Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Bir iyodür-Sarı floresan Protein-Gap Junction hücreler arası iletişim tahlil

Published: February 1, 2019 doi: 10.3791/58966
Automatic Translation
1, 1
1College of Pharmacy, Yonsei Institute of Pharmaceutical Sciences, Yonsei University

Summary

Burada, gap junction oransal kimyasal ilaç bulma ve toksikolojik değerlendirme için yüksek üretilen iş filtreleme için tasarlanmış bir roman gap junction hücreler arası iletişim tahlil için bir iletişim kuralı mevcut.

Abstract

Gap kavşak (GJs) bitişik hücreler arasında 1 kDa daha küçük moleküllerin difüzyon izin hücre zarı kanallar vardır. Fizyolojik ve patolojik rollere sahip olduğu ilaç bulma ve toksikoloji deneyleri GJ modülatörler tanımlamak için lüzum-in yüksek-den geçerek (HTS) eleme deneyleri. Bir roman iyodür-Sarı floresan protein-gap junction hücreler arası iletişim (ı-YFP-GJIC) tahlil bu ihtiyacı karşılamaktadır. Stabil olan floresans hassas iyodür veya SLC26A4, bir iyodür taşıyıcı tarafından sırasıyla söndürülür bir sarı floresan protein (YFP) değişken ifade etmek için tasarlanmıştır alıcısı ve donör hücreleri de dahil olmak üzere hücre tabanlı bir tahlil olduğunu. İyodür iki hücre tiplerinin karışık bir kültüre eklendiğinde, donör hücreleri ile SLC26A4 taşıyıcı girin ve nereye YFP floresan gidermek GJs ile bitişik alıcısı hücrelere diffüz. YFP floresan iyi iyi bir kinetik modunda ölçülür. YFP su verme oranı GJ etkinliğini yansıtır. Güvenilir ve HTS. için kullanılacak hızlı tahlil LN215 hücreleri, insan gliyom hücreleri, kullanarak ben-YFP-GJIC tahlil için protokol açıklanmıştır.

Introduction

Gap kavşak (GJs) hareket hücreler arası kanalları küçük moleküllerin difüzyon izin vermek için < 1 kDa besin, metabolitleri ve bitişik hücreler arasında sinyal molekülleri gibi. Bileske öğeleri hemichannel veya connexon her hücrede içerir ve her connexon altı connexins (Cxs)1teşkil eder. GJs ve Cxs gibi GJ inhibitörleri2,3,4olan aromatik polisiklik hidrokarbonlar (PAH), karsinojenler, toksikoloji deneyleri içinde kullanılmaya başlandı. Kesintiye GJIC nongenotoxic karsinojenezis5,6ile ilişkili olduğu düşünülmektedir. Potansiyel terapötik hedef olarak, belirli alt türlerinden nöbetler7,8, kalp ve beyin iskemi/reperfüzyon hasarı9, migren aura10ile koruma GJ tutulum bildirilmiştir, ilaca bağlı karaciğer hasarı6,11ve12şifa yara. Yüksek işlem hacmi (HTS) eleme deneyleri GJ oransal kimyasal madde veya ilaç bulma, toksikoloji deneyleri için için antikorlar tanıtmakta ve Roman hücresel düzenleyiciler GJ faaliyet tanımlamak için gereklidir. HTS deneyleri GJ modülatörler2,13,14,15yapısı-aktivite ilişkileri araştırmak için kullanabilirsiniz.

Bazı GJIC deneyleri boya transferi veya ikili yama kelepçe teknikleri içerir. Lucifer sarı CH (LY) ve calcein acetoxymethyl ester (calcein-AM) boya-devret deneyleri içinde kullanılmaya başlandı. Hücreler LY, mikroenjeksiyon, yükleme kazıma veya Elektroporasyon tarafından kullanılmaya geçirgen değildir. Bir kez hücre içindeki komşu hücreleri yoluyla GJs LY yayılır ve GJ etkinlik LY geçiş16ölçüde tarafından denetlesinler. Calcein-AM deneyleri genellikle photobleaching17,18sonra boşluk-floresan kurtarma içerir. Calcein-AM intracellularly geçirimsiz calcein tarafından içsel bir esteraz dönüştürülür bir hücre permeant boya var. Tahlil bu lazer photobleaching takip çevresindeki bir hücreye calcein-AM transferini gözlemlemek için confocal mikroskop gerektirir. Fonksiyonel GJs varsa, calcein-AM bitişik hücrelerde photobleached hücreleri girer ve floresan kurtarılır. GJ faaliyet photobleached hücrelerinin floresans kurtarma ölçüde tarafından denetlesinler. Boya-devret deneyleri zahmetli ve zaman alıcı veya düşük hassasiyetleri sahip. İkili yama sıkma bileske gürültülerinden ölçer elektrofizyolojik bir yöntemdir. Gürültülerinden doğrudan bir bağımlılık açık GJs19sayısı ile oldukça hassas; Ancak, bu teknik olarak talep, zaman alıcı ve pahalı20. Ben-YFP-GJIC tahlil HTS. kullanım için geliştirilmiştir

Şekil 1 gösterir bileşenleri ve alıcısı hücreleri H148Q ve I152L taşıyan bir iyodür duyarlı YFP değişken ifade kullanır-YFP GJIC tahlil adımlardan (YFPQL) ve donör hücreleri bir iyodür ışınlama (SLC26A4) ifade21 . YFPQL tarafından yapılan iki mutasyon floresans iyodür22tarafından Şoklama izin. İodides Co kültürlü alıcısı ve donör hücreleri eklenir; alıcısı hücreleri girmez ancak mevcut SLC26A4 taşıyıcıları tarafından donör hücreleri alınır. İodides donör hücreleri işleyen GJs nerede YFPQL floresans gidermek bitişik alıcısı hücrelere yaygın. GJs kapalı veya inhibitörleri tarafından bloke, iyodür floresans gidermek için alıcısı hücreleri giremezsiniz. YFPQL su verme oranı GJ etkinliğini yansıtır. Ben-YFP GJIC tahlil ne karmaşık ne de zaman alıcı bir işlemdir. HTS ile uyumlu ve nispeten kısa bir süre içinde GJ etkinlik bileşikler çok sayıda etkilerini test etmek için kullanılabilir. Sadece alıcısı ve donör hücreleri ve iki dengeli tuz çözüm gerektirir. Aşağıda açıklanan protokol önemli olan Cx Cx4321yaşında LN215 hücreleri temel alan. LN215-YFPQL reseptörü ve LN215-ı− donör hücreleri YFPQL veya SLC26A421,23ifade lentiviruses ile iletim tarafından üretilen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. nesil YFPQL ve SLC26A4 ifade lentiviruses

  1. HEK293T insan embriyonik böbrek hücreleri % 80 100 mm Kültür tabaklarda confluency büyümek. Dulbecco'nın modifiye kartal Orta (% 10 fetal Sığır serum, 100 U/mL penisilin ve 100 µg/mL streptomisin ile desteklenmiş DMEM) boyunca protokolünün HEK293T ve aşağıda belirtilen diğer hücreleri korumak için kullanılan kültür ortamıdır.
  2. Her şey 10 dakika süreyle 2 mL steril poli-L-lizin (PLL) çözüm %0,005 ekleyerek kat 6-şey kültür tabak PLL çözüm Aspire edin ve yüzey iki kez 2 mL steril su ile durulayın.
  3. Yıkama HEK293T hücreleri ile fosfat 10 mL serum fizyolojik (PBS) arabelleğe alınmış ve 3 dk. eklemek 5 mL kültür ortamının için 37 ° C'de 2 mL % 0.25 tripsin-EDTA çözeltisi ile her 100 mm çanak içinde hücre monolayers tedavi ve hücreleri resuspend.
  4. Bir hemasitometre hücreleri saymak ve 250.000 hücre/ml kültür ortamında hücre süspansiyon yoğunluğunu ayarlamak ve 500.000 hücreler kültür orta 2 mL için lisin kaplı de 6-şey plakaları ekleyin. Oksijen 5 hücrelerde kuluçkaya % CO2/95% hava atmosfer 24 h 37 ° C'de ve kültür orta DMEM ile penisilin veya streptomisin değiştirir.
  5. Bir 1,5 mL tüp transfection reaktif 20 µL DMEM 500 µL serum veya antibiyotik olmadan ile sulandırmak. Pipetting tarafından karışımı yavaşça ve 5 min için oda sıcaklığında bekletin.
  6. Bu arada, DMEM 250 µL her iki 1,5 mL tüpler içine pipet ve 1500 ng pLVX-EIP-YFPQL veya pLenti6P-SLC26A4, psPAX2, 1225 ng ve 375 ekleyin her pMD2.G ng. İki lentiviral plazmid yukarıda açıklanan21olmuştur. Karışımı yavaşça ve oda sıcaklığında 20 dk için kuluçkaya seyreltilmiş transfection reaktif 250 µL her plazmid tüp ekleyin.
  7. 20 dk sonra transfection reaktif ve plazmid kompleksleri 500 µL 1,5 mL tüplerde dropwise her kültür tabağına de adım 1.4 ve mix tabak ileri geri sallanan tarafından ekleyin. CO2 kuluçka için 12 h 37 ° C'de hücreler kuluçkaya.
  8. Orta ile 2.5 mL taze orta değiştirmek ve ek bir 48 saat için kuluçkaya. Sonra kültür plaka buz infektivite korumak için soğutulmuş lentivirus içeren şartına orta tutmak 5 min için yerleştirin.
  9. Lentiviruses içeren medya hasat ve 15 mL konik tüpler için transfer. 3000 x g 3 dk 4 ° C'de, santrifüj kapasitesi ve kayan HEK293T hücreleri süpernatant 0.4 µm, filtrasyon sayesinde kaldır.
  10. Lentiviruses 2 gün içinde kullanılmak üzere 4 ° C'de içeren medyayı depolamak. Daha sonra kullanmak üzere saklamak 200 µL aliquots −80 ° C.

2. nesil LN215-YFPQL ve LN215-ı− hücreleri tarafından lentiviral iletim

  1. 100 mm Kültür plakaları LN215 hücrelerde % 80 ile % 10 fetal Sığır serum (FBS) 100 U/mL penisilin ve yukarıda açıklandığı gibi 100 µg/mL streptomisin takıma DMEM confluency büyür.
    Not: Eğer ben-YFP-GJIC tahlil farklı hücre satırı kullanarak yapılır, uygun kültür aracı kullanın. LN215-YFPQLve LN215-ı- hücreleri Yonsei Üniversitesi Üniversite-Sanayi Vakfı tarafından sağlanan. Lütfen ilgili yazarına başvurun.
  2. Bir gün önce iletim, yıkama hücreleri iki kez PBS 10 mL ile % 0.25 tripsin-EDTA 3 dk. 37 ° C'de 2 mL ile tedavi 5 mL 10 mL gonore pipet ile kültür ortamının hücrelerde Resuspend ve 50. 000 hücre/ml yoğunluğu ayarlayın. 20.000 hücre medya 400 µL içinde her şey için tedavi hiçbir virüs denetimi, YFPQLve SLC26A4 hücreleri olarak 24-şey kültür plaka ekleyin.
  3. PLVX-EIP-YFPQL veya pLenti6P-SLC26A4 lentivirus ve taze kültür polybrene, 4 µg/mL nihai bir konsantrasyon ile takıma orta 1:1 karışımı 400 µL kültür orta değiştirerek, kuluçka 37 ° C'de 24 saat sonra iki kuyu transduce. Hiçbir virüs denetimler için kültür orta ile değiştirin.
  4. 15 h için 37 ° C'de hücreler kuluçkaya, lentiviruses içeren orta Aspire edin, taze kültür orta eklemek ve bir ek 72 h için hücreleri kuluçkaya.
    Dikkat: kültür lentivirus içeren orta Aspire edin veya taze büyüme orta dağıtmak lentivirus kuyular arasında kirlenmesini önlemek için yeni ip uçlarına ya da pipets her şey için kullanın.
  5. 3 dk. Resuspend için kültür orta 2 mL hücrelerde ve 2 µg/mL puromisindir ile altı-şey kültür tabak tabak her hücrelere de iki kez PBS 0.5 mL ile tripsin-EDTA 300 µL ile tedavi yıkama.
  6. Denetimdeki tüm hücreleri de ölünceye kadar 2 µg/mL puromisindir içeren medya hücrelerde Kültür (yuvarlak şekilli veya mikroskobu gözlenen yüzen), genellikle bir hafta sürer. Kültür puromisindir her geçen gün seçim döneminde içeren medya yenileyin. Eğer LN215 YFPQL veya LN215-ı- seçim tamamladı önce haline kültürler birleşmesi, 100 mm hücrelere plaka ve seçim adım 2,5 olduğu gibi devam transfer.

3. hazırlık tahlil için gerekli çözümleri

  1. 500 mL C-çözüm (10 mM HEPES, 140 mM NaCl, 10 mM glikoz, 5 mM KCl, 1 mM MgCl2ve 1 mM CaCl2) ve ben-çözüm (10 mM HEPES, 140 mM NaI, 10 mM glikoz, 5 mM KCl ve 1 mM CaCl2) 500 mL hazırlayın.
  2. 7.4 1 N NaOH ile her iki çözüm pH ayarlama, çözümler depolama için 0.4 µm, filtrations tarafından sterilize. 4 ° C'de 1 ay için saklayın. PH kullanmadan önce kontrol edin.

4. LN215-YFPQL ve LN215 kaplama-ben− hücreleri

  1. LN215-YFPQL ve LN215 kültür-ben 100 mm Levha ayrı ayrı kültür tayini için gerekli populasyonlarının reach için orta− hücrelerde. LN215-YFPQL ve LN215-ı− hücreleri % 40 ve %80 confluency 100 mm plakalar içinde sırasıyla, 96-şey plaka tahlil için yeterli bulunmaktadır.
  2. Daha önce ben-YFP GJIC tahlil iletken bir gün her 100 mm Kültür plaka 10 mL PBS ile yıkayın. Her plaka 2 mL % 0.25 tripsin-EDTA çözeltisi ile tedavi ve 37 ° C'de 5 dk. Resuspend için her plaka kültür orta ve 15 mL konik tüpler transfer 4 ml hücrelerde kuluçkaya.
  3. Hücreleri tarafından Santrifüjü 1000 x g 3 dk. atmak için de süpernatant cips ve her hücre Pelet kültür orta 5 mL ile resuspend. Aşağı yukarı 10 mL serolojik pipet ile yaklaşık 20 kat pipetting tarafından herhangi bir hücre kümeleri tek hücreye bölün.
  4. Bir hemasitometre hücreleri saymak ve hücre süspansiyonlar LN215-YFPQL 80.000 hücre/mL, ve LN215 yapmak için kültür orta hücrelerde seyreltik-ben− 160.000 hücre/mL.
  5. 7 mL LN215-YFPQL ve 7 mL LN215 mix-ben− hücre süspansiyonlar bir rezervuar içinde. 100 µL karışımı bir çok kanallı pipet kullanarak bir 96-şey hücre kültür plaka her şey için ekleyin.
    Not: karma hücre süspansiyon yaklaşık 10 mL karışımı 100 µL 96-şey hücre plaka her kuyuya eklemek için gereklidir. Gerekenden daha fazla hücre süspansiyon yapmak için tavsiye edilir.
  6. Hücreleri kuluçkaya %5 CO2/95% hava 24 h 37 ° C'de nemlendirilmelidir. LN215-YFPQL ve LN215-ı−hücre kültürü-meli var olmak %100 birleşmesi ne zaman tahlil yapılır.

5. ı-YFP GJIC tahlil iletken

Not: 20 x büyütme ile floresan mikroskop ve 96-şey plakaları orada emin olmak için kontrol için GFP filtre hiçbir kümeleri LN215-YFPQL veya LN215-SLC26A4 hücreleri ve hücre kültürleri tamamen konfluent ve daha önce de dağıtılmış olan kullanım tahlil yürütmektedir.

  1. Tahlil yapmadan önce en az 30 dakika bir Mikroplaka açın ve 37 ° C'ye ayarlayın
  2. Bir otomatik enjektör 3 mL % 70 etanol, 3 mL distile su ve ben-çözüm 3 mL tüp 300 µL/s debi yıkayın.
  3. C - ve ben-çözümler su banyosu 37 ° C'de ısıtın.
    Not: her çözümün 100 µL 96-şey plaka her şey için gerektiğinde, yaklaşık 10 mL her çözüm her tahlil için gereklidir. Çözüm ek bir 10 mL her plaka (Toplam 20 mL) astar için gereklidir ve bir ek 25 mL C çözümün her plaka (Toplam 35 mL) Yıkama için gereklidir.
  4. Büyüme orta Aspire edin veya boşaltıncaya kalıbı ters çevirme; kalan orta dokunun.
    Not: Artık fetal Sığır serum büyüme medya tahlil kalitesinde arka plan floresans ve bir düşüş neden olur.
  5. C-çözüm 200 µL her şey için çok kanallı pipet kullanarak bir rezervuar ekleyin. C-çözüm Aspire edin veya boş ve kalıntı çözüm dokunun kalıbı ters çevir.
  6. 50 µL µL eklemek C-çözüm, 2.5 mM kimyasal stokunun 1 µL (bkz. Tablo 1) veya dimethylsulfoxide (DMSO) bir araç olarak ve o zaman 50 µL µL C-çözüm bir çok kanallı pipet ile her şey için.
    Not: Kimyasal kitaplığındaki çoğu reaktifler DMSO içinde çözülür ve en fazla %1 (v/v) çoğu hücre tabanlı deneyleri24saat içinde izin verilir. DMSO sudan daha yüksek yoğunluklu olduğu gibi DMSO içinde çözünmüş reaktifler hangi tahlil çözümleri konsantrasyonları rahatsız ediyor kültür plaka wells için eklendiğinde altına gitmek eğilimindedir. Bu sırada C-çözüm, DMSO reaktifler ve 50 µL C - çözümün 50 µL ekleyerek atlatılabilir. C-çözüm son 50 µL karıştırma için var.
  7. 37 ° C'de % 5 CO2değil, havada hücreleri kuluçkaya. Kuluçka süresi değiştirilebilir, ancak 10 dk iyon kanal modülatörler hareket genellikle yeterli olur.
  8. Kuluçka sırasında 1-çözüm her şey için 100 µL eklemesine Mikroplaka Okuyucu program ayarla s ve floresan 10 ölçmek için 0.4 s aralıklarla s. Floresans altından okumak için okuyucu ayarlayın. 135 µL/s. Set uyarma dalga boyu 485 nm ve okuma 520, emisyon için önerilen enjeksiyon hızıdır nm.
    Not: Mikroplaka Okuyucu programlar için ayrıntılı ayarları aşağıdaki gibidir.
    1. Yönet iletişim kuralları düğmesini tıklatın.
    2. Yeni düğmesini tıklatın. Floresan yoğunluğu ölçüm yöntemi bölüm ve De modu seçin okuma modu bölümü. Ardından, Tamam düğmesini tıklatın. Yeni sekme görüntülenir.
    3. Temel parametreler menüsünde uyarma dalga boyu 485 için ayarlanan nm ve emisyon, 520 nm. Floresans altından okumak için Alt optik seçin. Küme ölçüm başlangıç saati olmak "0 s", "25", sayısını basması şey, başı olmak aralıkları ve aralığı "20" olmak ve olmak için aralığı zaman sayı "0,4 s".
    4. Düzen menüsünde bölge plaka okumak için çizin.
    5. Konsantrasyonları/birimler/Shacking menüsünde Mikroplaka Okuyucu-çözüm her şey için 100 µL 135 µL/s enjeksiyon hızı ile enjekte etmek için ayarlayın.
      Not: içinde hücre dekolmanı sağladığından daha yüksek enjeksiyon hızları kaçının.
    6. Enjeksiyon zaman menüde 1 olarak enjeksiyon başlangıç zamanını ayarlamak s. Sonra Ölçüm Başlat düğmesini tıklatın.
  9. Kuluçka sonra Mikroplaka Okuyucu 96-şey tabak yerleştirin ve ölçüm Ölçüm Başlat düğmesini yeniden tıklatarak başlatın.

6. GJIC aktivite hesaplanması

  1. YFPQL Şoklama ve GJIC etkinliği23 olarak yüzdeleri hesaplamak
    YFPQL Şoklama (%) =Equation 1
    GJIC aktivite (%) =Equation 2
    Not: prensip olarak, GJIC faaliyet YFP floresan oranlarda farklılığı wells alıcısı hücreleri ve donör hücreleri ile üzerinden hesaplanması gerektiğini ve sadece ilgili alıcısı hücre kuyuları. Ancak, LN215-YFPQL önemsiz YFP iyodür tarafından 10'dan sonra Şoklama hücreleri gösterir s, biz yapmayız arka plan YFP dikkate LN215 YFPQL ve LN215 kullanarak HTS iletken zaman Şoklama-ı- hücreleri.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

29 96-şey kültür plakaları istimal belgili tanımlık LN215-YFPQL ve LN215-YFP GJIC tahlil tarafından roman GJIC modülatörler tanımlamak için 2,320 kimyasallar ekran için kullanılmıştır-ben− hücreleri. Temsil edici bir plaka ile elde edilen sonuçlar Şekil 2' de gösterilir. Her iyi YFP floresan yüzdesi Şekil 2A bir çizgi grafik olarak gösterilir ve her şey GJIC etkinlik yüzdesini Şekil 2Bçubuk grafiği gösterilir. Negatif ve pozitif denetimleri ve gösterildi 80 kimyasallar Tablo 1' de gösterilmiştir. Her şey için 10 dk. terbinafin tamamen GJIC inhibe ve GJIC yaklaşık % 50'si homosalate inhibe bir bileşik 25 µM ile tedavi edildi. Terbinafin GJ inhibitörü olarak teyit edildi. Onun doz-yanıt, reversibility ve diğer deneysel sonuçlar başka bir yerde23yayınlandı.

Figure 1
Resim 1 : Bileşenleri ve ben-YFP GJIC tahlil adımlardan (A) sarı ve koyu sarı beşgenler temsil alıcısı hücreleri YFPQL öncesi ve sonrası Şoklama ifade. Siyah beşgenler SLC26A4 ifade donör hücrelerdir. Mavi çubuklar GJs ve kırmızı çubuklar SLC26A4 taşıyıcılar. Pembe daireler iodides vardır. Ne zaman GJs (üst paneli) açık, iodides SLC26A4 geçmek ve donör hücre girin. İodides bitişik alıcısı hücreleri yoluyla için GJs. Iodides sertleştirme YFP floresan alıcısı hücrelerin göç eder. GJs (alt paneli) kapalıysa, donör hücreleri girerek iodides komşu alıcısı hücrelere hareket edemez ve yalnızca donör hücreleri içinde korunur. İodides (B) faz kontrast ve floresan görüntüleri ek bir ben-YFP-GJIC tahlil yaparken elde sonra YFP floresan alıcısı hücrelerinin önemli ölçüde azalır değil. Alıcısı ve donör hücreleri 1:1 oranında kaplama zaman iodides (üst paneli) eklenen sonra YFPQL Şoklama 1dk gözlendi. Ne zaman yalnızca alıcısı hücreleri kaplama, iyot tedavisi için 1 dk21Şoklama önemli YFPQL yol vermedi. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 2
Resim 2 : Temsilcisi HTS sonuç ben-YFP-GJIC tahlil kullanarak (A)süspansiyonlar, 1:2 karışımları LN215-YFPQL ve LN215-ı− hücreleri kaplama ve Bölüm 4 iletişim kuralında tanımlandığı gibi 24 saat inkübe. Hücreleri sonra yıkanmış ve araç veya iletişim kuralı Bölüm 5 olduğu gibi kimyasallar ile tedavi. Tüm kimyasallar DMSO 2.5 mM hisse senedi çözümlerinde 10 dk 25 µM örnekleri olarak denetlesinler. Her şey 1 µL DMSO ve C-çözeltinin 100 µL içeriyordu. Plaka ilk ve son satır (araç) negatif ve pozitif (carbenoxolone) denetimleri için ayrıldı. Kalan 80 wells Tablo 1' de listelenen kimyasallar ekran için kullanıldı. Tedaviden sonra ben-YFP-GJIC tahlil Protokolü olduğu gibi Bölüm 5 iyi iyi devam edilmiştir. Her iyi YFP floresan her zaman yüzdesi değerine 2 adlı normalleştirilmiş s ve zamana karşı çizilen. Şekildeki çizgiler içinde YFP floresan her iyi değişiklikleri gösterir. En iyi YFP floresan 10 s 70'den % için % 80'i arasında değişiyordu. GJ inhibitörleri (B) çubuk grafik gösterir için yüzde GJIC aktivite her 96 Wells terbinafin ve homosalate potansiyel sayısı... Yüzde GJIC faaliyet 6.1 protokolü adımda gösterildiği gibi hesaplanır ve iyi numaraları karşı bar grafikte çizilen. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

İyi No Pozisyon Kimyasal İyi No Pozisyon Kimyasal
1 A01 DMSO 49 E01 DMSO
2 A02 difloxacin hidroklorid 50 E02 propofol
3 A03 betametazon valerate 51 E03 oleandomycin fosfat
4 A04 Eritromisin 52 E04 mianserin hidroklorür
5 A05 siproheptadin hidroklorür 53 E05 valsartan
6 A06 Liothyronine 54 E06 salsalate
7 A07 teofilin 55 E07 hidrokortizon
8 A08 tolnaftate 56 E08 rifaximin
9 A09 trimethobenzamide hidroklorid 57 E09 adrenolone hidroklorid
10 A10 cefamandole nafate 58 E10 imiquimod
11 A11 Dimetil fumarat 59 E11 nonoxynol-9
12 A12 CBX 60 E12 CBX
13 B01 DMSO 61 F01 DMSO
14 B02 Pirasetam 62 F02 ranolazine
15 B03 Gluconolactone 63 F03 danthron
16 B04 azlocillin sodyum 64 F04 acedapsone
17 B05 Kolin klorür 65 F05 atomoxetine hidroklorid
18 B06 atorvastatin kalsiyum 66 F06 desoxycorticosterone asetat
19 B07 oxyphencyclimine hidroklorid 67 F07 tramadol hidroklorür
20 B08 propafenone hidroklorür 68 F08 Terbinafin hidroklorid
21 B09 flukonazol 69 F09 epilepsili
22 B10 Lovastatin 70 F10 gemifloxacin mesylate
23 B11 Bleomycin (gösterilen bleomycin b2) 71 F11 Doğum sodyum
24 B12 CBX 72 F12 CBX
25 C01 DMSO 73 G01 DMSO
26 C02 Asesülfam potasyum 74 G02 levalbuterol hidroklorid
27 C03 teniposide 75 G03 metformin hidroklorür
28 C04 tannik asit 76 G04 Pregabalin
29 C05 Carprofen 77 G05 Topotecan hidroklorid
30 C06 hydroxychloroquine sülfat 78 G06 phenoxybenzamine hidroklorid
31 C07 pentoxifylline 79 G07 Arecoline hydrobromide
32 C08 mepivacaine hidroklorid 80 G08 mepartricin
33 C09 nilutamide 81 G09 Pantoprazol
34 C10 aminolevulinik asit hidroklorür 82 G10 Loperamide hidroklorid
35 C11 Aniracetam 83 G11 podofilox
36 C12 CBX 84 G12 CBX
37 D01 DMSO 85 H01 DMSO
38 D02 metaxalone 86 H02 levodopa
39 D03 chloroguanide hidroklorid 87 H03 ethisterone
40 D04 klaritromisin 88 H04 enrofloksasin
41 D05 Modaline sülfat 89 H05 sparteine sülfat
42 İLAÇLAR D06 protirelin 90 H06 testosteron propiyonat
43 D07 theobromine 91 H07 pyridostigmine bromür
44 D08 rosiglitazone maleat 92 H08 enilconazole sülfat
45 D09 Losartan 93 H09 betametazon sodyum fosfat
46 D10 homosalate 94 H10 azaserine
47 D11 salicylanilide 95 H11 acrisorcin
48 D12 CBX 96 H12 CBX

Tablo 1. Bu çalışmada ekranlı kimyasallar listesi.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Sağlam, hızlı ve ucuz olduğu için ben-YFP-GJIC tahlil HTS için kullanılabilir. Bir HTS tahlil sağlam kabul edilir eğer Z'-0.525bir faktördür. Zhang ve ark. bkz: HTS deneyleri25uygunluğunun değerlendirilmesi için kullanılan istatistiksel analiz açıklaması için. LN215 hücreler kullanıldığında, Z'-faktör oldu > 0,5 olmadan herhangi bir tahlil en iyi duruma getirme. Diğer hücre tipleri tahlil ve onun Z kullanılan Eğer '-faktör < 0.5, sağlamlık geliştirilmiş olabilir tahlil saat21genişleterek. Bir Z elde etmek için LN215 ve HOS, insan osteosarkom hücreleri, hücre gerek sadece 10 s'-faktör > 0.521. Tahlil sadece alıcısı ve donör hücreleri, ben-çözüm ve C-çözüm gerektirir. LY ve calcein-AM gibi hiçbir ek reaktifler ihtiyaç vardır. Bu GJIC tahlil bir diğer avantajı bu düşük iyi arasında değişkenlik sonuçları bir tek şey, hücrelerde toplam GJIC etkinliğini ölçer var. Mikroenjeksiyon, photobleaching (sıkı bağlamak) ve ikili yama kelepçe deneyleri sonra boşluk-floresan kurtarma bölümü alanındaki bir hücreyi ölçümü önemli ölçüde etkileyebilir. Scrape yükleme deneyleri GJIC nispeten geniş bir alana değerlendirmek rağmen kazıma-yükleme yordamı önemli değişkenlik26tanıtabilirsiniz.

Ben-YFP-GJIC tahlil başarılı yürütülmesi için kritik adımları aşağıdaki gibidir. Bir C - ve ben-çözümler pH 7.4 her kullanımdan önce ayarlanması gerekir. YFPQL floresans kuvvetle pH yanı sıra halojenürlerden22tarafından etkilenir. İki çözüm arasında bir pH fark anormal değişiklik YFP floresan-çözüm ilavesi sonra yol açabilir. Donör ve alıcısı hücreleri tamamen kaplama önce ayrışmış olmalı. Donör veya alıcısı hücre kümeleri tahlil rahatsız. Karma kültür izdiham GJs oluşumu hücreler arasında en üst düzeye çıkarmak için % 100 olmalıdır. Alıcısı donör hücrelere oranını da Lee. ark tarafından açıklandığı gibi tahlil sonuçları etkiler 21. yalnızca alıcısı hücreleri YFP floresans gibi oranı ve alıcısı ve donör hücreleri düzenleme kolayca floresan mikroskop ile tahlil gerçekleştirmeden önce kontrol edilebilir. Araç veya kimyasallar ile tedavi öncesi kalan orta kaldırmak için C-çözüm ile ortak kültür yıkamak önemlidir. Kalan serum veya fenol red kültür orta arka plan floresan veya istenmeyen floresans içki bir kaynağı sırasıyla olabilir. Böylece ben-YFP-GJIC tahlil kesintiye uğratabilecek. Büyüme faktörleri içinde FBS mevcut Ayrıca GJIC27inhibe olabilir. Öte yandan, serum açlık sonunda apoptosis28tarafından kimyasal arıtma da hızlandırılabilir, yol açabilir. Tedavi ile en kimyasallar olmadan 10 min için serum C-çözümde 25 µM, ekranlı sonra deneyim, alıcısı ve donör hücreleri sağlıklı. Bazı kimyasallar 4 h için tedavi sonra bile zehirli değildi. Kimyasal toksisitesi değişir gibi tedavi daha uzun süre için gerekli olduğunda hücreleri durumu dikkatle denetlenmelidir. Hücreleri sağlıklı, değilseniz 1 içinde oluşur YFP floresan belirgin bir azalma-çözüm getirilmesi hücre dekolmanı neden olabilir sonra s. Bu mikroskobik gözlenmesi dahil tarafından teyit de.

Ben-YFP-GJIC assay olarak kullanılan hücre çeşitli gereksinimleri karşılamalı. Onlar GJs endogenously express veya forma GJs bağlı olmak. Cx43 oluşan kanalları atomik katyon ve anyon29için hemen hemen eşit geçirgen olduğu gibi iodides-YFP GJIC LN215 hücrelerde mevcut kanallardan geçirebilirsiniz. Cx kanalları ilgi hücrelerdeki düşük iyodür geçirgenliği ama özgürce difüzyon ve Ca2 +izin ben-YFP-GJIC tahlil mümkün olmayabilir. İyot alımını aktivitesi yokluğu bir gereksinimdir. Fonksiyonel anyon kanalları ve alımı iyodür hızla hızlı hücreler bu tahlil için uygun değildir. Hücre büyümesini başka bir gereksinimdir. Alıcısı ve donör hücreleri iletim YFPQL veya SLC26A4 ve puromisindir en az 1 hafta19seçimle ifade lentiviruses tarafından oluşturulur. Yavaş yavaş büyüyen veya büyüme birincil tetkikine gibi sınırlı hücreler bu tahlil için uygun değildir. Hücre plastik kültür eşya yüzeyine yapışma da önemlidir. Sıkıca, HEK293 hücreleri gibi uymayan hücreleri kolayca-çözüm giriş tarafından ayrılır. Bu kaplama önce PLL 96-şey plakaların kaplama tarafından üstesinden gelebilir. Ancak, kaplama plakaları bir sıkıcı adım, ve bu tür hücrelerin kaçınmak önerilir. Toksikolojik, fizyolojik olarak, ilke olarak, primer hücre astrocytes, hepatositlerin ve Lenfositi gibi vardır ve farmakolojik daha kanser hücreleri tümörü, hepatoma ve Bazal Hücre Karsinomu Hücre gibi daha alakalı. Ancak, kendi sınırlı büyüme oranları tahlil için uygunsuz onları. Yukarıdaki gereksinimleri karşılamak için uzun yaşam dönem, primer hücre oluşumunu sağlayan hücre kültüründe gelecekteki gelişmeler bu tahlil ile mümkün toksikolojik, psikolojik ve farmakolojik değerlendirmeler genişletmek.

Ben-YFP GJIC tahlil sadece HTS için aynı zamanda bir hücre tipi endogenously fonksiyonel GJs ifade olup olmadığını belirlemek için kullanılabilir. Hücreleri GJs varsa, YFPQL su verme oranı cocultured alıcısı gözlenen ve donör hücreleri yalnızca alıcısı hücreleri kaplama zaman gözlenen farklı olmaz. Su verme oranları önemli bir fark varsa, özgün hücrelerin fonksiyonel GJs hızlı. Olarak fark Şekil 2içindeAgösterildiği gibi zamanla artış eğilimi, bu tahlil kazıma-yükleme daha zayıf GJIC etkinlik tespit veya deneyleri boşluğu sıkı bağlamak için daha büyük bir duyarlılık vardır. Saat ders veri, doz-yanıt ilişkileri ve GJ modülatörler reversibility değerlendirme ı-YFP-GJIC tahlil23,30ile elde edilebilir. Cx ilgi ifade fonksiyonel GJs yoksun hücreye inducing ve alıcısı ve bağış üreten, ben-YFP belirli Cx-GJIC deneyleri kurulan23olabilir. Bu tahlil böylece Cx belirli bir tür bir kimyasal IC50 değerlerini belirlemek olanak sağlar.

Çoğu HTS deneyleri gibi ben-YFP-GJIC tahlil SLC26A4, YFPQLveya hücresel iyodür geçirgenliği değişikliklerden kaynaklanan yanlış pozitif sonuçlar üretebilir. Yanlış GJ inhibisyon SLC26A4 inhibisyonu veya YFPQL duyarsızlaştırma iyodür için neden olabileceğinden, her potansiyel GJ inhibitörü YFPQL ve SLC26A4 coexpress hücreleri kullanarak test edilmelidir. Potansiyel bir GJ önleyici bir SLC26A4 engelleyici veya YFP desensitizer ise, YFP Şoklama zayıflatılmış. Aksine, gerçek bir GJ inhibitörü YFP Şoklama etkilemez. Elektrofizyolojik yöntemleri veya saf YFPQL SLC26A4 blokerler ve YFP desensitizers arasında ayırt edebilirsiniz. YFP iyodür için duyarlı veya iyodür geçirgenliği anyon kanalları, Cx hemichannels, üzerinden veya spesifik olmayan toksik etkileri tarafından artırmak GJ aktivatörleri da yanlış pozitif sonuçlar verecektir. Potansiyel GJ harekete geçirmek ne zaman yalnızca alıcısı hücreleri kaplama YFP Şoklama geliştirmek olup olmadığını tespit edilmelidir. Daha sonra bir kimyasal YFPQL sensitizes veya iyodür geçirgenliği artar, alıcısı hücre kültürlerinde bağış olmadan YFPQL Şoklama artacak. Yanlış GJ aktivatörleri iki tür yükleme kazıma veya sıkı bağlamak veya saf YFPQL protein kullanma gibi diğer GJ deneyleri içinde ayrılır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar hiçbir ifşa etmek çıkar çatışması var.

Acknowledgments

Bu araştırma temel bilim araştırma programı aracılığıyla Ulusal Araştırma Vakfı, Kore (Eğitim Bakanlığı tarafından finanse edilen NMG) tarafından desteklenmiştir (2011-0023701, 2016R1D1A1A02937397 ve 2018R1A6A1A03023718).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
96-well plate SPL 30096
Calcium chloride (CaCl2) Sigma C5670 I-solution
D-(+)-Glucose Sigma G7021 C-solution, I-solution
Dimethyl sulfoxide (DMSO) sigma 276855
HEPES Sigma RES6003H-B7 C-solution, I-solution
Lipofectamine 2000 Invitrogen 11668-027 transfection reagent
Magnesium chloride hexahydrate (MgCl2 6H2O) Sigma M2393 C-solution
Microplate reader  BMG LabTech  POLARstar Omega 415-1618
pMD2.G  Addgene #12259
Polybrene sigma H9268
Poly-L-lysine solution sigma P4707
Potassium chloride (KCl) Sigma P5405 C-solution, I-solution
psPAX2  Addgene  #12260
Puromycin Dihydrochloride sigma P8833
Sodium chloride (NaCl) Sigma S5886 C-solution, I-solution
Sodium hyroxide (NaOH) Sigma S2770
Sodium Iodide (NaI) Sigma 383112 I-solution

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Goodenough, D. a, Goliger, J. a, Paul, D. L. Connexins, connexons, and Intercellular Communication. Annual Review of Biochemistry. 65, 475-502 (1996).
  2. Upham, B. L., Weis, L. M., Trosko, J. E. Modulated Gap Junctional Intercellular Communication as a Biomarker of PAH Epigenetic Toxicity: Structure-Function Relationship. Environmental Health Perspectives. 106, 975 (1998).
  3. U, J. E. T., Chang, C., Upham, B., Wilson, M. Epigenetic toxicology as toxicant-induced changes in intracellular signalling leading to altered gap junctional intercellular communication. Toxicology Letters. , 71-78 (1998).
  4. Yamasaki, H. Role of disrupted gap junctional intercellular communications in detection and characterization of carcinogens. Mutation Research - Reviews in Genetic Toxicology. , (1996).
  5. Yamasaki, H., et al. Gap junctional intercellular communication and cell proliferation during rat liver carcinogenesis. Environmental Health Perspectives. 101, suppl 5 191-197 (1993).
  6. Vinken, M., et al. Gap junctional intercellular communication as a target for liver toxicity and carcinogenicity. Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology. 44, 201-222 (2009).
  7. Fonseca, C. G., Green, C. R., Nicholson, L. F. B. Upregulation in astrocytic connexin 43 gap junction levels may exacerbate generalized seizures in mesial temporal lobe epilepsy. Brain Research. 929 (1), 105-116 (2002).
  8. Garbelli, R., et al. Expression of connexin 43 in the human epileptic and drug-resistant cerebral cortex. Neurology. 76 (10), 895-902 (2011).
  9. Schulz, R., et al. Connexin 43 is an emerging therapeutic target in ischemia/reperfusion injury, cardioprotection and neuroprotection. Pharmacology and Therapeutics. 153, 90-106 (2015).
  10. Sarrouilhe, D., Dejean, C., Mesnil, M. Involvement of gap junction channels in the pathophysiology of migraine with aura. Frontiers in Physiology. , (2014).
  11. Patel, S. J., et al. Gap junction inhibition prevents drug-induced liver toxicity and fulminant hepatic failure. Nature Biotechnology. 30 (2), 179-183 (2012).
  12. Kandyba, E. E., Hodgins, M. B., Martin, P. E. A murine living skin equivalent amenable to live-cell imaging: analysis of the roles of connexins in the epidermis. Journal of Investigative Dermatology. 128 (4), 1039-1049 (2008).
  13. Upham, B. L., et al. Differential roles of 2 , 6 , and 8 carbon ceramides on the modulation of gap junctional communication and apoptosis during carcinogenesis. Cancer Letters. 191, 27-34 (2003).
  14. Upham, B. L., et al. Structure-activity-dependent regulation of cell communication by perfluorinated fatty acids using in vivo and in vitro model systems. Environmental Health Perspectives. 117 (4), 545-551 (2009).
  15. Weis, L. M., et al. Bay or Baylike Regions of Polycyclic Aromatic Hydrocarbons Were Potent Inhibitors of Gap Intercellular Communication. Environmental Health Perspectives. 106 (1), 17-22 (1998).
  16. el-Fouly, M. H., Trosko, J. E., Chang, C. C. Scrape-Loading and Dye Transfer: A Rapid and Simple Technique to Study Gap Junctional Intercellular Communication. Experimental Cell Research. 168 (2), 422-430 (1987).
  17. Wade, M. H., Trosko, J. E., Schindler, M. Photobleaching Assay of Gap Junction- Mediated Communication Between Human Cells. Advancement of Science. 232 (4749), 525-528 (2010).
  18. Abbaci, M., et al. In vitro characterization of gap junctional intercellular communication by gap-FRAP technique. Proceedings of SPIE. , 585909 (2005).
  19. Neyton, J., Trautmann, A. Single-channel currents of an intercellular junction. Nature. 317 (6035), 331-335 (1985).
  20. Wilders, R., Jongsma, H. J. Limitations of the dual voltage clamp method in assaying conductance and kinetics of gap junction channels. Biophysical Journal. 63 (4), 942-953 (1992).
  21. Lee, J. Y., Choi, E. J., Lee, J. A new high-throughput screening-compatible gap junctional intercellular communication assay. BMC Biotechnology. 15 (1), 1-9 (2015).
  22. Galietta, L. J. V., Haggie, P. M., Verkman, A. S. Green fluorescent protein-based halide indicators with improved chloride and iodide affinities. FEBS Letters. 499 (3), 220-224 (2001).
  23. Lee, J. Y., Yoon, S. M., Choi, E. J., Lee, J. Terbinafine inhibits gap junctional intercellular communication. Toxicology and Applied Pharmacology. 307, 102-107 (2016).
  24. Hughes, J., Rees, S., Kalindjian, S., Philpott, K. Principles of early drug discovery. British Journal of Pharmacology. 162 (6), 1239-1249 (2011).
  25. Zhang, J. H., Chung, T. D. Y., Oldenburg, K. R. A simple statistical parameter for use in evaluation and validation of high throughput screening assays. Journal of Biomolecular Screening. 4 (2), 67-73 (1999).
  26. Upham, B. L. Role of Integrative Signaling Through Gap Junctions in Toxicology. Current Protocols in Toxicology. , (2011).
  27. Schalper, K. A., et al. Modulation of gap junction channels and hemichannels by growth factors. Molecular BioSystems. 8 (3), 685-698 (2012).
  28. Kulkarni, G. V., Mcculloch, C. A. G. Serum deprivation induces apoptotic cell death in a subset of Balb / c 3T3 fibroblasts. Journal of Cell Science. 1179, 1169-1179 (1994).
  29. Harris, A. L., Locke, D. Permeability of Connexin Channels. Connexins. , 165-206 (2009).
  30. Choi, E. J., Yeo, J. H., Yoon, S. M., Lee, J. Gambogic Acid and Its Analogs Inhibit Gap. Junctional Intercellular Communication. 9, 1-10 (2018).

Tags

Biyoloji sayı: 144 Gap junction gap junction hücreler arası iletişim connexin yüksek üretilen iş tarama Sarı floresan protein iyodür
Bir iyodür-Sarı floresan Protein-Gap Junction hücreler arası iletişim tahlil
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Yeo, J. H., Lee, J. An Iodide-Yellow … More

Yeo, J. H., Lee, J. An Iodide-Yellow Fluorescent Protein-Gap Junction-Intercellular Communication Assay. J. Vis. Exp. (144), e58966, doi:10.3791/58966 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter