Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

An आयोडाइड-पीला फ्लोरोसेंट प्रोटीन गैप जंक्शन-सेलुलर संचार परख

doi: 10.3791/58966 Published: February 1, 2019

Summary

यहां, हम अंतर जंक्शन के उच्च प्रवाह स्क्रीनिंग के लिए डिजाइन एक उपंयास अंतर जंक्शन सेलुलर संचार परख के लिए एक प्रोटोकॉल मौजूद-दवा की खोज और विषाक्तता आकलन के लिए रसायन संग्राहक ।

Abstract

गैप जंक्शनों (GJs) सेल झिल्ली चैनल है कि छोटे अणुओं के प्रसार की अनुमति से सटे कोशिकाओं के बीच 1 केडीए हैं । के रूप में वे शारीरिक और रोग भूमिकाओं है, वहां उच्च प्रवाह स्क्रीनिंग (HTS) परख की जरूरत है दवा खोज और विषविज्ञान परख में GJ मॉडुलन की पहचान है । एक उपंयास आयोडाइड-पीला फ्लोरोसेंट प्रोटीन गैप जंक्शन-सेलुलर संचार (मैं YFP-GJIC) परख इस जरूरत को पूरा । यह एक सेल स्वीकारकर्ता और दाता कोशिकाओं है कि छुरा एक पीले फ्लोरोसेंट प्रोटीन (YFP) संस्करण, जिसका प्रतिदीप्ति संवेदनशील आयोडाइड, या SLC26A4, एक आयोडाइड ट्रांसपोर्टर, क्रमशः द्वारा बुझती है व्यक्त इंजीनियर है सहित परख आधारित है । जब आयोडाइड दो सेल प्रकार के एक मिश्रित संस्कृति में जोड़ा जाता है, वे SLC26A4 ट्रांसपोर्टर के माध्यम दाता कोशिकाओं में प्रवेश और GJs के माध्यम से आसंन स्वीकारकर्ता कोशिकाओं को फैलाना जहां वे YFP प्रतिदीप्ति बुझाने । YFP प्रतिदीप्ति अच्छी तरह से एक काइनेटिक मोड में मापा जाता है । YFP शमन दर GJ गतिविधि को दर्शाता है । परख विश्वसनीय और काफी तेजी से HTS के लिए इस्तेमाल किया जा रहा है । मैं-YFP-GJIC परख LN215 कोशिकाओं, मानव तंत्रिकाबंधार्बुद कोशिकाओं का उपयोग कर के लिए प्रोटोकॉल, वर्णित है ।

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

गैप जंक्शनों (GJs) में सेलुलर चैनल के रूप में कार्य करने के लिए < 1 केडीए के छोटे अणुओं जैसे पोषक तत्वों, चयापचयों के प्रसार की अनुमति है, और आसंन कोशिकाओं के बीच अणुओं संकेत । जंक्शनीय तत्वों में प्रत्येक कोशिका में एक hemichannel या connexon शामिल है, और प्रत्येक connexon का गठन छह connexins (Cxs)1. GJs और Cxs जैसे एरोमेटिक खुशबूदार हाइड्रोकार्बन (पः), जो GJ अवरोधकों2,3,4है के रूप में कैंसर की विषविज्ञान परख में इस्तेमाल किया गया है । बाधित GJIC nongenotoxic कैंसरजनन5,6के साथ संबद्ध किया गया है । एक संभावित चिकित्सकीय लक्ष्य के रूप में, GJ शामिल बरामदगी के विशेष उपप्रकार में सूचित किया गया है7,8, हृदय और मस्तिष्क के ischemia से संरक्षण/reperfusion चोट9, आभा10के साथ माइग्रेन, दवा प्रेरित जिगर की चोट6,11, और घाव भरने12. उच्च प्रवाह स्क्रीनिंग (HTS) परख GJ की पहचान करने के लिए आवश्यक है-संग्राहक रसायन या दवा की खोज के लिए एंटीबॉडी, विषविज्ञान परख के लिए, और GJ गतिविधि के उपंयास सेलुलर नियामकों की पहचान । HTS परख भी GJ ढा2,13,14,15के संरचना-गतिविधि संबंधों की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।

कुछ GJIC परख डाई स्थानांतरण या दोहरी पैच दबाना तकनीक शामिल हैं । लूसिफ़ेर पीला CH () और calcein acetoxymethyl एस्टर (calcein-AM) डाई-स्थानांतरण परख में इस्तेमाल किया गया है । कोशिकाओं को पारगंय नहीं कर रहे हैं, जो microinjection द्वारा शुरू की है, scraping लोड हो रहा है, या electroporation । एक बार कोशिका के अंदर, GJs और GJ गतिविधि के माध्यम से पड़ोसी कोशिकाओं में फैल जाता है, जो कि16स्थानांतरण की हद तक परख कर लिया जाता है । Calcein-हूं परख आमतौर पर शामिल गैप-प्रतिदीप्ति वसूली के बाद17photobleaching,18। Calcein-AM एक सेल permeant डाई कि एक आंतरिक Calcein द्वारा अभेद्य esterase में intracellularly में परिवर्तित कर दिया है । परख एक फोकल माइक्रोस्कोप की आवश्यकता के लिए calcein के हस्तांतरण का पालन-यह लेजर photobleaching निंनलिखित आसपास के लोगों से एक सेल में हूं । यदि कार्यशील GJs मौजूद हैं, तो सन्निकट कक्षों में calcein-AM photobleached कक्षों में प्रवेश करता है और प्रतिदीप्ति पुनर्प्राप्त किया जाता है. GJ गतिविधि photobleached कोशिकाओं के प्रतिदीप्ति वसूली की हद तक परख है । डाई हस्तांतरण परख श्रमसाध्य और समय लेने या कम संवेदनशीलता है । दोहरी पैच clamping एक electrophysiological विधि है कि उपाय जंक्शन के कंडक्टर है । यह खुला GJs19की संख्या पर कंडक्टर की सीधी निर्भरता के साथ अपेक्षाकृत संवेदनशील है; हालांकि, यह तकनीकी रूप से मांग, समय लगता है, और20महंगी है । मैं-YFP-GJIC परख HTS में इस्तेमाल के लिए विकसित किया गया था ।

चित्रा 1 घटकों और मैं-YFP GJIC परख, जो स्वीकार करता है एक आयोडाइड-संवेदनशील YFP संस्करण असर H148Q और I152L (YFPQL) और दाता कोशिकाओं एक आयोडाइड ट्रांसपोर्टर (SLC26A4) एक्सप्रेस 21 व्यक्त कोशिकाओं का इस्तेमाल के कदम दिखाता है . दो YFPQL द्वारा किए गए उत्परिवर्तनों22आयोडाइड द्वारा प्रतिदीप्ति की शमन अनुमति देते हैं । Iodides को सह-कल्चरल स्वीकारकर्ता और दाता कोशिकाओं में जोड़ा जाता है; वे स्वीकारकर्ता कोशिकाओं में प्रवेश नहीं करते हैं, लेकिन दाता की कोशिकाओं पर मौजूद SLC26A4 ट्रांसपोर्टरों द्वारा उठाए जाते हैं । दाता कोशिकाओं में Iodides आसंन स्वीकार करने वाले कोशिकाओं में GJs कामकाज के माध्यम से फैलाना जहां वे YFPQL प्रतिदीप्ति बुझाने । GJs बंद या अवरोधकों द्वारा अवरुद्ध कर रहे हैं, तो आयोडाइड प्रतिदीप्ति बुझाने के लिए स्वीकारकर्ता कोशिकाओं में प्रवेश नहीं कर सकते । YFPQL शमन दर GJ गतिविधि को दर्शाता है । मैं-YFP GJIC परख प्रक्रिया न तो जटिल है और न ही समय लगता है । यह HTS के साथ संगत है और एक अपेक्षाकृत कम अवधि में GJ गतिविधि पर यौगिकों की एक बड़ी संख्या के प्रभाव का परीक्षण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । यह केवल स्वीकारकर्ता और दाता कोशिकाओं की आवश्यकता है, और दो संतुलित नमक समाधान । नीचे वर्णित प्रोटोकॉल LN215 कोशिकाओं पर आधारित है जिसका प्रमुख Cx21Cx43 है । LN215-YFPQL रिसेप्टर और LN215-I दाता कोशिकाएं transduction के lentiviruses YFP या QL 21,23को व्यक्त करने के साथ उत्पन्न हुई थीं ।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. lentiviruses व्यक्त YFPQL और SLC26A4 की पीढ़ी

  1. ८०% १०० mm संस्कृति प्लेटों पर प्रवाह के लिए मानव भ्रूण गुर्दे की कोशिकाओं HEK293T हो जाना । Dulbecco के संशोधित ईगल मध्यम (DMEM) 10% भ्रूण गोजातीय सीरम, १०० U/एमएल पेनिसिलिन, और १०० µ g/एमएल streptomycin के साथ पूरक है संस्कृति माध्यम में इस्तेमाल किया HEK293T और अंय कोशिकाओं के नीचे उल्लेख बनाए रखने के लिए प्रोटोकॉल भर है ।
  2. कोट 6-अच्छी तरह से संस्कृति प्लेटें बाँझ पाली के ०.००५% के 2 मिलीलीटर-L-lysine (पीएलएल) समाधान के लिए प्रत्येक अच्छी तरह से 10 min. महाप्राण के लिए पीएलएल समाधान और कुल्ला सतह दो बार बाँझ पानी की 2 मिलीलीटर के साथ ।
  3. HEK293T कोशिकाओं को धो लें फास्फेट (पंजाब) के 10 मिलीलीटर के साथ और प्रत्येक १०० mm डिश में सेल monolayers का इलाज ०.२५% trypsin-EDTA समाधान के 2 मिलीलीटर के साथ ३७ डिग्री सेल्सियस पर 3 मिनट के लिए । संस्कृति माध्यम के 5 मिलीलीटर जोड़ें और कोशिकाओं resuspend ।
  4. एक hemocytometer में कोशिकाओं की गणना और संस्कृति माध्यम में २५०,००० कोशिकाओं/एमएल के लिए सेल निलंबन के घनत्व को समायोजित करने और संस्कृति माध्यम के 2 मिलीलीटर में ५००,००० कोशिकाओं को जोड़ने के लिए प्रत्येक lysine-अच्छी तरह से प्लेटों के लेपित । एक humidified 5% CO2/९५% हवा वायुमंडल में ३७ डिग्री सेल्सियस पर 24 घंटे के लिए और फिर DMEM के साथ संस्कृति माध्यम की जगह बिना पेनिसिलिन या streptomycin के लिए कोशिकाओं की मशीन ।
  5. एक १.५ मिलीलीटर ट्यूब में, सीरम या एंटीबायोटिक दवाओं के बिना DMEM के ५०० µ एल के साथ अभिकर्मक रिएजेंट के 20 µ एल पतला । pipetting द्वारा धीरे मिश्रण और 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर खड़े हो जाओ ।
  6. इस बीच, पिपेट २५० दो १.५ मिलीलीटर ट्यूबों में से प्रत्येक में DMEM के µ एल और फिर pLVX के एनजी-EIP-YFPQL या pLenti6P-SLC26A4, १२२५ psPAX2 के एनजी और pMD2. G के एनजी के प्रत्येक के लिए ३७५ जोड़ें । इनमें से दो lentiviral plasmids पहले21बताई गई हैं । प्रत्येक प्लाज्मिड ट्यूब के लिए पतला अभिकर्मक एजेंट के २५० µ एल जोड़ें, धीरे से मिश्रण और कमरे के तापमान पर 20 मिनट के लिए गर्मी ।
  7. 20 मिनट के बाद, अभिकर्मक रिएजेंट और १.५ मिलीलीटर ट्यूबों में प्लाज्मिड परिसरों के ५०० µ एल जोड़ने के चरण १.४ में अच्छी तरह से प्रत्येक संस्कृति थाली के लिए dropwise और थाली और आगे पीछे कमाल से मिश्रण । 12 एच के लिए एक सह2 मशीन में ३७ ° c पर कोशिकाओं की मशीन
  8. ताजा माध्यम के २.५ मिलीलीटर के साथ मध्यम बदलें और एक अतिरिक्त ४८ एच के लिए मशीन । तो 5 मिनट के लिए बर्फ पर संस्कृति थाली जगह lentivirus युक्त मध्यम रखने के लिए infectivity बनाए रखने ठंडा ।
  9. lentiviruses युक्त मीडिया हार्वेस्ट और 15 मिलीलीटर शंकु ट्यूबों के लिए स्थानांतरण । 3 मिनट के लिए 4 ° c पर ३,००० x g पर केंद्रापसारक और फिर ०.४ µm पर निस्पंदन द्वारा supernatant से फ्लोटिंग HEK293T कोशिकाओं को हटा दें ।
  10. 2 दिनों के भीतर उपयोग के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर lentiviruses युक्त मीडिया स्टोर । बाद में उपयोग के लिए, स्टोर २०० µ l aliquots पर − ८० ° c.

2. LN215 की पीढ़ी-YFPQL और LN215-I कोशिकाओं को lentiviral transduction

  1. १०० mm संस्कृति प्लेटों में LN215 कोशिकाओं को विकसित करने के लिए ८०% DMEM में प्रवाह के साथ पूरक 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) १०० U/एमएल पेनिसिलिन, और १०० µ g/एमएल streptomycin ऊपर वर्णित के रूप में ।
    नोट: यदि मैं-YFP-GJIC परख एक अलग सेल लाइन का उपयोग कर आयोजित किया जाता है, उपयुक्त संस्कृति माध्यम का उपयोग करें । LN215-YFPQL, और LN215-I- कोशिकाओं को विश्वविद्यालय-उद्योग फाउंडेशन, Yonsei विश्वविद्यालय द्वारा प्रदान किया जा सकता है । कृपया इसी लेखक से संपर्क करें ।
  2. एक दिन transduction से पहले, दो बार पंजाब के 10 मिलीलीटर के साथ कोशिकाओं को धोने, 3 मिनट के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस पर ०.२५% trypsin-EDTA के 2 मिलीलीटर के साथ इलाज । एक 10 मिलीलीटर serologic पिपेट के साथ संस्कृति माध्यम के 5 मिलीलीटर में कोशिकाओं resuspend और ५०,००० कोशिकाओं को घनत्व को समायोजित/ मीडिया के ४०० µ एल में २०,००० कोशिकाओं को कोई वायरस नियंत्रण, YFPQL, और SLC26A4 कोशिकाओं के रूप में इलाज के लिए एक 24 अच्छी तरह से संस्कृति प्लेट के प्रत्येक अच्छी तरह से जोड़ें ।
  3. ३७ ° c में मशीन के 24 ज के बाद, transduce के ४०० µ एल के साथ संस्कृति माध्यम की जगह द्वारा दो कुओं का pLVX-EIP-YFPQL या pLenti6P-SLC26A4 lentivirus और ताजा संस्कृति मध्यम 4 polybrene जी की एक अंतिम एकाग्रता पर µ के साथ पूरक/ कोई वायरस नियंत्रण के लिए, संस्कृति माध्यम से प्रतिस्थापित करें ।
  4. 15 एच के लिए ३७ ° c में कोशिकाओं की मशीन, lentiviruses युक्त माध्यम महाप्राण, ताजा संस्कृति माध्यम जोड़ने के लिए, और एक अतिरिक्त ७२ एच के लिए कोशिकाओं की मशीन ।
    सावधानी: कुओं के बीच lentivirus के संक्रमण को रोकने के लिए, नए सुझावों या pipets का उपयोग एक अच्छी तरह से जब आप संस्कृति lentivirus युक्त माध्यम महाप्राण या नए सिरे से विकास के माध्यम से बांटना ।
  5. प्रत्येक अच्छी तरह से दो बार में ०.५ पंजाब के मिलीलीटर के साथ कोशिकाओं को धो लें, trypsin के ३०० µ एल के साथ इलाज-EDTA 3 मिनट के लिए । संस्कृति मध्यम और थाली के 2 मिलीलीटर में कोशिकाओं को resuspend 2 µ g/एमएल puromycin के साथ अच्छी संस्कृति प्लेटें ।
  6. संस्कृति मीडिया में कोशिकाओं 2 µ जी/एमएल puromycin जब तक नियंत्रण में सभी कोशिकाओं को अच्छी तरह से मर रहे है (दौर के आकार या तैरते जब माइक्रोस्कोप में मनाया), जो आम तौर पर एक सप्ताह लगता है । चयन अवधि के दौरान हर दूसरे दिन puromycin युक्त कल्चर मीडिया को रिफ्रेश करें । यदि LN215-YFPQL या LN215-I- संस्कृतियों के चयन के पूरा होने से पहले धाराप्रवाह हो, १०० mm प्लेट के लिए कोशिकाओं को हस्तांतरण और २.५ कदम के रूप में चयन जारी है ।

3. समाधान की तैयारी परख के लिए आवश्यक

  1. तैयार ५०० मिलीलीटर की सी-समाधान (10 मिमी HEPES, १४० मिमी NaCl, 10 मिमी ग्लूकोज, 5 मिमी KCl, 1 मिमी MgCl2, और 1 मिमी CaCl2) और मैं के ५०० मिलीलीटर-समाधान (10 मिमी HEPES, १४० मिमी NaI, 10 मिमी ग्लूकोज, 5 मिमी KCl, और 1 मिमी CaCl2).
  2. 1 N NaOH के साथ ७.४ के लिए दोनों समाधान के पीएच समायोजित करें, भंडारण के लिए ०.४ µm पर निस्पंदन द्वारा समाधान निष्फल । 1 महीने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर । उपयोग करने से पहले पीएच की जांच करें ।

4. LN215-YFPQL और LN215-I कोशिकाओं को चढ़ाना

  1. कल्चरल LN215-YFPQL और LN215-I कोशिकाओं में १०० एमएम प्लेट्स में अलग से कल्चरल मीडियम को परख के लिए जरूरी आबादियों तक पहुंचाना. LN215-YFPQL और LN215-I कोशिकाओं में ४०% और ८०% में प्रवाह १०० mm प्लेट्स, क्रमशः, एक ९६-अच्छी तरह से प्लेट परख के लिए पर्याप्त हैं ।
  2. मैं YFP GJIC परख आयोजित करने से पहले एक दिन, पंजाब के 10 मिलीलीटर के साथ प्रत्येक १०० mm संस्कृति प्लेट धो लो । ०.२५% trypsin के 2 मिलीलीटर के साथ प्रत्येक थाली का इलाज-EDTA समाधान और 5 मिनट के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस पर गर्मी । संस्कृति माध्यम के 4 मिलीलीटर में प्रत्येक थाली में कोशिकाओं को फिर से सस्पेंड और 15 मिलीलीटर शंकु ट्यूबों के लिए स्थानांतरण ।
  3. 3 मिनट के लिए १,००० x g पर केंद्रापसारक द्वारा कोशिकाओं गोली supernatant त्यागना और संस्कृति माध्यम के 5 मिलीलीटर के साथ प्रत्येक सेल गोली resuspend । ऊपर और नीचे के बारे में 20 बार एक 10 मिलीलीटर सीरम वैज्ञानिक पिपेट के साथ pipetting द्वारा एकल कोशिकाओं में किसी भी कोशिका के झुरमुट को तोड़ने ।
  4. एक hemocytometer में कोशिकाओं की गणना, और संस्कृति माध्यम में कोशिकाओं को पतला LN215-YFPQL के सेल सस्पेंशन बनाने के लिए ८०,००० कोशिकाओं/एमएल और LN215-I पर १६०,००० कोशिकाओं/
  5. एक जलाशय में 7 मिलीलीटर LN215-YFPQL और 7 मिलीलीटर की LN215-I सेल सस्पेंशन को मिलाएं । मिश्रण के १०० µ एल जोड़ें एक ९६ के एक अच्छी तरह से सेल संस्कृति प्लेट एक मल्टीचैनल पिपेट का उपयोग करने के लिए ।
    नोट: जोड़ने के लिए १०० µ एल मिश्रण के प्रत्येक कुआं में ९६-well सेल प्लेट, के बारे में 10 मिलीलीटर की मिश्रित सेल निलंबन की जरूरत है । इसे जरूरत से ज्यादा सेल सस्पेंशन बनाने की सिफारिश की गई है ।
  6. humidified में कोशिकाओं की मशीन 5% CO2/९५% हवा में ३७ ° c 24 घंटे के लिए । LN215-YFPQL और LN215-Iसेल कल्चर १००% धाराप्रवाह होना चाहिए जब परख आयोजित की जाती है ।

5. I-YFP GJIC परख का आयोजन

नोट: 20x आवर्धन के साथ एक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप का प्रयोग करें, और एक GFP फिल्टर ९६ की जांच करने के लिए अच्छी तरह से प्लेटें यकीन है कि वहां LN215 के कोई झुरमुट-YFPQL या LN215-SLC26A4 कोशिकाओं और है कि सेल संस्कृतियों पूरी तरह से धाराप्रवाह है और अच्छी तरह से पहले वितरित कर रहे है परख का आयोजन ।

  1. परख कर रही है, एक microplate पर बारी और ३७ डिग्री सेल्सियस के लिए निर्धारित करने से पहले ंयूनतम 30 मिनट ।
  2. ७०% इथेनॉल, आसुत जल के 3 मिलीलीटर के 3 मिलीलीटर के साथ एक स्वचालित इंजेक्टर की टयूबिंग धोने, और फिर मैं के 3 मिलीलीटर-समाधान ३०० µ एल की एक प्रवाह दर पर/
  3. गर्म सी और मैं पानी स्नान में ३७ डिग्री सेल्सियस के समाधान ।
    नोट: के रूप में १०० प्रत्येक समाधान के µ एल ९६ की एक अच्छी तरह से थाली के लिए आवश्यक है, प्रत्येक समाधान के बारे में 10 मिलीलीटर प्रत्येक परख के लिए आवश्यक है । I-समाधान के एक अतिरिक्त 10 मिलीलीटर प्रत्येक थाली (कुल 20 मिलीलीटर) और सी के एक अतिरिक्त 25 मिलीलीटर-समाधान प्रत्येक प्लेट (३५ मिलीलीटर की कुल) धोने के लिए आवश्यक है भड़काने के लिए की जरूरत है ।
  4. विकास माध्यम महाप्राण या प्लेट को पलटने से उसे खाली कर देना; अवशिष्ट माध्यम नल ।
    नोट: विकास मीडिया में अवशिष्ट भ्रूण गोजातीय सीरम पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति और परख गुणवत्ता में गिरावट का कारण बनता है ।
  5. जोड़ें २०० µ सी के एल-समाधान एक मल्टीचैनल पिपेट का उपयोग कर एक जलाशय से एक अच्छी तरह से । महाप्राण सी समाधान या प्लेट को खाली करने के लिए और अवशिष्ट समाधान नल बाहर औंधा ।
  6. Add ५० µ l µ l ग-हल, 1 µ l का २.५ mM केमिकल स्टॉक ( टेबल 1देखें) या dimethylsulfoxide (DMSO) एक वाहन के रूप में, और फिर ५० µ l µ एल सी-समाधान एक मल्टीचैनल पिपेट के साथ एक अच्छी तरह से ।
    नोट: एक रासायनिक पुस्तकालय में अधिकांश reagent DMSO में भंग कर रहे है और 1% तक (वी/वी) सबसे सेल आधारित परख24में अनुमति दी है । के रूप में DMSO पानी की तुलना में एक उच्च घनत्व है, DMSO में भंग एजेंट के नीचे करने के लिए नीचे जाने के लिए जब संस्कृति प्लेट कुओं, जो परख समाधान की सांद्रता परेशान करने के लिए जोड़ा जाता है । इस DMSO में सी समाधान, रिएजेंट के ५० µ एल जोड़कर दरकिनार किया जा सकता है, और ५० µ एल के सी-समाधान के क्रम में । C-समाधान के अंतिम ५० µ एल मिश्रण के लिए है ।
  7. हवा में ३७ ° c में कोशिकाओं की मशीन, 5% सह2में नहीं । मशीन समय संशोधित किया जा सकता है, लेकिन 10 मिनट के लिए काम करने के लिए आयन चैनल मॉडुलन के लिए आम तौर पर पर्याप्त है.
  8. मशीन के दौरान, microplate रीडर कार्यक्रम के लिए मैं-1 एस में एक अच्छी तरह से समाधान के १०० µ एल इंजेक्षन करने के लिए और 10 एस के लिए प्रतिदीप्ति मापने के लिए सेट पर ०.४ s अंतराल । पाठक को नीचे से प्रतिदीप्ति पढ़ने के लिए सेट करें । अनुशंसित इंजेक्शन गति है १३५ µ एल/एस सेट उत्तेजना तरंग दैर्ध्य ४८५ एनएम के लिए और ५२० एनएम पर उत्सर्जन पढ़ें ।
    नोट: microplate रीडर प्रोग्राम के लिए विस्तृत सेटिंग्स निंनानुसार हैं ।
    1. क्लिक करें प्रोटोकॉल का प्रबंधन करेंबटन है ।
    2. नया बटन क्लिक करें । माप विधि अनुभाग में, और पठन मोड अनुभाग में अच्छी तरह से मोड में प्रतिदीप्ति तीव्रता का चयन करें । अगला, ठीक बटन क्लिक करें । नया टैब दिखाई देगा ।
    3. मूल पैरामीटर मेनू में, सेट उत्तेजना तरंग दैर्ध्य के लिए ४८५ एनएम और उत्सर्जन पर ५२० एनएम । नीचे से प्रतिदीप्ति पढ़ने के लिए नीचे ऑप्टिक का चयन करें । सेट माप प्रारंभ समय "0 s" होने के लिए, अंतरालों की संख्या "25" होने के लिए, अच्छी तरह से प्रति चमक की संख्या, और अंतराल होने के लिए "20", और अंतराल के लिए समय "०.४ s" ।
    4. लेआउट मेनू में, पढ़ा जा करने के लिए थाली के क्षेत्र ड्रा ।
    5. में सांद्रता/खंड/झोंपड़ी मेनू, microplate पाठक सेट के लिए १०० µ एल सुई के लिए मैं-समाधान के साथ एक अच्छी तरह से १३५ µ एल/
      नोट: वे कोशिकाओं की टुकड़ी में परिणाम कर सकते हैं क्योंकि तेजी से इंजेक्शन की गति से बचें.
    6. इंजेक्शन समय मेनू में, इंजेक्शन शुरू समय 1 एस होने के लिए सेट करें । फिर, मापन प्रारंभ करें बटन पर क्लिक करे.
  9. मशीन के बाद, microplate रीडर में ९६-अच्छी तरह से प्लेट रखें और माप शुरू करें क्लिक करके मापन बटन फिर से शुरू करें ।

6. GJIC गतिविधि की गणना

  1. YFPQL शमन और GJIC गतिविधि के प्रतिशत की गणना के रूप में23
    YFPQL शमन (%) =Equation 1
    GJIC गतिविधि (%) =Equation 2
    नोट: सिद्धांत रूप में, GJIC गतिविधि को स्वीकारकर्ता कोशिकाओं और दाता कोशिकाओं के साथ कुओं में YFP प्रतिदीप्ति के प्रतिशत के अंतर से गणना की जानी चाहिए और इसी स्वीकारकर्ता-सेल केवल कुओं । हालांकि, के रूप में LN215-YFPQL कोशिकाओं आयोडाइड द्वारा नगण्य YFP शमन दिखाने के बाद 10 एस, हम पृष्ठभूमि YFP खाते में शमन जब HTS-LN215 YFP और QL-I- कोशिकाओं का उपयोग LN215 का आयोजन नहीं लेते ।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

२९ ९६-अच्छी तरह से संस्कृति प्लेटों के लिए २,३२० रसायनों स्क्रीन मैं YFP GJIC परख द्वारा LN215-YFPQL और LN215-i कोशिकाओं का उपयोग करके उपंयास GJIC मॉडुलन की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया गया । एक प्रतिनिधि प्लेट के साथ प्राप्त परिणामों चित्रा 2में दिखाया गया है । प्रत्येक कुआं में YFP प्रतिदीप्ति का प्रतिशत चित्रा 2 में रेखा ग्राफ के रूप में दिखाया गया है और प्रत्येक कुआं में GJIC गतिविधि का प्रतिशत चित्रा 2बीमें बार ग्राफ में दिखाया गया है । नकारात्मक और सकारात्मक नियंत्रण और ८० रसायनों कि जांच की गई तालिका 1में दिखाया गया है । प्रत्येक अच्छी तरह से 10 मिनट टर्बिनाफाइन क्लोबेटासोल पूरी तरह से बाधित GJIC और homosalate के लिए एक यौगिक के 25 µ एम के साथ इलाज किया गया था GJIC के लगभग ५०% बाधित । टर्बिनाफाइन क्लोबेटासोल एक GJ अवरोध करनेवाला के रूप में पुष्टि की थी । इसकी खुराक-प्रतिक्रिया, reversibility, और अन्य प्रयोगात्मक परिणाम23कहीं प्रकाशित किया गया है.

Figure 1
चित्रा 1 : घटक और मैं-YFP GJIC परख के कदम () पीले और काले पीले पेंटागन स्वीकार करने से पहले और शमन के बाद YFPQL व्यक्त कोशिकाओं का प्रतिनिधित्व करते हैं । काले पेंटागन दाता कोशिकाओं SLC26A4 व्यक्त कर रहे हैं । नीली पट्टियां GJs हैं और लाल पट्टियां SLC26A4 ट्रांसपोर्टरों की हैं । गुलाबी घेरे iodides हैं । जब GJs खुले (ऊपरी पैनल), iodides SLC26A4 के माध्यम से पारित और दाता सेल में प्रवेश कर रहे हैं । Iodides GJs. Iodides के माध्यम से सन्निकट स्वीकारकर्ता कोशिकाओं के लिए माइग्रेट करें स्वीकारकर्ता कोशिकाओं के YFP प्रतिदीप्ति को बुझाते हैं. यदि GJs बंद कर रहे है (कम पैनल), दाता कोशिकाओं में प्रवेश iodides पड़ोसी स्वीकार करता है कोशिकाओं को नहीं ले जा सकते हैं, और दाता की कोशिकाओं में ही बनाए रखा । स्वीकारकर्ता कोशिकाओं के YFP प्रतिदीप्ति iodides के अलावा के बाद काफी कम नहीं है () चरण इसके विपरीत और फ्लोरोसेंट छवियों प्राप्त जब एक मैं-YFP-GJIC परख कर रही है । जब स्वीकारकर्ता और दाता कोशिकाओं 1:1 के अनुपात में चढ़ाया गया, YFPQL शमन 1 मिनट मनाया गया था के बाद iodides (ऊपरी पैनल) जोड़ा गया । जब केवल स्वीकारकर्ता कोशिकाओं चढ़ाया गया, 1 मिनट के लिए आयोडाइड उपचार महत्वपूर्ण YFPQL शमन21के लिए नेतृत्व नहीं किया । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2 : प्रतिनिधि HTS मैं-YFP-GJIC परख का उपयोग परिणाम (A) LN215-YFPQL के 1:2 मिश्रण का निलंबन और LN215-I कोशिकाओं को 24 एच के लिए चढ़ाया और तैयार किया गया, जैसा कि प्रोटोकॉल अनुभाग 4 में वर्णित है । कोशिकाओं को धोया और वाहन या प्रोटोकॉल अनुभाग 5 में के रूप में रसायनों के साथ इलाज किया गया । सभी रसायनों DMSO में 10 मिनट के लिए २.५ mM स्टॉक समाधान से 25 µ एम नमूनों के रूप में परख रहे थे । एक अच्छी तरह से समाहित 1 µ एल DMSO और १०० सी के µ एल-समाधान । थाली की पहली और अंतिम पंक्तियों को ऋणात्मक (वाहन) और धनात्मक (carbenoxolone) नियंत्रणों को असाइन किया गया था. शेष ८० कुओं 1 तालिकामें सूचीबद्ध रसायनों स्क्रीन करने के लिए इस्तेमाल किया गया । उपचार के बाद, मैं-YFP-GJIC परख अच्छी तरह से आयोजित किया गया था-by-अच्छी तरह के रूप में प्रोटोकॉल अनुभाग 5 में । प्रत्येक समय में प्रत्येक कुआं में YFP प्रतिदीप्ति का प्रतिशत 2 एस में मूल्य को सामान्यीकृत किया गया और समय के खिलाफ साजिश रची गई । आंकड़ा में लाइनें एक अच्छी तरह से YFP प्रतिदीप्ति में परिवर्तन का प्रतिनिधित्व करते हैं । YFP प्रतिदीप्ति में सबसे अच्छी तरह से 10 एस में ७०% से ८०% तक की दूरी पर है । टर्बिनाफाइन क्लोबेटासोल और homosalate GJ अवरोधकों के लिए संभावित हिट थे () बार ग्राफ ९६ कुओं में से प्रत्येक के प्रतिशत GJIC गतिविधि से पता चलता है । प्रोटोकॉल चरण ६.१ में दिखाए गए के रूप में प्रतिशत GJIC गतिविधि की गणना की गई और अच्छी संख्या के विरुद्ध बार ग्राफ़ में प्लॉट किया गया । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

खैर नहीं । स्थिति रासायनिक खैर नहीं । स्थिति रासायनिक
1 A01 DMSO ४९ E01 DMSO
2 A02 difloxacin हाइडरोक्लॉराइड ५० E02 propofol
3 A03 बेटमेटसोने valerate ५१ E03 oleandomycin फॉस्फेट
4 A04 इरिथ्रोमाइसिन ५२ E04 mianserin हाइडरोक्लॉराइड
5 A05 cyproheptadine हाइडरोक्लॉराइड ५३ E05 वल्सरटान
6 A06 liothyronine ५४ E06 salsalate
7 A07 theophylline ५५ E07 hydrocortisone
8 A08 tolnaftate ५६ E08 rifaximin
9 A09 trimethobenzamide हाइडरोक्लॉराइड ५७ E09 adrenolone हाइडरोक्लॉराइड
10 A10 cefamandole nafate ५८ E10 imiquimod
11 A11 dimethyl fumarate ५९ E11 nonoxynol-9
12 A12 CBX ६० E12 CBX
13 B01 DMSO ६१ F01 DMSO
14 B02 piracetam ६२ F02 ranolazine
15 B03 gluconolactone ६३ F03 danthron
16 B04 azlocillin सोडियम ६४ F04 acedapsone
17 B05 choline क्लोराइड ६५ F05 atomoxetine हाइडरोक्लॉराइड
18 B06 atorvastatin कैल्शियम ६६ F06 desoxycorticosterone एसीटेट
19 B07 oxyphencyclimine हाइडरोक्लॉराइड ६७ F07 tramadol हाइडरोक्लॉराइड
20 B08 propafenone हाइडरोक्लॉराइड ६८ F08 टर्बिनाफाइन क्लोबेटासोल हाइडरोक्लॉराइड
21 B09 fluconazole ६९ F09 topiramate
22 B10 lovastatin ७० F10 gemifloxacin mesylate
23 B11 ब्लीयामीसिन (ब्लीयामीसिन b2 दिखाया गया है) ७१ F11 pravastatin सोडियम
24 B12 CBX ७२ F12 CBX
25 C01 DMSO ७३ G01 DMSO
26 C02 acesulfame पोटेशियम ७४ G02 levalbuterol हाइडरोक्लॉराइड
27 C03 teniposide ७५ G03 मेटफार्मिन हाइडरोक्लॉराइड
28 C04 टेनिंग एसिड ७६ G04 pregabalin
29 C05 carprofen ७७ G05 topotecan हाइडरोक्लॉराइड
30 C06 hydroxychloroquine सल्फेट ७८ G06 phenoxybenzamine हाइडरोक्लॉराइड
31 C07 pentoxifylline ७९ G07 arecoline hydrobromide
३२ C08 mepivacaine हाइडरोक्लॉराइड ८० G08 mepartricin
३३ C09 nilutamide ८१ G09 pantoprazole
३४ C10 aminolevulinic एसिड हाइडरोक्लॉराइड ८२ G10 लॉपरमाइड हाइडरोक्लॉराइड
३५ C11 aniracetam ८३ G11 podofilox
३६ C12 CBX ८४ G12 CBX
३७ D01 DMSO ८५ H01 DMSO
३८ D02 metaxalone ८६ H02 लीवोडोपा
३९ D03 chloroguanide हाइडरोक्लॉराइड ८७ H03 ethisterone
४० D04 क्लरीत्रोमयसीं ८८ H04 enrofloxacin
४१ D05 modaline सल्फेट ८९ H05 sparteine सल्फेट
४२ D06 protirelin ९० H06 टेस्टोस्टेरोन propionate
४३ D07 theobromine ९१ H07 pyridostigmine ब्रोमाइड
४४ D08 rosiglitazone maleate ९२ H08 enilconazole सल्फेट
४५ D09 losartan ९३ H09 बेटमेटसोने सोडियम फॉस्फेट
४६ D10 homosalate ९४ H10 azaserine
४७ D11 salicylanilide ९५ H11 acrisorcin
४८ D12 CBX ९६ H12 CBX

तालिका 1. इस अध्ययन में दिखलाई गई रसायनों की सूची ।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

मैं-YFP-GJIC परख HTS के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है क्योंकि यह मजबूत है, तेजी से, और सस्ती । एक HTS परख मजबूत माना जाता है अगर Z'-फैक्टर ०.५25से ऊपर है । झांग एट अल मिलते हैं । HTS परख25की उपयुक्तता का आकलन करने के लिए प्रयुक्त सांख्यिकीय विश्लेषण के विवरण के लिए । जब LN215 कोशिकाओं का इस्तेमाल किया गया, Z'-फैक्टर किसी भी परख अनुकूलन के बिना 0.5 > गया था । यदि अंय कोशिका प्रकार परख में उपयोग किया जाता है और इसके Z'-कारक 0.5 < है, मजबूती परख समय21विस्तार से सुधार किया जा सकता है । LN215 और HOS, मानव ऑस्टियो कोशिकाओं, कोशिकाओं केवल 10 एस की जरूरत है एक Z'-फैक्टर > 0.521प्राप्त करने के लिए । परख केवल स्वीकारकर्ता और दाता कोशिकाओं, मैं समाधान, और सी समाधान की आवश्यकता है । कोई अतिरिक्त एजेंट, जैसे कि और calcein-AM की जरूरत है । इस GJIC परख का एक और लाभ यह है कि यह एक अच्छी तरह से, जो कम के बीच में परिणाम-अच्छी तरह से परिवर्तनशीलता में कोशिकाओं की कुल GJIC गतिविधि उपाय । microinjection में, गैप-प्रतिदीप्ति रिकवरी photobleaching के बाद (frap है), और दोहरी पैच दबाना परख, परख क्षेत्र में एक सेल काफी माप को प्रभावित कर सकते हैं । हालांकि स्क्रैप लोड हो रहा है परख एक अपेक्षाकृत व्यापक क्षेत्र पर GJIC का मूल्यांकन, स्क्रैप लोडिंग प्रक्रिया महत्वपूर्ण परिवर्तनशीलता26लागू कर सकते हैं ।

I-YFP-GJIC परख के सफल संचालन के लिए महत्वपूर्ण कदम इस प्रकार हैं । C-और I-समाधान का पीएच प्रत्येक उपयोग करने से पहले ७.४ करने के लिए समायोजित किया जाना चाहिए । YFPQL प्रतिदीप्ति जोरदार पीएच द्वारा के रूप में अच्छी तरह के रूप में22halides द्वारा प्रभावित है । एक पीएच दो समाधान के बीच अंतर I-समाधान के अलावा YFP प्रतिदीप्ति में ंयायपालिका परिवर्तन करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं । दाता और स्वीकारकर्ता कोशिकाएँ चढ़ाना से पहले पूरी तरह असंबद्ध होना चाहिए. दाता या स्वीकारकर्ता कोशिकाओं के झुरमुट को परख कर परेशान करते हैं । मिश्रित संस्कृति का संगम कोशिकाओं के बीच GJs के गठन को अधिकतम करने के लिए १००% होना चाहिए । दाता कोशिकाओं को स्वीकार करने का अनुपात भी ली एट अल द्वारा वर्णित के रूप में परख परिणाम को प्रभावित करताहै । 21. के रूप में ही स्वीकारकर्ता कोशिकाओं YFP प्रतिदीप्ति है, अनुपात और स्वीकार्यता और दाता कोशिकाओं की व्यवस्था आसानी से परख आयोजित करने से पहले एक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप के साथ की जांच की जा सकती है । यह महत्वपूर्ण है सह-संस्कृति के साथ धोने के लिए सी समाधान वाहन या रसायनों के साथ उपचार से पहले अवशिष्ट माध्यम को दूर करने के लिए । अवशिष्ट सीरम या संस्कृति माध्यम से phenol लाल पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति या एक अवांछित प्रतिदीप्ति शमन का एक स्रोत, क्रमशः हो सकता है । वे इस प्रकार मैं-YFP-GJIC परख में बाधा हो सकती है । FBS में मौजूद विकास कारकों को भी GJIC27को बाधित कर सकते हैं । दूसरी ओर, सीरम भुखमरी अंततः28apoptosis नेतृत्व कर सकते हैं, जो भी रासायनिक उपचार द्वारा त्वरित किया जा सकता है । हमारे अनुभव में, स्वीकारकर्ता और दाता कोशिकाओं के उपचार के बाद स्वस्थ थे 25 µ एम में सी में 10 मिनट के लिए सीरम के बिना समाधान । 4 एच के लिए इलाज के बाद भी कुछ केमिकल विषैले नहीं थे । के रूप में रासायनिक विषाक्तता बदलता है, कोशिकाओं की हालत ध्यान से जाँच की जानी चाहिए जब लंबी अवधि के लिए उपचार की आवश्यकता है. यदि कोशिकाओं को स्वस्थ नहीं हैं, YFP प्रतिदीप्ति की एक स्पष्ट कमी है कि I-समाधान की शुरूआत के बाद 1 s में होता है कोशिका टुकड़ी से परिणाम हो सकता है । कि शामिल अच्छी तरह से सूक्ष्म अवलोकन द्वारा पुष्टि की जा सकती है ।

I-YFP-GJIC परख में प्रयुक्त कोशिकाओं को कई आवश्यकताओं को पूरा करना चाहिए । वे GJs endogenously व्यक्त या GJs फार्म करने के लिए प्रेरित किया जाना चाहिए । Cx43 से बना चैनल के रूप में लगभग समान रूप से परमाणु cations और ॠणायन29के लिए पारगंय हैं, iodides YFP कोशिकाओं में मैं-GJIC LN215 में मौजूद चैनलों के माध्यम से पलायन कर सकते हैं । यदि ब्याज की कोशिकाओं में Cx चैनल कम आयोडाइड पारगम्यता है, लेकिन आज़ादी 2 सीए के प्रसार की अनुमति+, मैं-YFP-GJIC परख संभव नहीं हो सकता है. आयोडाइड की अनुपस्थिति गतिविधि एक आवश्यकता है । कोशिकाओं है कि कार्यात्मक आयनों चैनलों और तेज आयोडाइड एक्सप्रेस तेजी से इस परख के लिए उपयुक्त नहीं हैं । कोशिका वृद्धि एक और आवश्यकता है । स्वीकारकर्ता और दाता कोशिकाओं lentiviruses के transduction द्वारा उत्पंन कर रहे है YFPQL या SLC26A4 और puromycin के साथ चयन के लिए ंयूनतम 1 सप्ताह19। कोशिकाओं है कि धीरे से बढ़ने या इस तरह के प्राथमिक हेपैटोसाइट्स के रूप में सीमित वृद्धि इस परख के लिए उपयुक्त नहीं हैं । प्लास्टिक की संस्कृति के बर्तन की सतह के लिए कोशिकाओं के आसंजन भी महत्वपूर्ण है । वे कोशिकाएं जो दृढ़ता से पालन नहीं करती हैं, जैसे कि HEK293 कोशिकाएं, I-समाधान का परिचय देकर आसानी से अलग हो जाती हैं । यह कोटिंग ९६-चढ़ाना से पहले पीएलएल के साथ अच्छी तरह से प्लेट से दूर किया जा सकता है । हालांकि, कोटिंग प्लेट एक थकाऊ कदम है, और कोशिकाओं के उन प्रकार से बचने की सिफारिश की है । सिद्धांत रूप में, astrocytes, हेपैटोसाइट्स, और keratinocytes जैसे प्राथमिक कोशिकाओं toxicologically, शारीरिक, और औषधीय तंत्रिकाबंधार्बुद, hepatoma, और बेसल सेल कार्सिनोमा कोशिकाओं की तरह कैंसर कोशिकाओं से अधिक प्रासंगिक हैं । हालांकि, उनके सीमित विकास दर उंहें परख के लिए अनुपयुक्त बनाते हैं । सेल संस्कृति में भविष्य के अग्रिमों है कि प्राथमिक कोशिकाओं है कि लंबे समय के लिए उपरोक्त आवश्यकताओं को पूरा करने के विकास की अनुमति, विषाक्तता व्यापक होगा, शारीरिक, और औषधीय आकलन इस परख के साथ संभव है ।

I-YFP GJIC परख न केवल HTS के लिए, लेकिन यह भी निर्धारित करने के लिए कि क्या एक सेल प्रकार endogenously कार्यात्मक GJs व्यक्त के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । यदि कोशिकाओं GJs नहीं है, YFPQL शमन दर cocultured स्वीकारकर्ता और दाता कोशिकाओं में मनाया है कि मनाया जब केवल स्वीकारकर्ता कोशिकाओं चढ़ाया गया से अलग नहीं होगा । यदि शमन दर में एक महत्वपूर्ण अंतर था, तो मूल कोशिकाओं कार्यात्मक GJs व्यक्त करते हैं । के रूप में अंतर समय के साथ वृद्धि के रूप में चित्र 2में दिखाया जाता है, इस परख एक बड़ी संवेदनशीलता को स्क्रैप से कमजोर GJIC गतिविधि का पता लगाने-लोड हो रहा है या गैप-frap है परख है । समय पाठ्यक्रम डेटा, खुराक-प्रतिक्रिया संबंधों, और GJ मॉडुलन के reversibility का आकलन I-YFP-GJIC परख23,30के साथ प्राप्त किया जा सकता है । कार्यात्मक GJs से रहित कोशिकाओं में ब्याज की एक Cx की अभिव्यक्ति उत्प्रेरण द्वारा और फिर स्वीकार करने वालों और दाताओं, मैं-YFP विशिष्ट Cx-GJIC परख23स्थापित किया जा सकता है । इस प्रकार यह परख Cx के एक विशिष्ट प्रकार पर एक रासायनिक के IC50 मूल्यों का निर्धारण करने के लिए संभव बनाता है ।

सबसे HTS परख की तरह, मैं YFP-GJIC परख झूठी सकारात्मक SLC26A4, YFPQL, या सेलुलर आयोडाइड पारगम्यता में परिवर्तन से उत्पंन परिणामों का उत्पादन कर सकते हैं । के रूप में झूठी GJ निषेध SLC26A4 या YFPQL के आयोडाइड के लिए बाधा के निषेध से परिणाम कर सकते हैं, हर संभावित GJ अवरोधक कोशिकाओं है कि coexpress YFP QL और SLC26A4 का उपयोग कर परीक्षण किया जाना चाहिए । यदि एक संभावित GJ अवरोधक एक SLC26A4 अवरोधक या एक YFP है, YFP शमन तनु है । इसके विपरीत, एक सच्चे GJ अवरोध करनेवाला YFP शमन प्रभावित नहीं करता है । Electrophysiological विधियों या शुद्ध YFPQL SLC26A4 ब्लॉकर्स और YFP के बीच भेदभाव कर सकते हैं । GJ उत्प्रेरक है कि संवेदनशील YFP आयोडाइड या आयनों चैनलों, Cx hemichannels, या विशिष्ट विषाक्त प्रभाव के माध्यम से आयोडाइड पारगम्यता बढ़ाने के लिए भी झूठी सकारात्मक परिणाम दे देंगे । यह निर्धारित किया जाना चाहिए कि क्या संभावित GJ उत्प्रेरक YFP शमन बढ़ाने जब केवल स्वीकार करता है कोशिकाओं को चढ़ाया जाता है । यदि एक रासायनिक संवेदी YFPQL या बढ़ाता है आयोडाइड पारगम्यता, तो यह YFPQL के दाताओं के बिना स्वीकारकर्ता सेल संस्कृतियों में शमन वृद्धि होगी । झूठी GJ उत्प्रेरक के दो प्रकार के अंय GJ परख में प्रतिष्ठित किया जा सकता है, जैसे स्क्रैप लोड हो रहा है या frap है या शुद्ध YFPQL प्रोटीन का उपयोग कर ।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

लेखकों के हित का खुलासा करने का कोई टकराव नहीं है.

Acknowledgments

इस शोध को बेसिक साइंस रिसर्च प्रोग्राम द्वारा नेशनल रिसर्च फाउंडेशन ऑफ कोरिया (एनआरएफ) द्वारा वित्त पोषित शिक्षा मंत्रालय (2011-0023701, 2016R1D1A1A02937397, और 2018R1A6A1A03023718) के जरिए सपोर्ट किया गया ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
96-well plate SPL 30096
Calcium chloride (CaCl2) Sigma C5670 I-solution
D-(+)-Glucose Sigma G7021 C-solution, I-solution
Dimethyl sulfoxide (DMSO) sigma 276855
HEPES Sigma RES6003H-B7 C-solution, I-solution
Lipofectamine 2000 Invitrogen 11668-027 transfection reagent
Magnesium chloride hexahydrate (MgCl2 6H2O) Sigma M2393 C-solution
Microplate reader  BMG LabTech  POLARstar Omega 415-1618
pMD2.G  Addgene #12259
Polybrene sigma H9268
Poly-L-lysine solution sigma P4707
Potassium chloride (KCl) Sigma P5405 C-solution, I-solution
psPAX2  Addgene  #12260
Puromycin Dihydrochloride sigma P8833
Sodium chloride (NaCl) Sigma S5886 C-solution, I-solution
Sodium hyroxide (NaOH) Sigma S2770
Sodium Iodide (NaI) Sigma 383112 I-solution

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Goodenough, D. a, Goliger, J. a, Paul, D. L. Connexins, connexons, and Intercellular Communication. Annual Review of Biochemistry. 65, 475-502 (1996).
  2. Upham, B. L., Weis, L. M., Trosko, J. E. Modulated Gap Junctional Intercellular Communication as a Biomarker of PAH Epigenetic Toxicity: Structure-Function Relationship. Environmental Health Perspectives. 106, 975 (1998).
  3. U, J. E. T., Chang, C., Upham, B., Wilson, M. Epigenetic toxicology as toxicant-induced changes in intracellular signalling leading to altered gap junctional intercellular communication. Toxicology Letters. 71-78 (1998).
  4. Yamasaki, H. Role of disrupted gap junctional intercellular communications in detection and characterization of carcinogens. Mutation Research - Reviews in Genetic Toxicology. (1996).
  5. Yamasaki, H., et al. Gap junctional intercellular communication and cell proliferation during rat liver carcinogenesis. Environmental Health Perspectives. 101, suppl 5 191-197 (1993).
  6. Vinken, M., et al. Gap junctional intercellular communication as a target for liver toxicity and carcinogenicity. Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology. 44, 201-222 (2009).
  7. Fonseca, C. G., Green, C. R., Nicholson, L. F. B. Upregulation in astrocytic connexin 43 gap junction levels may exacerbate generalized seizures in mesial temporal lobe epilepsy. Brain Research. 929, (1), 105-116 (2002).
  8. Garbelli, R., et al. Expression of connexin 43 in the human epileptic and drug-resistant cerebral cortex. Neurology. 76, (10), 895-902 (2011).
  9. Schulz, R., et al. Connexin 43 is an emerging therapeutic target in ischemia/reperfusion injury, cardioprotection and neuroprotection. Pharmacology and Therapeutics. 153, 90-106 (2015).
  10. Sarrouilhe, D., Dejean, C., Mesnil, M. Involvement of gap junction channels in the pathophysiology of migraine with aura. Frontiers in Physiology. (2014).
  11. Patel, S. J., et al. Gap junction inhibition prevents drug-induced liver toxicity and fulminant hepatic failure. Nature Biotechnology. 30, (2), 179-183 (2012).
  12. Kandyba, E. E., Hodgins, M. B., Martin, P. E. A murine living skin equivalent amenable to live-cell imaging: analysis of the roles of connexins in the epidermis. Journal of Investigative Dermatology. 128, (4), 1039-1049 (2008).
  13. Upham, B. L., et al. Differential roles of 2 , 6 , and 8 carbon ceramides on the modulation of gap junctional communication and apoptosis during carcinogenesis. Cancer Letters. 191, 27-34 (2003).
  14. Upham, B. L., et al. Structure-activity-dependent regulation of cell communication by perfluorinated fatty acids using in vivo and in vitro model systems. Environmental Health Perspectives. 117, (4), 545-551 (2009).
  15. Weis, L. M., et al. Bay or Baylike Regions of Polycyclic Aromatic Hydrocarbons Were Potent Inhibitors of Gap Intercellular Communication. Environmental Health Perspectives. 106, (1), 17-22 (1998).
  16. el-Fouly, M. H., Trosko, J. E., Chang, C. C. Scrape-Loading and Dye Transfer: A Rapid and Simple Technique to Study Gap Junctional Intercellular Communication. Experimental Cell Research. 168, (2), 422-430 (1987).
  17. Wade, M. H., Trosko, J. E., Schindler, M. Photobleaching Assay of Gap Junction- Mediated Communication Between Human Cells. Advancement of Science. 232, (4749), 525-528 (2010).
  18. Abbaci, M., et al. In vitro characterization of gap junctional intercellular communication by gap-FRAP technique. Proceedings of SPIE. 585909 (2005).
  19. Neyton, J., Trautmann, A. Single-channel currents of an intercellular junction. Nature. 317, (6035), 331-335 (1985).
  20. Wilders, R., Jongsma, H. J. Limitations of the dual voltage clamp method in assaying conductance and kinetics of gap junction channels. Biophysical Journal. 63, (4), 942-953 (1992).
  21. Lee, J. Y., Choi, E. J., Lee, J. A new high-throughput screening-compatible gap junctional intercellular communication assay. BMC Biotechnology. 15, (1), 1-9 (2015).
  22. Galietta, L. J. V., Haggie, P. M., Verkman, A. S. Green fluorescent protein-based halide indicators with improved chloride and iodide affinities. FEBS Letters. 499, (3), 220-224 (2001).
  23. Lee, J. Y., Yoon, S. M., Choi, E. J., Lee, J. Terbinafine inhibits gap junctional intercellular communication. Toxicology and Applied Pharmacology. 307, 102-107 (2016).
  24. Hughes, J., Rees, S., Kalindjian, S., Philpott, K. Principles of early drug discovery. British Journal of Pharmacology. 162, (6), 1239-1249 (2011).
  25. Zhang, J. H., Chung, T. D. Y., Oldenburg, K. R. A simple statistical parameter for use in evaluation and validation of high throughput screening assays. Journal of Biomolecular Screening. 4, (2), 67-73 (1999).
  26. Upham, B. L. Role of Integrative Signaling Through Gap Junctions in Toxicology. Current Protocols in Toxicology. (2011).
  27. Schalper, K. A., et al. Modulation of gap junction channels and hemichannels by growth factors. Molecular BioSystems. 8, (3), 685-698 (2012).
  28. Kulkarni, G. V., Mcculloch, C. A. G. Serum deprivation induces apoptotic cell death in a subset of Balb / c 3T3 fibroblasts. Journal of Cell Science. 1179, 1169-1179 (1994).
  29. Harris, A. L., Locke, D. Permeability of Connexin Channels. Connexins. 165-206 (2009).
  30. Choi, E. J., Yeo, J. H., Yoon, S. M., Lee, J. Gambogic Acid and Its Analogs Inhibit Gap. Junctional Intercellular Communication. 9, 1-10 (2018).
An आयोडाइड-पीला फ्लोरोसेंट प्रोटीन गैप जंक्शन-सेलुलर संचार परख
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Yeo, J. H., Lee, J. An Iodide-Yellow Fluorescent Protein-Gap Junction-Intercellular Communication Assay. J. Vis. Exp. (144), e58966, doi:10.3791/58966 (2019).More

Yeo, J. H., Lee, J. An Iodide-Yellow Fluorescent Protein-Gap Junction-Intercellular Communication Assay. J. Vis. Exp. (144), e58966, doi:10.3791/58966 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter