Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Produktion, rening och kvalitetskontroll för Adeno-associerade Virus-baserat vektorer

Published: January 29, 2019 doi: 10.3791/58960
Automatic Translation
*1,2, *1,2, *1,2, 1,2, 1,2,3
1VIB-KU Leuven Center for Brain and Disease Research, 2Department of Neuroscience, KU Leuven, 3Leuven Brain Institute
* These authors contributed equally

Summary

Här beskriver vi en effektiv och reproducerbara strategi för att producera, titer och kvalitetskontroll partier av adeno-associerade virusvektorer. Det tillåter användaren att få en vektor beredning med hög-titer (≥ 1 x 1013 vektor genomen/mL) och en hög renhet, redo för bruk in vitro- eller in-vivo .

Abstract

Gen leveransverktyg baserat på adeno-associerade virus (AAVs) är ett populärt val för leverans av transgener till det centrala nervsystemet (CNS), inklusive gen terapi program. AAV vektorer är icke-replikering, kan infektera både dela och icke-dela celler och ge långsiktiga transgenens uttryck. Ännu viktigare, vissa serotyper, såsom nyligen beskriven PHP. B, kan korsa blod-hjärna-barriären (BBB) i djurmodeller, efter systemisk leverans. AAV vektorer kan produceras effektivt i laboratoriet. Robust och reproducerbara protokoll krävs dock att erhålla AAV vektorer med tillräcklig renhet nivåer och antikroppnivåns värden tillräckligt hög för i vivo applikationer. Det här protokollet beskriver en effektiv och reproducerbara strategi för AAV vektor produktion, baserat på en iodixanol gradient rening strategi. Iodixanol rening metoden är lämplig för att erhålla partier av hög-titer AAV vektorer av hög renhet, jämfört med andra reningsmetoder. Protokollet är dessutom allmänt snabbare än andra metoder som för närvarande beskrivs. Dessutom en kvantitativ polymerasen kedjar reaktion (qPCR)-baserad strategi beskrivs för en snabb och noggrann bestämning av vektor titern, liksom silver färgning metod att bestämma renheten av vektor batchen. Slutligen, representativa resultat gen leverans till CNS, efter systemisk administrering av AAV-PHP. B, presenteras. Sådana resultat bör vara möjligt i alla laboratorier med de protokoll som beskrivs i denna artikel.

Introduction

Under de senaste 30 åren, har vildtyp AAVs konstruerats för att skapa rekombinant AAV vektorer, som har visat sig vara mycket användbara verktyg för genöverföring till CNS1,2,3,4, 5,6 och gene therapy närmar sig till sjukdom (inklusive FDA - och EMA-godkänd terapier)4,7. Lämpligheten för användning i CNS härrör till stor del från deras förmåga att infektera icke-dividera, efter mitotiska celler, normalt återfinns i CNS8. AAV-baserade vektorer har emellertid också fördelen att ett långvarigt uttryck av någon viss terapeutisk transgenens4,9 medan framkalla en mildare immunsvar jämfört med andra virala vektorer7, 8,10,11,12.

De viktigaste delarna i varje AAV vektor är genomet och kapsid. Vildtyp AAVs är enkelsträngat (ss) DNA virus med en arvsmassa cirka 5 kilobases (kb)13. För produktion av rekombinant AAV vektorer, rep och cap generna (nödvändigt för genomet replikering och montering av viral kapsid) är bort från genomet hos den vildtyp AAV och tillhandahålls i trans, vilket lämnar utrymme för en uttryck kassett som innehåller transgenens14,15. Den inverterade terminal upprepa sekvenser (ITRs) av det ursprungliga virala genomet är de enda balanserade element i en AAV vektor, eftersom dessa är viktiga för replikering och förpackning3,10,14. AAV vektorer kan vara konstruerad för att förbättra transgenens uttryck; en mutation i en av ITRs leder till bildandet av en hårnål-loop som effektivt gör att genereringen av en kompletterande DNA strand3,7,15. Den största fördelen med denna konfiguration kallas en self-kompletterande (sc) genomet, är att det kringgår behovet av andra-strand syntes typiska i konventionella livscykeln för AAVs, avsevärt öka hastighet och nivåer av transgenens uttryck 1. dock använda en scAAV arvsmassa minskar lastkapacitet av vektorn för cirka 2,4 kb. Detta inkluderar transgenens sekvenser, liksom eventuella reglerande sekvenser såsom initiativtagare eller mikroRNA-bindande platser, för att begränsa uttrycket till viss cell typer16.

AAV kapsid avgör vektor-host cell interaktionen och ger en viss cell typ eller vävnad tropism för en AAV serotyp, som också kan utnyttjas för att begränsa transgenens uttryck till specifika platser. Flera AAV serotyper förekommer i naturen, medan andra har producerats i laboratorier genom rekombinant strategier (dvs, PHP. (B). Dessutom några förhoppningsvis också skänka andra användbara egenskaper, såsom möjlighet att korsa BBB, vilket resulterar i leveransen av transgener i hela CNS efter systemisk administrering. Detta har visats för AAV9 samt för den nyligen beskriven PHP. B kapsid17. Följaktligen bör har dessa serotyper visat sig vara särskilt relevanta för nya gen terapi metoder för neurodegenerativa sjukdomar1,17,18.

Syftet med detta protokoll är att beskriva en kostnadseffektiv metod för småskalig produktion av AAV vektorer med hög titer och renhet. Även om de resultat som presenteras här använder PHP. B kapsid och en scAAV uttryck kassett, protokollet är lämplig för produktion av flera AAV vektor serotyper och genomet konfigurationer, vilket ger maximal experimentella flexibilitet. Den vektor avkastning och slutliga renhet kan emellertid variera beroende på den valda serotypen.

Själva protokollet är en variant av den klassiska tri-transfection metoden för virala vektorn produktion och omfattar användning av en iodixanol lutning för vektor ren-upp, som i jämförelse med klassiskt användningen av cesium klorid (CsCl) lutningar, varit rapporterade för att producera AAV vektorer på ett mer tidseffektivt sätt19,20,21högre renhet.

Transfection, rening och koncentration stegen är avsedda att utföras enligt god laboratoriesed (GLP) i en vävnadskultur laboratorium varmt för virala vektorn arbete. Varje uppgift måste utföras i enlighet med den relevanta lokala och nationella lagstiftningen avseende viral vektor produktion och använda. Arbete måste utföras under en LAF och sterila förhållanden. Inuti anläggningen i vektor rekommenderas det att bära en lab-förkläde, utöver den regelbundna vävnadsodling labbrock. Dessutom bör en dubbel par handskar samt plast galoscher, bäras hela tiden.

Innan produktionsstart vektor, se till att all nödvändig utrustning och plasmider är tillgängliga. (1) pCapsid plasmiden innehåller den rep -genen som kodar fyra icke-strukturella proteiner nödvändiga för replikering, nämligen Rep78, Rep68, Rep52 och Rep40, och den gemensamma jordbrukspolitik -genen som kodar tre strukturella kapsid proteiner, nämligen VP1, VP2 och VP3. (2) pHelper plasmiden innehåller generna E4, E2Aoch VA från adenovirus, vilket underlättar AAV produktionen i HEK293T celler. (3) pTransgene plasmiden innehåller transgenens uttryck kassett, flankerad av två ITRs. Dessa plasmider kan vara syntetiskt de novo i laboratoriet använder sekvenser tillgängliga online22. För plasmider gjort de novo, är särskilt de som innehåller roman transgener, sekvensering skyldig att se till att transgenens och ITRs är rätt. Alternativt, premade plasmider kan förvärvas direkt genom online plasmid förråd. Vid behov, plasmider kan amplifieras och renas med hjälp av standard kit, enligt tillverkarens instruktioner23.

Vector titer och renhet kan påverka transduktion förmåga vektorn. Tilläggsprotokollen levereras för att utvärdera kvaliteten på de producerade vektorn. De slutliga vektorerna kommer att vara användbart för studier av funktionen CNS cell i både in vitro- och in-vivo applikationer.

Protocol

Lösning Sammansättning
Cellodling och transfection
DMEM1 DMEM 1 x
1% FBS (v/v)
1% GlutaMAX (v/v)
DMEM10 DMEM 1 x
10% FBS (v/v)
1% GlutaMAX (v/v)
150 mM NaCl 4.380 g NaCl
Upp till 500 mL ultrarent vatten
AAV rening och avsaltning
5 M NaCl 146,1 g NaCl
Upp till 500 mL ultrarent vatten
1 M Tris HCl (pH 8,5) 12.11 g Tris base FÖRSIKTIGHET
Upp till 100 mL ultrarent vatten
Lägg till 1 M HCl med en Pasteur-pipett för att minska pH till 8,5
Lyseringsbuffert 15 mL 5 M NaCl
25 mL 1 M Tris HCl (pH 8,5) FÖRSIKTIGHET
Upp till 500 mL ultrarent vatten
10 x fosfatbuffrad saltlösning (PBS) 80 g NaCl
2 g KCl FÖRSIKTIGHET
14,4 g Na2HPO4
2.4 g KH2PO4
Upp till 1 L ddvatten
1 M MgCl2 20,33 g MgCl2-6 H2O
Upp till 100 mL ultrarent vatten
1 M KCl 7.45 g KCl FÖRSIKTIGHET
Upp till 100 mL ultrarent vatten
5 x stamlösning av PBS Magnesium-kalium (PBS-MK) 250 mL 10 x PBS
2,5 mL 1 M MgCl2
6,25 mL 1 M KCl FÖRSIKTIGHET
Upp till 500 mL Ultrapure vatten H2O
15% Iodixanol 12,5 mL Optiprep täthet lutning medium FÖRSIKTIGHET
10 mL 5 M NaCl
10 mL 5 x PBS-MK
17,5 mL av ultrarent vatten
25% Iodixanol 20,8 mL Optiprep täthet lutning medium FÖRSIKTIGHET
10 mL 5 x PBS-MK
19,2 mL ultrarent vatten
100 µL av fenolrött
40% Iodixanol 33,3 mL Optiprep täthet lutning medium FÖRSIKTIGHET
10 mL 5 x PBS-MK
6,7 mL ultrarent vatten
60% Iodixanol 50 mL av Optiprep täthet lutning medium FÖRSIKTIGHET
100 µL av fenolrött FÖRSIKTIGHET
AAV renhet kontroll
10 x Tris EDTA (TEA) acetatbuffert 44,8 g Tris base FÖRSIKTIGHET
11,4 mL isättika (17.4M)
3.7 g EDTA
Upp till 1 L ultrarent vatten
Agarosgel 0,8 g ultrarena agaros
Upp till 100 mL 1 x te buffert
Gel-buffert 181,7 g Tris base FÖRSIKTIGHET
1,5 g SDS FÖRSIKTIGHET
Justera pH till 8,45 med 1 M HCl FÖRSIKTIGHET
Upp till 500 mL ultrarent vatten
Katod buffert 10 x 121.14 g Tris base FÖRSIKTIGHET
179.2 g Tricine FÖRSIKTIGHET
1% SDS (w/w) FÖRSIKTIGHET
Upp till 1 L ultrarent vatten
Anod buffert 10 x 242,3 g Tris base FÖRSIKTIGHET
Upp till 1 L ultrarent vatten
Justera pH till 8,9 med 1 M HCl FÖRSIKTIGHET
Prov buffert 5 x För 20 mL:
605 mg Tris base FÖRSIKTIGHET
4 g SDS FÖRSIKTIGHET
10 mg Serva blå G
12 g Glycerol
Justera pH till 6,8 med 1 M HCl, alikvotens och förvaras vid-20 ° C FÖRSIKTIGHET
Stapling gel För 2 geler:
400 µL akrylamid FÖRSIKTIGHET
750 µL gel buffert
1,85 mL ultrarent vatten
4 ΜL TEMED FÖRSIKTIGHET
20 µL 10% APS (v/v) FÖRSIKTIGHET
Lägga till TEMED och 10% APS omedelbart innan du häller i gelen. Använd båda kemikalier enligt en kemisk huva.
Att lösa gel För 2 geler:
3.32 mL akrylamid FÖRSIKTIGHET
3.35 mL gel buffert
1.14 mL ultrarent vatten
2.12 mL 50% glycerol
6 ΜL TEMED FÖRSIKTIGHET
50 µL 10% APS (w/v) FÖRSIKTIGHET
Lägga till TEMED och 10% APS omedelbart innan du häller i gelen. Använd båda kemikalier enligt en kemisk huva.
Vattenmättad butanol 10 mL n-butanol FÖRSIKTIGHET
1 mL ultrarent vatten
Varning: Se tabellen material för riktlinjer för användning av farliga kemikalier.

Tabell 1: Sammansättning av lösningarna som krävs.

1. Tri-transfection av HEK293T celler

Obs: Se tabell 1 för sammansättningen av den buffrar och lösningar används i protokollet.
Obs: Genomförandet av denna del av protokollet tar cirka 4 dagar.

  1. Tina en injektionsflaska med mänskliga embryonala njurar (HEK) 293T celler i vattenbad vid 37 ° C.
    Obs: Använd endast celler som har blivit överförda mindre än 20 x för att garantera optimal transfection effektivitet.
  2. Frö HEK293T celler på en densitet på 2 x 103 till 6 x 103 celler/cm2 i DMEM10 i 15 cm diameter cell kultur rätter.
  3. Växa cellerna till 70 – 80% sammanflödet i en standard inkubator inställd på 37 ° C, med 95% luftfuktighet och 5% CO2.
    Obs: Produktionen av en batch av AAV vektorer använder det här protokollet kräver 18 cell kultur rätter (15 cm diameter). En cell sammanflödet av 70% - 80% motsvarar 6 x 103 till 7 x 103 celler/cm2, underhålls i 17 – 20 mL DMEM10 odlingsmedium.
  4. Förbereda polyethylenimine (PEI) / DNA mix i koncentrationsförhållandet 1/3.5 (w/w).
    1. Förbereda den DNA-mix för 18 cell kultur rätter i en 50 mL konisk röret genom att blanda 360 µg pΔF6, 180 µg av pCapsid och 180 µg av pTransgene i 18 mL 150 mM NaCl.
    2. Fördela den DNA-mix över tre 50 mL koniska rör (6 mL DNA blanda per koniska rör).
    3. Förbereda PEI mixen för sex cell kultur rätter i en ny 50 mL koniska rör genom att blanda 840 µg av PEI (1 µg/µL) i 6 mL 150 mm NaCl.
    4. Förbereda den PEI/DNA-mix genom att tillsätta 6 mL PEI mixen (bereddes i steg 1.4.3), droppe för droppe, till en av de koniska rör som innehåller DNA mixen (bereddes i steg 1.4.2) och inkubera i 20 min i rumstemperatur.
      Obs: Efter 20 min inkubering blir PEI/DNA mixen lätt grumlig.
  5. Ta sex cell kultur rätter ur inkubatorn och helt aspirera på medellång från varje kultur skålen i en LAF. Ta bort spår av mediet genom att skölja rätter med 5 mL förvärmd Dulbeccos fosfatbuffrad koksaltlösning (DPBS).
  6. Säkerställa en distribution av DPBS över hela ytan genom att försiktigt luta skålen.
  7. Försiktigt aspirera i DPBS och tillsätt 12 mL DMEM1 till varje maträtt.
    Obs: Undvik lossa cellerna genom att lägga till mediet långsamt, från en pipett som placeras på kanten av skålen.
  8. Blanda PEI/DNA genom pipettering upp och ner 3 x - 5 x. Tillsätt 2 mL av PEI/DNA mixen till var och en av de sex cell kultur rätterna i en droppvis-mode, noggrant fördela den över hela ytan. När blandningen läggs till varje maträtt, placera rätter tillbaka i inkubatorn. Upprepa steg 1.4.3– 1,8 för de återstående kultur-rätterna.
  9. Inkubera transfekterade cellerna för 5 h vid 37 ° C, med 95% luftfuktighet och 5% CO2.
  10. Lägga till ytterligare 12 mL av DMEM10 till varje kultur skålen utan att ta bort det befintliga mediet (summa medium volym = 25 mL).
  11. Inkubera transfekterade cellerna upp till 72 h efter transfection vid 37 ° C, med 95% luftfuktighet och 5% CO2.

Supplementary Figure
Kompletterande Figur1: HEK 293T cellmorfologi visualiseras av fas kontrast mikroskopi (vänster) med bekräftelse av GFP uttryck visualiseras av fluorescens imaging (höger). (A) framgångsrika transfection av HEK293T celler med en GFP-kodning pTransgene bekräftas av fluorescens imaging. (B) HEK293T celler som behandlades enbart med transfection reagenser Visa inget GFP uttryck. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

  1. Skörda mediet och de celler 72 h efter transfection. Använda en cell-skrapa för att försiktigt lossa cellerna från kultur skålen. Samla på medellång och cellerna i en 50 mL konisk tub förvaras på is.
    Obs: Innehållet i två cell kultur rätter kan samlas i ett enda 50 mL koniska rör. I slutet av detta steg, kommer var och en av de nio rören innehåller ca 50 mL av medium.
  2. Centrifugera koniska rören vid 420 x g i 10 minuter vid 4 ° C med den acceleration och retardation av centrifugen inställd på max.
  3. Noggrant Kassera supernatanten från varje rör. Använd inte pipetter för att förhindra förlust av material. Istället försiktigt Häll supernatanten i en sophantering behållare och placera rören som innehåller cell pellets tillbaka på isen.
  4. Återsuspendera varje cellpelleten i 2 mL lyseringsbuffert direkt i 50 mL koniska röret genom pipettering upp och ned 5-10 x. Gör inte vortex. Poolen på lysates från tre rör grupp.
    Obs: Vid denna punkt, kommer det finnas tre 50 mL koniska rör, varje en innehållande 6 mL återsuspenderade cellerna i lyseringsbuffert.

2. AAV vektor rening

Obs: Genomförandet av detta protokoll avsnitt tar cirka 1 dag. Utför följande steg samtidigt på varje av de tre 50 mL koniska rör som innehåller celler resuspended i lyseringsbuffert (se ovan).

  1. Frysa och Tina återsuspenderade cellerna 3 x att lysera dem och släppa AAV partiklarna. Utför frysning steg genom att placera rören i en hink med torr-is blandas med etanol. Utföra upptining av omedelbart utsläppande cellerna i ett vattenbad vid 37 ° C.
  2. Efter det tredje upptining steget, Centrifugera 1 167 x g under 15 minuter vid 4 ° C.
    Obs: En märkbar pellet består av cellfragment kommer att bildas. Vid hantering av rören, Undvik plötsliga rörelser eftersom dessa kan orsaka avskildheten av pelleten i supernatanten, som kommer att äventyra renheten av den final vektorgrafik.
  3. Noggrant överföra supernatanterna rengör 50 mL koniska rör och Lägg sedan till nuclease varje tub, till en slutlig koncentration på 50 U/mL supernatant.
  4. Inkubera i 30 minuter vid 37 ° C. Snurra de 50 mL koniska rör för hand varje 10 min för att säkerställa att nuclease blandas då grundligt med supernatanten.
  5. Klargöra supernatanten genom centrifugering vid 13,490 x g i 20 min vid 4 ° C.
  6. Bifoga ett 0,45 µm filter i en 10 mL-spruta och placera det ovanpå en ren 50 mL koniska tub. Försiktigt bort kolvstången och Fyll sprutan med supernatanten från steg 2.5.
  7. Använd kolven för att tvinga den lysate genom filtret. Använd ett nytt filter och spruta för varje tub av supernatanten som erhölls i steg 2.5.
    Obs: Den erhållna fraktionen är känd som 'råolja lysate'.
  8. Förbereda varje 15%, 25%, 40% och 60% iodixanol fraktioner i fyra separata 50 mL koniska rör, enligt anvisningarna i tabell 1.
  9. Förbereda de iodixanol lutningarna i tre ultracentrifugering rör använder följande ordning av iodixanol fraktioner: 8 mL 15% iodixanol, 5,5 mL 25% iodixanol, 5 mL av 40% iodixanol och 4,5 mL av 60% iodixanol.
    Varning: Iodixanol kan orsaka irritation på ögon, hud och de gastrointestinala- och respiratoriska skrifter. När du hanterar iodixanol övertoningar, bär handskar och arbeta under en LAF.
    1. Pipettera 8 mL 15% iodixanol i varje ultracentrifugering rör.
    2. Pipettera över 5,5 mL 25% iodixanol lösning till en ren 50 mL koniska tub (figur 1A).
    3. Använda en icke-examen Pasteur-pipett (halsen på ultracentrifugering röret är för snävt för konventionella graderade pipetter) till noggrant lager 5,5 mL 25% iodixanol lösning under 15% iodixanol lösningen (figur 1B).
      Obs: Detta kan framgångsrikt uppnås genom att lägga till iodixanol i tre steg eftersom den Pasteur-pipetten kan bara lagra ca 2 mL.
    4. Lägga till 40% och 60% iodixanol lösningarna som beskrivs i steg 2.9.3. Stör inte de olika iodixanol gränssnitt under skiktning.
      Obs: Korrekt beredning av olika iodixanol fraktioner kan säkerställas genom visuell bekräftelse tack vare den fenolrött tillsätts iodixanol fraktioner (se anvisningarna i tabell 1). Eftersom varje fraktion har en specifik täthet, de inte kommer att blanda under skiktning steg, om det utförs på rätt sätt (se figur 1 c).
  10. Lager för råolja lysate ovanpå 15% iodixanol övertoningen med en Pasteur-pipett. Fortsätt droppe för droppe att undvika att störa gränssnittet mellan rå lysate och iodixanol lösningen.
  11. Fyll ultracentrifugering röret med lyseringsbuffert tills menisken når basen av tube halsen att se till att röret inte kollapsar under de mycket höga krafter som genereras under ultracentrifugering (figur 1 c).
  12. Stäng ultracentrifugering rören med hjälp av lämpliga lock. Använd en digital skala för att kontrollera alla tre ultracentrifugering rör ha samma vikt. Justera vikten, om nödvändigt, genom att lägga till mer lyseringsbuffert ovanpå 'rå lysate'.
    Obs: Viktskillnaden mellan ultracentrifugering rören måste understiga 0,1 g att säkerställa säker drift av ultracentrifugen. Ultracentrifuges är potentiellt farliga delar av utrustning och bör endast användas av utbildad personal.
  13. Centrifugera rören vid 301,580 x g, med en fast vinkel Titan rotor, för 1 h och 40 min vid 12 ° C, med maximal hastighet på acceleration och retardation.
  14. Sätt försiktigt en trubbig nål i rostfritt stål på 40% och 60% iodixanol gränssnitt.
    1. Fäst nålen en 5 mL doseringsspruta (figur 1E).
    2. Aspirera endast den tydliga fraktionen, som innehåller vector partiklarna.
      Obs: Den totala volymen som samlas in är cirka 2,5 – 3 mL. Undvika insamling av material från gränssnittet 25 – 40%, eftersom detta kommer att öka nivån av kontamination i final vektorgrafik parti på grund av icke-önskvärda proteiner.
    3. Bearbeta det insamlade bråket (avsaltning och koncentration) eller lagra det över natten vid 4 ° C.

Figure 1
Figur 1: Setup för iodixanol gradient rening och efterföljande vector insamling. (A) före pipettering olika iodixanol Övertoningarna i ultracentrifugering röret, överför med pipett en lämplig volym av varje iodixanol lösning till ett separat koniska rör. (B) sedan använda en Pasteur Pipettera sekventiellt överföra varje iodixanol lösning till ultracentrifugering röret: lager av en allt högre iodixanol koncentration bör läggas på botten av röret under den föregående plastskikt. (C) lager råolja vektorn lysate på toppen en gång toningen har upprättats. Denna vektor samling systemet använder inte vassa nålar, som utgör en risk för ' nålsticksskador '. (D), ett rostfritt stål 316-sprutans nål förs in genom iodixanol lutning upp till 40% / 60% iodixanol gränssnittet. (E) vektor partiklar finns i 40% iodixanol fas och samlas. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

3. avsaltning och koncentration av AAV vektor

Obs: Genomförandet av denna del av protokollet tar ca 2 h.

  1. Prerinse filtermembranet centrifugal filtret genom att tillsätta 5 mL 1 x PBS-MK och Centrifugera under 5 minuter vid 4000 x g.
  2. Tillsätt 5 mL av 1 x PBS-MK att andelen insamlade AAV vektor, blanda och sedan lägga till den totala volymen i filtret. Vid tillsats av 1 x PBS-MK, grumlighet observeras. Centrifugera vid 4000 x g tills volymen finns på konformade filtret har minskats till 1 mL. Kassera den genomströmmande ackumuleras i yttre samling röret.
  3. Tillsätt 13 mL 1 x PBS-MK att konformade filtret och upprepa centrifugeringen steg så många gånger som behövs (minst 3 x), tills det är ingen mer grumlighet observerades när färsk 1 x PBS-MK läggs.
  4. I finalen tvätta steg, tillsätt 13 mL PBS + 0,01% (v/v) icke-jonisk tensid och centrifugera vid 4000 x g tills volymen reducerats till 300 – 350 µL.
  5. Samla den återstående fraktionen som är närvarande på filtret genom pipettering hela volymen i ett sterilt kjolar mikrocentrifug rör.
    Obs: Denna fraktion innehåller desalted och koncentrerad AAV vektorn. I de följande stegen i detta protokoll benämns denna fraktion som den 'primära' fraktionen. Se till att hantera röret under huven och förvara det vid 4 ° C.
  6. Skölj filtret med 200 µL 1 x PBS-MK att samla in de resterande vektor partiklarna kvar på filtret. Samla i en steril mikrocentrifug rör.
    Obs: Detta är utspädda vektor lager, som kan vara lämpliga för vissa tillämpningar som kräver lägre vektor-titrar. I framtida åtgärder benämns denna del ”sekundära” bråket.
  7. För korttidslagring, lagra den vektor fraction(s) vid 4 ° C (mindre än 2 veckor). Delprov och store vektorn vid ‑20 ° C när långsiktig lagring krävs.
  8. Utföra kvalitetskontroll som beskrivs i avsnitt 4.

4. titrering av vektorn av kvantitativa Polymerase Chain Reaction

Obs: Genomförandet av denna del av protokollet tar ungefär 3 h.

  1. Standardkurva
    1. Linjär transgenens-uttryckande plasmiden (pTransgene) används för transfection HEK-293T celler i avsnitt 1.
    2. Förbereda begränsning digest mixen i en 0,5 mL mikrocentrifug rör (se tabell 2 för sammansättningen av den begränsning digest mix).
      Obs: Justera sammansättningen av begränsning digest mixen enligt det enzym som används och de relaterade riktlinjerna från tillverkaren.
    3. Inkubera begränsning digest mixen för 1 h vid 37 ° C.
    4. Kontrollera effektiviteten i begränsning matsmältningen genom att köra den linearized plasmiden på en 0,8% (w/v) agarosgel på 100 V för 1 h. fullständig nedbrytning av Plasmiden bör producera ett enda fragment av definierad storlek.
    5. Rena den linjära plasmiden DNA med hjälp av en PCR-rening kit, efter tillverkarens instruktioner24, och mäta den DNA-koncentrationen med en spektrofotometer genom att mäta upptaget på 260 nm. Efter titrering, lagra den återstående alikvoten av linjära plasmiden vid ‑20 ° C för vidare användning.
    6. Beräkna molekylerna (dvs DNA kopior) av Plasmiden beståndet per mikroliter enligt följande.
      1. Först beräkna molekylvikt Plasmiden. Antar att den genomsnittliga vikten av en DNA-baspar (bp) är 650 Dalton (Da) och att en mol av en bp väger 650 g, kan molekylvikten för valfri dubbelsträngat DNA mall uppskattas genom att ta en produkt av sin längd (i bp) och vikt per baspar.
        Plasmid molekylvikt [g/mol] = plasmid storlek [bp] x 650 [Da/bp]
      2. Nästa, beräkna antalet mol av Plasmiden per mikroliter.
        Mol av Plasmiden per mikroliter = plasmid koncentration [g/µL] / plasmid molekylvikt [g/mol]
        Obs: Inversen av molekylvikten är antalet mol av Plasmiden i 1 g av materialet.
      3. Sedan beräkna antalet plasmid molekyler per mikroliter, använder Avogadros tal (6.022 x 1023 molekyler/mullvad).
        Molekyler av Plasmiden per mikroliter = födelsemärken av Plasmiden per mikroliter [födelsemärken/µL] x Avogadros tal [molekyler/mol]
      4. Slutligen, späd plasmid beståndet (molekyler/µL) för att erhålla en 100 µL lösning med önskad koncentration av 1 x 109 molekyler (vector genomen (vg) per mikroliter).
        Plasmid lager (100 µL) = (önskad koncentration [molekyler/µL] x 100 µL) / plasmid molekyler [molekyler/µL]
    7. Gör seriespädningar av Plasmiden beståndet (1 x 109 vg/µL) i exemplar:
      10 µL 1 x 109 vg/µL plasmid lager + 90 µL av H2O = 1 x 108 vg/µL lösning
      10 µL 1 x 108 vg/µL utspädning + 90 µL av H2O = 1 x 107 vg/µL lösning
      10 µL 1 x 107 vg/µL utspädning + 90 µL av H2O = 1 x 106 vg/µL lösning
      10 µL 1 x 106 vg/µL utspädning + 90 µL av H2O = 1 x 105 vg/µL lösning
      Fortsätta att få en 1 x 101 vg/µL lösning.
    8. Hålla de seriella utspädningarna av standard plasmid beståndet på is tills laddar dem på qPCR plattan (avsnitt 4.3).
Komponent Belopp
10 x restriktionsenzym buffert 5 ΜL
Restriktionsenzym 2,5 ΜL
Plasmid 5 µg
H2O upp till 50 µL

Tabell 2: Begränsning digest blandning sammansättning.

Tabell 3: lager plasmid volym kalkylator. Vänligen klicka här för att hämta tabellen.

  1. DNA-extraktion från AAV vektorn
    1. Blanda 2 µL av AAV vektor stock (den primära fraktionen från steg 3.5) med 198 µL av DNAS jag buffra (1 x) i remsan rör (PCR-rör) och tillsätt 2 µL av DNAS jag.
      Obs: DNAS jag kommer att försämra genetiska material som inte är innehållet insida en vektor kapsid (som skulle snedvrida resultaten qPCR). Denna lösning kallas utspädning 'dil1 x 10-2'.
    2. Inkubera i 30 minuter vid 37 ° C, följt av 10 min vid 95 ° C.
      Obs: Protokollet kan stoppas på denna punkt och materialet kan lagras på obestämd tid vid 4 ° C, för att undvika produkten försämring.
    3. Tillsätt 2 µL av proteinas K till dil1 x 10-2 lösningen (steg 4.2.1) och inkubera i 60 min vid 50 ° C, följt av 20 min vid 95 ° C.
      Obs: Detta steg kommer att demontera AAV vektor kapsid och släppa AAV vektor genomet i lösningen. Lägg till proteinas K i självrisk proteinhalten (kapsid) av provet inte är känd. Observera att det är nödvändigt att säkerställa att alla proteinas K aktivitet tas bort av denaturering, före qPCR, för att undvika problem med (partiell) polymeras nedbrytning påverkar slutresultatet.
    4. Bered 1:10 seriespädningar av proteinas K behandlade dil1 x 10-2 lösningen (4.2.3 steg) i 1,5 mL mikrocentrifugrör enligt följande:
      10 µL dil1 x 10-2 + 90 µL av H2O = dil1 x 10-3 utspädning
      10 µL dil1 x 10-3 + 90 µL av H2O = dil1 x 10-4utspädning
      10 µL of dil1 x 10-4 + 90 µL av H2O = dil1 x 10-5 utspädning
    5. Hålla de seriella utspädningarna av DNA extraheras från vektorn på is tills laddar dem på qPCR plattan (avsnitt 4.3).
  2. Titrering av SYBR Green baseras på upptäckt qPCR
    1. Förbereda qPCR huvudmixen i ett 1,5 mL mikrocentrifug rör, för både provet och standarder. Använd 10 µL SYBR Green Master Mix, 1 µL framåt primer (10 µM lager), 1 µL reverse primer (10 µM lager) och 3 µL av H2O per reaktion. Se protokollet i tabell 4 för primer sekvenser.
    2. Pipettera qPCR huvudmixen upp och ner, men göra inte vortex.
    3. Tillsätt 15 µL av qPCR huvudmixen, följt av antingen 5 µL av standardkurvan beredd i avsnitt 4.1 eller DNA extraheras från AAV vektorn i avsnitt 4.2, i varje brunn. Inkludera tre brunnar innehållande endast qPCR huvudmixen, som en negativ kontroll. Se figur 2 för layouten plattan.
    4. Försegla plattan med en tätning film och centrifugera kort qPCR plattan vid 1500 x g i 30 s vid 4 ° C.
    5. Kör qPCR reaktionen på en tallrik-baserade realtid PCR-amplifiering och upptäckt instrumentet, med de villkor som föreslås i tabell 5.
Primer namn Sekvens
Forward primer 5'-CCCACTTGGCAGTACATCAA-3'
Reverse primer 5'-GCCAAGTAGGAAAGTCCCAT-3'

Tabell 4: Primer sekvenser utformad mot CBA arrangören.

Figure 2
Figur 2: plattan layout för qPCR-baserade vektor titrering. Proverna är färgkodade: grön = standardkurvan; blå = H2O kontroll; grå = primär fraktion; Orange = sekundär fraktion. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Steg Tid Temperatur Cykler Syftet
Före inkubering 5 min 95 ° C x1 DNA denaturering och polymeras aktivering (hot-start reaktion).
Förstärkning 10 min 95 ° C x1 Amplifiering av DNA. Inställningar kan optimeras om alternativa grundfärger med olika glödgning temperatur används.
10 s 95 ° C x40
40 s 60 ° C
1 s 72 ° C
Kylning 10 s 40 ° C x1 Plattan som kylning. Slutet av PCR.

Tabell 5: Termisk cykling protokoll för SYBR green-baserade qPCR titrering.

  1. Att bestämma titern AAV vector analys av data
    1. Fyll kalkylbladet datacellerna (tabell 6A) med de Ct-värden som erhålls för de olika spädningarna av standardprovet beredd i avsnitt 4.1 att generera en standardkurva.
      Obs: Ekvationen för standardkurvan visas (y = en ln (x) + b) tillsammans med R2 effektivitet (tabell 6B). En qPCR måste ha en verkningsgrad på nära 100% och R2 nära 1.0 (≥ 0,96).
    2. Använd de beräknade värdena för a och b för att fylla i motsvarande dataceller i kalkylbladet: 6 (tabell c).
    3. Komplett kalkylbladet med de Ct-värden som erhålls för de olika spädningarna av AAV provet beredd i avsnitt 4.2.
    4. Beräkna genomsnittlig AAV vektor titern i vektor genom per mikroliter av den del' primära' med hjälp av följande formel:
      Equation
      Obs: faktorn 400 används för enda stranded genomen, medan sc genomen använder en multiplikationsfaktor på 20025. I själva verket som DNA kvantiteter dubbel under varje qPCR cykel, upptäckt sc DNA är 2 x jämfört med en ss arvsmassa. Syftet med titreringen är att beräkna koncentrationen det vektor genomet per mikroliter. En korrigering är nödvändigt för att köra qPCR när du använder 2 µL av utgångsmaterial (steg 4.2.1). DIL representerar utspädningsfaktorer från steg 4.2.4. Antikroppnivåns på den ”sekundära” AAV vektor fraktionen (steg 3.6) kan beräknas samtidigt.

Tabell 6: mall för qPCR dataanalys. Vänligen klicka här för att hämta den här filen.

5. renhet kontroll av SDS-PAGE och silverfärgning

Obs: Genomförandet av denna del av protokollet tar ungefär 5 h.

  1. Använd 70% (v/v) etanol att grundligt rengöra glasplattorna används för gjutning gelerna.
  2. Montera gel gjutning systemet. Se till att bottnarna i glasplattorna inte är kluvet, för att förhindra läckage av akrylamid blandningen när gjutning gelen.
  3. Förbereda stapling och lösa gel lösningarna i två separata 50 mL koniska rör. Utelämna tetramethylethylenediamine (TEMED) och de 10% (w/v) ammonium persulfatoxidation (APS), som de ansvarar för polymerisation av gelen. Lägga till dem omedelbart före gjutning gelen.
    Obs: Den slutliga andelen av akrylamid i gel påverkar profilen separation av proteiner: vanligtvis en slutlig koncentration av 10% (v/v) av akrylamid räcka för att testa en AAV vektor förberedelse renhet.
  4. Blanda försiktigt genom omskakning röret som innehåller gel beståndsdelar. Gör inte vortex, eftersom överdriven syresättning kan försämra polymerisation.
  5. Lägga till TEMED och 10% (w/v) APS att lösa gellösningen. Blanda och häll sedan i gel hållaren tills den når 1-2 cm nedanför toppen av små glasskivan.
  6. Placera ett lager av vattenmättad butanol på toppen av akrylamid blandningen. Detta kommer att säkerställa bildandet av en plan yta under polymeriseringen. Lämna inte gelen under alkohol längre än 30 min eftersom det torkar ut gelen och försämrar dess funktion.
    Varning: Butanol är farligt vid hudkontakt. Den presenterar också en brandrisk. Hantera med försiktighet.
  7. Vänta tills gelen att polymerisera och häll sedan bort butanolen. Tips: Kontrollera huruvida den överskjutande gel mix i röret har stelnat. Polymerisation inträffar i mindre än 20 min. Tvätta ytan av gelen med H2O och sedan torka det med hushållspapper, noga med att inte störa ytan av gelen.
  8. Tillsätt TEMED och 10% (w/v) APS till stapling gelen och häll gelen i gel hållaren ovanpå separerande gelen.
  9. Placera medföljande kammen i gelen. Utföra den här åtgärden med en stadig rörelse för att undvika bildandet av luftbubblor inuti brunnarna.
  10. Vänta minst 20 min för gelen att polymerisera. Tips: Kolla om överskott gelen blanda i koniska röret har stelnat.
  11. Förbered två mixar (tabell 7) för både primärt och den sekundära AAV vektor fraktioner (steg 3.5 och 3.6, respektive).
Högt belopp Låga belopp
AAV vektor stock 5 ΜL 1 ΜL
5 x provet buffert 3 ΜL 3 ΜL
H2O 7 ΜL 11 ΜL

Tabell 7: Sammansättning av provet blandar krävs för silverfärgning.

  1. Fullständigt denaturera prov mixar genom att värma dem för 5 min vid 95 ° C. Montera elektrofores tanken, att uppmärksamma elektrod orientering.
  2. Fyll tanken med 1 x katod buffert på insidan av församlingens elektrod och 1 x anod buffert på utsidan.
    Obs: Anod buffert kan återvinnas från kör-och-kör. Färsk katod buffert måste alltid användas.
  3. Ta bort kammen från gelen och rengör brunnarna av gelen med 1 x katod buffert.
  4. Ladda 1 µL protein stege i en brunn. Ladda urval mixar i olika brunnar på samma gel (figur 3). Kör gelen vid 50 V tills proven anger lösa gelen. Sedan öka spänningen till 100 V tills dye framdel når den nedre gränsen av gelen.
  5. Extrahera gelen försiktigt från glasplattorna och använda silver färgning kit (enligt tillverkarens instruktioner26) för att visualisera virala proteiner (VP1, VP2 och VP3 subenheter) som utgör AAV kapsid, samt att kontrollera om möjligt protein kontaminering (figur 3).

Figure 3
Figur 3: utvärdering av vektor renhet med hjälp av SDS-PAGE och silverfärgning. Använder en Tricine-SDS gel, 5 µL av olika vektor preparat var åtskilda. Proteiner upptäcktes senare av silverfärgning. Vektorer anses rena när VP1 (82 kDa), VP2 (67 kDa), och VP3 (60 kDa) är synliga i en 1:1:10 förhållande (lane 1), utan överdriven bakgrund (lane 2) eller icke-specifika band (lane 3). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Representative Results

AAV9 ansågs, tills nyligen, att vara den mest effektiva AAV vektor serotypen i passerar BBB och transducing celler i CNS, perifer administrering. Ett viktigt framsteg i kapsid design uppnåddes när Deverman et al. rapporterade användningen av en metod för urval av kapsid som kallas Cre rekombination-baserade AAV-riktad evolution (skapa)17. Med den här metoden identifierat de en ny kapsid, heter PHP. B, som de uppgavs kunna transduce majoriteten av astrocyter och nervceller i flera CNS regioner, efter systemisk injektion17. Vid denna punkt, det bör noteras att även om PHP. B ger positiva resultat i C57/Bl6 möss (som var den stam som används i de ursprungliga isolering experiment), preliminära rapporter tyder dess effektivitet kan variera på ett sätt som stam-beroende. Ytterligare experiment kommer, utan tvekan, sprida mer ljus över denna fråga31.

Trots dessa problem, PHP. B erbjuder spännande möjligheter för noninvasiv gen manipulation i CNS av möss, inklusive proof-of-concept gen terapi experiment i sjukdomsmodeller. Som sådan, valde vi att bedöma effektiviteten av transgenens uttryck med hjälp av PHP. B kontra AAV9, som har varit 'guld-standard' vektorn för CNS transduktion perifer administrering sedan 20092. För att utföra en direkt jämförelse av båda serotyperna, under optimala förhållanden för transgenens uttryck, använde vi en sc genomet konfiguration32. Båda vektorer bärs transgenens för grönt fluorescerande protein (GFP) under kontroll av promotorn allestädes närvarande kyckling β-aktin (CBA). C57/Bl6 honmöss vid postnatal dag 42 (ca 20 g i vikt) fick en dos på 1 x 1012 vg per mus av antingen scAAV2/PHP. B-CBA-GFP eller scAAV2/9-CBA-GFP. Vector administrationen var utförs via svans ven injektion. Experimenten godkändes av den etiska kommittén den KU Leuven.

Tre veckor postinjection, mössen genomgick transcardial perfusion med iskall PBS, följt av 4% (w/v) iskall PARAFORMALDEHYD (PFA). Deras hjärnor skördades och genomgick ytterligare postfixation genom en över natten inkubation i samma fixeringsvätskan, innan du överför till 0,01% (w/v) Na-natriumazid/PBS för lagring tills vidare analys. Efteråt, hjärnor var sektioneras med hjälp av en vibrerande mikrotomen och immunohistokemi utfördes på 50 µm tjocka sektioner.

För att utvärdera nivåerna av transgenens uttryck, avsnitt var fläckade med primära antikroppar mot GFP (kanin anti-GFP), detektering med sekundära antikroppar konjugerat med ett fluorescerande färgämne (anti-kanin Alexa Fluor 488) (figur 4A, B ). Fluorescens intensitet mätningar (i godtyckliga enheter [au]) bekräftade en betydande ökning av GFP uttryck när en sc genomet och PHP. B kapsid användes i förhållande till AAV9. Observerades förhöjningar GFP i storhjärnan (2105 ± 161 vs. 1441 ± 99 au; p = 0.0032), lillhjärnan (2601 ± 196 vs. 1737 ± 135 au; p = 0.0032), och hjärnstammen (3082 ± 319 vs. 2485 ± 88 au; p = 0.0038) (figur 4 c).

Figure 4
Figur 4: systemisk leverans av scAAV2/PHP. B-CBA-GFP leder till en hög GFP uttryck i CNS. scAAV2/PHP. B-CBA-GFP eller scAAV2/9-CBA-GFP (1 x 1012 vg/mus) administrerades till 6 veckor gamla C57/Bl6 möss via svans ven injektion. GFP upptäcktes med immunohistokemi på koronalt hjärnan avsnitt 3 veckor postinjection. (A) de storhjärnan och (B) visas i lillhjärnan och hjärnstammen. Skala barer = 1 mm. (C) kvantifiering av relativa fluorescens stödnivåer utfördes för att bestämma nivåerna av GFP signal uppnås med varje vektor (10 sektioner per mus; tre möss per vektor grupp). En envägs ANOVA-test utfördes, följt av en tvåsidiga Students t-test; data är uttryckt som medelvärde ± standardavvikelse; p < 0,01; Au. godtyckliga enheter. pCapsid, används för AAV vektor produktion, innehåller den gen rep från serotyp 2 och gen cap från serotyp PHP. B eller AAV9, med detta. Denna siffra har ändrats från Rincon et al.32. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Discussion

Produktionen av rekombinant AAV vektorer beskrivs här använder material och utrustning som är gemensamma för de flesta molekylär biologi labs och cell kultur faciliteter. Det tillåter användaren att få ren, preklinisk grade AAV vektorer som kan användas för att rikta flera celler och vävnad typer inom en rad olika in vitro- och in-vivo -program. En av de största fördelarna med detta protokoll, jämfört med andra (dvs CsCl-baserade rening), är den korta arbetstiden som behövs. Ready-to-use AAV vektorer kan erhållas i högst 6 arbetsdagar efter den inledande transfection av HEK293T celler.

Flera faktorer kan negativt påverka den slutliga avkastningen eller kvaliteten på AAV vektorn. Stackars transfection effektivitet är en av de främsta orsakerna till en låg viral avkastning33. En stor rekommendation är att använda HEK293T celler som inte har varit anpassade mer än 20 gånger och har inte en cell sammanflödet större än 90% vid tidpunkten för transfection21. Transfection vald metod har dessutom stor inverkan på resultaten. Detta protokoll baseras på användning av PEI. PEI är en katjoniska polymer med förmåga att leverera exogent DNA till cellkärnan genom generering av komplex av polymer och nukleinsyra, känd som polyplexes, som tas upp av cellen och trafikerade via endosomes34. PEI-baserade transfection är lätt och snabbt att utföra, i motsats till andra allmänt använda metoder, såsom samfällning av DNA med kalciumfosfat35. PEI-baserade transfection är också mycket billigare jämfört med andra nyligen införda metoder, såsom användning av katjoniska lipider och magnet-medierad transfection36.

Rening strategin spelar en nyckelroll i protokollet. Jämfört med andra metoder, tenderar iodixanol-baserade reningar att innehålla en högre andel av Tom viruspartiklar (20%)20. Detta kompenseras, till en grad, av det faktum att iodixanol-baserade rening rutinmässigt resulterar i AAV vektor preparat med partikel-till-smittsamhet förhållande av mindre än 100. Detta innebär en betydande förbättring i jämförelse med konventionella CsCl-baserade förfaranden, som är betydande förlust av partikel smittsamhet rapporterade37. Ett annat vanligt alternativ metod att rena AAV vektorer är kromatografi-baserade rening. Men denna metod har den stora nackdelen att det krävs en särskild kolumn för varje vektor kapsid används: till exempel AAV2 är klassiskt isolerade med heparin kolumner, denna metod fungerar inte med AAV4 och AAV5, som inte äger heparin-bindande platser på deras förhoppningsvis38. Med tanke på att kromatografi rening är också dyra, är iodixanol-baserade rening generellt mer lämplig för laboratorier som vill producera hög kvalitet partier av AAV vektorer på en liten skala33,39, 40. men för att maximera den slutliga avkastning och renhet av vektor, extrem försiktighet behövs när du gör iodixanol Övertoningarna. De olika iodixanol fraktionerna ska överföras till ultracentrifugering röret med hjälp av en steril Pasteur-pipett vars spets vidrör väggen i röret: iodixanol bör utvisas från pipetten långsamt och kontinuerligt. Som vektor partiklarna ansamlas i 40% iodixanol lagret, måste vidtas för att säkerställa att de gradient gränssnitt inte blanda20. Slutligen bör det bråk som innehåller vektorn återvinnas genom införandet av en rostfritt stål trubbig nål med en mätare som inte är större än 20 G. För att maximera vektor återhämtning, ska tydlig bråket hämtas i sin helhet. Under detta steg är timing kritisk. För att undvika att äventyra renheten av preparatet, är det viktigt att stoppa samlingen innan andra (kontaminerande) faser av övertoningen samlas.

Skillnader i erhållna vektor titern kan också hänföras till vektorn inneboende förmåga att producera paketerade partiklar. En jämförelse mellan olika AAV serotyper visade att vissa AAV vektorer är svårare att producera en högre titer än andra (t.ex. AAV2)41. Nederbörd vektorns under avsaltning steg, kan vara en möjlig orsak till en lägre titer och förebyggas enkelt genom att undvika överkoncentration33. Dessutom är det också möjligt att av iodixanol gradient-baserade reningens effektivitet skiljer sig något mellan serotyper och, därför, avvikelser i titern erhålls med olika serotyper kan observeras41.

Slutligen måste det påpekas att även om qPCR är en mycket noggrann metod för DNA kvantifiering vissa inneboende variabilitet i tekniken kan observeras. Noggrannhet i titreringen beror primärt på exakt pipettering och ordentlig vortexa av alla lösningar. För att garantera den mest exakta titer läsning, qPCR självständigt kan upprepas, och erhållna medelvärdet. Valet av primers som presenteras i detta protokoll är baserat på sekvens av CBA arrangören ligger i pTransgene plasmiden används i vårt laboratorium. CBA arrangören är en stark syntetisk arrangören som används mycket i fältet vektor att driva uttryck över flera celltyper. Den innehåller flera element, inklusive cytomegalovirus (CMV) tidig enhancer elementet; arrangören, första exon och den första intron av CBA genen; och den skarv acceptorn av den kanin β-globingenen. Primers kan dock utformas för praktiskt taget alla element som ligger inom uttryck kassetten (inklusive promotorn, transgenens och reglerande element). Jämförelse av titer över partier är också möjligt, att tillhandahålla primers används mot regioner vanligt att vektorerna i fråga.

Avslutningsvis kan detta protokoll användas för att producera AAV vektorer med en mängd förhoppningsvis, genomet konfigurationer, promotorn typer och transgenens laster. Detta gör att användare att enkelt anpassa sin vektorer till bästa experimentella behov slutliga egenskaper. I exemplet presenteras i de representativa resultat, användning av PHP. B kapsid, som effektivt korsar BBB, gav högeffektiva genuttryck i CNS, följande svans ven injektion32. Systemisk administrering av CNS penetrant vektorer har avsevärda fördelar när det gäller eventuella biverkningar2,17,32. Ett möjligt alternativ till perifera injektion, samtidigt som man undviker förbehåll av invasiva tekniker, är intratekal leverans, som består av leverans av AAV vektorn i ryggmärgsvätskan. Denna leverans rutt är visat sig vara effektiva, visar utbredd uttryck för transgenens hela CNS, mindre off-target effekter i perifera organ, och låga nivåer av immunsvar42. Intratekala injektioner är dock mycket mer utmanande, eftersom de kräver högre tekniska färdigheter än svans ven injektion.

Kapsid vidareutveckling att förfina denna teknik kommer att drivas av möjligheterna för AAV vektor användning i gen terapi program. Sådana tillvägagångssätt erbjuder attraktiva möjligheter att behandla för närvarande obotliga CNS-störningar, såsom amyotrofisk lateral skleros, Charcot-Marie-Tooth sjukdom, Parkinsons sjukdom och Alzheimers sjukdom18.

Disclosures

Författarna har något att avslöja.

Acknowledgments

M.R. stöds av en Fonds voor yrkesverksamma Onderzoek Vlaanderen (CVE) postdoktorsstipendium (133722/1204517N) och erkänner ett kontinuerligt stöd för Fundación hjärt-de Colombia administrativa Department of Science, Teknik och Innovation (Grant CT-FP44842-307-2016, Projektkod 656671250485). M.M. stöds av ett CVE doktorand stipendium (1S48018N). M.G.H. stöddes av en VIB institutionella grant och externt stöd från Thierry Latran Foundation (SOD-VIP), Stiftelsen för Alzheimerforskningen (SAO-FRA) (P #14006), FWO (Grant 1513616N) och den Europeiska forskningsrådet (ERC) (Starting Grant 281961 - AstroFunc; Bevis på konceptet Grant 713755 - AD-VIP). Författarna erkänner Jeason Haughton för hans hjälp med musen djurhållning, Stephanie Castaldo för hennes hjälp med att utföra svans ven injektionerna och Caroline Eykens för att ge bilder av transfekterade HEK293T celler. M.G.H. erkänner Michael Dunlop, Peter Hickman och Dean Harrison.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Plasmid production
pTransgene plasmid De novo design or obtained from a plasmid repository N/A See step 1 of main protocol for further details
pCapsid De novo design or obtained from a plasmid repository N/A See step 1 of main protocol for further details
pHelper Agilent 240071
Plasmid Plus maxi kit Qiagen 12963
QIAquick PCR purification Kit Qiagen 28104
AAV Helper-Free System Agilent 240071
Cell culture and transfection
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM), high glucose, no glutamine Life technologies 11960-044 Supplement DMEM with FBS (1% or 10% v/v) and GlutaMAX 200 mM (1% v/v) then filter sterilize the medium using a 0.22 µm filter
Fetal bovine serum (FBS) GIBCO 10500-064
GlutaMAX supplement GIBCO 35050038
(200 mM)
Corning bottle-top vacuum filter system Sigma-Aldrich CLS430769
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (DPBS) with no calcium and no magnesium GIBCO 14190094
HEK293T cells American Tissue Culture Collection CRL3216 Upon receipt, thaw the cells and culture as described in the protocol. After a minimal number of passages, freeze a subfraction for future in aliquots. Always use cells below passage number 20. Once cultured cells have been passaged more than 20 times, restart a culture from the stored aliquots
Cell culture dishes Greiner Cellstar 639160 15 cm diameter culture dishes
Cell scrapers VWR 10062-904
Polyethylenimine (PEI) Polyscience 23966-2 PEI in powder form is dissolved at 1 µg/µL in deionized water (ddwater) at pH=2 (use HCl). Prepare in a beaker and stir for 2-3 h. When dissolved, bring the pH back to 7 with NaOH. Filter sterilize and store the resuspended stock solution in 1 ml aliquots at -20 °C. PEI aliquots can be freeze/thawed multiple times.
Virkon solution Fisher Scientific NC9821357 Disinfect any material that has been in contact with assembled vector particles with Virkon solution
Mutexi long-sleeve aprons Fisher Scientific 11735423 Wear an apron over the top of a regular lab coat
Fisherbrand maximum protection disposable overshoes Fisher Scientific 15401952
AAV Purification and desalting
Optiprep density gradient medium Sigma-Aldrich D1556 Optiprep is a 60% (w/v) solution of iodixanol in water (sterile). CAUTION. Use under a laminar flow hood. Wear gloves
Phenol red Sigma-Aldrich P0290 CAUTION. Use under a laminar flow hood
Pasteur pipette Sigma-Aldrich Z627992 Sterilize before use
OptiSeal Polypropylene tubes Beckman 361625
Benzonase (250 U/µL) Sigma-Aldrich E1014 Supplied as a ready-to-use solution
Acrodisc syringe filter Pall corporation 4614
Omnifix syringe (5 mL) Braun 4617053V
Blunt syringe needle Sigma Aldrich Z261378 Stainless steel 316 syringe needle, pipetting blunt 90° tip gauge 16, L 4 in. Referred to in the text as a blunt-end needle
Aqua Ecotainer B. Braun 0082479E Sterile endotoxin-free water. Referred to as 'Ultrapure water'
Amicon ultra-15 centrifugal filter unit Millipore UFC910024 These filters concentrate the final product by collecting the vector particles in consecutive centrifugation steps
Pluronic F68 (100x) Thermo Fisher 24040032 Non-ionic surfactant. Dilute in sterile PBS to use at 0.01% (v/v)
Fisherbrand Sterile Microcentrifuge Tubes with Screw Caps (2 mL) Fisher Scientific 02-681-374 Use skirted tubes for easy handling
AAV Titration
Restriction enzyme: StuI (10 U/µL) Promega R6421
DNAse I (1 U/µL) Fisher Scientific EN0521
Proteinase K Sigma-Aldrich 3115852001 Reconstitute in ultrapure water and use at a final concentration of 10 mg/mL. Solution can be stored at -20 °C
EasyStrip Plus Tube Strips (with attached caps) Fisher Scientific AB2000
Eppendorf microtube 3810x Sigma-Aldrich Z606340-1000EA
LightCycler 480 SYBR Green I Master Mix Roche 4707516001
LightCycler Multiwell Plates, 96 wells Roche 4729692001 White polypropylene plate (with unique identifying barcode)
Microseal 'A' PCR plate and PCR Plate Sealing Film Bio-Rad msa5001
AAV Purity control
Ammonium persulfate (APS) Sigma-Aldrich A3678 Reconstitute in ultrapure water to 10% (v/v). CAUTION. Use under a laminar flow hood. Wear gloves
Tetramethylethylenediamine (TEMED) Sigma-Aldrich T9281 CAUTION. Use under a laminar flow hood. Wear gloves
Tris Base ULTROL Grade Merck 648311 CAUTION: Use under a laminar flow hood. Wear gloves
UltraPure Agarose Thermo Fisher 16500-500
Rotiphorese® Gel 30 (37,5:1) Carl Roth 3029.3 Aqueous 30% acrylamide and bisacrylamide stock solution at a ratio of 37.5:1. CAUTION: Use under a laminar flow hood. Wear gloves
Serva Blue G Sigma-Aldrich 6104-58-1
Precision Plus prestained marker Bio-Rad 1610374edu
1-Butanol Sigma-Aldrich B7906 CAUTION: Use under a laminar flow hood. Wear gloves
Immunohistochemistry
Rabbit anti-GFP Synaptic Systems 132002 1:300 dilution
Anti-rabbit Alexa Fluor 488 Invitrogen A21206 1:1,000 dilution
Equipment Company Catalog number Comments
Vector production lab
Rotina 380 bench-top centrifuge * Hettich 1701
Optima XPN 80 ultracentrifuge * Beckmann Coulter A95765
Type 50.2 Ti fixed-angle titanium rotor * Beckmann Coulter 337901
Entris digital scale * Sartorius 2202-1S
Warm water bath * Set at 37 °C
Ice bucket * VWR 10146-290 Keep material used in the vector production lab separate from that used in standard lab areas
Pipetboy pro * Integra 156,400
Graduated pipettes: Cell star * Greiner bio-one 606180 Capacity of 5 mL
Graduated pipettes: Cell star * Greiner bio-one 607180 Capacity of 10 mL
Graduated pipettes: Cell star * Greiner bio-one 760180 Capacity of 25 mL
CO2 incubator CB150 * Binder 9040-0038 Set at 37 °C, 5% CO2 and 95% humidity
Nuaire safety cabinet NU 437-400E * Labexchange 31324 Clean all the surfaces with 70% ethanol and Virkon before and after use
Conventional lab
T100 thermal cycler * Bio-Rad 1861096
LightCycler 480 Instrument II * Roche 5015278001
ThermoMixer * Eppendorf C 5382000015
Nanodrop * ThermoFisher Scientific ND 2000
Mini-Protean Tetra Cell* Bio-Rad 1658001FC For use with handmade or precast gels
ProteoSilver silver stain kit Sigma-Aldrich PROTSIL1 High sensitivity protein detection with low background
Centrifuge 5804 R * Eppendorf B1_022628045 High speed centrifuge for medium capacity needs (up to 250 mL)
Graduated pipettes Cell star * Greiner bio-one 606180 5 mL
Graduated pipettes Cell star * Greiner bio-one 607180 25 mL
Graduated pipettes Cell star * Greiner bio-one 760180 25 mL
Filter tips * Greiner bio-one 750257 1250 µL
Filter tips * Greiner bio-one 738257 300 µL
Filter tips * Greiner bio-one 771257 10 µL
Ice bucket with lid * VWR 10146-290
Mini diaphragm vacuum pump, VP 86 * VWR 181-0065
Pipetman P2 Gilson F144801
Pipetman P20 Gilson F123600
Pipetman P100 Gilson F123615
Pipetman P200 Gilson F123601
Pipetman P1000 Gilson F123602
* Materials marked with an asterisk are expensive pieces of equipment and are usually central infrastructure items shared between multiple labs. These items can also be replaced by equivalents if available. Note, when a different ultracentrifuge is used, care must be taken to select the correct rotor and centrifuge tubes.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Daya, S., Berns, K. I. Gene Therapy Using Adeno-Associated Virus Vectors. Clinical Microbiology Reviews. 21 (4), 583-593 (2008).
  2. Duque, S., et al. Intravenous Administration of Self-complementary AAV9 Enables Transgene Delivery to Adult Motor Neurons. Molecular Therapy. 17 (7), 1187-1196 (2009).
  3. Bourdenx, M., Dutheil, N., Bezard, E., Dehay, B. Systemic gene delivery to the central nervous system using Adeno-associated virus. Frontiers in Molecular Neuroscience. 7, (2014).
  4. Kantor, B., McCown, T., Leone, P., Gray, S. J. Clinical Applications Involving CNS Gene Transfer. Advances in Genetics. 87, 71-124 (2014).
  5. Crystal, R. G. Adenovirus: The First Effective In Vivo Gene Delivery Vector. Human Gene Therapy. 25 (1), 3-11 (2014).
  6. Weinberg, M. S., Samulski, R. J., McCown, T. J. Adeno-associated virus (AAV) gene therapy for neurological disease. Neuropharmacology. 69, 82-88 (2013).
  7. Henckaerts, E., Linden, R. M. Adeno-associated virus: a key to the human genome? Future Virology. 5 (5), 555-574 (2010).
  8. Howarth, J. L., Lee, Y. B., Uney, J. B. Using viral vectors as gene transfer tools (Cell Biology and Toxicology Special Issue: ETCS-UK 1 day meeting on genetic manipulation of cells). Cell Biology and Toxicology. 26 (1), 1-20 (2010).
  9. Nathwani, A. C., et al. Adenovirus-Associated Virus Vector-Mediated Gene Transfer in Hemophilia B. The New England Journal of Medicine. 365 (25), 2357-2365 (2011).
  10. Carter, B. J. Adeno-associated virus and the development of adeno-associated virus vectors: a historical perspective. Molecular Therapy. 10 (6), 981-989 (2004).
  11. Schambach, A., Zychlinski, D., Ehrnstroem, B., Baum, C. Biosafety Features of Lentiviral Vectors. Human Gene Therapy. 24 (2), 132-142 (2013).
  12. Van Vliet, K. M., Blouin, V., Brument, N., Agbandje-McKenna, M., Snyder, R. O. The Role of the Adeno-Associated Virus Capsid in Gene Transfer. Methods in Molecular Biology. 437, 51-91 (2008).
  13. Rincon, M. Y., VandenDriessche, T., Chuah, M. K. Gene therapy for cardiovascular disease: advances in vector development, targeting, and delivery for clinical translation. Cardiovascular Research. 108 (1), 4-20 (2015).
  14. Samulski, R. J., Muzyczka, N. AAV-Mediated Gene Therapy for Research and Therapeutic Purposes. Annual Review of Virology. 1 (1), 427-451 (2014).
  15. McCarty, D. M. Self-complementary AAV Vectors; Advances and Applications. Molecular Therapy. 16 (10), 1648-1656 (2008).
  16. Choi, J. H., et al. Optimization of AAV expression cassettes to improve packaging capacity and transgene expression in neurons. Molecular Brain. 7, 17 (2014).
  17. Deverman, B. E., et al. Cre-dependent selection yields AAV variants for widespread gene transfer to the adult brain. Nature Biotechnology. 34 (2), 204-209 (2016).
  18. Jackson, K. L., Dayton, R. D., Deverman, B. E., Klein, R. L. Better Targeting, Better Efficiency for Wide-Scale Neuronal Transduction with the Synapsin Promoter and AAV-PHP.B. Frontiers in Molecular Neuroscience. 9, (2016).
  19. Lock, M., et al. Versatile Manufacturing of Recombinant Adeno-Associated Viral Vectors at Scale. Human Gene Therapy. 21 (10), 1259-1271 (2010).
  20. Strobel, B., Miller, F. D., Rist, W., LamLa, T. Comparative Analysis of Cesium Chloride- and Iodixanol-Based Purification of Recombinant Adeno-Associated Viral Vectors for Preclinical Applications. Human Gene Therapy Methods. 26 (4), 147-157 (2015).
  21. Jungmann, A., Leuchs, B., Katus, H. A., Rommelaere, J., Müller, O. J. Protocol for efficient generation and characterization of adeno-associated viral (AAV) vectors. Human Gene Therapy Methods. , (2017).
  22. Tolmachov, O. Designing Plasmid Vectors. Methods in Molecular Biology. 542, 117-129 (2009).
  23. QIAGEN Plasmid Purification Handbook. , Available from: https://www.qiagen.com/us/resources/download.aspx?id=46205595-0440-459e-9d93-50eb02e5707e&lang=en (2018).
  24. QIAquick PCR Purification Kit Protocol. , Available from: http://2012.igem.org/wiki/images/a/a3/QIAquick_PCR-purification.pdf (2008).
  25. Lock, M., Alvira, M. R., Chen, S. J., Wilson, J. M. Absolute Determination of Single-Stranded and Self-Complementary Adeno-Associated Viral Vector Genome Titers by Droplet Digital PCR. Human Gene Therapy Methods. 25 (2), 115-125 (2014).
  26. Sigma. ProteoSilver Silver Stain Kit (PROTSIL1) - Bulletin, ProteoSilver. , Available from: https://www.sigmaaldrich.com/content/dam/sigma-aldrich/docs/Sigma/Bulletin/protsil1bul.pdf (2018).
  27. Machholz, E., et al. Manual Restraint and Common Compound Administration Routes in Mice and Rats. Journal of Visualized Experiments. (67), e2771 (2012).
  28. Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), e3564 (2012).
  29. Puntel, M., et al. Gene transfer into rat brain using adenoviral vectors. Current Protocols in Neuroscience. 50 (1), (2010).
  30. Bachman, J. Immunohistochemistry on Freely Floating Fixed Tissue Sections. Methods in Enzymology. 533, 207-215 (2013).
  31. Hordeaux, J., et al. The Neurotropic Properties of AAV-PHP.B Are Limited to C57BL/6J Mice. Molecular Therapy. 26 (3), 664-669 (2018).
  32. Rincon, M. Y., et al. Widespread transduction of astrocytes and neurons in the mouse central nervous system after systemic delivery of a self-complementary AAV-PHP.B vector. Gene Therapy. 25 (2), 83-92 (2018).
  33. Crosson, S. M., Dib, P., Smith, J. K., Zolotukhin, S. Helper-free Production of Laboratory Grade AAV and Purification by Iodixanol Density Gradient Centrifugation. Molecular Therapy. Methods & Clinical Development. 10, 1-7 (2018).
  34. Merdan, T., Kunath, K., Fischer, D., Kopecek, J., Kissel, T. Intracellular processing of poly(ethylene imine)/ribozyme complexes can be observed in living cells by using confocal laser scanning microscopy and inhibitor experiments. Pharmaceutical Research. 19 (2), 140-146 (2002).
  35. Meissner, P., et al. Transient gene expression: recombinant protein production with suspension-adapted HEK293-EBNA cells. Biotechnology and Bioengineering. 75 (2), 197-203 (2001).
  36. Reed, S. E., Staley, E. M., Mayginnes, J. P., Pintel, D. J., Tullis, G. E. Transfection of mammalian cells using linear polyethylenimine is a simple and effective means of producing recombinant adeno-associated virus vectors. Journal of Virological Methods. 138 (1-2), 85-98 (2006).
  37. Zolotukhin, S., et al. Recombinant adeno-associated virus purification using novel methods improves infectious titer and yield. Gene Therapy. 6 (6), 973-985 (1999).
  38. Kaludov, N., Handelman, B., Chiorini, J. A. Scalable Purification of Adeno-Associated Virus Type 2, 4, or 5 Using Ion-Exchange Chromatography. Human Gene Therapy. 13 (10), 1235-1243 (2002).
  39. Nass, S. A., et al. Universal Method for the Purification of Recombinant AAV Vectors of Differing Serotypes. Molecular Therapy. Methods & Clinical Development. 9, 33-46 (2017).
  40. Qu, G., et al. Separation of adeno-associated virus type 2 empty particles from genome containing vectors by anion-exchange column chromatography. Journal of Virological Methods. 140 (1-2), 183-192 (2007).
  41. Holehonnur, R., et al. Adeno-associated viral serotypes produce differing titers and differentially transduce neurons within the rat basal and lateral amygdala. BMC Neuroscience. 15, 28 (2014).
  42. Wang, H., et al. Widespread spinal cord transduction by intrathecal injection of rAAV delivers efficacious RNAi therapy for amyotrophic lateral sclerosis. Human Molecular Genetics. 23 (3), 668-681 (2014).

Tags

Neurovetenskap fråga 143 Adeno-associerade virus (AAV)-baserat iodixanol lutning centrala nervsystemet gen leverans vektorer blod-hjärn-barriären PHP. B kapsid
Produktion, rening och kvalitetskontroll för Adeno-associerade Virus-baserat vektorer
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Fripont, S., Marneffe, C., Marino,… More

Fripont, S., Marneffe, C., Marino, M., Rincon, M. Y., Holt, M. G. Production, Purification, and Quality Control for Adeno-associated Virus-based Vectors. J. Vis. Exp. (143), e58960, doi:10.3791/58960 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter