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JoVE Journal Immunology and Infection
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Immunology and Infection

एक थाली आधारित Cytotoxicity चूहा अपरा प्राकृतिक हत्यारा सेल Cytolytic समारोह के मूल्यांकन के लिए परख

Published: June 2, 2019 doi: 10.3791/58961
Automatic Translation
1, 1, 2, 1,2
1Department of Emergency Medicine, University of Mississippi Medical Center, 2Department of Experimental Therapeutics and Pharmacology, University of Mississippi Medical Center

Summary

यहां, हम अलग और एक वर्णमितीय प्लेट परख द्वारा placentas से प्राकृतिक हत्यारा कोशिकाओं के साइटोटोक्सिक समारोह का आकलन करने के लिए एक विस्तृत पद्धति प्रदान करते हैं । कम गर्भाशय छिड़काव अपरा ischemia के दबाव चूहा मॉडल एंटीबॉडी-mediated अलगाव और प्राकृतिक हत्यारा कोशिकाओं के साइटोटोक्सिक समारोह का आकलन प्रदर्शित करने के लिए चुना गया था ।

Abstract

यह सर्वविदित है कि डेडुड्युल नेचुरल किलर (एनके) कोशिकाएं सामान्य गर्भावस्था की स्थापना और रखरखाव में महत्वपूर्ण भूमिका निभाती हैं । हाल के अध्ययनों में परिसंचारी और महिलाओं को जो इस तरह के आवर्ती गर्भपात और preeclampsia के रूप में प्रतिकूल गर्भावस्था जटिलताओं से पीड़ित में decidual एनके कोशिकाओं की एक बदल आबादी का प्रदर्शन किया है । हमारे समूह से अध्ययन से पता चला है कि गर्भावस्था में उच्च रक्तचाप सतह सक्रियण मार्कर की अभिव्यक्ति के आधार पर अपरा में सक्रिय एनके कोशिकाओं की एक वृद्धि की आबादी के साथ जुड़ा हुआ है । इस पांडुलिपि एक विस्तृत करने के लिए एनके कोशिकाओं के साइटोटोक्सिक समारोह का आकलन करने के लिए प्रदान करता है एक preeclampsia की तरह पशु मॉडल में placentas की शल्य चिकित्सा प्रेरित अपरा ischemia । निंनलिखित चरणों का विस्तार से वर्णन किया गया है: एकल कोशिका निलंबन, एनके सेल अलगाव, पूर्व vivo उत्तेजना, effector का उत्पादन: लक्ष्य सेल सह संस्कृति, और साइटोटॉक्सिसिटी परख ।

Introduction

Preeclampsia भ्रूण विकास प्रतिबंध, अंत अंग क्षति और क्रोनिक प्रतिरक्षा सक्रियण की विशेषता गर्भावस्था के एक ग्रस्त विकार है । क्रोनिक preeclampsia के साथ महिलाओं में प्रतिरक्षा सक्रियण बढ़ परिसंचारी और अपरा भड़काऊ cytokines, सीडी 4 में असंतुलन+ टी कोशिकाओं आबादी, और सक्रिय प्राकृतिक हत्यारा (NK) कोशिकाओं1की वृद्धि हुई जनसंख्या की ओर जाता है । हाल ही में हमारी प्रयोगशाला द्वारा प्रकाशित अध्ययनों में एनके कोशिकाओं के लिए एक भूमिका का प्रदर्शन कम गर्भाशय Perfusion दबाव (RUPP) preeclampsia के चूहे मॉडल में preeclampsia के साथ जुड़े pathophysiology के कुछ कारण । प्रवाह cytometry का उपयोग करने के लिए एनके कोशिकाओं पर सक्रियण मार्कर की सतह अभिव्यक्ति को मापने के लिए, परिसंचरण में सक्रिय एनके कोशिकाओं की एक वृद्धि की आबादी और RUPP चूहों की सामांय गर्भवती (एनपी) चूहों की तुलना में placentas2मनाया गया ।

प्रवाह कोशिका-मिति टिप्पणियों की पुष्टि करने के लिए, एन के placentas से अलग NP और RUPP चूहों के साइटोटोक्सिक गतिविधि का आकलन करने के लिए कार्यात्मक अध्ययन किया गया । साइटोटोक्सिक सीडी 8+ टी कोशिकाओं और एनके कोशिकाओं के साइटोटोक्सिक समारोह के मूल्यांकन के लिए कई तरीके उपलब्ध हैं । कार्यात्मक साइटोटोक्सिक विश्लेषण के लिए सोने के मानक क्रोमियम रिलीज परख3है । अंय विकसित प्रोटोकॉल का उपयोग किया प्रवाह कोशिका मिति4, छवि cytometry5, calcein रिलीज6, और सबसे हाल ही में bioluminescence7शामिल हैं । यह वीडियो अच्छी तरह से स्थापित लैक्टेट डिहाइड्रोजनेज (ldh) जारी परख का उपयोग करने के लिए एनके कोशिकाओं के साइटोटोक्सिक समारोह एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध ldh साइटोटोक्सिक परख किट का उपयोग करने पर एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान करेगा ।

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Protocol

सभी प्रोटोकॉल के मिसिसिपी चिकित्सा केंद्र विश्वविद्यालय में संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित किया गया । पशुओं की देखभाल और हथालन, नैतिक पशु उपचार के लिए राष्ट्रीय स्वास्थ्य दिशा-निर्देशों के अनुरूप थे ।

1. लिम्फोसाइट कोशिका Placentas से अलगाव

  1. एक नाल को चूहे के गर्भाशय से निकालें (गर्भावधि 19) और 10 मिलीलीटर बर्फ की ठंडी पीबीएस8में रखें ।
  2. एक नाल को १०० μm फिल्टर पर रखें और एक पेट्री डिश में बैठें जिसमें १३.५ मिलीलीटर आरपीएमआई और १.५ मिलीलीटर एफबीएस (कुल मात्रा 15 मिलीलीटर है) । पेट्री डिश में फिल्टर के माध्यम से नाल को पुश करने के लिए एक सिरिंज प्लंजर के फ्लैट की ओर का उपयोग करें ।
  3. प्रत्येक ऊतक के लिए ३ १५ मिलीलीटर शंकु ट्यूब तैयार करें । घनत्व ढाल मध्यम के 3 मिलीलीटर जोड़ें ( सामग्री की मेजदेखें) प्रत्येक ट्यूब के लिए, तो ध्यान से प्रत्येक ट्यूब में homogenized अपरा के 5 मिलीलीटर उपरिशाई ।
  4. ३०० एक्स जी पर 25 मिनट के लिए कोई ब्रेक के साथ कमरे के तापमान (आरटी) पर अपकेंद्रित्र । एक स्थानांतरण pipette के साथ पतली सफेद buffy परत लीजिए ।
    नोट: अपकेंद्रण के बाद, 3 परतों दिखाई दे रहे हैं, शीर्ष पर लाल RPMI, बीच में सफेद buffy परत, और नीचे स्पष्ट घनत्व ढाल मध्यम परत । ट्यूब से सफेद buffy परत को खींचने के लिए एक स्थानांतरण पिपेट का उपयोग करें । 1 ट्यूब में एक ही नाल के सभी ट्यूबों से buffy परत का मिश्रण ।
  5. जोड़ buffy परतों के लिए RPMI के 10 मिलीलीटर जोड़ें । 10 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र, ३०० x जी, 4 डिग्री सेल्सियस पर और supernatant त्यागने ।

2. प्राकृतिक हत्यारा कोशिकाओं का अलगाव

  1. फिर से निलंबित सेल गोली ५० μL आइस-कोल्ड पीबीएस में
  2. बायोटिन लेबल वाले CD3 एंटीबॉडी को निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार कोशिकाओं को पेलेट करने के लिए जोड़ें और एक पिपेट के साथ अच्छी तरह से मिलाएं । एक ट्यूब अंग को घुमानेवाला में ट्यूब प्लेस और 4 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट सेते ।
  3. RPMI के 1 मिलीलीटर, ४०० x g और 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र जोड़ें, और supernatant छोड़ें ।
  4. RPMI के 1 मिलीलीटर में गोली फिर से निलंबित और एक १.५ मिलीलीटर माइक्रोअपकेंद्रित्र ट्यूब में चुंबकीय मोतियों की १५० μL के साथ गठबंधन । माइक्रोअपकेंद्रित्र नली को एक ट्यूब रोटेटर में रखें और 4 ° ब् पर 30 मिनट के लिए इनक्यूबैटिंग करते हुए घुमाएं ।
    नोट: इस समय में रिलीज बफर बाहर खींचो और जैव सुरक्षा कैबिनेट में आरटी तक पहुँचने के लिए अनुमति देते हैं ।
  5. 1 मिनट के लिए चुंबक में ट्यूबों रखें । supernatant लीजिए और CD3-सेल आबादी को बचाने के लिए बर्फ पर एक 15 मिलीलीटर ट्यूब में ।
    नोट: यह CD3- कोशिकाओं की आबादी है ।
  6. चुंबक से ट्यूब निकालें और RPMI के 1 मिलीलीटर जोड़ें । मिक्स सेल और मोती 5 बार एक पिपेट के साथ ।
  7. दोहराएं चरण २.५ ।
  8. CD3 ४०० एक्स जी और 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए और supernatant त्यागें सेल गोली ५० में आइस-कोल्ड PBS के μL निलंबित
  9. निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार CD3- कोशिकाओं के लिए बायोटिन लेबल CD161a एंटीबॉडी जोड़ें और अच्छी तरह से मिलाएं । एक ट्यूब में रोटेटर और 4 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए इनक्यूबेट में ट्यूब प्लेस ।
  10. RPMI के 1 मिलीलीटर, ४०० x g और 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र जोड़ें, और supernatant छोड़ें । RPMI के 1 मिलीलीटर में गोली फिर से निलंबित और एक १.५ मिलीलीटर माइक्रोअपकेंद्रित्र ट्यूब में चुंबकीय मोतियों की १५० μL के साथ गठबंधन ।
  11. एक ट्यूब अंग को घुमानेवाला में माइक्रोअपकेंद्रित्र ट्यूब प्लेस और 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए इंक्यूबैटिंग जबकि घुमाएगी ।
  12. 1 मिनट के लिए एक चुंबक में ट्यूबों प्लेस । supernatant लीजिए और CD3-/Cd161a- कोशिकाओं को त्यागने ।
  13. चुंबक से ट्यूब निकालें और RPMI के 1 मिलीलीटर जोड़ें । मिक्स सेल और मोती 5 बार एक पिपेट के साथ ।
  14. दोहराएं चरण २.१२ ।
  15. चुंबक से माइक्रोअपकेंद्रित्र ट्यूबों निकालें और आर टी रिलीज बफर के 1 मिलीलीटर जोड़ें । ट्यूब पर जगह ट्यूब अंग को घुमानेवाला और घुमाएगी, जबकि आरटी में 15 मिनट के लिए इंक्यूबैटिंग ।
  16. 1 मिनट के लिए चुंबक में जगह ट्यूबों. बर्फ पर एक नए 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में supernatant लीजिए ।
    नोट: यह एनके सेल्स की पॉपुलैरिटी है ।
  17. चुंबक से ट्यूब निकालें और आरटी RPMI के 1 मिलीलीटर जोड़ें । मिक्स सेल और मोती 5 बार पिपेट के साथ ।
  18. दोहराएं कदम २.१६, एक ही ट्यूब में supernatant रखकर । अच्छी तरह से मिलाएं और कोशिकाओं की गिनती करने के लिए एक 20 μL नमूना ले
    नोट: बर्फ पर ट्यूब रखें ।
  19. 3 मिनट, ४०० एक्स जी के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर, तो supernatant हटाने के लिए सेंट्रलाइज CD3-/cd161a+ कोशिकाओं । RPMI में कक्षों (10% FBS, 1% पेन/Strep, 2 ng/mL IL-2) और बीज 3 x 105 कोशिकाओं २.५/ ४८ एच के लिए ३७ ° c, 5% से कम एक humidified इनक्यूबेटर में2 कोशिकाओं को सेते ।

3. cytotoxicity परख: एनके कोशिकाओं या संस्कृति या पासिंग कोशिकाओं से YAC1 पुनःप्राप्त

नोट: सभी कदम हुड के तहत आयोजित किया जाना चाहिए । सभी सेल ट्यूब्स को हर हाल में बर्फ पर रखना चाहिए ।

  1. Flask से YAC1 कोशिकाओं और मीडिया को इकट्ठा करने के लिए एक गिलास सीरम विज्ञानी पिपेट का प्रयोग करें, बर्फ पर एक ५० मिलीलीटर ट्यूब में जगह है, और अच्छी तरह से मिश्रण । कोशिकाओं की गणना करने के लिए 20 μL ले लो ।
  2. ३०० x g और 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए YAC1 कोशिकाओं स्पिन । जब ये घूमते हैं, तब कक्षों की गणना करना ।
  3. एक एनके सेल 6-वेल प्लेट में ट्रिपसिन/ईटीए को प्रत्येक कुएं में डालिए । इनक्यूबेटर में थाली और जगह पर टैप करें ।
  4. के बाद कोशिकाओं trypsin के साथ इंक्यूबेटेड है/३७ ° c पर 5 मिनट के लिए EDTA, एक बाँझ प्लेट स्क्रैपर के साथ थाली कुरेदना/ हर अच्छी तरह से NK सेल मीडिया के 1 मिलीलीटर जोड़ें ।
  5. सीरम विज्ञानी पिपेट के साथ कोशिकाओं और मीडिया लीजिए और एक 15 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूब में इकट्ठा । कोशिकाओं की गणना करने के लिए 20 μL ले लो ।
  6. एनके सेल्स को 10 मिनट, ४०० x g को 4 डिग्री सेल्सियस पर स्पिन करें । इस अपकेंद्रण के दौरान चरण ३.५ से कक्षों के नमूने की गणना ।
    नोट: एक खुर्दबीन के नीचे संस्कृति प्लेटों को देखने से पहले उंहें यकीन है कि वहां कोई और अधिक कक्षों कुओं के नीचे का पालन कर रहे है करने के लिए discarding । चूंकि प्रयोग NK कोशिकाओं और YAC1 कोशिकाओं का उपयोग करता है, प्रत्येक एक अलगसे गिनती करने के लिए सुनिश्चित हो ।
  7. कोशिकाओं की गणना और लक्ष्य की उचित संख्या के लिए परीक्षण करने के लिए अनुकूलन परीक्षणों में निर्धारित सांद्रता पर resuspend: effector अनुपात. यह फिर से अपने संबंधित मीडिया में गोली निलंबित द्वारा प्राप्त किया जाएगा निंनलिखित सेल सांद्रता: YAC1 4 x 105 कोशिकाओं/एमएल और एनके कोशिकाओं पर 2 x 107 कोशिकाओं/

4. cytotoxicity परख: परख प्रोटोकॉल

  1. एक दौर नीचे का प्रयोग करें, संस्कृति का इलाज ९६-खैर थाली के रूप में तालिका 1में सुझाव दिया स्थापित करने के लिए । यह तालिका प्रायोगिक नियंत्रणों और NK प्रायोगिक स्तंभों के 3 सेट दिखाती है । यह एक ९६-कूप प्लेट में कुल 10 एनके प्रायोगिक स्तंभों के लिए विस्तारित किया जा सकता है ।
  2. 4 मिनट के लिए २५० x जी पर परख थाली के अपकेंद्रित्र निश्चित है कि effector और लक्ष्य कोशिकाओं के संपर्क में हैं । ३७ डिग्री सेल्सियस, 5% से कम लक्ष्य और effector कोशिकाओं के बीच पर्याप्त संपर्क प्राप्त करने के लिए2 और effector कोशिकाओं द्वारा लक्ष्य कोशिका lysis में 5 घंटे के लिए ९६-कूप प्लेट को सेते ।
    नोट: यहां प्रोटोकॉल को रोका जा सकता है ।
  3. ४५ मिनट की कटाई से पहले supernatants, लक्ष्य सेल अधिकतम LYSIS रिलीज वेल्स (वेल्स 1E, 1E, 1E, और 1E) के लिए 10x Lysis समाधान के 10 μL जोड़ें और थाली humidified चैंबर में वापस रखें ।
  4. ऊष्मायन समय पूरा होने के बाद, 4 मिनट के लिए २५० एक्स जी पर थाली केंद्रान्तरण । एक मल्टीचैनल pipettor का उपयोग कर, सभी कुओं से ५० μl aliquots एक ताजा ९६-अच्छी तरह से फ्लैट नीचे परख थाली के लिए स्थानांतरण ।
    नोट: कुओं के नीचे स्पर्श नहीं है कि कोशिकाओं को ताजा परख थाली में स्थानांतरित नहीं कर रहे हैं । ताजा परख थाली के रूप में एक सभ्य इलाज थाली का उपयोग न करें ।
  5. परख अभिकर्मक बनाओ ।
    1. बाद परख बफर कमरे के तापमान पर पहुंच गया है, एक सब्सट्रेट मिक्स बोतल को परख बफर के 12 मिलीलीटर जोड़ें । पलटी और धीरे से पूरी तरह से भंग जब तक हिला । 1 बोतल २ ९६-कूप प्लेटों के लिए पर्याप्त है ।
      नोट: परख बफर प्रकाश से संरक्षित किया जाना चाहिए, जबकि thawed जा रहा है । मिश्रण तुरंत पहले उपयोग करने के लिए ।
  6. चरण ४.६ से परख थाली में सभी कुओं को परख अभिकर्मक के ५० μL जोड़ें । थाली को प्रकाश से बचाने के लिए और कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए इनक्यूबेट से कवर करें ।
    नोट: नव बनाया परख अभिकर्मक एक फ्रीजर में संग्रहित किया जाना चाहिए । अभिकर्मक लगभग 8 सप्ताह के लिए अच्छा है ।
  7. प्रत्येक अच्छी तरह से बंद समाधान के ५० μL जोड़ें । बंद करो समाधान जोड़ने के बाद 1 घंटे के भीतर प्लेट पढ़ें और ४९० एनएम पर अवशोषण रिकॉर्ड । प्रतिनिधि डेटा तालिका 2में दिखाया गया है ।

5. परिणामों की गणना

  1. संस्कृति मध्यम पृष्ठभूमि कुओं से औसत अवशोषण मूल्य की गणना और प्रयोगात्मक के लिए सभी अवशोषण मूल्यों से घटाना, लक्ष्य सेल सहज LDH रिलीज और Effector सेल सहज LDH रिलीज कुओं.
  2. मात्रा सुधार नियंत्रण कुओं के लिए औसत अवशोषण मूल्यों की गणना और लक्ष्य सेल अधिकतम LDH रिहाई नियंत्रण कुओं के लिए अधिग्रहीत अवशोषण मूल्यों से घटाना ।
  3. एक effector के लिए प्रतिशत साइटोटॉक्सिसिटी की गणना करने के लिए निम्न सूत्र में चरण ५.१ और ५.२ से सही मान का उपयोग करें: लक्ष्य अच्छी तरह से ।
    Equation 1

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Representative Results

Placental एनके एनपी और RUPP चूहों से प्राप्त कोशिकाओं 50:1 के अनुपात में अपने संबंधित medias में लक्ष्य कोशिकाओं के साथ 5 एच के लिए इनक्यूबिटेड थे (NK: लक्ष्य) । अवशोषन ४९० एनएम पर दर्ज किया गया और कच्चा डाटा सारणी 2में दर्शाया गया है । संस्कृति माध्यम पृष्ठभूमि और मात्रा सुधार नियंत्रण कूपों के औसत अवशोषण की गणना की गई थी । ये औसत निर्माता के प्रोटोकॉल में दर्शाए गए उपयुक्त कुओं से घटाया गया था और तालिका 3में दर्शाया गया है । संशोधित मान तब निर्माता द्वारा प्रदान किए गए प्रोटोकॉल का उपयोग कर% साइटोटॉक्सिसिटी प्राप्त करने के लिए उपयोग किया गया (तालिका 4) ।

1 2 3 4 5
टीसीएस वीसीसी ECSR-1 ECSR-2 ECSR-3
टीसीएस वीसीसी ECSR-1 ECSR-2 ECSR-3
टीसीएस वीसीसी ECSR-1 ECSR-2 ECSR-3
टीसीएस वीसीसी ECSR-1 ECSR-2 ECSR-3
Tcm Cmb EW-1 EW-2 EW-3
Tcm Cmb EW-1 EW-2 EW-3
Tcm Cmb EW-1 EW-2 EW-3
Tcm Cmb EW-1 EW-2 EW-3

तालिका 1: आमापन प्लेट लेआउट । टीसीएस = लक्ष्य सेल सहज LDH रिलीज (५० μL लक्ष्य कोशिकाओं + ५० μL लक्ष्य सेल मध्यम); TCM = लक्ष्य सेल अधिकतम LDH रिलीज (५० μL लक्ष्य कोशिकाओं + ५० μL लक्ष्य सेल मध्यम); VCC = मात्रा सुधार नियंत्रण (५० μL लक्ष्य सेल मध्यम + ५० μL NK सेल मध्यम); सीएमबी = संस्कृति माध्यम पृष्ठभूमि नियंत्रण (५० μL लक्ष्य सेल मध्यम + ५० μL NK सेल मध्यम); ECSR = Effector सेल सहज रिलीज (५० μL NK कोशिकाओं + ५० μL NK कोशिकाओं मध्यम); EW = प्रयोगात्मक कुओं (५० μL लक्ष्य कोशिकाओं + ५० μL NK कोशिकाओं) ।

1 2 3 4 5
Np Rupp Np
०.६१५ ०.४८४ ०.४७३ ०.४६३ ०.४७१
०.५८६ ०.४८४ ०.४५८ ०.४७४ ०.४६९
०.६१ ०.४८६ ०.४६४ ०.४५९ ०.४६९
०.५७८ ०.४९५ ०.४७८ ०.४५८ ०.४८२
०.६०५ ०.५५ ०.५२४ ०.५२६ ०.५४३
०.५७६ ०.५०४ ०.५१९ ०.५०२ ०.५२८
०.५६५ ०.५१२ ०.५१५ ०.५१३ ०.५३१
०.५६३ ०.५८१ ०.५२६ ०.५०८ ०.५१९

तालिका 2: एक परख कॉलम 1 और 2 और प्रायोगिक कुओं में प्रयोगात्मक नियंत्रण युक्त थाली के कच्चे अवशोषण डेटा NP और rupp चूहों से YAC1 लक्ष्य कोशिकाओं के खिलाफ अपरा एनके कोशिकाओं के साइटोटॉक्सिसिटी को मापने के लिए ।

1 2 3 4 5
Np Rupp Np
०.१२७७५ -०.०१४२५ -०.०२४२५ -०.०१६२५
०.०९८७५ -०.०२९२५ -०.०१३२५ -०.०१८२५
०.१२२७५ -०.०२३२५ -०.०२८२५ -०.०१८२५
०.०९०७५ -०.००९२५ -०.०२९२५ -०.००५२५
०.०६८२५ ०.०३६७५ ०.०३८७५ ०.०५५७५
०.०३९२५ ०.०३१७५ ०.०१४७५ ०.०४०७५
०.०२८२५ ०.०२७७५ ०.०२५७५ ०.०४३७५
०.०२६२५ ०.०३८७५ ०.०२०७५ ०.०३१७५

तालिका 3. सही अवशोषण । विनिर्माता के प्रोटोकोल के अनुसार नियंत्रण कूपों के औसत अवशोषण के घटाव के बाद कुओं का अवशोषण । स्तंभ 1, वेल्स 1-4, टीसीएस अवशोषक मान-औसत CMB अवशोषण मान रहे हैं । स्तंभ 1, वेल्स 5-8, TCM अवशोषण मान रहे हैं-औसत VCC अवशोषण मूल्य.

Np Rupp Np
१२८.९९१६ १०८.८२३५ ९३.६९७४८
६३.४४५३८ ११८.९०७६ ६६.८०६७२
७५.९२५९३ ७२.७५१३२ ६४.२८५७१
६६.२७९०७ ६३.१७८२९ ८३.३३३३३
औसत% साइटोटॉक्सिसिटी ८३.६६०४९ ९०.९१५१८ ७७.०३०८१

तालिका 4. साइटोटॉक्सिसिटी की गणना । एनपी और rupp चूहों से अलग अपरा एनके कोशिकाओं की प्रतिकृति नमूनों की औसत प्रतिशत साइटोटॉक्सिसिटी ।

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Discussion

वहां महत्वपूर्ण प्रमुख नोटों की एक संख्या के लिए इष्टतम परिणामों के लिए विचार कर रहे हैं । उपयोग की गई कोशिकाओं की बंध्यता बहुत महत्वपूर्ण है । नाल के संग्रह के बाद, यह महत्वपूर्ण है कि तैयारी और एनके कोशिकाओं के अलगाव एक जैव सुरक्षा कैबिनेट में बाँझ शर्तों के तहत प्रदर्शन कर रहे हैं । इसके अलावा, क्योंकि सभी कोशिकाओं सेलुलर नुकसान पर LDH जारी, देखभाल के लिए अलगाव के बाद एनके कोशिकाओं की एक उच्च व्यवहार्यता प्राप्त करने के लिए और सह संस्कृति प्रक्रिया के दौरान लिया जाना चाहिए । एनके कोशिकाओं से बहुत अधिक सहज LDH रिलीज अक्सर नकारात्मक में परिणाम कर सकते हैं, व्यर्थ डेटा

इस प्रोटोकॉल के कुछ पहलू हैं जो यूजर और उनकी जरूरतों के लिए खास होंगे । उदाहरण के लिए, इस आलेख में विधियों, जैसे कि यांत्रिक और एंजाइमी विसमुच्चयन के अतिरिक्त, अपरा से मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं के अलगाव के लिए विभिन्न तरीके हैं । साथ ही, यह उपयोगकर्ता इष्टतम लक्ष्य कक्ष संख्या और effector निर्धारित करने के लिए है: लक्ष्य अनुपात जो उनके प्रयोग के लिए उपयुक्त हो जाएगा । हमारे हाथ में, १०,००० लक्ष्य कोशिकाओं और एक effector: 50:1 के लक्ष्य अनुपात हमारे प्रयोगों के लिए इष्टतम होना निर्धारित किया गया था. इन नंबरों को चुना लक्ष्य कोशिकाओं के आधार पर बदल सकते है और जिस ऊतक से एनके कोशिकाओं अलग कर रहे है पर । अंय जांचकर्ताओं इस विधि का उपयोग किया है जिगर और तिल्ली9से अलग कोशिकाओं के एनके समारोह का आकलन । इसलिए, इस विधि अनुसंधान के विभिंन क्षेत्रों में नियोजित किया जा सकता है, न केवल preeclampsia के अध्ययन में, के रूप में हम इसे का उपयोग करने के लिए चुना है ।

साइटोटॉक्सिसिटी मूल्यांकन के लिए सोने के मानक क्रोमियम रिलीज परख5है । हालांकि इस विधि विश्वसनीय और reproducible है, सबसे स्पष्ट सीमा कर्मियों और रेडियोधर्मी निपटान करने के लिए रेडियोधर्मी जोखिम खतरे का उपयोग है । अन्य, गैर रेडियोधर्मी साइटोटॉक्सिसिटी प्रवाह कोशिका मिति आधारित और calcien रिहाई assays हैं जैसे कि सीआरए6,10,11के लिए तुलनीय परिणाम की रिपोर्ट कर रहे हैं. हालांकि, प्रवाह-cytometry आधारित assays है परख चलाने के प्रवाह कोशिका मिति में कर्मियों के अतिरिक्त विशेष प्रशिक्षण की आवश्यकता है । LDH रिलीज परख किसी भी विशेष प्रशिक्षण की आवश्यकता नहीं है, के रूप में इस परीक्षण केवल साधारण परख प्रदर्शन pipetting की आवश्यकता है । इसके अतिरिक्त, जबकि LDH रिलीज परख मानक स्पेक्ट्रोस्कोपी या फ्लोरोसेंट का पता लगाने का उपयोग किया जा सकता है, calcien रिहाई और प्रवाह-cytometry-आधारित विधियों प्रतिदीप्ति का पता लगाने में सक्षम उपकरणों की आवश्यकता होती है । LDH रिलीज परख की सीमाएं क्षतिग्रस्त कोशिकाओं से LDH की अधूरी रिहाई के कारण कोशिका मौत का एक कम अनुमान शामिल हैं ।

इस परख में, मीडिया में जारी ldh की माप एक एंजाइमी प्रतिक्रिया जिसमें iodonitrotetrazolium (एक tetrazolium नमक) में परिवर्तित किया जाता है द्वारा होता है (लाल रंग में) । अवशोषण मानक स्पेक्ट्रोस्कोपी द्वारा मापा जाता है और संस्कृति में क्षतिग्रस्त कोशिकाओं की मात्रा लाल रंग की तीव्रता के लिए आनुपातिक है । इस परख एक नमूना में क्षतिग्रस्त या घायल कोशिकाओं के सटीक निर्धारण के लिए अनुमति देता है । अंत में, इस वर्णमितीय परख भी अंय कोशिका प्रकार के साथ किया जा सकता है के लिए परख साइटोटॉक्सिसिटी सेल के माध्यम से होने वाली mediated के रूप में अच्छी तरह के रूप में रासायनिक मध्यस्थता तंत्र ।

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Disclosures

ब्याज का कोई संघर्ष, वित्तीय या अंयथा, लेखकों द्वारा घोषित कर रहे हैं ।

Acknowledgments

इस काम के राष्ट्रीय स्वास्थ्य के दिल फेफड़ों और रक्त संस्थान अनुदान R00HL130456, राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान के राष्ट्रीय संस्थानों के जनरल मेडिकल साइंसेज के तहत पुरस्कार P20GM104357 के तहत, और द्वारा समर्थित किया गया था मिसिसिपी INBRE, अनुदान संख्या P20GM103476 के तहत स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थानों के सामांय चिकित्सा विज्ञान के राष्ट्रीय संस्थानों से एक संस्थागत विकास पुरस्कार (विचार) द्वारा वित्त पोषित । सामग्री केवल लेखकों की जिंमेदारी है और जरूरी स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थानों के सरकारी विचारों का प्रतिनिधित्व नहीं करता है ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 mL Eppendorf tube Fisher 5408129
100 µL Filter Fisher 22363549 Nylon Mesh
15 mL conical tube Fisher 0553859A
3 mL syringe Fisher 14823436
50 mL conical tube Fisher 7203510
6-well cell culture plate Corning 720083
96-well Tissue Culture Plate CELLTREAT 229190 Sterile, Round Bottom
AOPI Nexcelom CS201065ML
Cell scraper Fisher 8100241
Cellometer Disposable Counting Chambers Nexcelom CHT4-SD100
Cellometer Vision Image Cytometer Nexcelom N/A
Cytotox 96 Non-Radioactive Cytotoxicity Assay Kit Promega G1780
Dynabeads Flowcomp Flexi Kit Invitrogen 11061D
DynaMag-2 Magnet Invitrogen 12321D
EDTA Sigma Aldrich EDS-100G
FBS Atlanta Biologicals S11150H
Flow Cytometry Tube Corning 352008
Lymphoprep Fisher NC0460539 Density gradient medium; 4 x 250 mL
PBS Fisher SH3025801 10 x 500 mL
Penicillin/Streptomycin Gibco 15140122
Petri dishes Fisher 9720500 Without Pad
Purified Mouse anti-Rat CD161a BD Biosciences 555006
Purified Mouse anti-Rat CD3 BD Biosciences 554829
Recombinant Rat IL-2 R&D Systems 502-RL
RPMI Gibco 11875135 1640 Medium
T25 flask Corning 430639
Trypsin ThermoFisher 15090046
YAC-1 cell ATCC TIB-160

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References

  1. Cornelius, D. C., Cottrell, J., Amaral, L. M., LaMarca, B. Inflammatory Mediators: A causal link to hypertension during pregnancy- Studies in Preeclampsia. British Journal of Pharmacology. , (2018).
  2. Elfarra, J., et al. Natural killer cells mediate pathophysiology in response to reduced uterine perfusion pressure. Clinical Science. 131 (23), 2753-2762 (2017).
  3. Brunner, K. T., Mauel, J., Cerottini, J. C., Chapuis, B. Quantitative assay of the lytic action of immune lymphoid cells on 51-Cr-labelled allogeneic target cells in vitro; inhibition by isoantibody and by drugs. Immunology. 14 (2), 181-196 (1968).
  4. Kim, G. G., Donnenberg, V. S., Donnenberg, A. D., Gooding, W., Whiteside, T. L. A novel multiparametric flow cytometry-based cytotoxicity assay simultaneously immunophenotypes effector cells: comparisons to a 4 h 51Cr-release assay. Journal of Immunological Methods. 325 (1-2), 51-66 (2007).
  5. Somanchi, S. S., McCulley, K. J., Somanchi, A., Chan, L. L., Lee, D. A. A Novel Method for Assessment of Natural Killer Cell Cytotoxicity Using Image Cytometry. PLoS One. 10 (10), 0141074 (2015).
  6. Neri, S., Mariani, E., Meneghetti, A., Cattini, L., Facchini, A. Calcein-acetyoxymethyl cytotoxicity assay: standardization of a method allowing additional analyses on recovered effector cells and supernatants. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 8 (6), 1131-1135 (2001).
  7. Karimi, M. A., et al. Measuring cytotoxicity by bioluminescence imaging outperforms the standard chromium-51 release assay. PLoS One. 9 (2), 89357 (2014).
  8. Caporossi, C., Nogueira, P. L., Marques, J. C., Assis, R. M., Aguilar-Nascimento, J. E. Validation of the gastroschisis experimental model and the influence of the mother's diet enriched with glutamine in the fetal morphology. Acta Cirúrgica Brasileira. 29 (3), 158-165 (2014).
  9. Lv, L. H., et al. Functional distinction of rat liver natural killer cells from spleen natural killer cells under normal and acidic conditions in vitro. Hepatobiliary and Pancreatic Diseases International. 11 (3), 285-293 (2012).
  10. Flieger, D., et al. A novel non-radioactive cellular cytotoxicity test based on the differential assessment of living and killed target and effector cells. Journal of Immunological Methods. 180 (1), 1-13 (1995).
  11. Jang, Y. Y., et al. An improved flow cytometry-based natural killer cytotoxicity assay involving calcein AM staining of effector cells. Annals of Clinical Laboratory Science. 42 (1), 42-49 (2012).

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Baik, C. H., Geer, M., Travis, O.… More

Baik, C. H., Geer, M., Travis, O. K., Cornelius, D. C. A Plate-based Cytotoxicity Assay for the Assessment of Rat Placental Natural Killer Cell Cytolytic Function. J. Vis. Exp. (148), e58961, doi:10.3791/58961 (2019).

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