Summary
Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll für eine neuartige Lücke Kreuzung interzelluläre Kommunikation Assay für den Hochdurchsatz-Screening von Lücke Kreuzung modulierende Chemikalien für die Arzneimittelforschung und toxikologische Bewertung entwickelt.
Abstract
GAP Junctions (GJs) sind Zellmembran-Kanäle, die Diffusion von Molekülen zwischen benachbarten Zellen kleiner als 1 kDa ermöglichen. Da sie physiologische und pathologische Rollen haben, braucht der Hochdurchsatz-screening (HTS) Assays, GJ-Modulatoren in Drug Discovery und Toxikologie Tests zu identifizieren. Ein neuartige Jodid-gelb fluoreszierende Protein-Gap Junction interzelluläre Kommunikation (I-YFP-GJIC) Assay erfüllt dieses Bedürfnis. Es ist eine zellbasierte Assays einschließlich Akzeptor und Spender-Zellen, die entwickelt sind, um stabil gelb fluoreszierenden Proteins (YFP) Variante, zum Ausdruck bringen deren Fluoreszenz sensibel von Jodid oder SLC26A4, ein Transporter Jodid bzw. gestillt ist. Wenn eine Mischkultur aus zwei Zelltypen Jodid hinzugefügt wird, sie betreten die Spenderzellen über den SLC26A4-Transporter und diffundieren zu den angrenzenden Akzeptor-Zellen über GJs wo sie die YFP Fluoreszenz zu stillen. YFP Fluoreszenz wird nun durch die nun in einem kinetischen Modus gemessen. Die YFP abschrecken Rate spiegelt GJ Aktivität. Der Test ist zuverlässig und schnell genug für HTS verwendet werden Das Protokoll für die e-YFP-GJIC-Assay mit LN215 Gliom menschliche Zellen, wird beschrieben.
Introduction
GAP Junctions (GJs) fungieren als interzelluläre Kanäle ermöglichen die Diffusion kleiner Moleküle von < 1 kDa wie Nährstoffe, Stoffwechselprodukte und Signalmoleküle zwischen benachbarten Zellen. Die Knoten Elemente sind mit einem Hemichannel oder Connexon in jede Zelle und jedes Connexon stellt sechs Connexine (Cxs)1. GJs und Cxs wurden in Toxikologie Tests von Karzinogenen wie polyzyklische aromatische Kohlenwasserstoffe (PAK), verwendet die GJ-Hemmer2,3,4sind. Gestörten GJIC wurde Nongenotoxic Karzinogenese5,6zugeordnet. Als eine mögliche therapeutische Ziel wurde GJ Beteiligung in bestimmte Subtypen der Anfälle7,8, Schutz von Herz und Gehirn Ischämie/Reperfusion Verletzungen9, Migräne mit Aura10berichtet, Arzneimittel-induzierte Leberschäden6,11und12der Wundheilung. Hochdurchsatz-screening (HTS) Tests sind erforderlich, GJ moduliert Chemikalien oder Antikörper für die Arzneimittelforschung für Toxikologie Assays zu identifizieren und zu neuartigen zelluläre Regulatoren des GJ Aktivität zu identifizieren. HTS-Assays können auch zur Untersuchung von Struktur-Aktivitäts-Beziehungen von GJ Modulatoren2,13,14,15.
Einige GJIC-Assays sind Dye Transfer oder dual Patch-Clamp-Techniken. Luzifer gelb CH (LY) und Calcein Acetoxymethyl Ester (Calcein-AM) wurden in Farbübertragungs-Tests verwendet. Zellen sind nicht durchlässig für LY, die durch Mikroinjektion, Schaben laden oder Elektroporation eingebracht wird. Einmal im Inneren der Zelle LY breitet sich in benachbarten Zellen über GJs und GJ Aktivität wird durch das Ausmaß der LY Migration16untersucht. Calcein-AM-Assays beinhalten in der Regel Lücke-Fluoreszenz Erholung nach Immunofluoreszenz17,18. Calcein-AM ist ein Zelle-permeationsfähigen Farbstoff, der durch eine intrinsische Esterase intrazellulär in undurchlässigen Calcein umgewandelt wird. Der Test erfordert ein confocal Mikroskop zu beobachten, die Übertragung von Calcein-AM in eine Zelle von diejenigen, die es nach Laser Immunofluoreszenz. Wenn funktionale GJs vorhanden sind, Calcein-AM in benachbarten Zellen tritt die Photobleached Zellen und die Fluoreszenz wird wiederhergestellt. GJ-Aktivität wird durch das Ausmaß der Fluoreszenz Erholung der Photobleached Zellen untersucht. Farbübertragungs-Assays sind mühsam und zeitaufwändig oder niedrige Empfindlichkeiten. Dual Patch spannen ist eine elektrophysiologische Methode, die Knoten Leitwert misst. Es ist relativ empfindlich, durch eine direkte Abhängigkeit der Leitfähigkeit die Anzahl der offenen GJs19; jedoch ist es technisch anspruchsvoll, zeitaufwendig und teuer20. Die e-YFP-GJIC-Assay wurde entwickelt für den Einsatz in HTS
Abbildung 1 zeigt die Komponenten und die Schritte des-YFP GJIC Assays, die Akzeptor-Zellen mit dem Ausdruck einer Iodid-Sensitive YFP Variante mit H148Q und I152L nutzt (YFPQL) und Spenderzellen mit dem Ausdruck einer Iodid-Transporter (SLC26A4)21 . Die beiden Mutationen durchführte, YFPQL ermöglichen abschrecken der Fluoreszenz von Iodid22. Jodide sind Co kultivierten Akzeptor und Spenderzellen hinzugefügt; Geben Sie nicht die Akzeptor-Zellen, sondern werden durch die vorliegenden SLC26A4-Transporter auf der Spenderzellen aufgegriffen. Jodide in die Spenderzellen diffundieren durch funktionierende GJs in angrenzenden Akzeptor Zellen, wo sie die YFPQL Fluoreszenz zu stillen. GJs sind geschlossen oder durch Inhibitoren blockiert, kann nicht Iodid der Akzeptor Körperzellen um die Fluoreszenz stillen gelangen. Die YFPQL abschrecken Rate spiegelt GJ Aktivität. Die Testverfahren YFP GJIC ist weder kompliziert noch zeitaufwändig. Es ist kompatibel mit HTS und kann verwendet werden, um die Auswirkungen einer großen Anzahl von Verbindungen auf GJ Aktivität in einem relativ kurzen Zeitraum zu testen. Es erfordert nur Akzeptor und Spenderzellen und zwei ausgewogene Salzlösungen. Das unten beschriebene Protokoll basiert auf LN215 Zellen, deren großen Cx Cx4321ist. LN215 und LN215-YFPQL Rezeptor-ich− Spenderzellen entstanden durch Transduktion mit Lentiviren YFPQL oder SLC26A421,23zum Ausdruck zu bringen.
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Protocol
1. Generation von Lentiviren YFPQL und SLC26A4 zum Ausdruck bringen
- Wachsen Sie, HEK293T menschlichen embryonalen Nierenzellen um 80 % confluency auf 100 mm Kultur Platten. Dulbeccos geändert Eagle Medium (DMEM) mit 10 % fötalen Rinderserum, 100 U/mL Penicillin und 100 µg/mL Streptomycin ergänzt wird das Kulturmedium im gesamten Protokoll verwendet, um HEK293T und andere Zellen, die unten genannten aufrechtzuerhalten.
- Mantel Kultur 6-Well-Platten durch Zugabe von 2 mL 0,005 % der sterilen Poly-L-Lysin (PLL) Lösung in jede Vertiefung für 10 min. Aspirieren der PLL-Lösung und spülen Sie die Fläche zweimal mit 2 mL sterilem Wasser.
- Waschen der HEK293T Zellen mit 10 mL von Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS) und die Zelle Monoschichten in jedes Gericht 100 mm mit 2 mL 0,25 % Trypsin-EDTA-Lösung bei 37 ° C für 3 Minuten fügen Sie 5 mL Kulturmedium zu behandeln und Aufschwemmen der Zellen.
- Zählen der Zellen in einem Hemocytometer und passen Sie die Dichte der Zellsuspension auf 250.000 Zellen/mL in Kulturmedium und 500.000 Zellen hinzufügen in 2 mL Kulturmedium jeweils Lysin auch der 6-Well-Platten beschichtet. Inkubieren Sie die Zellen in einem befeuchteten 5 % CO295 % Luft-Atmosphäre bei 37 ° C für 24 h und ersetzen Sie das Kulturmedium mit DMEM ohne Penicillin und Streptomycin.
- Verdünnen Sie in einer Röhre 1,5 mL 20 µL Transfection Reagens mit 500 µL DMEM ohne Serum oder Antibiotika. Mischen von pipettieren und 5 min bei Raumtemperatur stehen lassen.
- Unterdessen pipette 250 µL DMEM in jedes zwei 1,5 mL Rohre und fügen Sie dann 1500 ng pLVX-EIP-YFPQL oder pLenti6P-SLC26A4, 1225 ng von psPAX2 und 375 ng der pMD2.G zueinander. Die zwei Lentivirale Plasmide wurden zuvor beschriebenen21. Jedes Plasmid-Rohr 250 µL verdünnter Transfection Reagens hinzufügen, vorsichtig mischen und 20 min bei Raumtemperatur inkubieren.
- Fügen Sie nach 20 min 500 µL Transfection Reagens und Plasmid-komplexe in 1,5 mL-Tuben tropfenweise auf jede Kultur Platte gut in Schritt 1.4 und Mischen von der Platte hin und her schaukeln hinzu. Inkubieren Sie Zellen bei 37 ° C in einem CO-2 -Inkubator für 12 h.
- Ersetzen Sie das Medium mit 2,5 mL frisches Medium und weitere 48 h inkubieren. Dann legen Sie die Kultur-Platte auf Eis für 5 min die konditionierte Lentivirus gekühlt um Infektiosität beizubehalten-haltigem Medium zu halten.
- Das Medium mit Lentiviren ernten und transfer zum 15 mL konische Röhrchen. Bei 3.000 X g bei 4 ° C für 3 min Zentrifugieren Sie und entfernen Sie HEK293T Einzelfeldern des Überstands durch Filtration bei 0,4 µm.
- Speichern Sie das Medium mit Lentiviren bei 4 ° C für den Einsatz innerhalb von 2 Tagen. Für die spätere Verwendung speichern Sie 200 µL-Aliquots bei −80 ° C.
2. Generation der LN215-YFPQL und LN215-ich− Zellen durch Lentivirale Transduktion
- Wachsen Sie LN215 Zellen in Kultur-Platten von 100 mm bis zu 80 % confluency in DMEM mit 10 % fetalen bovine Serum (FBS) 100 U/mL Penicillin und 100 µg/mL Streptomycin wie oben beschrieben ergänzt.
Hinweis: Wenn der e-YFP-GJIC-Test erfolgt über eine andere Zelle her, verwenden Sie die entsprechenden Kulturmedium. LN215-YFPQLund LN215-ich– Zellen zur Verfügung gestellt von der University-Industry Foundation, Yonsei Universität. Kontaktieren Sie bitte den entsprechenden Autoren. - Einen Tag vor Transduktion, Waschen der Zellen mit 2 mL 0,25 % Trypsin-EDTA bei 37 ° C für 3 min. zweimal mit 10 mL PBS, behandeln die Zellen in 5 mL Kulturmedium mit einer serologischen 10 mL-Pipette Aufschwemmen und passen Sie die Dichte bis 50.000 Zellen/mL. Fügen Sie 20.000 Zellen in 400 µL der Medien, in jede Vertiefung einer 24-Well-Kultur-Platte für die Behandlung als kein Virus Control, YFPQLund SLC26A4 Zellen.
- Transduzieren Sie nach 24 h Inkubation bei 37 ° C zwei Brunnen indem das Kulturmedium mit 400 µL einer 1:1 Mischung aus pLVX-EIP-YFPQL oder pLenti6P-SLC26A4-Lentivirus und frischen Kulturmedium mit Polybrene auf eine Endkonzentration von 4 µg/mL ergänzt. Ersetzen Sie für keine Virus-Steuerelemente mit Nährmedium.
- Inkubieren Sie die Zellen bei 37 ° C für 15 h, aspirieren Sie Lentiviren-haltigem Medium fügen Sie frischen Kulturmedium hinzu und inkubieren Sie die Zellen für weitere 72 h.
Achtung: Um Lentivirus zwischen Brunnen zu vermeiden, verwenden Sie neue Tipps oder Mehrkanalpipette für jedes gut beim Aspirieren Kulturmedium mit Lentivirus oder frische Wachstumsmedium zu verzichten. - Wäsche, die die Zellen in jedem gut zweimal mit 0,5 mL PBS, mit 300 µL Trypsin-EDTA zu behandeln, für 3 min. aufzuwirbeln, die Zellen in 2 mL Kulturmedium und Platte in sechs Brunnen Kultur Platten mit 2 µg/mL Puromycin.
- Kulturzellen in Medien mit 2 µg/mL Puromycin, bis alle Zellen im Steuerelement nun tot sind (rundes oder schwimmende, wenn Sie im Mikroskop beobachtet), die in der Regel dauert eine Woche. Aktualisieren Sie die Nährmedien mit Puromycin täglich während den Selektionszeitraum. Wenn LN215-YFPQL oder LN215-ich– Zusammenfluss der Kulturen werden vor Auswahl abgeschlossen ist, übertragen die Zellen bis zu 100 mm Platte und Auswahl wie im Schritt 2.5 weiter.
3. Vorbereitung der Lösungen für den assay
- 500 mL C-Lösung (10 mM HEPES, 140 mM NaCl, Glukose 10 mM, 5 mM KCl, 1 mM MgCl2und 1 mM CaCl2) und 500 mL Lösung (10 mM HEPES, 140 mM NaI, 10 mM Glukose, 5 mM KCl und 1 mM CaCl2) vorzubereiten.
- Stellen Sie den pH-Wert der beiden Lösungen auf 7,4 mit 1 N NaOH, Sterilisieren Sie die Lösungen von Filtrationen bei 0,4 µm für die Lagerung zu. Lagerung bei 4 ° C für bis zu 1 Monat. Kontrollieren Sie vor der Benutzung den pH-Wert.
(4) die LN215-YFPQL und LN215 Beschichtung-ich− Zellen
- Kultur LN215-YFPQL und LN215-ich− Zellen in 100 mm Platten separat in Kulturmedium, die Bevölkerung für Assay erforderliche zu erreichen. LN215-YFPQL und LN215-ich− Zellen in 40 % und 80 % Konfluenz in 100 mm Platten, bzw. sind ausreichend für eine 96-Well-Platte-Assay.
- Waschen Sie einen Tag vor der Durchführung der-YFP GJIC Assay, jede 100 mm-Kultur-Platte mit 10 mL PBS. Jede Platte mit 2 mL 0,25 % Trypsin-EDTA-Lösung zu behandeln und Inkubation bei 37 ° C für 5 min. Aufschwemmen der Zellen in jeder Platte in 4 mL Kulturmedium und Transfer zum 15 mL konische Röhrchen.
- Pellet-Zellen durch Zentrifugation bei 1.000 X g für 3 min. verwerfen des Überstands und jede Zelle Pellet mit 5 mL Kulturmedium aufzuwirbeln. Jede Zelle Klumpen in Einzelzellen von oben und unten ca. 20 Mal mit einer serologischen 10 mL-Pipette Pipettieren zerbrechen.
- Zählen der Zellen in einem Hemocytometer und verdünnen Sie die Zellen in das Kulturmedium Zellsuspensionen LN215-YFPQL bei 80.000 Zellen/mL und LN215 zu machen-ich− bei 160.000 Zellen/mL.
- 7 mL LN215-YFPQL und 7 mL LN215 mischen-ich− Zellsuspensionen in ein Reservoir. Jede Vertiefung einer 96-Well-Zelle-Kultur-Platte mit einer Mehrkanal-Pipette fügen Sie 100 µL der Mischung hinzu.
Hinweis: Um 100 µL des Gemisches in jede Vertiefung der Zellplatte 96-Well hinzuzufügen, wird etwa 10 mL gemischte Zellsuspension benötigt. Es wird empfohlen, mehr Zellsuspension als nötig zu machen. - Inkubieren Sie die Zellen in befeuchtet 5 % CO295 % Luft bei 37 ° C für 24 h. Die LN215-YFPQL und LN215-ich−Zellkultur sollte 100 % Zusammenfluss sein, wenn der Test durchgeführt wird.
(5) Durchführung von-YFP GJIC assay
Hinweis: Verwenden Sie ein Fluoreszenzmikroskop mit 20 X Vergrößerung und ein GLP-Filter 96-Well-Platten prüfen um sicher zu sein es keine Klumpen des LN215-YFPQL oder LN215-SLC26A4-Zellen und die Zellkulturen sind voll konfluierende und gut verteilte vor Durchführung des Tests.
- Mindestens 30 min vorher die Probe Einschalten einer Mikrotestplatte und auf 37 ° C.
- Waschen Sie das Rohr der automatisierten Injektor mit 3 mL 70 % igem Ethanol, 3 mL destilliertem Wasser und 3 mL Lösung bei einer Durchflussmenge von 300 µL/s.
- Erwärmen Sie die C - und ich-Lösungen auf 37 ° C im Wasserbad.
Hinweis: Bei Bedarf 100 µL jeder Lösung für jedes gut die 96-Well-Platte benötigt ca. 10 mL der jeweiligen Lösung für jedes Assay. Eine zusätzliche 10 mL der Lösung für jede Platte (insgesamt 20 mL) Grundierung erforderlich ist und eine zusätzliche 25 mL der C-Lösung wird zum Waschen jede Platte (insgesamt 35 mL) benötigt. - Aspirieren Sie das Wachstumsmedium oder invertieren Sie die Platte, um ihn zu entleeren; Tippen Sie auf, passives Medium.
Hinweis: Passives fötalen Rinderserum in den Wachstumsmedien verursacht Hintergrundfluoreszenz und einem Rückgang in Assay-Qualität. - Geben Sie 200 µL des C-Lösung in jeder aus einem Reservoir mit einer Mehrkanal-Pipette. Aspirieren Sie die C-Lösung oder umkehren Sie die Platte zu leeren und tippen Sie auf verbleibende Lösung.
- Fügen Sie 50 µL µL C-Lösung 1 µL 2,5 mM chemischen Lager (siehe Tabelle 1) oder Dimethylsulfoxide (DMSO) als Vehikel und dann 50 µL µL C-Lösung in jede Vertiefung mit einer Mehrkanal-Pipette.
Hinweis: Die meisten Reagenzien in einer chemischen Bibliothek sind in DMSO gelöst und bis zu 1 % (V/V) ist in den meisten zellbasierte Assays24zulässig. DMSO hat eine höhere Dichte als Wasser, tendenziell Reagenzien, die in DMSO gelöst sinken auf den Boden, wenn die Kultur Platte Brunnen hinzugefügt was die Konzentration der Assay-Lösungen stört. Dies kann umgangen werden, durch Zugabe von 50 µL der C-Lösung und Reagenzien in DMSO 50 µL C - Lösung in Ordnung. Die letzten 50 µL der C-Lösung ist für das Mischen. - Inkubation der Zellen bei 37 ° C in Luft, nicht in 5 % CO2. Die Inkubationszeit kann geändert werden, aber 10 min ist in der Regel ausreichend für Ionenkanal Modulatoren, zu handeln.
- Während der Inkubation, setzen die Mikrotestplatte Leseprogramm, 100 µL des ich-Lösung in jede Vertiefung 1 injizieren s und zur Messung der Fluoreszenz für 10 s 0,4 s Intervallen. Legen Sie den Leser Fluoreszenz von unten zu lesen. Die empfohlene Einspritzgeschwindigkeit ist 135 µL/s. Set die Erregung Wellenlänge 485 nm und lesen die Emission bei 520 nm.
Hinweis: Detaillierte Einstellungen für die Mikrotestplatte-Reader-Programme sind wie folgt.- Klicken Sie auf Protokolle verwalten .
- Klicken Sie auf die Schaltfläche neu . Wählen Sie die Fluoreszenz-Intensität in der Messstrecke Methode und Gut-Modus in der Lesung Abschnitt Modus. Klicken Sie auf die Schaltfläche " OK ". Neue Registerkarte wird angezeigt.
- Im Menü Grundparameter eingestellt die Erregung Wellenlänge auf 485 nm und die Emission bei 520 nm. Wählen Sie aus der Unteren Optic Fluoreszenz von unten zu lesen. Eingestellten Messung Startzeit sein "0 s", Anzahl der Intervalle zu "25", Anzahl der Blitze pro Bohrloch, und Intervall "20" sein und Intervallzeit sein "0,4 s".
- Zeichnen Sie im Menü Layout Region der Platte gelesen werden.
- Im Menü Konzentrationen/Volumes/Shacking einstellen des Mikrotestplatte Lesers 100 µL des ich-Lösung in jede Vertiefung mit 135 µL/s Einspritzgeschwindigkeit zu injizieren.
Hinweis: Vermeiden Sie schnellere Einspritzgeschwindigkeiten, weil sie in Ablösung der Zellen führen können. - Im Menü Einspritzzeit legen die Injektion Startzeit 1 s. Klicken Sie auf die Schaltfläche " Messung starten ".
- Nach der Inkubation der 96-Well-Platten in der Mikrotestplatte Leser und starten Sie die Messung durch nochmaliges Klicken Starten Messtaste.
6. Berechnung der GJIC-Aktivität
- Berechnen Sie die Prozentsätze der YFPQL abschrecken und GJIC Tätigkeit als23
YFPQL abschrecken (%) =
GJIC Aktivität (%) =
Hinweis: Im Prinzip GJIC Aktivität berechnet werden soll aus der Differenz der Prozentsätze der YFP Fluoreszenz in Brunnen mit Akzeptor und Spenderzellen und die entsprechende Akzeptor-Zelle nur Brunnen. Als LN215-YFPQL Zellen zeigen jedoch vernachlässigbar YFP abschrecken von Jodid nach 10 s, wir nehmen Sie nicht den Hintergrund YFP abschrecken zu berücksichtigen bei der Durchführung von HTS mit LN215-YFPQL und LN215-ich– Zellen.
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Representative Results
Neunundzwanzig Kultur 96-Well Platten dienten 2.320 Chemikalien um neuartige GJIC Modulatoren identifizieren den Bildschirm-YFP GJIC Assay unter Verwendung der LN215-YFPQL und LN215-ich− Zellen. Mit einem repräsentativen Teller erzielten Ergebnisse sind in Abbildung 2dargestellt. Der Anteil der YFP Fluoreszenz in jede Vertiefung ist als Liniendiagramm in Abbildung 2A und der Prozentsatz der GJIC Aktivität in jede Vertiefung ist in das Balkendiagramm in Abbildung 2Bangezeigt. Die negativen und positiven Kontrollen und die 80 Chemikalien, die gezeigt wurden, sind in Tabelle 1dargestellt. Jeder war gut mit 25 µM einer Verbindung behandelt, für 10 min. Terbinafin vollständig GJIC gehemmt und Homosalate, etwa 50 % der GJIC gehemmt. Terbinafin wurde als GJ-Inhibitor bestätigt. Die Dosis-Wirkungs-, Reversibilität und anderen experimentellen Ergebnisse wurden an anderer Stelle23veröffentlicht.
Abbildung 1 : Die Komponenten und Schritte-YFP GJIC Assay (A) den gelb und dunkel gelb Fünfecke repräsentieren Akzeptor Zellen mit dem Ausdruck YFPQL , vor und nach dem abschrecken. Die schwarzen Fünfecken sind Spenderzellen mit dem Ausdruck SLC26A4. Die blauen Balken GJs und die roten Balken sind SLC26A4 Transporter. Die rosa Kreise sind Jodide. Wenn das GJs sind (obere Abdeckung) zu öffnen, Jodide SLC26A4 durchlaufen und die Spender Zelle eindringen. Jodide Wandern in benachbarte Akzeptor Zellen über GJs. Jodide Quench YFP Fluoreszenz der Akzeptor Zellen. Wenn das GJs (untere Leiste) geschlossen sind, Jodide betreten die Spenderzellen nicht zu den benachbarten Akzeptor-Zellen bewegen, und werden nur in die Spenderzellen beibehalten. Die YFP Fluoreszenz der Akzeptor-Zellen ist nicht wesentlich verringert, nach die Zugabe von Jodide (B) Phasenkontrast und fluoreszierende Bilder erhält man, wenn einen e-YFP-GJIC-Test zu tun. Als Akzeptor und Spenderzellen in einem Verhältnis von 1:1 überzogen waren, wurde YFPQL abschrecken 1 min beobachtet, nachdem die Jodide (obere Abdeckung) hinzugefügt wurden. Wenn nur Akzeptor Zellen überzogen waren, führten Jodid Behandlung für 1 min nicht zu signifikanten YFPQL 21abschrecken. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2 : Vertreter HTS ergibt sich mit der e-YFP-GJIC-Test (A) Suspensionen von 1:2 Mischungen aus LN215-YFPQL und LN215-ich− Zellen waren vergoldet und für 24 h inkubiert, wie im Protokoll Abschnitt 4 beschrieben. Zellen wurden dann gewaschen und mit Fahrzeug oder Chemikalien wie in Abschnitt 5 Protokoll behandelt. Alle Chemikalien wurden als 25 µM Proben von 2,5 mM auf Lagerlösungen in DMSO für 10 min geprüft. Auch enthalten jeweils 1 µL DMSO und 100 µL der C-Lösung. Die ersten und letzten Zeilen der Platte waren negativ (Fahrzeug) und positiv (Carbenoxolon) Steuerelemente zugeordnet. Die restlichen 80 Brunnen dienten in Tabelle 1aufgeführten Chemikalien auf den Bildschirm. Nach der Behandlung wurde die e-YFP-GJIC-Assay Brunnen von Brunnen wie in Abschnitt 5 Protokoll durchgeführt. Der Anteil der YFP Fluoreszenz in jede Vertiefung zu jeder Zeit war normiert auf den Wert 2 s und gegen die Zeit aufgetragen. Die Linien in der Abbildung stellen die Änderungen YFP Fluoreszenz in jede Vertiefung dar. Die YFP Fluoreszenz in den meisten gut bei 10 s zwischen 70 % und 80 %. Terbinafin und Homosalate waren potenzielle Hits für GJ-Inhibitoren (B) das Balkendiagramm zeigt die prozentuale GJIC Aktivität jedes der 96 Kavitäten. Die prozentuale GJIC Aktivität wurde berechnet, wie im Protokoll Schritt 6.1 dargestellt und geplottet im Balkendiagramm gegen die gut zahlen. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
| Nun, nein. | Position | Chemische | Nun, nein. | Position | Chemische |
| 1 | A01 | DMSO | 49 | E01 | DMSO |
| 2 | A02 | Difloxacin Hydrochlorid | 50 | E02 | Propofol |
| 3 | A03 | Betamethason valerate | 51 | E03 | Oleandomycin Phosphat |
| 4 | A04 | Erythromycin | 52 | E04 | Mianserin-Hydrochlorid |
| 5 | A05 | Cyproheptadine Hydrochlorid | 53 | E05 | Valsartan |
| 6 | A06 | Liothyronine | 54 | E06 | salsalate |
| 7 | A07 | Theophyllin | 55 | E07 | Hydrocortison |
| 8 | A08 | tolnaftate | 56 | E08 | Rifaximin |
| 9 | A09 | Trimethobenzamide Hydrochlorid | 57 | E09 | Adrenolone Hydrochlorid |
| 10 | A10 | Cefamandole nafate | 58 | E10 | Imiquimod |
| 11 | A11 | Dimethyl Fumarat | 59 | E11 | Nonoxynol-9 |
| 12 | A12 | CBX | 60 | E12 | CBX |
| 13 | B01 | DMSO | 61 | F01 | DMSO |
| 14 | B02 | Piracetam | 62 | F02 | Ranolazin |
| 15 | B03 | Glukonolakton | 63 | F03 | danthron |
| 16 | B04 | Azlocillin Natrium | 64 | F04 | acedapsone |
| 17 | B05 | Cholinchlorid | 65 | F05 | Atomoxetin Hydrochlorid |
| 18 | B06 | Atorvastatin Kalzium | 66 | F06 | Desoxycorticosterone Acetat |
| 19 | B07 | Oxyphencyclimine Hydrochlorid | 67 | F07 | Tramadol Hydrochlorid |
| 20 | B08 | Propafenon-Hydrochlorid | 68 | F08 | Terbinafin Hydrochlorid |
| 21 | B09 | Fluconazol | 69 | F09 | Topiramat |
| 22 | B10 | Lovastatin | 70 | F10 | Gemifloxacin mesylate |
| 23 | B11 | Bleomycin (Bleomycin b2 angezeigt) | 71 | F11 | Pravastatin-Natrium |
| 24 | B12 | CBX | 72 | F12 | CBX |
| 25 | C01 | DMSO | 73 | G01 | DMSO |
| 26 | C02 | Acesulfam Kalium | 74 | G02 | Levalbuterol Hydrochlorid |
| 27 | C03 | teniposide | 75 | G03 | Metformin-Hydrochlorid |
| 28 | C04 | Gerbsäure | 76 | G04 | médicaments |
| 29 | C05 | Carprofen | 77 | G05 | Topotecan Hydrochlorid |
| 30 | C06 | Hydroxychloroquin-Sulfat | 78 | G06 | Phenoxybenzamine hydrochloride |
| 31 | C07 | Pentoxifyllin | 79 | G07 | Arecoline hydrobromide |
| 32 | C08 | Mepivacain Hydrochlorid | 80 | G08 | mepartricin |
| 33 | C09 | nilutamide | 81 | G09 | Pantoprazol |
| 34 | C10 | Aminolevulinic Säure Hydrochlorid | 82 | G10 | Loperamid Hydrochlorid |
| 35 | C11 | Aniracetam | 83 | G11 | Podofilox |
| 36 | C12 | CBX | 84 | G12 | CBX |
| 37 | D01 | DMSO | 85 | H01 | DMSO |
| 38 | D02 | metaxalone | 86 | H02 | Levodopa |
| 39 | D03 | Chloroguanide Hydrochlorid | 87 | H03 | ethisterone |
| 40 | D04 | Clarithromycin | 88 | H04 | Enrofloxacin |
| 41 | D05 | Modaline Sulfat | 89 | H05 | Sparteine Sulfat |
| 42 | D06 | protirelin | 90 | H06 | Testosteronpropionat |
| 43 | D07 | Theobromin | 91 | H07 | Pyridostigmine bromide |
| 44 | D08 | Rosiglitazon-Maleat | 92 | H08 | Enilconazole Sulfat |
| 45 | D09 | Losartan | 93 | H09 | Betamethason Natriumphosphat |
| 46 | D10 | homosalate | 94 | H10 | azaserine |
| 47 | D11 | salicylanilide | 95 | H11 | acrisorcin |
| 48 | D12 | CBX | 96 | H12 | CBX |
Tabelle 1. Liste der Chemikalien, die in dieser Studie gezeigt.
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Discussion
E-YFP-GJIC-Assay kann für HTS verwendet werden, denn es robust, schnell und preiswert ist. Ein HTS Assay gilt als robust wenn die Z'-Faktor ist über 0,525. Siehe Zhang Et Al. für eine Beschreibung der statistischen Analyse zur Beurteilung der Eignung von HTS-Assays25. Wenn LN215 Zellen verwendet wurden, die Z'-Faktor war > 0,5 ohne jede Assay-Optimierung. Wenn andere Zelltypen in der Test und seine Z verwendet werden "-Faktor ist < 0,5, die Robustheit durch die Verlängerung der Probe Zeit21verbessert werden kann. LN215 und HOS, menschlichen Osteosarkom Zellen, Zellen müssen nur 10 s eine Z zu erhalten "-Faktor > 0,521. Der Test erfordert nur Akzeptor und Spender-Zellen, die Lösung und die C-Lösung. Keine zusätzliche Reagenzien, wie LY und Calcein-AM sind erforderlich. Ein weiterer Vorteil dieser GJIC-Assay ist, dass er die GJIC Aktivität der Zellen in einem einzigen Brunnen misst führt zu niedrigen zwischen gut Variabilität. Mikroinjektion, Spalt-Fluoreszenz Erholung nach Immunofluoreszenz (FRAP) und dual Patch-Clamp-Assays kann eine Zelle im definierten Bereich die Messung erheblich beeinträchtigen. Obwohl Schaben laden Assays GJIC über einen relativ großen Bereich bewerten, kann die Schaben Ladevorgang erhebliche Variabilität26einführen.
Die entscheidenden Schritte für die erfolgreiche Durchführung des e-YFP-GJIC-Assays sind wie folgt. Der pH-Wert von der C - und ich-Lösungen muss auf 7,4 vor jedem Gebrauch angepasst werden. YFPQL Fluoreszenz wird durch den pH-Wert sowie durch Halogenide22stark beeinflusst. Ein pH-Unterschied zwischen den beiden Lösungen kann zu abweichenden Änderung YFP Fluoreszenz nach Zugabe der Lösung führen. Der Donor und Akzeptor Zellen müssen vor der Beschichtung komplett getrennt werden. Klumpen von Spender oder Akzeptor Zellen stören den Assay. Zusammenfluss von der Mischkultur sollte 100 % Bildung von GJs zwischen Zellen zu maximieren. Das Verhältnis der Akzeptor, Spenderzellen wirkt sich auch auf die Untersuchungsergebnisse wie beschrieben von Lee Et al.. 21. da nur Akzeptor Zellen YFP Fluoreszenz haben, das Verhältnis und die Anordnung der Akzeptor und Spender-Zellen können leicht überprüft werden mit dem Fluoreszenzmikroskop vor der Durchführung des Tests. Es ist wichtig, waschen Sie die Kokultur mit C-Lösung für passives Medium vor der Behandlung mit Fahrzeug oder Chemikalien zu entfernen. Verbleibende Serum oder Phenol rot aus dem Kulturmedium möglicherweise eine Quelle der Hintergrundfluoreszenz oder eine unerwünschte Fluoreszenz Quencher, beziehungsweise. Sie können somit die e-YFP-GJIC-Assay unterbrechen. Wachstumsfaktoren in der FBS vorhanden können auch GJIC27hemmen. Auf der anderen Seite kann Serum Hunger schließlich Apoptose28, führen, auch durch chemische Behandlung beschleunigt werden kann. Nach unserer Erfahrung waren die Akzeptor und Spender-Zellen gesund, nach der Behandlung durch die meisten Chemikalien bei 25 µM im C-Lösung ohne Serum für 10 min gezeigt. Einige Chemikalien wurden auch nach der Behandlung für 4 h nicht giftig. Da chemische Toxizität variiert, sollte der Zustand der Zellen sorgfältig überprüft werden, wenn die Behandlung über einen längeren Zeitraum erforderlich ist. Wenn die Zellen nicht gesund sind eine deutliche Reduktion der YFP Fluoreszenz, die innerhalb von 1 s nach Einführung der Lösung aus Zelle Ablösung führen kann. Bestätigt werden kann, dass durch mikroskopische Beobachtung der Beteiligten gut.
Die Zellen in der e-YFP-GJIC-Assay verwendet müssen mehrere Anforderungen erfüllen. Sie soll ausdrücken, GJs endogen oder Formular GJs induziert werden. Wie Kanäle, bestehend aus Cx43 fast ebenso durchlässig für atomare kationen und Anionen29sind, können durch die Kanäle in-YFP GJIC in den LN215 Zellen vorhanden Jodide migrieren. Wenn die Cx-Kanäle in den Zellen von Interesse niedrige Iodid Durchlässigkeit haben aber Diffusion von Ca2 +frei zulassen, kann die e-YFP-GJIC-Assay nicht möglich. Das Fehlen von Iodid-Aufnahme-Aktivität ist eine Voraussetzung. Die Zellen, die funktionelle Anion Kanäle und Aufnahme Iodid rasch ausdrücken eignen sich nicht für diesen Test. Zellwachstum ist eine weitere Voraussetzung. Die Akzeptor und Spender-Zellen entstehen durch Transduktion von Lentiviren YFPQL oder SLC26A4 und Auswahl mit Puromycin für mindestens 1 Woche19zum Ausdruck bringt. Zellen, die langsam wachsen, oder wenig Wachstum wie primäre Hepatozyten eignen sich nicht für diesen Test. Wichtig ist auch die Adhäsion der Zellen an die Oberfläche der Kunststoff Kultur Ware. Zellen, die nicht fest, wie z. B. HEK293 Zellen halten werden leicht durch die Einführung der Lösung getrennt. Dies kann überwunden werden durch die Beschichtung 96-Well-Platten mit PLL vor der Beschichtung. Jedoch Lackplatten ist ein mühsamer Schritt, und diese Art von Zellen zu vermeiden wird empfohlen. Primärzellen wie Astrozyten, Hepatozyten und Keratinozyten sind grundsätzlich toxikologisch, physiologisch und pharmakologisch relevanter als Krebszellen wie Gliom, Hepatom und Basalzell-Karzinom-Zellen. Ihre begrenzte Wachstumsraten machen sie jedoch ungeeignet für den Assay. Zukünftige Fortschritte in der Zellkultur, die Wachstum von Primärzellen zu ermöglichen, die den obigen für längere Zeiträume Anforderungen, würde die toxikologischen, physiologischen und pharmakologischen Bewertungen möglich mit dieser Assay erweitern.
YFP GJIC Assay kann verwendet werden, nicht nur für HTS, sondern auch zur Feststellung, ob ein Zelltyp endogen funktionale GJs drückt. Wenn die Zellen keinen GJs, die YFPQL abschrecken Rate beobachtet in cocultured Akzeptor und Spenderzellen wäre nicht anders als zu beobachten, wenn nur die Akzeptor-Zellen überzogen waren. Gäbe es ein signifikanten Unterschied in den Preisen abschrecken, äußern die Originalzellen funktionale GJs. Da der Unterschied mit der Zeit tendenziell wie in Abbildung 2Azu erhöhen, hat dieser Test eine größere Sensibilität für schwache GJIC Aktivität als kratzen-laden zu erkennen oder Lücke-FRAP Assays. Zeitdaten Kurs, Dosis-Wirkungs-Beziehungen und Beurteilung der Reversibilität der GJ Modulatoren erhalten Sie mit dem e-YFP-GJIC Assay23,30. Durch induzieren die Expression von Cx von Interesse in die Zellen frei von funktionalen GJs und generieren dann Akzeptoren und Spender können-YFP bestimmten Cx-GJIC-Assays etablierten23sein. Dieser Assay ermöglicht somit die IC50-Werte einer Chemikalie auf eine bestimmte Art von Cx bestimmen.
Wie die meisten HTS-Assays kann die e-YFP-GJIC-Assay falsch positive Ergebnisse, die aufgrund von Änderungen in SLC26A4, YFPQLoder zellulären Jodid Durchlässigkeit produzieren. Da falsche GJ Hemmung von Hemmung des SLC26A4 oder Desensibilisierung der YFPQL Jodid führen kann, sollte jeder potenzielle GJ-Inhibitor mit Zellen, die YFPQL und SLC26A4 coexpress getestet werden. Ist ein potenzieller GJ-Hemmer eine SLC26A4-Blocker oder eine YFP Desensitizer, wird YFP abschrecken abgeschwächt. Im Gegenteil, wirkt ein wahre GJ-Inhibitor YFP abschrecken nicht. Elektrophysiologische Methoden oder gereinigte YFPQL kann zwischen SLC26A4-Blocker und YFP Desensitizers unterscheiden. GJ-Aktivatoren, die YFP, Jodid zu sensibilisieren oder Jodid Durchlässigkeit Anion Dienstweg, Cx Hemichannels, oder durch unspezifische toxische Wirkung zu erhöhen geben auch falsch-positive Ergebnisse. Es sollte festgestellt werden, ob mögliche GJ Aktivatoren verbessern YFP abschrecken, wenn nur Akzeptor Zellen überzogen sind. Wenn eine chemische YFPQL sensibilisiert oder Jodid Durchlässigkeit erhöht, dann erhöht sich YFPQL abschrecken in Akzeptor Zellkulturen ohne Geber. Die zwei Arten von falschen GJ Aktivatoren können in andere GJ-Assays, wie Schaben laden oder FRAP oder mit gereinigten YFPQL Protein unterschieden werden.
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Disclosures
Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenlegen.
Acknowledgments
Diese Forschung wurde unterstützt durch das grundlegende Wissenschaft Forschungsprogramm durch die National Research Foundation von Korea (NRF) finanziert durch das Ministerium für Bildung (2011-0023701, 2016R1D1A1A02937397 und 2018R1A6A1A03023718).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96-well plate | SPL | 30096 | |
| Calcium chloride (CaCl2) | Sigma | C5670 | I-solution |
| D-(+)-Glucose | Sigma | G7021 | C-solution, I-solution |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | sigma | 276855 | |
| HEPES | Sigma | RES6003H-B7 | C-solution, I-solution |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668-027 | transfection reagent |
| Magnesium chloride hexahydrate (MgCl2 6H2O) | Sigma | M2393 | C-solution |
| Microplate reader | BMG LabTech | POLARstar Omega 415-1618 | |
| pMD2.G | Addgene | #12259 | |
| Polybrene | sigma | H9268 | |
| Poly-L-lysine solution | sigma | P4707 | |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma | P5405 | C-solution, I-solution |
| psPAX2 | Addgene | #12260 | |
| Puromycin Dihydrochloride | sigma | P8833 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma | S5886 | C-solution, I-solution |
| Sodium hyroxide (NaOH) | Sigma | S2770 | |
| Sodium Iodide (NaI) | Sigma | 383112 | I-solution |
References
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