Summary
Hier bieden we een gedetailleerde methodologie voor het isoleren en beoordelen van de chemo-functie van Natural killer cellen van placentas door een colorimetrische plaat assay. De verminderde uteriene bloeddruk rat model van placentale ischemie werd gekozen om de antilichaam-gemedieerde isolatie en beoordeling van de chemo-functie van Natural killer cellen aan te tonen.
Abstract
Het is algemeen bekend dat deciduale Natural Killer (NK) cellen een cruciale rol spelen bij het opzetten en onderhouden van een normale zwangerschap. Recente studies hebben aangetoond een veranderde populatie van circulerende en deciduale NK cellen bij vrouwen die last hebben van ongunstige zwangerschap complicaties, zoals terugkerende miskraam en Preeclampsia. De studies van onze groep hebben aangetoond dat de hypertensie in zwangerschap met een verhoogde bevolking van geactiveerde NK cellen in de placenta wordt geassocieerd die op de uitdrukking van de markeringen van de oppervlakte activering wordt gebaseerd. Dit manuscript geeft een gedetailleerd protocol om de chemo-functie van NK-cellen geïsoleerd van placenta in een Preeclampsia dierlijk model van chirurgisch geïnduceerde placenta ischemie te beoordelen. De volgende stappen worden in detail beschreven: generatie van één cel schorsing, NK cel isolatie, ex vivo stimulatie, effect: doel cel co-cultuur, en de chemo analyse.
Introduction
Preeclampsia is een hypertensieve wanorde van zwangerschap die door foetale de groeibeperking, eind orgaanschade en chronische immune activering wordt gekenmerkt. Chronische immuun activering bij vrouwen met Preeclampsia leidt tot verhoogde circulerende en placenta inflammatoire cytokines, een onevenwichtigheid in CD4+ T cellen populaties, en een verhoogde populatie van activated Natural Killer (NK) cellen1. Studies onlangs gepubliceerd door ons lab tonen een rol voor NK-cellen in het veroorzaken van een aantal van de pathofysiologie geassocieerd met Preeclampsia in de verminderde uteriene bloeddruk (RUPP) Rat model van Preeclampsia. Gebruikend Stroom Cytometry om oppervlakte uitdrukking van activerings markeringen op NK cellen te meten, werd een verhoogde bevolking van geactiveerde NK cellen in de omloop en de placentas van RUPP ratten in vergelijking met normale zwangere (NP) ratten waargenomen2.
Om de flow Cytometry observaties te bevestigen, werden functionele studies uitgevoerd om de chemo activiteit van NK-cellen die geïsoleerd zijn van de placenta van NP en RUPP ratten te beoordelen. Er zijn verschillende methoden beschikbaar voor de beoordeling van de chemo functie van chemo CD8+ T-cellen en NK-cellen. De gouden standaard voor functionele chemo-analyse is de chromium-vrijgave assay3. Andere ontwikkelde protocollen gebruikt omvatten flow Cytometry4, image Cytometry5, calceïne release6, en meest recent bioluminescentie7. Deze video zal een gedetailleerd protocol over het gebruik van de gerenommeerde lactaatdehydrogenase (LDH) release assay te meten chemo-functie van NK-cellen met behulp van een commercieel beschikbare LDH chemo graad assay kit.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle protocollen werden goedgekeurd door de Institutional Animal zorg en het gebruik Comite aan de Universiteit van Mississippi Medical Center. De zorg en de behandeling van de dieren waren in overeenstemming met de nationale instituten van gezondheidsrichtlijnen voor ethische dierlijke behandeling.
1. cel van de lymfocyten isolatie van Placentas
- Verwijder een placenta uit de rat baarmoeder (zwangerschap dag 19) en plaats in 10 mL ijskoude PBS8.
- Plaats een placenta op een 100 µm filter en zitten in een Petri schaaltje met 13,5 mL RPMI en 1,5 mL FBS (totale volume is 15 mL). Gebruik de platte kant van een spuit zuiger om de placenta te duwen door het filter in de Petri schaal.
- Bereid 3 15 mL kegelvormige buizen voor elk weefsel. Voeg 3 mL dichtheidsgradiënt medium (Zie de lijst van materialen) aan elke buis, dan voorzichtig overlay 5 ml gehomogeniseerd placenta in elke buis.
- Centrifugeer gedurende 25 min bij 300 x g bij kamertemperatuur (RT) zonder rem. Verzamel de dunne witte Buffy Layer met een transfer pipet.
Opmerking: Na centrifugeren, 3 lagen zichtbaar zijn, de rode RPMI aan de top, de witte Buffy Layer in het midden, en de duidelijke dichtheid gradiënt medium laag aan de onderkant. Gebruik een transfer pipet te trekken van de witte Buffy laag uit de buis. Combineer Buffy laag van alle buizen van dezelfde placenta in 1 tube. - Voeg 10 mL RPMI aan gecombineerde Buffy lagen. Centrifugeer gedurende 10 min, 300 x g, bij 4 °c en gooi bovendrijvende.
2. isolatie van natuurlijke killer cellen
- Opnieuw op te schorten cel pellet in 50 l van ijskoude PBS
- Voeg Biotine-gelabelde CD3 antilichaam aan pelleted cellen volgens het Protocol van de fabrikant en meng goed met een pipet. Plaats de buis in een buis Rotator en incubeer 20 min bij 4 °C.
- Voeg 1 mL RPMI toe, Centrifugeer gedurende 10 min bij 400 x g en 4 °c, en gooi bovendrijvende.
- Hersuspendeer de pellet in 1 mL RPMI en Combineer met 150 l van magnetische kralen in een 1,5 mL micro centrifugebuis. Plaats de micro centrifugebuis in een buis Rotator en roteer terwijl het uitbroeden 30 min bij 4 °C.
Opmerking: Trek de release buffer op dit moment en laat RT in de bioveiligheid te bereiken. - Plaats de tubes in de magneet voor 1 min. Verzamel bovendrijvende en bewaar CD3-Cell populatie in een 15 mL Tube op ijs.
Opmerking: Dit is de CD3- populatie van cellen. - Haal de tube uit de magneet en voeg 1 mL RPMI toe. Meng de cellen en kralen 5 keer met een pipet.
- Herhaal stap 2,5.
- Centrifugeer de CD3- populatie van cellen voor 10 min bij 400 x g en 4 °c en gooi bovendrijvende. Hersuspendeer de Cell pellet in 50 l van ijskoude PBS
- Voeg Biotine-gelabeld CD161a antilichaam toe aan CD3- cellen volgens het Protocol van de fabrikant en meng goed. Plaats de tube in een buis Rotator en incubeer gedurende 20 min bij 4 °C.
- Voeg 1 mL RPMI toe, Centrifugeer gedurende 10 min bij 400 x g en 4 °c, en gooi bovendrijvende. Hersuspendeer de pellet in 1 mL RPMI en Combineer met 150 l van magnetische kralen in een 1,5 mL micro centrifugebuis.
- Plaats micro centrifugebuis in een buis Rotator en roteer terwijl het uitbroeden 30 min bij 4 °C.
- Plaats de buizen in een magneet voor 1 min. Verzamel bovendrijvende en negeer CD3-/CD161a- Cells.
- Verwijder de tube van de magneet en voeg 1 mL RPMI toe. Meng de cellen en kralen 5 keer met een pipet.
- Herhaal stap 2,12.
- Verwijder de microcentrifuge tubes uit de magneet en voeg 1 mL RT vrijgave buffer toe. Plaats de tube op de buis Rotator en draai tijdens de incubatie gedurende 15 minuten bij RT.
- Plaats buizen in magneet voor 1 min. Verzamel bovendrijvende in een nieuwe 15 mL conische buis op ijs.
Opmerking: Dit is de populatie van NK-cellen. - Verwijder de tube van de magneet en voeg 1 mL RT RPMI toe. Meng de cellen en kralen 5 keer met een pipet.
- Herhaal stap 2,16, het plaatsen van bovendrijvende in dezelfde buis. Meng goed en neem een 20 l Steekmonster om cellen te tellen
Opmerking: Houd de tube op het ijs. - Centrifugeer CD3-/CD161a+ cellen voor 10 min, 400 x g bij 4 °c, verwijder dan bovendrijvende. Hersuspendeer de cellen in RPMI (10% FBS, 1% pen/keelontsteking, 2 ng/mL IL-2) en zaad bij een concentratie van 3 x 105 cellen/goed in een 6-well plaat in 2,5 ml NK cel activatie media. Incubeer cellen voor 48 h bij 37 °C, 5% CO2 in een bevochtigde incubator.
3. chemo test: het ophalen van NK-cellen of YAC1 uit cultuur of het passeren van cellen
Opmerking: Alle stappen moeten worden uitgevoerd onder de motorkap. Alle celwanden moeten te allen tijde op het ijs worden gehouden.
- Gebruik een glazen serologische pipet om YAC1 cellen en media te verzamelen uit de kolf, plaats in een 50 mL Tube op ijs, en meng goed. Neem 20 µ L om cellen te tellen.
- Draai de YAC1 cellen gedurende 10 min bij 300 x g en 4 °c. Tel cellen terwijl deze draaien.
- Voeg trypsine/EDTA aan elk goed in een NK cel 6-well plaat. Tik op de plaat en plaats in incubator.
- Nadat de cellen zijn uitgebroed met trypsine/EDTA voor ~ 5 min bij 37 ° c, schraap de plaat/kolf met een steriele plaat schraper. Voeg 1 mL NK Cell media toe aan elk goed.
- Verzamel cellen en media met serologisch pipet en verzamel in een 15 mL centrifugebuis. Neem 20 µ L om cellen te tellen.
- Draai de NK-cellen voor 10 min, 400 x g bij 4 °c. Tel de steekproef van cellen van stap 3,5 tijdens deze centrifugeren.
Opmerking: Bekijk de kweek platen onder een Microscoop alvorens ze te teruggooi om er zeker van te zijn dat er geen cellen meer aan de bodem van de putten worden vastgehouden. Aangezien het experiment gebruikmaakt van NK-cellen en YAC1 cellen, moet u elk afzonderlijktellen. - Tel cellen en opnieuw op te schorten bij de concentraties bepaald in optimalisatie proeven om te testen voor het juiste aantal target: effect ratio. Dit zal worden bereikt door het opnieuw opschorten van de pellet in hun overeenkomstige media om de volgende cel concentraties te maken: YAC1 bij 4 x 105 cellen/ml en NK-cellen op 2 x 107 cellen/ml.
4. de test van de chemo analyse: het Protocol van de analyse
- Gebruik een ronde bodem, cultuur behandeld 96-well plaat om het opzetten van de plaat, zoals voorgesteld in tabel 1. Deze tabel toont de experimentele controles en 3 sets van NK-experimentele kolommen. Dit kan worden uitgebreid tot een totaal van 10 NK-experimentele zuilen in een 96-well plaat.
- Centrifugeer de assay plaat bij 250 x g voor 4 min om er zeker van te zijn dat de effect-en doelcellen in contact zijn. Incubeer de 96-well plaat voor 5 uur in een bevochtigde kamer incubator bij 37 °C, 5% CO2 om voldoende contact te bereiken tussen target en effect cellen en target cel lysis door de effect cellen.
Opmerking: Het protocol kan hier worden onderbroken. - 45 min voorafgaand aan het oogsten supernatants, voeg 10 µ L van 10x lysis oplossing aan de doel cel toe maximum LDH versie putten (Wells 1E, 1F, 1G, en 1H) en plaats de plaat terug in de bevochtigde kamer.
- Na de incubatietijd is voltooid, centrifugeer de plaat op 250 x g voor 4 min. met behulp van een multikanaals pipetter, overdracht 50 µ l van alle putten naar een verse 96-goed platte bodem assay plaat.
Opmerking: Raak niet de bodem van de putten aan zodat de cellen niet in de verse testplaat worden overgebracht. Gebruik geen gekweekte behandelde plaat als de verse assay plaat. -
Maak assay reagens.
- Na assay buffer heeft bereikt kamertemperatuur, Voeg 12 mL van de test buffer op een substraat mix fles. Omkeren en schud zachtjes tot volledig opgelost. 1 fles is genoeg voor 2 96-goed platen.
Opmerking: Assay buffer moet worden beschermd tegen licht tijdens het ontdooien. Meng onmiddellijk voorafgaand aan gebruik.
- Na assay buffer heeft bereikt kamertemperatuur, Voeg 12 mL van de test buffer op een substraat mix fles. Omkeren en schud zachtjes tot volledig opgelost. 1 fles is genoeg voor 2 96-goed platen.
- Voeg 50 µ L van assay reagens toe aan alle putten in de assay plaat van stap 4,6. Bedek de plaat met folie om het te beschermen tegen licht en incuberen voor 30 min bij kamertemperatuur.
Opmerking: Nieuw gemaakt assay reagens moet worden opgeslagen in een vriezer. Reagens is goed voor ongeveer 8 weken. - Voeg 50 µ L van stop oplossing voor elk goed. Lees de plaat binnen 1 uur na het toevoegen van stop-oplossing en registreer de absorptie op 490 nm. Representatieve gegevens worden weergegeven in tabel 2.
5. berekening van de resultaten
- Bereken de gemiddelde absorptiewaarde van de Cultuurmiddel grote achtergrond putten en aftrekken van alle absorptiewaarden voor experimentele, target cel spontane LDH release en effect cel spontane LDH release Wells.
- Bereken de gemiddelde absorptiewaarden voor de volume correctie controleputten en aftrekken van de absorptiewaarden verworven voor de doelgroep cel maximale LDH release Control Wells.
- Gebruik de gecorrigeerde waarden uit de stappen 5,1 en 5,2 in de volgende formule om het percentage chemo voor elke effect meter te berekenen: doel goed.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Placentale NK-cellen verkregen uit NP en RUPP ratten werden uitgebroed voor 5 uur met doelcellen in hun respectieve media op een verhouding van 50:1 (NK: target). De absorptie werd geregistreerd bij 490 nm en de ruwe gegevens worden getoond in lijst 2. De gemiddelde absorptie van de Cultuurmiddel grote achtergrond en de de controleputten van de volume correctie werden berekend. Deze gemiddelden werden afgetrokken van de aangewezen putten die in het Protocol van de fabrikant worden vermeld en zijn vertegenwoordigd in tabel 3. De gecorrigeerde waarden werden vervolgens gebruikt om het%-chemo percentage te verkrijgen met gebruikmaking van het door de fabrikant verstrekte Protocol (tabel 4).
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 |
| Tcs | Vcc | ECSR-1 | ECSR-2 | ECSR-3 |
| Tcs | Vcc | ECSR-1 | ECSR-2 | ECSR-3 |
| Tcs | Vcc | ECSR-1 | ECSR-2 | ECSR-3 |
| Tcs | Vcc | ECSR-1 | ECSR-2 | ECSR-3 |
| Tcm | Cmb | EW-1 | EW-2 | EW-3 |
| Tcm | Cmb | EW-1 | EW-2 | EW-3 |
| Tcm | Cmb | EW-1 | EW-2 | EW-3 |
| Tcm | Cmb | EW-1 | EW-2 | EW-3 |
Tabel 1: analyse plaat indeling. TCS = target Cell spontane LDH release (50 l doelcellen + 50 l target Cell medium); TCM = target Cell maximale LDH vrijgave (50 l doelcellen + 50 l target Cell medium); = Volume correctie controle (50 l-cel medium + 50 l-cel medium); CMB = cultuurmedium achtergrond controle (50 l-doel cel medium + 50 l NK-cel medium); ECSR = spontane vrijgave van de effect cel (50 l NK-cellen + 50 l NK-cellen medium); EW = experimentele putten (50 l doelcellen + 50 l NK-cellen).
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 |
| Np | Rupp | Np | ||
| 0,615 | 0,484 | 0,473 | 0,463 | 0,471 |
| 0,586 | 0,484 | 0,458 | 0,474 | 0,469 |
| 0,61 | 0,486 | 0,464 | 0,459 | 0,469 |
| 0,578 | 0,495 | 0,478 | 0,458 | 0,482 |
| 0,605 | 0,55 | 0,524 | 0,526 | 0,543 |
| 0,576 | 0,504 | 0,519 | 0,502 | 0,528 |
| 0,565 | 0,512 | 0,515 | 0,513 | 0,531 |
| 0,563 | 0,581 | 0,526 | 0,508 | 0,519 |
Tabel 2: ruwe absorptie gegevens van een assay plaat met de experimentele controles in de kolommen 1 en 2 en experimentele putten om de chemo graad van placentale NK cellen te meten van NP en RUPP ratten tegen YAC1 doelcellen.
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 |
| Np | Rupp | Np | ||
| 0,12775 | -0,01425 | -0,02425 | -0,01625 | |
| 0,09875 | -0,02925 | -0,01325 | -0,01825 | |
| 0,12275 | -0,02325 | -0,02825 | -0,01825 | |
| 0,09075 | -0,00925 | -0,02925 | -0,00525 | |
| 0,06825 | 0,03675 | 0,03875 | 0,05575 | |
| 0,03925 | 0,03175 | 0,01475 | 0,04075 | |
| 0,02825 | 0,02775 | 0,02575 | 0,04375 | |
| 0,02625 | 0,03875 | 0,02075 | 0,03175 |
Tabel 3. Gecorrigeerde absorptie. Absorptie van putten na aftrekken van de gemiddelde absorptie van de controleputten volgens het Protocol van de fabrikant. Kolom 1, Wells 1-4, zijn TCS absorptiewaarden-de gemiddelde CMB absorptiewaarde. Kolom 1, Wells 5-8, zijn de TCM-absorptiewaarden-de gemiddelde waarde van de afzuiging.
| Np | Rupp | Np | |
| 128,9916 | 108,8235 | 93,69748 | |
| 63,44538 | 118,9076 | 66,80672 | |
| 75,92593 | 72,75132 | 64,28571 | |
| 66,27907 | 63,17829 | 83,33333 | |
| Gemiddelde% chemo | 83,66049 | 90,91518 | 77,03081 |
Tabel 4. De berekeningen van de chemo. Gemiddelde percentage chemo van repliceren monsters van placentale NK cellen geïsoleerd van NP en RUPP ratten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Er zijn een aantal belangrijke belangrijkste nota's om voor optimale resultaten te overwegen. De steriliteit van de gebruikte cellen is zeer belangrijk. Na het verzamelen van de placenta is het belangrijk dat de voorbereiding en isolatie van de NK-cellen onder steriele omstandigheden in een Biosafety-kabinet wordt uitgevoerd. Omdat alle cellen LDH op cellulaire beschadigingen vrijgeven, moet er ook voor worden gezorgd dat NK-cellen na isolatie en tijdens het co-cultuur proces een hoge levensvatbaarheid krijgen. Te veel spontane LDH afgifte van de NK-cellen kan vaak leiden tot negatieve, onbruikbare gegevens
Er zijn een aantal aspecten van dit protocol dat specifiek zal zijn voor de gebruiker en hun behoeften. Bijvoorbeeld, zijn er diverse methodes voor isolatie van mononucleaire cellen van placenta naast de methodes in dit artikel, zoals mechanische en enzymatische deaggregatie. Daarnaast is het de gebruiker om te bepalen van de optimale doelcellen nummer en de effect factor: target ratio die geschikt zal zijn voor hun experiment. In onze handen, 10.000 doelcellen en een effect: target ratio van 50:1 was vastbesloten om optimaal te zijn voor onze experimenten. Deze getallen kunnen veranderen afhankelijk van de gekozen doelcellen en van het weefsel waaruit de NK-cellen geïsoleerd zijn. Andere onderzoekers hebben deze methode gebruikt om NK-functie van cellen geïsoleerd van lever en milt9te beoordelen. Daarom kan deze methode worden ingezet op verschillende gebieden van onderzoek, niet alleen in studies van Preeclampsia, zoals we hebben gekozen om het te gebruiken.
De goudstandaard voor chemo beoordeling is de chromium-versie assay5. Hoewel deze methode betrouwbaar en reproduceerbaar is, is de meest voor de hand liggende beperking het gebruik van radioactieve blootstellingsrisico's voor personeel en radioactieve verwijdering. Andere, niet-radioactieve chemo onderzoeken, zoals de flow Cytometry gebaseerd en calcien release assays worden gerapporteerd om vergelijkbare resultaten te hebben aan CRA6,10,11. Nochtans, vereisen de Stroom-Cytometry-gebaseerde analyses extra gespecialiseerde opleiding van personeel in Stroom Cytometry om de analyse in werking te stellen. De LDH release assay vereist geen gespecialiseerde opleiding, omdat deze test vereist alleen eenvoudige pipetten om de test uit te voeren. Bovendien, terwijl de LDH release assay kan worden gebruikt met behulp van standaard spectroscopie of fluorescerende detectie, de calcien release en flow-Cytometry-gebaseerde methoden vereisen apparatuur die kan detecteren fluorescentie. De beperkingen van de LDH versie analyse omvatten een onderschatting van celdood toe te schrijven aan onvolledige versie van LDH van beschadigde cellen.
In deze Assay, de meting van LDH vrijgegeven in de media optreedt door een enzymatische reactie waarbij iodonitrotetrazolium (een tetrazolium zout) wordt omgezet in Formazan (rood van kleur). De absorptie wordt gemeten door standaard spectroscopie en de hoeveelheid beschadigde cellen in de cultuur is evenredig aan de intensiteit van de rode kleur. Deze test zorgt voor een nauwkeurige bepaling van beschadigde of gewonde cellen in een monster. Tot slot kan deze colorimetrische assay ook gebruikt worden met andere cel types om de chemo-test te testen die optreedt via cel-gemedieerde en chemisch gemedieerde mechanismen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen belangenverstrengeling, financieel of anderszins, worden verklaard door de auteurs.
Acknowledgments
Dit werk werd gesteund door het nationale Instituut van de hart Long en van het bloed van de nationale instituten van gezondheid onder toelage R00HL130456, het nationale Instituut van algemene medische wetenschappen van de nationale instituten van gezondheid onder toekenning P20GM104357, en door Mississippi INBRE, gefinancierd door een Institutional Development Award (IDeA) van de nationale instituten van de algemene medische wetenschappen van de nationale instituten voor gezondheid onder Grant Number P20GM103476. De inhoud is uitsluitend de verantwoordelijkheid van de auteurs en vertegenwoordigt niet noodzakelijkerwijs de officiële standpunten van de nationale instituten van de gezondheid.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL Eppendorf tube | Fisher | 5408129 | |
| 100 µL Filter | Fisher | 22363549 | Nylon Mesh |
| 15 mL conical tube | Fisher | 0553859A | |
| 3 mL syringe | Fisher | 14823436 | |
| 50 mL conical tube | Fisher | 7203510 | |
| 6-well cell culture plate | Corning | 720083 | |
| 96-well Tissue Culture Plate | CELLTREAT | 229190 | Sterile, Round Bottom |
| AOPI | Nexcelom | CS201065ML | |
| Cell scraper | Fisher | 8100241 | |
| Cellometer Disposable Counting Chambers | Nexcelom | CHT4-SD100 | |
| Cellometer Vision Image Cytometer | Nexcelom | N/A | |
| Cytotox 96 Non-Radioactive Cytotoxicity Assay Kit | Promega | G1780 | |
| Dynabeads Flowcomp Flexi Kit | Invitrogen | 11061D | |
| DynaMag-2 Magnet | Invitrogen | 12321D | |
| EDTA | Sigma Aldrich | EDS-100G | |
| FBS | Atlanta Biologicals | S11150H | |
| Flow Cytometry Tube | Corning | 352008 | |
| Lymphoprep | Fisher | NC0460539 | Density gradient medium; 4 x 250 mL |
| PBS | Fisher | SH3025801 | 10 x 500 mL |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| Petri dishes | Fisher | 9720500 | Without Pad |
| Purified Mouse anti-Rat CD161a | BD Biosciences | 555006 | |
| Purified Mouse anti-Rat CD3 | BD Biosciences | 554829 | |
| Recombinant Rat IL-2 | R&D Systems | 502-RL | |
| RPMI | Gibco | 11875135 | 1640 Medium |
| T25 flask | Corning | 430639 | |
| Trypsin | ThermoFisher | 15090046 | |
| YAC-1 cell | ATCC | TIB-160 |
References
- Cornelius, D. C., Cottrell, J., Amaral, L. M., LaMarca, B. Inflammatory Mediators: A causal link to hypertension during pregnancy- Studies in Preeclampsia. British Journal of Pharmacology. , (2018).
- Elfarra, J., et al. Natural killer cells mediate pathophysiology in response to reduced uterine perfusion pressure. Clinical Science. 131 (23), 2753-2762 (2017).
- Brunner, K. T., Mauel, J., Cerottini, J. C., Chapuis, B. Quantitative assay of the lytic action of immune lymphoid cells on 51-Cr-labelled allogeneic target cells in vitro; inhibition by isoantibody and by drugs. Immunology. 14 (2), 181-196 (1968).
- Kim, G. G., Donnenberg, V. S., Donnenberg, A. D., Gooding, W., Whiteside, T. L. A novel multiparametric flow cytometry-based cytotoxicity assay simultaneously immunophenotypes effector cells: comparisons to a 4 h 51Cr-release assay. Journal of Immunological Methods. 325 (1-2), 51-66 (2007).
- Somanchi, S. S., McCulley, K. J., Somanchi, A., Chan, L. L., Lee, D. A. A Novel Method for Assessment of Natural Killer Cell Cytotoxicity Using Image Cytometry. PLoS One. 10 (10), 0141074 (2015).
- Neri, S., Mariani, E., Meneghetti, A., Cattini, L., Facchini, A. Calcein-acetyoxymethyl cytotoxicity assay: standardization of a method allowing additional analyses on recovered effector cells and supernatants. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 8 (6), 1131-1135 (2001).
- Karimi, M. A., et al. Measuring cytotoxicity by bioluminescence imaging outperforms the standard chromium-51 release assay. PLoS One. 9 (2), 89357 (2014).
- Caporossi, C., Nogueira, P. L., Marques, J. C., Assis, R. M., Aguilar-Nascimento, J. E. Validation of the gastroschisis experimental model and the influence of the mother's diet enriched with glutamine in the fetal morphology. Acta Cirúrgica Brasileira. 29 (3), 158-165 (2014).
- Lv, L. H., et al. Functional distinction of rat liver natural killer cells from spleen natural killer cells under normal and acidic conditions in vitro. Hepatobiliary and Pancreatic Diseases International. 11 (3), 285-293 (2012).
- Flieger, D., et al. A novel non-radioactive cellular cytotoxicity test based on the differential assessment of living and killed target and effector cells. Journal of Immunological Methods. 180 (1), 1-13 (1995).
- Jang, Y. Y., et al. An improved flow cytometry-based natural killer cytotoxicity assay involving calcein AM staining of effector cells. Annals of Clinical Laboratory Science. 42 (1), 42-49 (2012).
