en celle sammenløbet større end 90% på tidspunktet for Transfektion21. Derudover har Transfektion valgte metode stor indflydelse på resultaterne. Denne protokol er baseret på anvendelse af PEI. PEI er en kationiske polymer med evnen til at levere eksogene DNA til cellekernen gennem generation af komplekser af polymer og nukleinsyre, kendt som polyplexes, som er overtaget af celle og trafikerede via endosomes34. PEI-baserede Transfektion er nemt og hurtigt at udføre, i modsætning til andre almindeligt anvendte metoder, såsom DNA udfældes sammen med calcium fosfat35. PEI-baserede Transfektion er også meget billigere i forhold til andre nyindførte metoder, såsom brugen af kationiske lipider og magnet-medieret Transfektion36.

Rensning strategi spiller en nøglerolle i protokollen. Sammenlignet med andre metoder, iodixanol-baserede purifications har tendens til at indeholde en højere procentdel af Tom viruspartikler (20%)20. Dette opvejes til en vis grad af den omstændighed, at iodixanol-baserede rensning rutinemæssigt resulterer i AAV vektor præparater med en partikel til smitteevne ratio på mindre end 100. Dette udgør en betydelig forbedring i forhold til konventionelle CsCl-baserede procedurer, som er betydeligt tab af partikel smitteevne rapporteret37. En anden fælles alternativ metode til at rense AAV vektorer er kromatografi-baserede rensning. Denne metode har dog den store ulempe, at en bestemt kolonne er påkrævet for hver vektor kapsid bruges: for eksempel, mens AAV2 er klassisk isoleret ved hjælp af heparin kolonner, denne metode virker ikke med AAV4 og AAV5, som ikke besidder heparin-binding Steder på deres capsids38. I betragtning af at kromatografi rensning er også dyrt, er iodixanol-baserede rensning generelt mere egnet til laboratorier, der ønsker at producere høj kvalitet partier af AAV vektorer på en lille skala33,39, 40. for at maksimere det endelige udbytte og renhed af vektoren, extreme care er dog nødvendigt når du foretager iodixanol forløb. De forskellige iodixanol fraktioner skal overføres til ultracentrifugering røret ved hjælp af en steril Pasteur pipette hvis spids er rørende mur af røret: iodixanol bør bortvises fra pipetten, langsomt og konstant. Som vektor partikler ophobes i 40% iodixanol lag, skal pleje tages for at sikre, at grænsefladerne gradient ikke blander20. Endelig, den brøkdel, som indeholder vektoren bør inddrives ved indsættelse af en rustfrit stål stump nål med en måler ikke større end 20 G. For at maksimere vektor opsving, skal den klare fraktion hentes i sin helhed. Under dette trin er timing afgørende. For at undgå at gå på kompromis med renheden af forberedelsen, er det vigtigt at stoppe samlingen, før andre (kontaminerende) faser af forløbet er indsamlet.

Forskelle i den fremkomne vektor titer kan tilskrives også vektoren iboende evne til at producere emballerede partikler. En sammenligning mellem forskellige AAV serotyper viste, at nogle AAV vektorerne er sværere at producere på en højere titer end andre (f.eks. AAV2)41. Udfældning af vektoren, under trinnet udvanding kan være en mulig årsag til en lavere titer og forhindres nemt ved at undgå overkoncentration33. Derudover er det også muligt, at effektiviteten af iodixanol gradient-baserede rensning lidt varierer mellem serotyper, og derfor, forskelle i titer fås med forskellige serotyper kan observeres41.

Endelig skal det påpeges, at selv om qPCR er en meget præcis metode til DNA kvantificering nogle iboende variabilitet i teknikken kan observeres. Nøjagtighed i titreringen afhænger primært præcis pipettering og korrekt vortexing af alle løsninger. For at garantere den mest nøjagtige titer læsning, qPCR uafhængigt kan gentages, og de opnåede værdier i gennemsnit. Valget af primere præsenteret i denne protokol er baseret på rækkefølgen af CBA initiativtageren beliggende i pTransgene plasmid brugt i vores laboratorium. CBA promotor er en stærk syntetiske promotor, som er meget udbredt i feltet vektor at drive udtryk på tværs af flere celletyper. Det indeholder flere elementer, herunder cytomegalovirus (CMV) tidlig enhancer element; initiativtageren, første exon og den første intron af CBA gen; og splejsning acceptoren af kanin β-globin genet. Men primere kan være konstrueret til stort set ethvert element, som ligger i udtrykket kassette (herunder promotor, transgene og regulerende elementer). Sammenligning af titer på tværs af partier er også muligt, at yde primere bruges mod regioner fælles for de pågældende vektorer.

Til sidst, kan denne protokol bruges til at producere AAV vektorer med en række capsids, genom konfigurationer, promoter typer og transgen laster. Dette vil tillade brugere at nemt tilpasse de endelige egenskaber ved deres vektorer der passer bedst til eksperimentelle behov. I eksemplet præsenteres i de repræsentative resultater, brugen af PHP. B kapsid, som effektivt krydser BBB, gav højeffektive genekspression i CNS, følgende hale vene injektion32. Systemisk administration af CNS penetrant vektorer har betydelige fordele i form af mulige bivirkninger2,17,32. Et muligt alternativ til perifere injektion, samtidig undgå forbehold af invasive teknikker, er Intratekal levering, som består af levering af AAV vektor i cerebrospinalvæsken. Denne leveringsbetingelser rute er vist sig for at være effektiv, viser udbredt udtryk af transgenet i hele CNS, mindre off target effekter i perifere organer, og lave niveauer af immunrespons42. Intratekal injektioner er dog meget mere udfordrende, da de kræver højere tekniske færdigheder end halen vene injektion.

Kapsid videreudvikling at forfine denne teknologi vil blive drevet af mulighederne for AAV vektor brug i gen terapi programmer. Sådanne tilgange tilbyde attraktive muligheder for at behandle i øjeblikket uhelbredelig CNS lidelser, såsom Amyotrofisk lateral sklerose, Charcot-Marie-Tooth sygdom, Parkinsons og Alzheimers sygdom18.

Disclosures

Forfatterne har ikke noget at oplyse.

Acknowledgments

M.R. understøttes af en Fonds voor Wetenschappelijk Onderzoek Vlaanderen (CVE) postdoc stipendium (133722/1204517N) og for kontinuerlig støtte af Fundación hjerte-kar-de Colombia og den Administrative afdeling for videnskab, Teknologi og Innovation (Grant CT-FP44842-307-2016, Projektkode 656671250485). M.M. er understøttet af et CVE ph.d.-stipendium (1S48018N). M.G.H. blev støttet af en VIB institutionelle grant og ekstern støtte fra Thierry Latran Foundation (SOD-VIP), The Foundation for Alzheimers forskning (SAO-FRA) (P #14006), CVE (Grant 1513616N) og det Europæiske Forskningsråd (ERC) (starter Grant 281961 - AstroFunc; Proof of Concept Grant 713755 - annonce-VIP). Forfatterne anerkender Jeason Haughton for hans hjælp med musen dyrehold, Stephanie Castaldo for hendes hjælp udfører hale vene injektioner og Caroline Eykens for at levere billeder af transfekteret HEK293T celler. M.G.H. erkender Michael Dunlop, Peter Hickman og Dean Harrison.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Plasmid production
pTransgene plasmid De novo design or obtained from a plasmid repository N/A See step 1 of main protocol for further details
pCapsid De novo design or obtained from a plasmid repository N/A See step 1 of main protocol for further details
pHelper Agilent 240071
Plasmid Plus maxi kit Qiagen 12963
QIAquick PCR purification Kit Qiagen 28104
AAV Helper-Free System Agilent 240071
Cell culture and transfection
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM), high glucose, no glutamine Life technologies 11960-044 Supplement DMEM with FBS (1% or 10% v/v) and GlutaMAX 200 mM (1% v/v) then filter sterilize the medium using a 0.22 µm filter
Fetal bovine serum (FBS) GIBCO 10500-064
GlutaMAX supplement GIBCO 35050038
(200 mM)
Corning bottle-top vacuum filter system Sigma-Aldrich CLS430769
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (DPBS) with no calcium and no magnesium GIBCO 14190094
HEK293T cells American Tissue Culture Collection CRL3216 Upon receipt, thaw the cells and culture as described in the protocol. After a minimal number of passages, freeze a subfraction for future in aliquots. Always use cells below passage number 20. Once cultured cells have been passaged more than 20 times, restart a culture from the stored aliquots
Cell culture dishes Greiner Cellstar 639160 15 cm diameter culture dishes
Cell scrapers VWR 10062-904
Polyethylenimine (PEI) Polyscience 23966-2 PEI in powder form is dissolved at 1 µg/µL in deionized water (ddwater) at pH=2 (use HCl). Prepare in a beaker and stir for 2-3 h. When dissolved, bring the pH back to 7 with NaOH. Filter sterilize and store the resuspended stock solution in 1 ml aliquots at -20 °C. PEI aliquots can be freeze/thawed multiple times.
Virkon solution Fisher Scientific NC9821357 Disinfect any material that has been in contact with assembled vector particles with Virkon solution
Mutexi long-sleeve aprons Fisher Scientific 11735423 Wear an apron over the top of a regular lab coat
Fisherbrand maximum protection disposable overshoes Fisher Scientific 15401952
AAV Purification and desalting
Optiprep density gradient medium Sigma-Aldrich D1556 Optiprep is a 60% (w/v) solution of iodixanol in water (sterile). CAUTION. Use under a laminar flow hood. Wear gloves
Phenol red Sigma-Aldrich P0290 CAUTION. Use under a laminar flow hood
Pasteur pipette Sigma-Aldrich Z627992 Sterilize before use
OptiSeal Polypropylene tubes Beckman 361625
Benzonase (250 U/µL) Sigma-Aldrich E1014 Supplied as a ready-to-use solution
Acrodisc syringe filter Pall corporation 4614
Omnifix syringe (5 mL) Braun 4617053V
Blunt syringe needle Sigma Aldrich Z261378 Stainless steel 316 syringe needle, pipetting blunt 90° tip gauge 16, L 4 in. Referred to in the text as a blunt-end needle
Aqua Ecotainer B. Braun 0082479E Sterile endotoxin-free water. Referred to as 'Ultrapure water'
Amicon ultra-15 centrifugal filter unit Millipore UFC910024 These filters concentrate the final product by collecting the vector particles in consecutive centrifugation steps
Pluronic F68 (100x) Thermo Fisher 24040032 Non-ionic surfactant. Dilute in sterile PBS to use at 0.01% (v/v)
Fisherbrand Sterile Microcentrifuge Tubes with Screw Caps (2 mL) Fisher Scientific 02-681-374 Use skirted tubes for easy handling
AAV Titration
Restriction enzyme: StuI (10 U/µL) Promega R6421
DNAse I (1 U/µL) Fisher Scientific EN0521
Proteinase K Sigma-Aldrich 3115852001 Reconstitute in ultrapure water and use at a final concentration of 10 mg/mL. Solution can be stored at -20 °C
EasyStrip Plus Tube Strips (with attached caps) Fisher Scientific AB2000
Eppendorf microtube 3810x Sigma-Aldrich Z606340-1000EA
LightCycler 480 SYBR Green I Master Mix Roche 4707516001
LightCycler Multiwell Plates, 96 wells Roche 4729692001 White polypropylene plate (with unique identifying barcode)
Microseal 'A' PCR plate and PCR Plate Sealing Film Bio-Rad msa5001
AAV Purity control
Ammonium persulfate (APS) Sigma-Aldrich A3678 Reconstitute in ultrapure water to 10% (v/v). CAUTION. Use under a laminar flow hood. Wear gloves
Tetramethylethylenediamine (TEMED) Sigma-Aldrich T9281 CAUTION. Use under a laminar flow hood. Wear gloves
Tris Base ULTROL Grade Merck 648311 CAUTION: Use under a laminar flow hood. Wear gloves
UltraPure Agarose Thermo Fisher 16500-500
Rotiphorese® Gel 30 (37,5:1) Carl Roth 3029.3 Aqueous 30% acrylamide and bisacrylamide stock solution at a ratio of 37.5:1. CAUTION: Use under a laminar flow hood. Wear gloves
Serva Blue G Sigma-Aldrich 6104-58-1
Precision Plus prestained marker Bio-Rad 1610374edu
1-Butanol Sigma-Aldrich B7906 CAUTION: Use under a laminar flow hood. Wear gloves
Immunohistochemistry
Rabbit anti-GFP Synaptic Systems 132002 1:300 dilution
Anti-rabbit Alexa Fluor 488 Invitrogen A21206 1:1,000 dilution
Equipment Company Catalog number Comments
Vector production lab
Rotina 380 bench-top centrifuge * Hettich 1701
Optima XPN 80 ultracentrifuge * Beckmann Coulter A95765
Type 50.2 Ti fixed-angle titanium rotor * Beckmann Coulter 337901
Entris digital scale * Sartorius 2202-1S
Warm water bath * Set at 37 °C
Ice bucket * VWR 10146-290 Keep material used in the vector production lab separate from that used in standard lab areas
Pipetboy pro * Integra 156,400
Graduated pipettes: Cell star * Greiner bio-one 606180 Capacity of 5 mL
Graduated pipettes: Cell star * Greiner bio-one 607180 Capacity of 10 mL
Graduated pipettes: Cell star * Greiner bio-one 760180 Capacity of 25 mL
CO2 incubator CB150 * Binder 9040-0038 Set at 37 °C, 5% CO2 and 95% humidity
Nuaire safety cabinet NU 437-400E * Labexchange 31324 Clean all the surfaces with 70% ethanol and Virkon before and after use
Conventional lab
T100 thermal cycler * Bio-Rad 1861096
LightCycler 480 Instrument II * Roche 5015278001
ThermoMixer * Eppendorf C 5382000015
Nanodrop * ThermoFisher Scientific ND 2000
Mini-Protean Tetra Cell* Bio-Rad 1658001FC For use with handmade or precast gels
ProteoSilver silver stain kit Sigma-Aldrich PROTSIL1 High sensitivity protein detection with low background
Centrifuge 5804 R * Eppendorf B1_022628045 High speed centrifuge for medium capacity needs (up to 250 mL)
Graduated pipettes Cell star * Greiner bio-one 606180 5 mL
Graduated pipettes Cell star * Greiner bio-one 607180 25 mL
Graduated pipettes Cell star * Greiner bio-one 760180 25 mL
Filter tips * Greiner bio-one 750257 1250 µL
Filter tips * Greiner bio-one 738257 300 µL
Filter tips * Greiner bio-one 771257 10 µL
Ice bucket with lid * VWR 10146-290
Mini diaphragm vacuum pump, VP 86 * VWR 181-0065
Pipetman P2 Gilson F144801
Pipetman P20 Gilson F123600
Pipetman P100 Gilson F123615
Pipetman P200 Gilson F123601
Pipetman P1000 Gilson F123602
* Materials marked with an asterisk are expensive pieces of equipment and are usually central infrastructure items shared between multiple labs. These items can also be replaced by equivalents if available. Note, when a different ultracentrifuge is used, care must be taken to select the correct rotor and centrifuge tubes.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Daya, S., Berns, K. I. Gene Therapy Using Adeno-Associated Virus Vectors. Clinical Microbiology Reviews. 21 (4), 583-593 (2008).
  2. Duque, S., et al. Intravenous Administration of Self-complementary AAV9 Enables Transgene Delivery to Adult Motor Neurons. Molecular Therapy. 17 (7), 1187-1196 (2009).
  3. Bourdenx, M., Dutheil, N., Bezard, E., Dehay, B. Systemic gene delivery to the central nervous system using Adeno-associated virus. Frontiers in Molecular Neuroscience. 7, (2014).
  4. Kantor, B., McCown, T., Leone, P., Gray, S. J. Clinical Applications Involving CNS Gene Transfer. Advances in Genetics. 87, 71-124 (2014).
  5. Crystal, R. G. Adenovirus: The First Effective In Vivo Gene Delivery Vector. Human Gene Therapy. 25 (1), 3-11 (2014).
  6. Weinberg, M. S., Samulski, R. J., McCown, T. J. Adeno-associated virus (AAV) gene therapy for neurological disease. Neuropharmacology. 69, 82-88 (2013).
  7. Henckaerts, E., Linden, R. M. Adeno-associated virus: a key to the human genome? Future Virology. 5 (5), 555-574 (2010).
  8. Howarth, J. L., Lee, Y. B., Uney, J. B. Using viral vectors as gene transfer tools (Cell Biology and Toxicology Special Issue: ETCS-UK 1 day meeting on genetic manipulation of cells). Cell Biology and Toxicology. 26 (1), 1-20 (2010).
  9. Nathwani, A. C., et al. Adenovirus-Associated Virus Vector-Mediated Gene Transfer in Hemophilia B. The New England Journal of Medicine. 365 (25), 2357-2365 (2011).
  10. Carter, B. J. Adeno-associated virus and the development of adeno-associated virus vectors: a historical perspective. Molecular Therapy. 10 (6), 981-989 (2004).
  11. Schambach, A., Zychlinski, D., Ehrnstroem, B., Baum, C. Biosafety Features of Lentiviral Vectors. Human Gene Therapy. 24 (2), 132-142 (2013).
  12. Van Vliet, K. M., Blouin, V., Brument, N., Agbandje-McKenna, M., Snyder, R. O. The Role of the Adeno-Associated Virus Capsid in Gene Transfer. Methods in Molecular Biology. 437, 51-91 (2008).
  13. Rincon, M. Y., VandenDriessche, T., Chuah, M. K. Gene therapy for cardiovascular disease: advances in vector development, targeting, and delivery for clinical translation. Cardiovascular Research. 108 (1), 4-20 (2015).
  14. Samulski, R. J., Muzyczka, N. AAV-Mediated Gene Therapy for Research and Therapeutic Purposes. Annual Review of Virology. 1 (1), 427-451 (2014).
  15. McCarty, D. M. Self-complementary AAV Vectors; Advances and Applications. Molecular Therapy. 16 (10), 1648-1656 (2008).
  16. Choi, J. H., et al. Optimization of AAV expression cassettes to improve packaging capacity and transgene expression in neurons. Molecular Brain. 7, 17 (2014).
  17. Deverman, B. E., et al. Cre-dependent selection yields AAV variants for widespread gene transfer to the adult brain. Nature Biotechnology. 34 (2), 204-209 (2016).
  18. Jackson, K. L., Dayton, R. D., Deverman, B. E., Klein, R. L. Better Targeting, Better Efficiency for Wide-Scale Neuronal Transduction with the Synapsin Promoter and AAV-PHP.B. Frontiers in Molecular Neuroscience. 9, (2016).
  19. Lock, M., et al. Versatile Manufacturing of Recombinant Adeno-Associated Viral Vectors at Scale. Human Gene Therapy. 21 (10), 1259-1271 (2010).
  20. Strobel, B., Miller, F. D., Rist, W., LamLa, T. Comparative Analysis of Cesium Chloride- and Iodixanol-Based Purification of Recombinant Adeno-Associated Viral Vectors for Preclinical Applications. Human Gene Therapy Methods. 26 (4), 147-157 (2015).
  21. Jungmann, A., Leuchs, B., Katus, H. A., Rommelaere, J., Müller, O. J. Protocol for efficient generation and characterization of adeno-associated viral (AAV) vectors. Human Gene Therapy Methods. , (2017).
  22. Tolmachov, O. Designing Plasmid Vectors. Methods in Molecular Biology. 542, 117-129 (2009).
  23. QIAGEN Plasmid Purification Handbook. , Available from: https://www.qiagen.com/us/resources/download.aspx?id=46205595-0440-459e-9d93-50eb02e5707e&lang=en (2018).
  24. QIAquick PCR Purification Kit Protocol. , Available from: http://2012.igem.org/wiki/images/a/a3/QIAquick_PCR-purification.pdf (2008).
  25. Lock, M., Alvira, M. R., Chen, S. J., Wilson, J. M. Absolute Determination of Single-Stranded and Self-Complementary Adeno-Associated Viral Vector Genome Titers by Droplet Digital PCR. Human Gene Therapy Methods. 25 (2), 115-125 (2014).
  26. Sigma. ProteoSilver Silver Stain Kit (PROTSIL1) - Bulletin, ProteoSilver. , Available from: https://www.sigmaaldrich.com/content/dam/sigma-aldrich/docs/Sigma/Bulletin/protsil1bul.pdf (2018).
  27. Machholz, E., et al. Manual Restraint and Common Compound Administration Routes in Mice and Rats. Journal of Visualized Experiments. (67), e2771 (2012).
  28. Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), e3564 (2012).
  29. Puntel, M., et al. Gene transfer into rat brain using adenoviral vectors. Current Protocols in Neuroscience. 50 (1), (2010).
  30. Bachman, J. Immunohistochemistry on Freely Floating Fixed Tissue Sections. Methods in Enzymology. 533, 207-215 (2013).
  31. Hordeaux, J., et al. The Neurotropic Properties of AAV-PHP.B Are Limited to C57BL/6J Mice. Molecular Therapy. 26 (3), 664-669 (2018).
  32. Rincon, M. Y., et al. Widespread transduction of astrocytes and neurons in the mouse central nervous system after systemic delivery of a self-complementary AAV-PHP.B vector. Gene Therapy. 25 (2), 83-92 (2018).
  33. Crosson, S. M., Dib, P., Smith, J. K., Zolotukhin, S. Helper-free Production of Laboratory Grade AAV and Purification by Iodixanol Density Gradient Centrifugation. Molecular Therapy. Methods & Clinical Development. 10, 1-7 (2018).
  34. Merdan, T., Kunath, K., Fischer, D., Kopecek, J., Kissel, T. Intracellular processing of poly(ethylene imine)/ribozyme complexes can be observed in living cells by using confocal laser scanning microscopy and inhibitor experiments. Pharmaceutical Research. 19 (2), 140-146 (2002).
  35. Meissner, P., et al. Transient gene expression: recombinant protein production with suspension-adapted HEK293-EBNA cells. Biotechnology and Bioengineering. 75 (2), 197-203 (2001).
  36. Reed, S. E., Staley, E. M., Mayginnes, J. P., Pintel, D. J., Tullis, G. E. Transfection of mammalian cells using linear polyethylenimine is a simple and effective means of producing recombinant adeno-associated virus vectors. Journal of Virological Methods. 138 (1-2), 85-98 (2006).
  37. Zolotukhin, S., et al. Recombinant adeno-associated virus purification using novel methods improves infectious titer and yield. Gene Therapy. 6 (6), 973-985 (1999).
  38. Kaludov, N., Handelman, B., Chiorini, J. A. Scalable Purification of Adeno-Associated Virus Type 2, 4, or 5 Using Ion-Exchange Chromatography. Human Gene Therapy. 13 (10), 1235-1243 (2002).
  39. Nass, S. A., et al. Universal Method for the Purification of Recombinant AAV Vectors of Differing Serotypes. Molecular Therapy. Methods & Clinical Development. 9, 33-46 (2017).
  40. Qu, G., et al. Separation of adeno-associated virus type 2 empty particles from genome containing vectors by anion-exchange column chromatography. Journal of Virological Methods. 140 (1-2), 183-192 (2007).
  41. Holehonnur, R., et al. Adeno-associated viral serotypes produce differing titers and differentially transduce neurons within the rat basal and lateral amygdala. BMC Neuroscience. 15, 28 (2014).
  42. Wang, H., et al. Widespread spinal cord transduction by intrathecal injection of rAAV delivers efficacious RNAi therapy for amyotrophic lateral sclerosis. Human Molecular Genetics. 23 (3), 668-681 (2014).

Tags

Neurovidenskab spørgsmålet 143 Adeno-associeret virus (AAV)-baseret vektorer iodixanol gradient gen levering centralnervesystemet blod-hjerne-barrieren PHP. B kapsid
Produktion, oprensning og kvalitetskontrol for Adeno-associeret Virus-baseret vektorer
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Fripont, S., Marneffe, C., Marino,… More

Fripont, S., Marneffe, C., Marino, M., Rincon, M. Y., Holt, M. G. Production, Purification, and Quality Control for Adeno-associated Virus-based Vectors. J. Vis. Exp. (143), e58960, doi:10.3791/58960 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter