Summary
هنا، نحن تصف استراتيجية فعالة واستنساخه لإنتاج وعيار ومراقبة الجودة دفعات من نواقل فيروسات الغدد المرتبطة. أنها تسمح للمستخدم بالحصول على إعداد ناقلات مع ارتفاع عيار (إيه وان × 1013 ناقلات جينومات مليلتر) ودرجة نقاء عالية، جاهزة للاستخدام في المختبر أو في الجسم الحي .
Abstract
أدوات توصيل الجينات استناداً إلى فيروسات الغدد المرتبطة (AAVs) خيار شعبي لإيصال المتسلسلات للجهاز العصبي المركزي (CNS)، بما في ذلك تطبيقات العلاج الجيني. إف الناقلة عدم تكرار، قادرة على إصابة الفاصل وعدم تقسيم الخلايا وتوفير طويل الأجل التحوير التعبير. الأهم من ذلك، بعض اللقاح، مثل بي إتش بي وصف حديثا. ب، يمكن عبر الدم-الدماغ-الجدار (بي بي بي) في نماذج حيوانية، عقب تسليم الجهازية. يمكن أن تنتج نواقل إف كفاءة في المختبر. ومع ذلك، قوية واستنساخه البروتوكولات مطالبون بالحصول على ناقلات إف مع مستويات النقاء كافية وعيار قيم عالية بما يكفي للتطبيقات في فيفو . ويصف هذا البروتوكول استراتيجية فعالة واستنساخه لإنتاج ناقلات إف، استناداً إلى استراتيجية تدرج تنقية إيوديكسانول. طريقة تنقية إيوديكسانول مناسبة للحصول على دفعات ناقلات إف عيار ارتفاع درجة نقاء عالية، عند مقارنتها بأساليب تنقية أخرى. وعلاوة على ذلك، أن البروتوكول عادة أسرع من الطرق الأخرى المذكورة حاليا. وباﻹضافة إلى ذلك، سلسلة بوليميراز كمية رد فعل (qPCR)-يتم وصف الاستراتيجية القائمة على أساس لتحديد عيار ناقلات الأمراض، فضلا عن فضية تلطيخ طريقة سريعة ودقيقة لتحديد نقاء دفعة ناقلات. وأخيراً، نتائج تمثيلية لإيصال الجينات إلى الجهاز العصبي المركزي، بعد الإدارة النظامية من إف-بي. ب، وترد. يجب أن تكون هذه النتائج الممكنة في جميع مختبرات استخدام بروتوكولات الموضحة في هذه المقالة.
Introduction
على مدى الأعوام الثلاثين الماضية، آفس البرية من نوع قد تم تصميمها لإنشاء ناقلات إف المؤتلف، التي أثبتت أن تكون أدوات مفيدة استثنائية لنقل الجينات في الجهاز العصبي المركزي1،2،،من34، نهج 5،6 والعلاج الجيني للأمراض (بما في ذلك العلاجات التي وافقت عليها إدارة الأغذية والعقاقير وأيما)4،7. ملاءمتها للاستخدام في الجهاز العصبي المركزي إلى حد كبير مستمد من قدرتها لتصيب خلايا غير تقسيم، بعد انتهاء الانقسامية، وتوجد عادة في الجهاز العصبي المركزي8. ومع ذلك، ناقلات المستندة إلى إف أيضا لديها ميزة السماح بتعبير طويل الأجل لأي4،التحوير علاجية معينة9 مع التماس استجابة المناعية أكثر اعتدالا مقارنة بسائر النواقل الفيروسية7، 8،10،،من1112.
هي العناصر الرئيسية لأي ناقل إف الجينوم وفي قفيصه. يتم آفس البرية من نوع واحد-الذين تقطعت بهم السبل (ss) فيروسات الحمض النووي مع جينوم حوالي 5 كيلوبس (kb)13. لإنتاج ناقلات إف المؤتلف، حذف من جينوم إف البرية من نوع الجينات مندوب و كاب (اللازمة للنسخ المتماثل للجينوم وجمعية قفيصه الفيروسية) وقدمت في ترانس، مما يترك مجالاً يحتوي على14،التحوير15كاسيت التعبير. تسلسل تكرار مقلوب المحطة الطرفية (الإسناد) الجينوم الفيروسي الأصلي هي فقط العناصر المحتجزة في متجه إف، كهذه ضرورية للنسخ المتماثل والتغليف3،،من1014. ويمكن إجراء هندسة عكسية ناقلات إف لتعزيز التعبير التحوير؛ طفرة في واحد من الإسناد يؤدي إلى تشكيل حلقة دبوس الذي يتيح فعالية توليد مكملة الحمض النووي حبلا3،،من715. والميزة الرئيسية لهذا التكوين، تسمى جينوم ذاتي تكميلية (sc)، أنها تتجاوز الحاجة إلى توليف حبلا الثانية النموذجية في دورة الحياة التقليدية من آفس، إلى حد كبير زيادة السرعة ومستويات التعبير التحوير 1. ومع ذلك، استخدام جينوم سكاف يقلل من قدرة البضائع المتجهة إلى 2.4 كيلو بايت تقريبا. وهذا يشمل تسلسل التحوير، فضلا عن أي تسلسل تنظيمي مثل المروجين أو مواقع microRNA الملزمة، للحد من التعبير إلى خلية معينة أنواع16.
يحدد التفاعل خلية ناقل المضيف قفيصه إف ويمنح درجة من انتحاء الخلية نوع أو الأنسجة للنمط المصلي المسيطر إف، التي يمكن أيضا استغلالها للحد من التعبير التحوير إلى مواقع محددة. تم العثور على عدة إف اللقاح في الطبيعة، بينما تم إنتاج أخرى في المختبرات من خلال النهج المؤتلف (أي، بي. ب). وباﻹضافة إلى ذلك، تضفي بعض كابسيدس أيضا الخصائص المفيدة الأخرى، مثل القدرة على عبور BBB، أسفر عن تسليم المتسلسلات في جميع أنحاء الجهاز العصبي المركزي بعد الإدارة النظامية. وقد تبين هذا AAV9، وكذلك لوصف مؤخرا بي إتش بي. قفيصه ب17. نتيجة لذلك، يتم إثبات هذه اللقاح مهمة بصفة خاصة على نهج العلاج بالجينات الجديدة للأعصاب اضطرابات1،،من1718.
والهدف من هذا البروتوكول وصف طريقة فعالة من حيث التكلفة لإنتاج الصغيرة نواقل إف مع عيار عالية ونقائه. على الرغم من أن النتائج المعروضة هنا استخدام بي إتش بي. قفيصه ب وكاسيت تعبير سكاف، ومناسبة لإنتاج عدة إف ناقلات اللقاح وتكوينات الجينوم، مما يتيح أقصى قدر من المرونة التجريبية. ومع ذلك، يمكن أن تختلف الغلة المتجهات والنقاء النهائي اعتماداً النمط المصلي المسيطر الذي تم اختياره.
البروتوكول نفسه هو البديل للأسلوب الكلاسيكي ثلاثي-تعداء لإنتاج النواقل الفيروسية ويتضمن استخدام التدرج إيوديكسانول لناقلات تنظيف، التي كانت بالمقارنة مع استخدام التدرجات (CsCl) كلوريد السيزيوم، الكلاسيكية وذكرت لإنتاج ناقلات إف درجة نقاء أعلى في20،،من1921طريقة أكثر كفاءة من حيث وقت.
وتهدف الخطوات تعداء وتنقيتها وتركيز تتم وفقا للممارسات المختبرية الجيدة (GLP) في مختبر زراعة الأنسجة لتصنيفها لعمل النواقل الفيروسية. كل مهمة تحتاج إلى أن يؤديها وفقا للتشريعات المحلية والوطنية ذات الصلة فيما يتعلق بإنتاج النواقل الفيروسية واستخدامها. يجب أن يتم العمل تحت غطاء الاندفاق الصفحي وفي ظروف معقمة. داخل مرفق ناقلات الأمراض، ينصح بارتداء مئزر مختبر، بالإضافة إلى معطف مختبر زراعة الأنسجة العادية. وعلاوة على ذلك، يجب أن تلبس زوج مزدوجة من القفازات، فضلا عن أوفيرشوس البلاستيكية، في جميع الأوقات.
قبل بدء إنتاج ناقلات الأمراض وضمان جميع المعدات اللازمة وتتوفر والبلازميدات. 1) بكابسيد بلازميد يحتوي على مندوب الجين الذي يشفر أربعة من البروتينات غير الهيكلية اللازمة للنسخ المتماثل، إلا وهي Rep78، Rep68، Rep52، و Rep40، و كاب الجين الذي يشفر ثلاثة بروتينات قفيصه الهيكلية، هما VP1 و VP2 و VP3. 2) فيلبير بلازميد يحتوي على جينات الفئة هاء-2 وهاء-4و خامسا من إتش، مما يسهل إنتاج إف في الخلايا HEK293T. 3) بترانسجيني بلازميد يحتوي على كاسيت التعبير التحوير، يحف به الإسناد اثنين. يمكن أن تكون هذه البلازميدات تجميعي حيثياته في المختبر باستخدام تسلسل متاح على الإنترنت22. والبلازميدات أدلى حيثياته، وبخاصة تلك التي تحتوي على رواية المتسلسلات، تسلسل بالنسبة المطلوبة، للتأكد من أن التحوير والإسناد الصحيحة. وبدلاً من ذلك، يمكن اكتساب والبلازميدات premade مباشرة عن طريق مستودعات بلازميد على الإنترنت. عند الضرورة، يمكن تفصيل والبلازميدات وتنقيته باستخدام مجموعات قياسية، وفقا لإرشادات الشركة المصنعة23.
عيار المتجهات والنقاء يمكن أن تؤثر سلبا على قدرة توصيل ناقل. يتم توفير بروتوكولات إضافية لتقييم جودة ناقل المنتجة. ناقلات النهائية ستكون مفيدة لإجراء دراسات للدالة cell CNS في تطبيقات في المختبر و في فيفو .
Protocol
| الحل | تكوين | |
| خلية ثقافة وتعداء | ||
| DMEM1 | دميم 1 x | |
| 1% FBS (v/v) | ||
| 1% جلوتاماكس (v/v) | ||
| DMEM10 | دميم 1 x | |
| 10% FBS (v/v) | ||
| 1% جلوتاماكس (v/v) | ||
| 150 مم كلوريد الصوديوم | ز 4.380 كلوريد الصوديوم | |
| ما يصل إلى 500 مل من الماء عالي النقاوة. | ||
| تنقية إف والملحي | ||
| كلوريد الصوديوم 5 م | 146.1 ز كلوريد الصوديوم | |
| ما يصل إلى 500 مل من الماء عالي النقاوة. | ||
| 1 م تريس HCl (pH 8.5) | قاعدة تريس 12.11 ز | تنبيه |
| ما يصل إلى 100 مل من الماء عالي النقاوة. | ||
| إضافة HCl م 1 باستخدام ماصة باستور خفض pH إلى 8.5 | ||
| المخزن المؤقت لتحلل | 15 مل من كلوريد الصوديوم 5 م | |
| 25 مل HCl تريس م 1 (pH 8.5) | تنبيه | |
| ما يصل إلى 500 مل من الماء عالي النقاوة. | ||
| 10 × مخزنة الفوسفات المالحة (PBS) | 80 جرام كلوريد الصوديوم | |
| ز 2 بوكل | تنبيه | |
| ز 14.4 غ2هبو4 | ||
| ز 2.4 خ2ص4 | ||
| ما يصل إلى 1 لتر ddالمياه | ||
| مجكل م 12 | ز 20.33 مجكل2-6 ح2س | |
| ما يصل إلى 100 مل من الماء عالي النقاوة. | ||
| بوكل م 1 | ز 7.45 بوكل | تنبيه |
| ما يصل إلى 100 مل من الماء عالي النقاوة. | ||
| 5 × الحل مخزون برنامج تلفزيوني المغنيسيوم-البوتاسيوم (برنامج تلفزيوني-MK) | 250 مل من برنامج تلفزيوني x 10 | |
| 2.5 مل من مجكل م 12 | ||
| مل 6.25 من بوكل م 1 | تنبيه | |
| يصل إلى 500 مل أولترابوري الماء ح2س | ||
| 15% إيوديكسانول | 12.5 مل من أوبتيبريب الكثافة المتوسطة التدرج | تنبيه |
| 10 مل من كلوريد الصوديوم 5 م | ||
| 10 مل 5 × برنامج تلفزيوني-MK | ||
| 17.5 مل من الماء عالي النقاوة. | ||
| 25% إيوديكسانول | مل 20.8 أوبتيبريب كثافة متوسطة الانحدار | تنبيه |
| 10 مل 5 × برنامج تلفزيوني-MK | ||
| 19.2 مل من الماء عالي النقاوة. | ||
| 100 ميليلتر من الفينول الحمراء | ||
| 40% إيوديكسانول | مل 33.3 من أوبتيبريب الكثافة المتوسطة التدرج | تنبيه |
| 10 مل 5 × برنامج تلفزيوني-MK | ||
| مل 6.7 من الماء عالي النقاوة. | ||
| 60% إيوديكسانول | 50 مل من أوبتيبريب الكثافة المتوسطة التدرج | تنبيه |
| 100 ميليلتر من الفينول الحمراء | تنبيه | |
| مراقبة نقاء إف | ||
| 10 × تريس خلات يدتا (الشاي) المخزن المؤقت | قاعدة تريس ز 44.8 | تنبيه |
| 11.4 مل حمض الخليك الجليدية (17.4M) | ||
| ز 3.7 يدتا | ||
| المياه تصل إلى 1 "لتر عالي النقاوة" | ||
| [اغروس] هلام | ز 0.8 عالي النقاوة [اغروس] | |
| ما يصل إلى 100 مل س 1 الشاي المخزن المؤقت | ||
| المخزن المؤقت لجل | قاعدة تريس 181.7 ز | تنبيه |
| ز 1.5 مخزونات النشر الاستراتيجي | تنبيه | |
| ضبط الأس الهيدروجيني إلى 8.45 مع 1 م هيدروكلورايد | تنبيه | |
| ما يصل إلى 500 مل من الماء عالي النقاوة. | ||
| المخزن المؤقت الكاثود 10 x | قاعدة تريس 121.14 ز | تنبيه |
| 179.2 ز تريسيني | تنبيه | |
| الحزب الديمقراطي الصربي 1% (w/w) | تنبيه | |
| المياه تصل إلى 1 "لتر عالي النقاوة" | ||
| المخزن المؤقت اﻷنود 10 x | قاعدة تريس 242.3 ز | تنبيه |
| المياه تصل إلى 1 "لتر عالي النقاوة" | ||
| ضبط الأس الهيدروجيني إلى 8.9 مع 1 م هيدروكلورايد | تنبيه | |
| المخزن المؤقت العينة 5 x | لمل 20: | |
| قاعدة تريس 605 ملغ | تنبيه | |
| 4 ز مخزونات النشر الاستراتيجي | تنبيه | |
| 10 ملغ Serva الأزرق ز | ||
| ز 12 والغليسيرول | ||
| ضبط الأس الهيدروجيني إلى 6.8 مع 1 م HCl، الكوة وتخزينها في-20 درجة مئوية | تنبيه | |
| التراص هلام | للجل 2: | |
| اكريلاميد 400 ميليلتر | تنبيه | |
| المخزن المؤقت لجل ميليلتر 750 | ||
| مل 1.85 الماء عالي النقاوة. | ||
| 4 ميليلتر تيميد | تنبيه | |
| % 10 ميليلتر 20 وكالة الأنباء الجزائرية (v/v) | تنبيه | |
| إضافة 10% وتيميد APS فورا قبل سكب الهلام. استخدام المواد الكيميائية على حد سواء تحت غطاء كيميائية. | ||
| حل هلام | للجل 2: | |
| اكريلاميد مل 3.32 | تنبيه | |
| المخزن المؤقت لجل مل 3.35 | ||
| 1.14 مل الماء عالي النقاوة. | ||
| 2.12 مل والغليسيرول 50% | ||
| تيميد ميليلتر 6 | تنبيه | |
| 50% 10 ميليلتر APS (w/v) | تنبيه | |
| إضافة 10% وتيميد APS فورا قبل سكب الهلام. استخدام المواد الكيميائية على حد سواء تحت غطاء كيميائية. | ||
| المياه المشبعة وبيوتانول | 10 مل ن-butanol | تنبيه |
| 1 مل الماء عالي النقاوة. | ||
| تنبيه: أرجع إلى "الجدول المواد" للمبادئ التوجيهية المتعلقة باستخدام المواد الكيميائية الخطرة. | ||
الجدول 1: تكوين الحلول المطلوبة.
1-ثلاثي-تعداء الخلايا HEK293T
ملاحظة: يرجى الرجوع إلى الجدول 1 لتكوين مخازن والحلول المستخدمة في البروتوكول.
ملاحظة: أداء هذا الجزء من البروتوكول يستغرق 4 أيام تقريبا.
- ذوبان الجليد قنينة خلايا 293T الكلي الجنينية البشرية (HEK) في حمام مائي في 37 درجة مئوية.
ملاحظة: استخدم فقط الخلايا التي قد تم باساجيد أقل من 20 x لضمان كفاءة تعداء الأمثل. - خلايا HEK293T البذور في كثافة 2 × 103 إلى 6 × 103 خلايا/سم2 في DMEM10 في أطباق الثقافة الخلية قطرها 15 سم.
- تنمو الخلايا لالتقاء 70 – 80% في حاضنة قياسية تعيين في 37 درجة مئوية، مع 95% رطوبة و 5% CO2.
ملاحظة: ويتطلب إنتاج دفعة واحدة من ناقلات إف استخدام هذا البروتوكول 18 خلية ثقافة الأطباق (قطرها 15 سم). ويناظر التقاء خلية من 70% إلى 80% 6 × 103 إلى 7 × 103 خلايا/سم2، يحتفظ في 17 – 20 مل من DMEM10 الثقافة المتوسطة. -
إعداد بولييثيلينيميني (جزيرة الأمير إدوارد)/مزيج الحمض النووي بنسبة تركيز 1/3.5 (w/w).
- إعداد مزيج الحمض النووي للخلية 18 ثقافة الأطباق في أنبوب مخروطي 50 مل واحد بخلط 360 ميكروغرام من pΔF6 و 180 ميكروغرام من بكابسيد 180 ميكروغرام من بترانسجيني في 18 مل من 150 مم كلوريد الصوديوم.
- توزيع مزيج الحمض النووي على مدى 50 مل ثلاثة أنابيب مخروطية الشكل (6 مل من الحمض النووي مزيج كل أنبوبة مخروطية الشكل).
- إعداد مزيج بي للخلية ستة أطباق الثقافة في أنبوب 50 مل مخروطية الشكل جديد بخلط ميكروغرام 840 من بي (1 ميكروغرام/ميليلتر) في 6 مل من 150 مم كلوريد الصوديوم.
- إعداد مزيج بي/الحمض النووي عن طريق إضافة 6 مل المزيج برينس (أعد الخطوة 1.4.3)، قطره قطره، إلى واحد من أنابيب مخروطية تحتوي على مزيج الحمض النووي (أعد الخطوة 1.4.2) واحتضانها لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
ملاحظة: وبعد 20 دقيقة من الحضانة، سوف تصبح مزيج بي/الحمض النووي عكر قليلاً.
- تأخذ الخلايا الست ثقافة الأطباق خارج الحاضنة ونضح المتوسطة من كل طبق الثقافة في غطاء الاندفاق الصفحي تماما. إزالة آثار المتوسط قبل الشطف الأطباق مع 5 مل من مخزنة الفوسفات المالحة بريوارميد دولبيكو (دببس).
- ضمان توزيع دببس على مدى كامل السطح بلطف إمالة الطبق.
- بلطف نضح في دببس وإضافة 12 مل DMEM1 لكل طبق.
ملاحظة: تجنب فصل الخلايا عن طريق إضافة المتوسطة ببطء، من ماصة وضعها على حافة الطبق. - مزيج بي/الحمض النووي من بيبيتينج صعودا وهبوطاً 3 س-5 س. إضافة 2 مل مزيج بي/الحمض النووي لكل من الأطباق ثقافة الخلية الستة في طريقة قطره قطره، توزيعه بعناية على كامل السطح. حالما تتم إضافة هذا المزيج لكل طبق، ضع الأطباق مرة أخرى في الحاضنة. كرر الخطوات 1.4.3– 1.8 للاطباق الثقافة المتبقية.
- احتضان الخلايا transfected ح 5 في 37 درجة مئوية، مع الرطوبة 95% و 5% لشركة2-
- إضافة 12 مل إضافية من DMEM10 لكل طبق الثقافة دون إزالة المتوسطة الموجودة من قبل (متوسطة الحجم الإجمالي = 25 مل).
- احتضان transfected الخلايا تصل إلى 72 ح تعداء فيما بعد عند 37 درجة مئوية، مع 95% رطوبة و 5% CO2.
التكميلية الرقم 1: مورفولوجيا الخلايا HEK 293T تصور الطوري (يسار) مع تأكيد التعبير بروتينات فلورية خضراء تصور بالأسفار التصوير (يمين)- تعداء (A) ناجحة لخلايا HEK293T مع بترانسجيني التجارة والنقل-ترميز ويتأكد من تصوير الأسفار. HEK293T (ب) تعامل فقط مع الكواشف تعداء الخلايا إظهار أي تعبير بروتينات فلورية خضراء. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
- الحصاد على المديين المتوسط وتعداء بعد انتهاء ح 72 الخلايا. استخدام مكشطة خلية لفصل الخلايا من طبق الثقافة بعناية. جمع المتوسطة والخلايا في أنبوب 50 مل مخروطية أبقى على الجليد.
ملاحظة: ويمكن جمع محتويات الخلية اثنين ثقافة الأطباق في أنبوب مخروطي واحدة 50 مل. في نهاية هذه الخطوة، سيحتوي كل من الأنابيب تسع حوالي 50 مل متوسطة. - الطرد المركزي هذه الأنابيب المخروطية في 420 x ز لمدة 10 دقائق في 4 درجات مئوية مع التسارع والتباطؤ في أجهزة الطرد المركزي إلى الحد الأقصى.
- تجاهل المادة طافية من كل أنبوبة بعناية. لا تستخدم الماصات للحيلولة دون فقدان المواد. بدلاً من ذلك، بلطف صب المادة طافية في حاوية النفايات، ووضع الأنابيب تحتوي على كريات الخلية مرة أخرى على الجليد.
- ريسوسبيند بيليه كل خلية في 2 مل من تحلل المخزن المؤقت مباشرة في أنبوب مخروطي 50 مل من بيبيتينج صعودا وهبوطاً x 5 – 10. عدم دوامة. تجمع ليساتيس من الأنابيب الثلاثة معا.
ملاحظة: عند هذه النقطة، سيكون هناك ثلاثة أنابيب مخروطية 50 مل، كل مل 6 تحتوي على واحد من الخلايا ريسوسبينديد في المخزن المؤقت لتحلل.
2-إف ناقلات تنقية
ملاحظة: أداء هذا القسم البروتوكول يأخذ حوالي الساعة 1 يوم. نفذ الخطوات التالية في وقت واحد في كل من هذه الأنابيب المخروطية 50 مل ثلاثة تحتوي على خلايا حراكه في المخزن المؤقت لتحلل (انظر الملاحظة السابقة).
- تجميد وإذابة الخلايا ريسوسبينديد 3 x لهم والإفراج عن الجسيمات إف. نفذ الخطوة التجميد بوضع الأنابيب في دلو يحتوي على ثلج جاف مختلطة مع الإيثانول. أداء ذوبان الجليد بوضع الخلايا مباشرة في حمام مائي في 37 درجة مئوية.
- بعد ذوبان الخطوة الثالثة، الطرد المركزي في س 1,167 ز لمدة 15 دقيقة في 4 درجات مئوية.
ملاحظة: وسوف تشكل بيليه ملحوظ تتألف من خلية الحطام. عند التعامل مع الأنابيب، تجنب الحركات المفاجئة كهذه يمكن أن يسبب مفرزة بيليه إلى المادة طافية، الذي سوف يعرض للخطر نقاء ناقلات النهائية. - نقل سوبيرناتانتس لتنظيف أنابيب مخروطية 50 مل بعناية ثم قم بإضافة نوكلاس إلى كل أنبوبة، إلى تركيز نهائي من 50 يو/مليلتر طافية.
- احتضان لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية. دوامة الأنابيب المخروطية 50 مل باليد كل 10 دقيقة لضمان أن نوكلاس يتم خلطها بشكل تام مع المادة طافية.
- توضيح المادة طافية بالطرد المركزي في س 13,490 ز لمدة 20 دقيقة في 4 درجات مئوية.
- إرفاق عامل تصفية 0.45 ميكرومتر بحقنه 10 مل ووضعه على رأس أنبوب مخروطي نظيف 50 مل. بعناية إزالة المكبس وملء المحاقن مع المادة طافية من الخطوة 2، 5.
- استخدام المكبس للقوة من خلال عامل تصفية. استخدام عامل تصفية جديد والمحاقن لكل أنبوبة من المادة طافية التي تم الحصول عليها في الخطوة 2، 5.
ملاحظة: ويعرف الكسر حصل على 'الخام ليساتي'. - تعد كل من الكسور إيوديكسانول 15%، 25%، 40%، ونسبة 60% في أربعة أنابيب مخروطية الشكل منفصلة 50 مل، وفقا للتعليمات الواردة في الجدول 1.
-
إعداد التدرجات إيوديكسانول في ثلاثة أنابيب تنبيذ فائق باستخدام الترتيب التالي للكسور إيوديكسانول: 8 مل إيوديكسانول 15%، 5.5 مل من إيوديكسانول 25%، 5 مل من إيوديكسانول 40%، ومل 4.5 من إيوديكسانول 60%.
تنبيه: إيوديكسانول يمكن أن يسبب تهيج العينين والجلد والمسالك التنفسية والمعوية. عند التعامل مع التدرجات إيوديكسانول، ارتداء القفازات وتعمل تحت غطاء الاندفاق الصفحي.- "الماصة؛" 8 مل إيوديكسانول 15% في كل أنبوبة تنبيذ فائق.
- "الماصة؛" 5.5 مل من محلول إيوديكسانول 25% في أنبوب نظيف 50 مل مخروطية الشكل (الشكل 1A).
- استخدام ماصة باستور غير تخرج من (كما عنق الأنبوب تنبيذ فائق ضيق جداً الماصات تخرج التقليدية) إلى طبقة بعناية 5.5 مل الحل إيوديكسانول 25% دون حل إيوديكسانول 15% (الشكل 1B).
ملاحظة: وهذا يمكن أن يتحقق عن طريق إضافة إيوديكسانول في ثلاث خطوات منذ ماصة باستور فقط يمكن أن تعقد حوالي 2 مل. - إضافة حلول إيوديكسانول 40% و 60% كما هو موضح في الخطوة 2.9.3. عدم الإزعاج الواجهات إيوديكسانول مختلفة خلال طبقات.
ملاحظة: يمكن ضمان التحضير السليم للكسور إيوديكسانول مختلفة حسب تأكيد البصرية وبفضل الفينول الحمراء إضافة إلى الكسور إيوديكسانول (انظر التعليمات في الجدول 1). وبكل جزء بكثافة محددة، أنها سوف لا تختلط أثناء الخطوة طبقات، إذا فإنه يتم تنفيذها بشكل صحيح (راجع الشكل 1).
- طبقة النفط الخام على رأس التدرج إيوديكسانول 15% مع ماصة باستور. تابع قطره بقطرة لتجنب الإخلال بالعلاقة بين النفط الخام ليستي والحل إيوديكسانول.
- ملء الأنبوب تنبيذ فائق مع المخزن المؤقت لتحلل حتى يصل غضروف قاعدة العنق الأنبوبة ضمان الأنبوبة لا ينهار تحت قوات عالية جداً التي تم إنشاؤها أثناء تنبيذ فائق (الشكل 1).
- إغلاق الأنابيب تنبيذ فائق باستخدام أغطية مناسبة. استخدام مقياس رقمي للتأكد من أن جميع الأنابيب تنبيذ فائق الثلاثة لها نفس الوزن. ضبط الوزن، إذا لزم الأمر، عن طريق إضافة المزيد من المخزن المؤقت تحلل على رأس 'الخام ليستي'.
ملاحظة: يجب أن يكون وزن الفرق بين أنابيب تنبيذ فائق أدنى من 0.1 غ لضمان التشغيل الأمن أولتراسينتريفوجي. أولتراسينتريفوجيس هي خطرة قطعة من المعدات، ويمكن استخدامه فقط من قبل موظفين مدربين تدريبا سليما. - الطرد المركزي هذه الأنابيب في 301,580 س ز، استخدام دوار تيتانيوم زاوية ثابتة، ح 1 و 40 دقيقة في 12 درجة مئوية، باستخدام السرعة القصوى للتسارع والتباطؤ.
-
عناية إدراج إبرة حادة الفولاذ المقاوم للصدأ في 40% و 60% إيوديكسانول واجهة.
- إرفاق الإبرة حقنه 5 مل (الشكل 1E).
- نضح واضحة الكسر فقط، التي تحتوي على جزيئات النواقل.
ملاحظة: من إجمالي حجم تجمع حوالي 2.5 – 3 مل. تجنب جمع مواد من واجهة 25-40%، حيث سيؤدي هذا إلى زيادة مستوى التلوث في دفعة ناقلات النهائية، نظراً لوجود بروتينات غير مرغوب فيها. - عملية الكسر المجمعة (الملحي وتركيز) أو تخزينها بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية.
رقم 1: الإعداد لتنقية التدرج إيوديكسانول وجمع المتجهات اللاحقة- (أ) قبل بيبيتينج إيوديكسانول مختلف التدرجات في أنبوب تنبيذ فائق، "الماصة؛" حجم مناسب لكل حل إيوديكسانول في أنبوب مخروطي منفصل. (ب) ثم استخدم باستور "الماصة؛" لنقل كل حل إيوديكسانول تسلسلياً إلى أنبوب تنبيذ فائق: ينبغي إضافة طبقات بتركيز إيوديكسانول ارتفاع متزايد في الجزء السفلي من الأنبوب تحت المحددده السابقة. وقد أعد (ج) طبقة ناقلات النفط الخام على أعلى مرة التدرج. لا يستخدم هذا النظام جمع المتجهات الإبر الحادة، التي تنطوي على احتمال الإصابات 'مخاطر'. يتم إدخال إبرة حقنه 316 الفولاذ المقاوم للصدأ (د) عن طريق التدرج إيوديكسانول تصل إلى واجهة إيوديكسانول 40%/60%. ناقلات (ﻫ) جسيمات توجد في مرحلة إيوديكسانول 40% ويتم جمعها. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
3-الملحي وتركيز ناقل إف
ملاحظة: أداء هذا الجزء من البروتوكول يأخذ حوالي 2 ح.
- بريرينسي الغشاء عامل التصفية لتصفية الطرد المركزي بإضافة 5 مل 1 × برنامج تلفزيوني-عضو الكنيست، وأجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 4,000 س ز.
- إضافة 5 مل س 1 برنامج تلفزيوني-عضو الكنيست للكسر ناقلات إف المجمعة، مزيج ثم قم بإضافة الحجم الإجمالي لعامل التصفية. عند إضافة 1 x برنامج تلفزيوني-عضو الكنيست، ويلاحظ تعكر. أجهزة الطرد المركزي في س 4,000 ز حتى وحدة التخزين الحالية على تصفية على شكل مخروط قد انخفض إلى 1 مل. تجاهل-التدفق عبر المتراكمة في أنبوب جمع الخارجي.
- إضافة مل 13 س 1 عضو الكنيست-برنامج تلفزيوني لعامل التصفية على شكل مخروط وتكرار الطرد المركزي الخطوة عدة مرات حسب الضرورة (x 3 الحد الأدنى)، وحتى لا تعكر أكثر من الملاحظ عند x 1 جديدة يتم إضافة برنامج تلفزيوني-عضو الكنيست.
- في المباراة النهائية يغسل الخطوة، إضافة 13 مل برنامج تلفزيوني + الفاعل غير الأيونية 0.01% (v/v) وأجهزة الطرد المركزي في 4,000 س ز حتى يتم تقليل الحجم إلى 300 – 350 ميليلتر.
- جمع الكسر المتبقية الحالية على التصفية بيبيتينج حجم كامل في أنبوب ميكروسينتريفوجي تحاشي عقيمة.
ملاحظة: هذا جزء يحتوي على ناقل إف ديسالتيد ومركزة. في الخطوات التالية من هذا البروتوكول، يشار إلى هذا الكسر الكسر 'الأولية'. تأكد من أن التعامل مع الأنبوب تحت غطاء محرك السيارة وتخزينها في 4 درجات مئوية. - شطف عامل التصفية مع 200 ميليلتر من 1 × MK برنامج تلفزيوني لجمع جزيئات النواقل المتبقية الإبقاء على عامل التصفية. جمع في أنبوب ميكروسينتريفوجي عقيمة.
ملاحظة: وهذا مخزون ناقلات مخفف، التي قد تكون مناسبة لبعض التطبيقات التي تتطلب أقل ناقل التتر. في الخطوات المقبلة، يشار إلى هذا الكسر الكسر 'الثانوي'. - للتخزين القصير الأجل، وتخزين fraction(s) متجه عند 4 درجة مئوية (أقل من أسبوعين). قاسمة ومخزن المتجه في ‑20 درجة مئوية عند التخزين على المدى الطويل المطلوب.
- تنفيذ مراقبة الجودة كما هو موضح في القسم 4.
4-معايرة ناقلات بالكمية تفاعل البوليميراز المتسلسل
ملاحظة: أداء هذا الجزء من البروتوكول يأخذ تقريبا 3 ح.
-
المنحنى المعياري
- لينيريزي بلازميد معربا عن التحوير (بترانسجيني) تستخدم تعداء الخلايا HEK-293T في الباب 1.
- إعداد مزيج خلاصة القيد في أنبوب ميكروسينتريفوجي 0.5 مل (الرجوع إلى الجدول 2 لتكوين مزيج خلاصة القيد).
ملاحظة: ضبط تكوين مزيج خلاصة القيد وفقا لأنزيم المستخدمة والمبادئ التوجيهية ذات الصلة من الشركة المصنعة. - احتضان مزيج خلاصة القيد ح 1 في 37 درجة مئوية.
- التحقق من كفاءة الهضم التقييد بتشغيل بلازميد خطية نسبة 0.8% (w/v) [اغروس] هلام في 100 الخامس لهضم حاء 1 كاملة بلازميد ينبغي أن ينتج جزء واحد من حجم محدد.
- تنقية بلازميد الخطي الحمض النووي باستخدام مجموعة أدوات تنقية بكر، اتباع إرشادات الشركة المصنعة24، وقياس تركيز الحمض النووي مع جهاز المطياف الضوئي بقياس الامتصاص في 260 نيوتن متر. بعد المعايرة، تخزين قاسمة المتبقية من بلازميد الخطي في ‑20 درجة مئوية لاستخدامها مرة أخرى.
- حساب الجزيئات (أي نسخ الحمض النووي) المخزون بلازميد كل ميكروليتير على النحو التالي.
- أولاً، حساب الوزن الجزيئي بلازميد. وعلى افتراض أن متوسط وزن زوج قاعدة الحمض النووي (bp) 650 دالتونس (دا) وأن الخلد واحد من bp يزن 650 غ، يمكن تقدير الوزن الجزيئي لأي قالب الحمض النووي المزدوج-الذين تقطعت بهم السبل بأخذ المنتج طول (في شركة بريتيش بتروليوم) والوزن لكل زوج قاعدي.
بلازميد الوزن الجزيئي [غ/مول] = حجم بلازميد [بي بي] x 650 [دا/bp] - وبعد ذلك، حساب عدد جزيئات بلازميد كل ميكروليتير.
جزيئات بلازميد الواحدة ميكروليتير = بلازميد تركيز [ز/ميليلتر]/الوزن الجزيئي بلازميد [غ/مول]
ملاحظة: هو معكوس الوزن الجزيئي عدد جزيئات بلازميد موجودة في 1 غرام المواد. - ثم، حساب عدد جزيئات بلازميد الواحدة ميكروليتير، استخدام عدد أفوجادرو (6.022 × 1023 الجزيئات/مول).
جزيئات بلازميد الواحدة ميكروليتير = جزيئات بلازميد الواحدة ميكروليتير [جزيئات/ميليلتر] × عدد أفوجادرو في [جزيئات/مول] - وأخيراً، تضعف الأسهم بلازميد (الجزيئات/ميليلتر) للحصول على حل 100 ميليلتر بتركيز 1 × 109 جزيئات (الجينوم المتجهات (vg) كل ميكروليتير) المطلوب.
بلازميد الأسهم (100 ميليلتر) = (التركيز المطلوب [جزيئات/ميليلتر] × 100 ميليلتر)/بلازميد الجزيئات [جزيئات/ميليلتر]
- أولاً، حساب الوزن الجزيئي بلازميد. وعلى افتراض أن متوسط وزن زوج قاعدة الحمض النووي (bp) 650 دالتونس (دا) وأن الخلد واحد من bp يزن 650 غ، يمكن تقدير الوزن الجزيئي لأي قالب الحمض النووي المزدوج-الذين تقطعت بهم السبل بأخذ المنتج طول (في شركة بريتيش بتروليوم) والوزن لكل زوج قاعدي.
- جعل المسلسل تخفيف المخزون بلازميد (1 × 109 vg/ميليلتر) في تريبليكاتيس:
10 ميليلتر من الأسهم بلازميد vg/ميليلتر9 1 × 10 + 90 ميليلتر من ح2س = 1 × 108 vg/ميليلتر الحل
10 ميليلتر لتمييع vg/ميليلتر8 1 × 10 + 90 ميليلتر من ح2س = 1 × 107 vg/ميليلتر الحل
10 ميليلتر لتمييع vg/ميليلتر7 1 × 10 + 90 ميليلتر من ح2س = 1 × 106 vg/ميليلتر الحل
10 ميليلتر لتمييع vg/ميليلتر6 1 × 10 + 90 ميليلتر من ح2س = 1 × 105 حل جيد جداً/ميليلتر
الاستمرار في الحصول على حل جيد جداً/ميليلتر1 1 × 10. - الحفاظ على تخفيف المسلسل المخزون بلازميد القياسية على الجليد حتى تحميلها على لوحة قبكر (الفرع 4-3).
| المكون | المبلغ |
| 10 × إنزيم التقييد المخزن المؤقت | 5 ميليلتر |
| إنزيم التقييد | 2، 5 ميليلتر |
| بلازميد | 5 ميكروغرام |
| ح2س | ما يصل إلى 50 ميليلتر |
الجدول 2: تقييد خلاصة مزيج التكوين.
الجدول 3: الأوراق المالية بلازميد حجم حاسبة. اضغط هنا لتحميل هذا الجدول.
-
استخراج الحمض النووي من موجه إف
- ميكس 2 ميليلتر من إف ناقلات الأسهم (جزء أساسي من الخطوة 3، 5) مع ميليلتر 198 من الدناز المخزن المؤقت (س 1) في قطاع الأنابيب (أنابيب PCR) وإضافة 2 ميليلتر من الدناز أنا.
ملاحظة: الدناز سوف الحط من أي مادة وراثية غير موجود داخل قفيصه المتجهات (التي تشوه نتائج qPCR). ويشار إلى هذا الحل تمييع 'dil1 × 10-2'. - احتضان لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية، تليها 10 دقيقة عند 95 درجة مئوية.
ملاحظة: البروتوكول يمكن أن يتوقف عند هذه النقطة، ويمكن تخزين المواد إلى أجل غير مسمى في 4 درجات مئوية، لتجنب تدهور المنتج. - إضافة 2 ميليلتر من البروتيناز ك إلى الحل dil1 × 10-2 (الخطوة 4.2.1) واحتضانها لمدة 60 دقيقة عند 50 درجة مئوية، تليها 20 دقيقة عند 95 درجة مئوية.
ملاحظة: هذه الخطوة سوف تفكيك قفيصه ناقل إف والإفراج عن الجينوم ناقل إف في الحل. إضافة بروتيناز ك الزائدة كما لا يعرف البروتين (قفيصه) المحتوى العينة. ملاحظة، من الضروري لضمان أن تتم إزالة كافة بروتيناز ك النشاط التي تمسخ، قبل قبكر، لتجنب حدوث مشاكل مع تدهور بوليميراز (الجزئية) التي تؤثر على النتيجة النهائية. - إعداد 01:10 تخفيف المسلسل الحل dil1 × 10-2 ك تعامل البروتيناز (الخطوة 4.2.3) في أنابيب ميكروسينتريفوجي 1.5 مل على النحو التالي:
10 ميليلتر dil1 × 10-2 + 90 ميليلتر من ح2س = dil1 × 10-3 إضعاف
10 ميليلتر dil1 × 10-3 + 90 ميليلتر من ح2س = dil1 × 10-4إضعاف
10 ميليلتر سdil1 و x 10-4 + 90 ميليلتر من ح2س = dil1 × 10-5 إضعاف - الاحتفاظ تخفيف المسلسل من الحمض النووي المستخرج من ناقلات على الجليد حتى تحميلها على لوحة قبكر (الفرع 4-3).
- ميكس 2 ميليلتر من إف ناقلات الأسهم (جزء أساسي من الخطوة 3، 5) مع ميليلتر 198 من الدناز المخزن المؤقت (س 1) في قطاع الأنابيب (أنابيب PCR) وإضافة 2 ميليلتر من الدناز أنا.
-
المعايرة "الأخضر سيبر" المستندة إلى الكشف عن قبكر
- إعداد مزيج qPCR الرئيسي في أنبوب ميكروسينتريفوجي 1.5 مل، لكل من العينة والمعايير. استخدام 10 ميليلتر من "سيبر الأخضر ماجستير المزيج"، 1 ميليلتر التمهيدي إلى الأمام (الأوراق المالية 10 ميكرومتر)، 1 ميليلتر لعكس التمهيدي (10 ميكرون الأسهم) وميليلتر 3 ح2س في رد فعل. انظر البروتوكول في الجدول 4 لمتواليات التمهيدي.
- "الماصة؛" مزيج الرئيسي qPCR صعودا وهبوطاً، ولكن لا دوامة.
- إضافة 15 ميليلتر من مزيج الرئيسي قبكر، تليها أما 5 ميليلتر من المنحنى المعياري الذي أعد في الفرع 4-1 أو الحمض النووي المستخرج من ناقل إف في الفرع 4-2، في كل بئر. وتشمل ثلاثة آبار تتضمن فقط qPCR الرئيسي المزيج، كعنصر سلبي. الرجوع إلى الرقم 2 لتخطيط اللوحة.
- ختم اللوحة مع فيلم ختم والطرد المركزي باختصار لوحة قبكر في 1,500 س ز لمدة 30 ثانية في 4 درجات مئوية.
- تشغيل رد فعل qPCR المستندة إلى لوحة أداة في الوقت الحقيقي PCR التضخيم والكشف، باستخدام الشروط المقترحة في الجدول 5.
| اسم الدليل | التسلسل |
| التمهيدي إلى الأمام | --كككاكتجكاجتاكاتكا 5 '-3' |
| عكس التمهيدي | --جككاجتاجااجتكككات 5 '-3' |
الجدول 4: تسلسل التمهيدي مصممة ضد مروج CBA.
رقم 2: تخطيط لوحة لمعايرة ناقلات القائم على قبكر- يتم ترميز العينات: أخضر = المنحنى المعياري؛ أزرق = ح2س التحكم؛ رمادي = الكسر الابتدائي؛ اللون البرتقالي = ثانوي الكسر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
| الخطوة | الوقت | درجة الحرارة | دورات | والهدف |
| ما قبل الحضانة | 5 دقيقة | 95 درجة مئوية | x1 | الحمض النووي بوليميريز وتمسخ التنشيط (رد فعل ابدأ الساخنة). |
| التضخيم | 10 دقيقة | 95 درجة مئوية | x1 | التضخيم من الحمض النووي. يمكن تحسين الإعدادات إذا استخدمت كبسولة تفجير البديلة مع درجة حرارة انلينغ مختلفة. |
| 10 s | 95 درجة مئوية | x40 | ||
| 40 s | 60 درجة مئوية | |||
| 1 s | 72 درجة مئوية | |||
| التبريد | 10 s | 40 درجة مئوية | x1 | لوحة التبريد. نهاية ال [بكر]. |
الجدول 5: بروتوكول الدراجات الحرارية لمعايرة سيبر qPCR المستندة إلى الأخضر.
-
تحليل البيانات لتحديد عيار ناقل إف
- ملء خلايا جدول البيانات (الجدول 6 ألف) مع القيم المقطعية التي تم الحصول عليها لتخفيف المختلفة للعينة القياسية في الفرع 4-1 على استعداد لإنشاء منحنى قياسي.
ملاحظة: سيظهر في معادلة المنحنى القياسي (y = ln (x) + ب) جنبا إلى جنب مع الكفاءة2 R(الجدول 6 باء). يجب أن يكون قبكر كفاءة ما يقرب من 100 ٪ و آر2 قريبة من 1.0 (≥ 0.96). - استخدم القيم المحسوبة من و ب لملء الخانات البيانات المقابلة في جدول البيانات (الجدول 6).
- استكمال جدول البيانات مع قيم الأشعة المقطعية التي تم الحصول عليها لتخفيف مختلفة من العينة إف أعد في الجزء 4-2.
- حساب عيار إف متوسط على ناقلات في جينومات ناقل كل ميكروليتير الكسر 'الأولية' باستخدام الصيغة التالية:
ملاحظة: يستخدم العنصر 400 للجينوم واحد الذين تقطعت بهم السبل، بينما استخدام الجينوم اتفاقية استكهولم عامل ضرب من 20025. في الواقع، ككميات الحمض النووي المزدوج خلال كل دورة قبكر، اتفاقية استكهولم الحمض النووي الكشف عن x 2 بالمقارنة جينوم ss. هدف المعايرة لحساب التركيز من حيث جينومات ناقل كل ميكروليتير. تصحيح ضروري لتشغيل في قبكر عند استخدام 2 ميليلتر من ابتداء من المواد (الخطوة 4.2.1). ديل تمثل عوامل التخفيف من الخطوة 4-2-4. ويمكن حساب عيار الكسر ناقلات إف 'الثانوية' (الخطوة 3، 6) في وقت واحد.
- ملء خلايا جدول البيانات (الجدول 6 ألف) مع القيم المقطعية التي تم الحصول عليها لتخفيف المختلفة للعينة القياسية في الفرع 4-1 على استعداد لإنشاء منحنى قياسي.
الجدول 6: نموذج لتحليل البيانات قبكر- اضغط هنا لتحميل هذا الملف.
5-نقاء سيطرة الحزب الديمقراطي الصربي صفحة وتلطيخ الفضة
ملاحظة: أداء هذا الجزء من البروتوكول يأخذ حوالي 5 ح.
- استخدام الإيثانول 70% (v/v) بدقة تنظيف ألواح الزجاج المستخدمة لصب المواد الهلامية.
- تجميع نظام صب جل. تكفل زميله القيعان من ألواح الزجاج هي لا، لمنع تسرب خليط مادة اكريلاميد عند الصب الهلام.
- إعداد التراص والحلول جل حل في اثنين من أنابيب مخروطية الشكل منفصلة 50 مل. حذف تيتراميثيليثيلينيدياميني (تيميد) وفوق كبريتات الأمونيوم 10% (w/v) (الجزائرية)، كما أنها مسؤولة عن بلمرة الجل. أضف لهم فورا قبل الصب الهلام.
ملاحظة: النسبة المئوية النهائية لمادة اكريلاميد في الهلام التأثيرات الشخصية فصل البروتينات: عادة ما يكون تركيز 10% (v/v) نهائية لمادة اكريلاميد كافية لاختبار نقاء إعداد ناقلات إف. - المزيج بلطف بدوامات الأنبوب الذي يحتوي على مكونات هلام. لا لا دوامة، نظراً للأوكسجين المفرط يمكن أن يعوق البلمرة.
- إضافة تيميد و 10% (w/v) وكالة الأنباء الجزائرية بحل جل حل. خلط وثم تصب في حامل جل حتى تصل إلى 1-2 سم تحت الجزء العلوي من اللوحة الزجاجية الصغيرة.
- ضع طبقة من المياه المشبعة وبيوتانول على رأس هذا الخليط الاكريلاميد. وهذا يضمن تشكيل سطح مستو أثناء البلمرة. لا تترك الجل تحت الكحول لمدة أطول من 30 دقيقة هذا سوف يذوي الجل وتخل بوظيفتها.
تنبيه: وبيوتانول الخطرة في حالة تماس الجلد. ويعرض أيضا على خطر الحريق. التعامل مع الرعاية. - انتظر هلام بلمرة وثم صب قبالة وبيوتانول. تلميح: تحقق لمعرفة ما إذا كان قد وطدت مزيج هلام الزائدة في الأنبوب. يحدث في أقل من 20 دقيقة أغسل السطح من الجل مع ح2س البلمرة والجاف ثم استخدام المناشف الورقية، مع الحرص على عدم تعكير سطح الهلام.
- إضافة تيميد و 10% (w/v) وكالة الأنباء الجزائرية أن جل التراص، وصب الجل في حامل جل فوق جل فصل.
- ضع المشط المتوفرة في الهلام. تنفيذ هذا الإجراء مع حركة واحدة ثابتة لتجنب تكوين فقاعات الهواء داخل الآبار.
- الانتظار لمدة 20 دقيقة على الأقل للهلام بلمرة. تلميح: تحقق من إذا خلط الجل الزائد الأنبوبة المخروطية وقد وطدت.
- إعداد يمزج اثنين (الجدول 7) للمرحلة الابتدائية واف الثانوي ناقلات الكسور (خطوات 3.5 و 3.6، على التوالي).
| ارتفاع المبلغ | انخفاض كمية | |
| الأسهم ناقلات إف | 5 ميليلتر | 1 ميليلتر |
| 5 x عينة المخزن المؤقت | 3 ميليلتر | 3 ميليلتر |
| ح2س | 7 ميليلتر | ميليلتر 11 |
الجدول 7: تكوين يمزج العينة المطلوبة لتلطيخ الفضة.
- تجريدها تماما يمزج عينة بتدفئة لهم لمدة 5 دقائق في 95 درجة مئوية. تجميع الدبابة التفريد، مع الاهتمام باتجاه القطب.
- ملء الخزان مع 1 x الكاثود العازلة داخل الجمعية القطب و 1 × العازلة اﻷنود في الخارج.
ملاحظة: يمكن إعادة تدويرها من التشغيل لتشغيل المخزن المؤقت اﻷنود. يجب دوماً استخدام المخزن المؤقت الكاثود الطازجة. - إزالة المشط من الجل وتنظيف آبار الجل مع 1 x الكاثود المخزن المؤقت.
- تحميل 1 ميليلتر من سلم البروتين في بئر. تحميل يمزج عينة في آبار مختلفة على نفس الجل (الشكل 3). تشغيل الهلام في 50 الخامس حتى إدخال العينات هلام حل. ثم زيادة الجهد إلى 100 الخامس إلى الجبهة صبغ يصل إلى الحد الأدنى من الجل.
- استخراج الجل بعناية من ألواح الزجاج والفضة تلطيخ كيت (وفقا لإرشادات الشركة المصنعة26) لتصور الفيروسية بروتينات (مفارز VP1 و VP2 VP3) التي تتألف منها قفيصه إف، كذلك فيما يتعلق بالتحقق من إمكانية استخدام تلوث البروتين (الشكل 3).
رقم 3: تقييم نقاء المتجهات باستخدام صفحة الحزب الديمقراطي الصربي وتلطيخ الفضة. استخدام هلام تريسيني--الحزب الديمقراطي الصربي، وتم فصل 5 ميليلتر من مختلف الأعمال التحضيرية متجه. في وقت لاحق تم الكشف عن البروتينات تلطيخ الفضة. ناقلات تعتبر النقي عندما VP1 (كاتشين 82)، VP2 (كاتشين 67)، و VP3 (60 كاتشين) تظهر في 1:1: نسبة 10 (لين 1)، دون خلفية المفرط (لين 2) أو عصابات غير محددة (لين 3). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Representative Results
واعتبر AAV9، حتى وقت قريب، لتكون النمط الأكثر فعالية المصلي إف ناقلات المسيطر في عبور بي بي بي وترانسدوسينج خلايا الجهاز العصبي المركزي، بعد الإدارة الطرفية. قد حققت تقدما كبيرا في تصميم قفيصه عند ديفيرمان وآخرون عن استخدام أسلوب اختيار قفيصه تسمى لجنة المساواة العرقية المستندة إلى جزئ تطور استهدفت إف (إنشاء)17. باستخدام هذا الأسلوب، وحددوا من قفيصه جديد، المسمى بي. ب، وأفادوا بأنها قادرة على ترانسدوسي غالبية astrocytes والخلايا العصبية في مناطق متعددة في الجهاز العصبي المركزي، بعد حقن الجهازية17. عند هذه النقطة، فإنه ينبغي أن تكون لاحظت أنه حتى ولو بي إتش بي. ب يوفر نتائج إيجابية في فئران C57/Bl6 (الذي كان الضغط المستخدمة في التجارب الأولية العزلة)، وتفيد التقارير الأولية قد تختلف كفاءتها بطريقة تعتمد على إجهاد. لا شك في أن تجارب أخرى ستلقى المزيد من الضوء على هذه القضية31.
ومع ذلك، وعلى الرغم من هذه القضايا، بي. ب يوفر إمكانيات مثيرة للتلاعب بالجينات موسع في الجهاز العصبي المركزي الفئران، بما في ذلك تجارب العلاج بالجينات لمفهوم الإثبات في نماذج المرض. على هذا النحو، اخترنا لتقييم كفاءة التعبير التحوير باستخدام بي إتش بي. ب مقابل AAV9، التي كانت متجه "المعيار الذهبي" لتوصيل الجهاز العصبي المركزي عقب الطرفية الإدارة منذ 20092. لإجراء مقارنة مباشرة للقاح على حد سواء، تحت الظروف المثلى للتعبير التحوير، استخدمنا اتفاقية استكهولم جينوم تكوين32. كلا ناقلات إجراء التحوير للبروتينات الفلورية الخضراء (بروتينات فلورية خضراء) تحت سيطرة المروج β-أكتين (CBA) الدجاج في كل مكان. فئران C57/Bl6 الإناث عند الولادة يوم 42 (حوالي 20 غرام في الوزن) تلقي جرعة مقدارها 1 × 1012 vg كل الماوس أما scAAV2/بي. ب-CBA-التجارة والنقل أو scAAV2/9-المصرف المركزي-التجارة والنقل. وكانت إدارة ناقلات المؤداة عن طريق حقن الوريد الذيل. التجارب التي أقرتها "اللجنة الأخلاقية" "وفين كو".
بوستينجيكشن ثلاثة أسابيع، خضع الفئران نضح ترانسكارديال مع برنامج تلفزيوني المثلج، تليها 4% (w/v) بارافورمالدهيد المثلج (منهاج عمل بيجين). كانت تحصد ادمغتهم وخضع المزيد من بوستفيكسيشن قبل حضانة بين عشية وضحاها في مثبت نفسه، قبل نقل إلى 0.01% (w/v) غ-أزيد/برنامج تلفزيوني لتخزين حتى إجراء مزيد من التحليل. بعد ذلك، كانت مقطوع العقول باستخدام مبضع تهتز، وأجرى immunohistochemistry على 50 ميكرومتر سميكة المقاطع.
لتقييم مستويات التعبير التحوير، الأبواب كانت ملطخة بالأجسام المضادة الأولية ضد التجارة والنقل (الأرنب المضادة-التجارة والنقل)، مع الكشف عن استخدام الأجسام المضادة الثانوية مترافق بصبغة فلورسنت (المضادة أرنب أليكسا فلور 488) (الشكل 4A، ب ). أكدت قياسات كثافة الفلورية (بوحدات التعسفي [الاتحاد الأفريقي]) زيادة كبيرة في التجارة والنقل التعبير عند اتفاقية استكهولم الجينوم وبي إتش بي. وقد استخدمت قفيصه ب بالنسبة AAV9. وقد لوحظت زيادات في التجارة والنقل في المخ (2105 ± 161 مقابل 1441 ± 99 الاتحاد الأفريقي؛ p = 0.0032)، المخيخ (2601 ± 196 مقابل 1737 ± 135 للاتحاد الأفريقي؛ p = 0.0032)، وجذع الدماغ (3082 ± 319 مقابل 2485 ± 88 الاتحاد الأفريقي؛ p = 0.0038) (الشكل 4).
الشكل 4: تسليم الجهازية scAAV2/بي. ب-CBA-التجارة والنقل يؤدي إلى تعبير بروتينات فلورية خضراء عالية في الجهاز العصبي المركزي. scAAV2/بي. ب-CBA-التجارة والنقل أو scAAV2/9-المصرف المركزي-التجارة والنقل (1 × 1012 vg/الماوس) تدار على فئران C57/Bl6 عمره 6 أسابيع عن طريق حقن الوريد الذيل. بروتينات فلورية خضراء تم الكشف عن استخدام إيمونوهيستوتشيميستري في المخ الاكليلية المقاطع 3 أسابيع بوستينجيكشن. (أ) المخ و (ب) ترد في المخيخ وجذع الدماغ. تغيير حجم أشرطة = 1 مم-(ج) أجرى التقدير الكمي كثافات fluorescence النسبي لتحديد مستويات بروتينات فلورية خضراء إشارة تحقق مع كل ناقل (10 أقسام كل الماوس؛ الفئران الثلاثة كل مجموعة المتجهات). وأجرى اختبار ANOVA أحادي اتجاه، يليه-التائي t-اختبار؛ يتم التعبير عن البيانات كما يعني ± الانحراف المعياري؛ ف < 0.01؛ الاتحاد الأفريقي. وحدات التعسفي. بكابسيد، تستخدم لإنتاج ناقلات إف، يحتوي على الجينات مندوب من النمط المصلي المسيطر 2 و الجينات كاب من النمط المصلي المسيطر بي. ب أو AAV9، وبناء على ذلك. وقد تم تعديل هذا الرقم من رينكون et al.32. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Discussion
إنتاج المؤتلف إف المتجهات الموصوفة هنا استخدامات المواد والمعدات المشتركة بين معظم مختبرات البيولوجيا الجزيئية ومرافق الثقافة الخلية. أنها تسمح للمستخدم بالحصول على ناقلات إف الصف الخالص الإكلينيكية، والتي يمكن استخدامها لاستهداف أنواع متعددة من الخلايا والأنسجة عبر مجموعة من التطبيقات في المختبر و في فيفو . واحد من أعظم مزايا هذا البروتوكول، مقارنة بالآخرين (أي تنقية المستندة إلى CsCl)، هو أقصر وقت العمل اللازم. جاهزة للاستخدام إف الناقلة التي يمكن الحصول عليها في مدة أقصاها 6 أيام عمل بعد تعداء الأولية للخلايا HEK293T.
وهناك عدة عوامل يمكن أن تؤثر سلبا على العائد النهائي أو نوعية ناقل إف. تعداء ضعف الكفاءة واحد من الأسباب الرئيسية لمنخفضة غلة فيروسية33. توصية رئيسية هي استخدام خلايا HEK293T التي قد لا باساجيد أكثر من 20 مرة ولا تملك التقاء خلية أكبر من 90% في وقت تعداء21. وبالإضافة إلى ذلك، قد تعداء الأسلوب المحدد لها تأثير كبير على النتائج. ويستند هذا البروتوكول استخدام بي. بي هو بوليمر الموجبة مع القدرة على توصيل خارجية الحمض النووي لنواة الخلية من خلال توليد مركبات البوليمر والحمض النووي، المعروفة باسم بوليبليكسيس، التي يتم تناولها بالخلية والمتجر بهم عن طريق اندوسوميس34. تعداء المستندة إلى جزيرة الأمير إدوارد سهل وسريع لتنفيذ، وعلى النقيض من الأساليب الأخرى المستخدمة على نطاق واسع، مثل الترسيب المشارك من الحمض النووي مع فوسفات الكالسيوم35. أيضا، على أساس بي تعداء أرخص بكثير بالمقارنة مع أساليب أخرى أدخلت حديثا، مثل استخدام الدهون الموجبة والمغناطيس بوساطة تعداء36.
استراتيجية تنقية تلعب دوراً رئيسيا في البروتوكول. ومقارنة بالأساليب الأخرى، تنقية المستندة إلى إيوديكسانول تميل إلى تحتوي على نسبة أعلى من الجسيمات الفيروسية فارغة (20 في المائة)20. وهذا يقابل، إلى حد ما، حقيقة أن تنقية إيوديكسانول-على أساس نتائج بشكل روتيني في الاستعدادات ناقل إف مع نسبة الجسيمات للعدوى أقل من 100. وهذا يمثل تحسنا كبيرا بالمقارنة مع الإجراءات التقليدية المستندة إلى CsCl، الذي هو خسارة كبيرة للعدوى الجسيمات عنها37. أسلوب بديل مشترك آخر لتنقية ناقلات إف تنقية المستندة إلى الفصل اللوني. ومع ذلك، هذا الأسلوب قد العيب الرئيسي عمود معين مطلوب لكل ناقل قفيصه المستخدمة: فعلى سبيل المثال، حين معزولة تقليديا باستخدام أعمدة الهيبارين AAV2، هذه المنهجية لا يعمل مع AAV4 و AAV5، التي لا تملك الهيبارين الملزمة مواقع في هذه كابسيدس38. وبالنظر إلى أن تنقية اللوني أيضا باهظة الثمن، تنقية المستندة إلى إيوديكسانول عموما أكثر ملاءمة للمختبرات التي ترغب في إنتاج دفعات عالية الجودة من ناقلات إف على نطاق صغير33،39، 40-ومع ذلك، لتعظيم العائد النهائي ونقاء ناقل، الحذر الشديد مطلوب عند صنع التدرجات إيوديكسانول. إيوديكسانول الكسور المختلفة ينبغي أن تنقل إلى أنبوب تنبيذ فائق باستخدام ماصة باستور عقيمة نصيحة الذي لمس جدار الأنبوبة: يجب طرد إيوديكسانول من الماصة ببطء وباستمرار. كما تتراكم الجزيئات متجه في طبقة إيوديكسانول 40 ٪، يحتاج الرعاية الواجب اتخاذها لضمان أن الواجهات التدرج لا تخلط20. وأخيراً، ينبغي أن يمكن استردادها الكسر التي تحتوي على الناقل بإدخال إبرة حادة الفولاذ المقاوم للصدأ مع مقياس ليس أكبر من 20 غ. لتحقيق أقصى قدر من الانتعاش متجه، ينبغي استرداد الكسر واضحة في مجملها. أثناء هذه الخطوة، التوقيت أمر بالغ الأهمية. لتجنب المساس بنقاء الإعداد، من الضروري أن تتوقف عن جمع قبل أن يتم جمع المراحل الأخرى (تلويث) التدرج.
الاختلافات في عيار المتجهات التي تم الحصول عليها يمكن أن يعزى أيضا إلى القدرة الجوهرية ناقل لإنتاج جزيئات تعبئتها. مقارنة بين مختلف إف اللقاح وأظهرت أن بعض ناقلات إف أكثر صعوبة لإنتاج في عيار أعلى من غيرها (مثلاً، AAV2)41. يمكن أن يكون سبب المحتمل عيار أقل هطول الأمطار خلال الخطوة desalting، ناقل، ومنعت بسهولة عن طريق تجنب اكتظاظ33. وعلاوة على ذلك، من الممكن أيضا أن كفاءة تنقية إيوديكسانول على أساس التدرج يختلف قليلاً بين اللقاح، وعليه، يمكن ملاحظة اختلافات في عيار الحصول عليها مع الأنماط المختلفة41.
وأخيراً، فإنه يحتاج إلى تجدر الإشارة إلى أنه على الرغم من أن قبكر أسلوب دقيق جداً للتحديد الكمي الحمض النووي يمكن ملاحظة بعض التغير المتأصلة في هذه التقنية. الدقة في المعايرة يعتمد أساسا على بيبيتينج دقيقة وفورتيكسينج السليم لكافة الحلول. يمكن ضمان عيار الأكثر دقة القراءة، تتكرر في قبكر بشكل مستقل، وحساب متوسط القيم التي تم الحصول عليها. اختيار الإشعال المعروضة في هذا البروتوكول يستند إلى تسلسل المروج CBA يقع في بلازميد بترانسجيني المستخدمة في المختبر. هو مروج CBA مروج اصطناعية قوية يستخدم على نطاق واسع في مجال مكافحة ناقلات للتعبير بالسيارة عبر العديد من أنواع الخلايا. وهو يتضمن العديد من العناصر، بما في ذلك عنصر محسن المبكر الفيروس المضخم للخلايا (CMV)؛ المروج وأول إكسون إنترون الأولى من الجينات CBA؛ ويقبلون لصق الجينات بيتا جلوبين الأرانب. ومع ذلك، يمكن تصميم كبسولة تفجير لتقريبا أي عنصر يقع ضمن كاسيت التعبير (بما في ذلك في المروج والتحوير والعناصر التنظيمية). مقارنة عيار عبر دفعات من الممكن أيضا، توفير الإشعال المستخدمة ضد المناطق المشتركة للناقلات في السؤال.
وفي الختام، يمكن استخدام هذا البروتوكول لإنتاج ناقلات إف مع مجموعة متنوعة من كابسيدس وتكوينات الجينوم وأنواع المروج والشحنات التحوير. هذا سوف تسمح للمستخدمين بسهولة التكيف مع خصائص النهائي لإيصالها إلى أفضل ما يناسب احتياجات التجريبية. في المقدمة في نتائج تمثيلية، مثال استخدام بي إتش بي. قفيصه ب، التي تعبر BBB كفاءة، أعطى التعبير الجيني ذات كفاءة عالية في الجهاز العصبي المركزي، حقن الوريد ذيل التالية32. الإدارة المنهجية لناقلات الاختراق الجهاز العصبي المركزي له مزايا كبيرة من حيث الآثار الجانبية المحتملة2،،من1732. بديل ممكن لحقن الطرفية، مع تجنب المحاذير التقنيات الغازية، هو التسليم إينتراثيكال، الذي يتكون من تسليم ناقل إف في السائل الدماغي النخاعي. وقد ثبت هذا الطريق التسليم لتكون فعالة، يظهر التعبير على نطاق واسع للتحوير عبر الجهاز العصبي المركزي، أقل آثار خارج الهدف في الأجهزة الطرفية، وانخفاض مستويات الاستجابة المناعية42. ومع ذلك، يتم حقن intrathecal تحديا أكبر بكثير، كما أنها تتطلب مهارات تقنية أعلى من حقن الوريد الذيل.
مزيد من التطوير قفيصه لصقل هذه التكنولوجيا سوف يكون مدفوعا بالفرص المتاحة لاستخدام ناقل إف في تطبيقات العلاج بالجينات. مثل هذا النهج يتيح إمكانيات جذابة لعلاج اضطرابات الجهاز العصبي المركزي حاليا المستعصية، مثل التصلب العضلي الجانبي-شاركو ماري الأسنان المرض والرعاش ومرض الزهايمر18.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
محمد معتمد من قبل فوندز voor ويتينشابيليجك أونديرزوك Vlaanderen (فو) زمالات ما بعد الدكتوراه (133722/1204517N)، وتعترف بالدعم المستمر من مؤسسة القلب والأوعية الدموية في كولومبيا وقسم العلوم الإدارية، التكنولوجيا والابتكار (منحة CT-FP44842-307-2016، رمز المشروع 656671250485). م. م. معتمد من قبل زمالة دكتوراه فو (1S48018N). وأيده M.G.H. منحة الحاصلة المؤسسية والدعم الخارجي من تييري لاتران مؤسسة (الهيئة العامة للسدود-VIP)، ومؤسسة لأبحاث مرض الزهايمر (ساو-FRA) (P #14006)، فو (منحة 1513616N)، ومجلس البحوث الأوروبي (المنسق) (ابتداء من المنح 281961-أستروفونك؛ والدليل على مفهوم المنح 713755--الإعلان--كبار الشخصيات). المؤلفون تعترف Haughton جاسون لمساعدته مع تربية الماوس، كاستالدو ستيفاني لمساعدة لها القيام بحقن الوريد الذيل، وكارولين ايكينس لتوفير صور transfected HEK293T الخلايا. وتسلم M.G.H. مايكل دنلوب، وبيتر هيكمان، وعميد هاريسون.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plasmid production | |||
| pTransgene plasmid | De novo design or obtained from a plasmid repository | N/A | See step 1 of main protocol for further details |
| pCapsid | De novo design or obtained from a plasmid repository | N/A | See step 1 of main protocol for further details |
| pHelper | Agilent | 240071 | |
| Plasmid Plus maxi kit | Qiagen | 12963 | |
| QIAquick PCR purification Kit | Qiagen | 28104 | |
| AAV Helper-Free System | Agilent | 240071 | |
| Cell culture and transfection | |||
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM), high glucose, no glutamine | Life technologies | 11960-044 | Supplement DMEM with FBS (1% or 10% v/v) and GlutaMAX 200 mM (1% v/v) then filter sterilize the medium using a 0.22 µm filter |
| Fetal bovine serum (FBS) | GIBCO | 10500-064 | |
| GlutaMAX supplement | GIBCO | 35050038 | |
| (200 mM) | |||
| Corning bottle-top vacuum filter system | Sigma-Aldrich | CLS430769 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (DPBS) with no calcium and no magnesium | GIBCO | 14190094 | |
| HEK293T cells | American Tissue Culture Collection | CRL3216 | Upon receipt, thaw the cells and culture as described in the protocol. After a minimal number of passages, freeze a subfraction for future in aliquots. Always use cells below passage number 20. Once cultured cells have been passaged more than 20 times, restart a culture from the stored aliquots |
| Cell culture dishes | Greiner Cellstar | 639160 | 15 cm diameter culture dishes |
| Cell scrapers | VWR | 10062-904 | |
| Polyethylenimine (PEI) | Polyscience | 23966-2 | PEI in powder form is dissolved at 1 µg/µL in deionized water (ddwater) at pH=2 (use HCl). Prepare in a beaker and stir for 2-3 h. When dissolved, bring the pH back to 7 with NaOH. Filter sterilize and store the resuspended stock solution in 1 ml aliquots at -20 °C. PEI aliquots can be freeze/thawed multiple times. |
| Virkon solution | Fisher Scientific | NC9821357 | Disinfect any material that has been in contact with assembled vector particles with Virkon solution |
| Mutexi long-sleeve aprons | Fisher Scientific | 11735423 | Wear an apron over the top of a regular lab coat |
| Fisherbrand maximum protection disposable overshoes | Fisher Scientific | 15401952 | |
| AAV Purification and desalting | |||
| Optiprep density gradient medium | Sigma-Aldrich | D1556 | Optiprep is a 60% (w/v) solution of iodixanol in water (sterile). CAUTION. Use under a laminar flow hood. Wear gloves |
| Phenol red | Sigma-Aldrich | P0290 | CAUTION. Use under a laminar flow hood |
| Pasteur pipette | Sigma-Aldrich | Z627992 | Sterilize before use |
| OptiSeal Polypropylene tubes | Beckman | 361625 | |
| Benzonase (250 U/µL) | Sigma-Aldrich | E1014 | Supplied as a ready-to-use solution |
| Acrodisc syringe filter | Pall corporation | 4614 | |
| Omnifix syringe (5 mL) | Braun | 4617053V | |
| Blunt syringe needle | Sigma Aldrich | Z261378 | Stainless steel 316 syringe needle, pipetting blunt 90° tip gauge 16, L 4 in. Referred to in the text as a blunt-end needle |
| Aqua Ecotainer | B. Braun | 0082479E | Sterile endotoxin-free water. Referred to as 'Ultrapure water' |
| Amicon ultra-15 centrifugal filter unit | Millipore | UFC910024 | These filters concentrate the final product by collecting the vector particles in consecutive centrifugation steps |
| Pluronic F68 (100x) | Thermo Fisher | 24040032 | Non-ionic surfactant. Dilute in sterile PBS to use at 0.01% (v/v) |
| Fisherbrand Sterile Microcentrifuge Tubes with Screw Caps (2 mL) | Fisher Scientific | 02-681-374 | Use skirted tubes for easy handling |
| AAV Titration | |||
| Restriction enzyme: StuI (10 U/µL) | Promega | R6421 | |
| DNAse I (1 U/µL) | Fisher Scientific | EN0521 | |
| Proteinase K | Sigma-Aldrich | 3115852001 | Reconstitute in ultrapure water and use at a final concentration of 10 mg/mL. Solution can be stored at -20 °C |
| EasyStrip Plus Tube Strips (with attached caps) | Fisher Scientific | AB2000 | |
| Eppendorf microtube 3810x | Sigma-Aldrich | Z606340-1000EA | |
| LightCycler 480 SYBR Green I Master Mix | Roche | 4707516001 | |
| LightCycler Multiwell Plates, 96 wells | Roche | 4729692001 | White polypropylene plate (with unique identifying barcode) |
| Microseal 'A' PCR plate and PCR Plate Sealing Film | Bio-Rad | msa5001 | |
| AAV Purity control | |||
| Ammonium persulfate (APS) | Sigma-Aldrich | A3678 | Reconstitute in ultrapure water to 10% (v/v). CAUTION. Use under a laminar flow hood. Wear gloves |
| Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Sigma-Aldrich | T9281 | CAUTION. Use under a laminar flow hood. Wear gloves |
| Tris Base ULTROL Grade | Merck | 648311 | CAUTION: Use under a laminar flow hood. Wear gloves |
| UltraPure Agarose | Thermo Fisher | 16500-500 | |
| Rotiphorese® Gel 30 (37,5:1) | Carl Roth | 3029.3 | Aqueous 30% acrylamide and bisacrylamide stock solution at a ratio of 37.5:1. CAUTION: Use under a laminar flow hood. Wear gloves |
| Serva Blue G | Sigma-Aldrich | 6104-58-1 | |
| Precision Plus prestained marker | Bio-Rad | 1610374edu | |
| 1-Butanol | Sigma-Aldrich | B7906 | CAUTION: Use under a laminar flow hood. Wear gloves |
| Immunohistochemistry | |||
| Rabbit anti-GFP | Synaptic Systems | 132002 | 1:300 dilution |
| Anti-rabbit Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A21206 | 1:1,000 dilution |
| Equipment | Company | Catalog number | Comments |
| Vector production lab | |||
| Rotina 380 bench-top centrifuge * | Hettich | 1701 | |
| Optima XPN 80 ultracentrifuge * | Beckmann Coulter | A95765 | |
| Type 50.2 Ti fixed-angle titanium rotor * | Beckmann Coulter | 337901 | |
| Entris digital scale * | Sartorius | 2202-1S | |
| Warm water bath * | Set at 37 °C | ||
| Ice bucket * | VWR | 10146-290 | Keep material used in the vector production lab separate from that used in standard lab areas |
| Pipetboy pro * | Integra | 156,400 | |
| Graduated pipettes: Cell star * | Greiner bio-one | 606180 | Capacity of 5 mL |
| Graduated pipettes: Cell star * | Greiner bio-one | 607180 | Capacity of 10 mL |
| Graduated pipettes: Cell star * | Greiner bio-one | 760180 | Capacity of 25 mL |
| CO2 incubator CB150 * | Binder | 9040-0038 | Set at 37 °C, 5% CO2 and 95% humidity |
| Nuaire safety cabinet NU 437-400E * | Labexchange | 31324 | Clean all the surfaces with 70% ethanol and Virkon before and after use |
| Conventional lab | |||
| T100 thermal cycler * | Bio-Rad | 1861096 | |
| LightCycler 480 Instrument II * | Roche | 5015278001 | |
| ThermoMixer * | Eppendorf | C 5382000015 | |
| Nanodrop * | ThermoFisher Scientific | ND 2000 | |
| Mini-Protean Tetra Cell* | Bio-Rad | 1658001FC | For use with handmade or precast gels |
| ProteoSilver silver stain kit | Sigma-Aldrich | PROTSIL1 | High sensitivity protein detection with low background |
| Centrifuge 5804 R * | Eppendorf | B1_022628045 | High speed centrifuge for medium capacity needs (up to 250 mL) |
| Graduated pipettes Cell star * | Greiner bio-one | 606180 | 5 mL |
| Graduated pipettes Cell star * | Greiner bio-one | 607180 | 25 mL |
| Graduated pipettes Cell star * | Greiner bio-one | 760180 | 25 mL |
| Filter tips * | Greiner bio-one | 750257 | 1250 µL |
| Filter tips * | Greiner bio-one | 738257 | 300 µL |
| Filter tips * | Greiner bio-one | 771257 | 10 µL |
| Ice bucket with lid * | VWR | 10146-290 | |
| Mini diaphragm vacuum pump, VP 86 * | VWR | 181-0065 | |
| Pipetman P2 | Gilson | F144801 | |
| Pipetman P20 | Gilson | F123600 | |
| Pipetman P100 | Gilson | F123615 | |
| Pipetman P200 | Gilson | F123601 | |
| Pipetman P1000 | Gilson | F123602 | |
| * Materials marked with an asterisk are expensive pieces of equipment and are usually central infrastructure items shared between multiple labs. These items can also be replaced by equivalents if available. Note, when a different ultracentrifuge is used, care must be taken to select the correct rotor and centrifuge tubes. |
References
- Daya, S., Berns, K. I. Gene Therapy Using Adeno-Associated Virus Vectors. Clinical Microbiology Reviews. 21 (4), 583-593 (2008).
- Duque, S., et al. Intravenous Administration of Self-complementary AAV9 Enables Transgene Delivery to Adult Motor Neurons. Molecular Therapy. 17 (7), 1187-1196 (2009).
- Bourdenx, M., Dutheil, N., Bezard, E., Dehay, B. Systemic gene delivery to the central nervous system using Adeno-associated virus. Frontiers in Molecular Neuroscience. 7, (2014).
- Kantor, B., McCown, T., Leone, P., Gray, S. J. Clinical Applications Involving CNS Gene Transfer. Advances in Genetics. 87, 71-124 (2014).
- Crystal, R. G. Adenovirus: The First Effective In Vivo Gene Delivery Vector. Human Gene Therapy. 25 (1), 3-11 (2014).
- Weinberg, M. S., Samulski, R. J., McCown, T. J. Adeno-associated virus (AAV) gene therapy for neurological disease. Neuropharmacology. 69, 82-88 (2013).
- Henckaerts, E., Linden, R. M. Adeno-associated virus: a key to the human genome? Future Virology. 5 (5), 555-574 (2010).
- Howarth, J. L., Lee, Y. B., Uney, J. B. Using viral vectors as gene transfer tools (Cell Biology and Toxicology Special Issue: ETCS-UK 1 day meeting on genetic manipulation of cells). Cell Biology and Toxicology. 26 (1), 1-20 (2010).
- Nathwani, A. C., et al. Adenovirus-Associated Virus Vector-Mediated Gene Transfer in Hemophilia B. The New England Journal of Medicine. 365 (25), 2357-2365 (2011).
- Carter, B. J. Adeno-associated virus and the development of adeno-associated virus vectors: a historical perspective. Molecular Therapy. 10 (6), 981-989 (2004).
- Schambach, A., Zychlinski, D., Ehrnstroem, B., Baum, C. Biosafety Features of Lentiviral Vectors. Human Gene Therapy. 24 (2), 132-142 (2013).
- Van Vliet, K. M., Blouin, V., Brument, N., Agbandje-McKenna, M., Snyder, R. O. The Role of the Adeno-Associated Virus Capsid in Gene Transfer. Methods in Molecular Biology. 437, 51-91 (2008).
- Rincon, M. Y., VandenDriessche, T., Chuah, M. K. Gene therapy for cardiovascular disease: advances in vector development, targeting, and delivery for clinical translation. Cardiovascular Research. 108 (1), 4-20 (2015).
- Samulski, R. J., Muzyczka, N. AAV-Mediated Gene Therapy for Research and Therapeutic Purposes. Annual Review of Virology. 1 (1), 427-451 (2014).
- McCarty, D. M. Self-complementary AAV Vectors; Advances and Applications. Molecular Therapy. 16 (10), 1648-1656 (2008).
- Choi, J. H., et al. Optimization of AAV expression cassettes to improve packaging capacity and transgene expression in neurons. Molecular Brain. 7, 17 (2014).
- Deverman, B. E., et al. Cre-dependent selection yields AAV variants for widespread gene transfer to the adult brain. Nature Biotechnology. 34 (2), 204-209 (2016).
- Jackson, K. L., Dayton, R. D., Deverman, B. E., Klein, R. L. Better Targeting, Better Efficiency for Wide-Scale Neuronal Transduction with the Synapsin Promoter and AAV-PHP.B. Frontiers in Molecular Neuroscience. 9, (2016).
- Lock, M., et al. Versatile Manufacturing of Recombinant Adeno-Associated Viral Vectors at Scale. Human Gene Therapy. 21 (10), 1259-1271 (2010).
- Strobel, B., Miller, F. D., Rist, W., LamLa, T. Comparative Analysis of Cesium Chloride- and Iodixanol-Based Purification of Recombinant Adeno-Associated Viral Vectors for Preclinical Applications. Human Gene Therapy Methods. 26 (4), 147-157 (2015).
- Jungmann, A., Leuchs, B., Katus, H. A., Rommelaere, J., Müller, O. J. Protocol for efficient generation and characterization of adeno-associated viral (AAV) vectors. Human Gene Therapy Methods. , (2017).
- Tolmachov, O. Designing Plasmid Vectors. Methods in Molecular Biology. 542, 117-129 (2009).
- QIAGEN Plasmid Purification Handbook. , Available from: https://www.qiagen.com/us/resources/download.aspx?id=46205595-0440-459e-9d93-50eb02e5707e&lang=en (2018).
- QIAquick PCR Purification Kit Protocol. , Available from: http://2012.igem.org/wiki/images/a/a3/QIAquick_PCR-purification.pdf (2008).
- Lock, M., Alvira, M. R., Chen, S. J., Wilson, J. M. Absolute Determination of Single-Stranded and Self-Complementary Adeno-Associated Viral Vector Genome Titers by Droplet Digital PCR. Human Gene Therapy Methods. 25 (2), 115-125 (2014).
- Sigma. ProteoSilver Silver Stain Kit (PROTSIL1) - Bulletin, ProteoSilver. , Available from: https://www.sigmaaldrich.com/content/dam/sigma-aldrich/docs/Sigma/Bulletin/protsil1bul.pdf (2018).
- Machholz, E., et al. Manual Restraint and Common Compound Administration Routes in Mice and Rats. Journal of Visualized Experiments. (67), e2771 (2012).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), e3564 (2012).
- Puntel, M., et al. Gene transfer into rat brain using adenoviral vectors. Current Protocols in Neuroscience. 50 (1), (2010).
- Bachman, J. Immunohistochemistry on Freely Floating Fixed Tissue Sections. Methods in Enzymology. 533, 207-215 (2013).
- Hordeaux, J., et al. The Neurotropic Properties of AAV-PHP.B Are Limited to C57BL/6J Mice. Molecular Therapy. 26 (3), 664-669 (2018).
- Rincon, M. Y., et al. Widespread transduction of astrocytes and neurons in the mouse central nervous system after systemic delivery of a self-complementary AAV-PHP.B vector. Gene Therapy. 25 (2), 83-92 (2018).
- Crosson, S. M., Dib, P., Smith, J. K., Zolotukhin, S. Helper-free Production of Laboratory Grade AAV and Purification by Iodixanol Density Gradient Centrifugation. Molecular Therapy. Methods & Clinical Development. 10, 1-7 (2018).
- Merdan, T., Kunath, K., Fischer, D., Kopecek, J., Kissel, T. Intracellular processing of poly(ethylene imine)/ribozyme complexes can be observed in living cells by using confocal laser scanning microscopy and inhibitor experiments. Pharmaceutical Research. 19 (2), 140-146 (2002).
- Meissner, P., et al. Transient gene expression: recombinant protein production with suspension-adapted HEK293-EBNA cells. Biotechnology and Bioengineering. 75 (2), 197-203 (2001).
- Reed, S. E., Staley, E. M., Mayginnes, J. P., Pintel, D. J., Tullis, G. E. Transfection of mammalian cells using linear polyethylenimine is a simple and effective means of producing recombinant adeno-associated virus vectors. Journal of Virological Methods. 138 (1-2), 85-98 (2006).
- Zolotukhin, S., et al. Recombinant adeno-associated virus purification using novel methods improves infectious titer and yield. Gene Therapy. 6 (6), 973-985 (1999).
- Kaludov, N., Handelman, B., Chiorini, J. A. Scalable Purification of Adeno-Associated Virus Type 2, 4, or 5 Using Ion-Exchange Chromatography. Human Gene Therapy. 13 (10), 1235-1243 (2002).
- Nass, S. A., et al. Universal Method for the Purification of Recombinant AAV Vectors of Differing Serotypes. Molecular Therapy. Methods & Clinical Development. 9, 33-46 (2017).
- Qu, G., et al. Separation of adeno-associated virus type 2 empty particles from genome containing vectors by anion-exchange column chromatography. Journal of Virological Methods. 140 (1-2), 183-192 (2007).
- Holehonnur, R., et al. Adeno-associated viral serotypes produce differing titers and differentially transduce neurons within the rat basal and lateral amygdala. BMC Neuroscience. 15, 28 (2014).
- Wang, H., et al. Widespread spinal cord transduction by intrathecal injection of rAAV delivers efficacious RNAi therapy for amyotrophic lateral sclerosis. Human Molecular Genetics. 23 (3), 668-681 (2014).
