Summary
여기, 우리 소설 간격 접속점 세포 통신 분석 결과 갭 정션 변조 화학 약물 발견 및 독성 평가의 높은 처리량 검열에 대 한 설계에 대 한 프로토콜을 제시.
Abstract
간격 접속점 (GJs)는 인접 한 셀 사이의 1 kDa 보다 작은 분자의 유포를 허용 하는 세포 막 채널. 그들은 생리 적 및 병 적인 역할을가지고, 약물 발견과 독물학 분석에서 글리제 변조기를 식별 하기 위해 높은 처리량 검열 (HTS) 분석 실험의 필요가 있다. 소설 요오드 화물-노랑 형광 단백질-간격 접속점 세포 통신 (난-YFP-GJIC) 분석 결과 수행이 필요 합니다. 그것은 안정적으로 노란 형광 성 단백질 (YFP) 변종, 그 형광은 요오드 화물, 또는 요오드 화물 운송업 자 SLC26A4 각각 침묵 민감하게 표현 하 설계는 기증자와 수락자 셀을 포함 하 여 세포 기반 분석 결과. 요오드 화물을 혼합된 문화는 두 종류의 세포에 추가 될 때 그들은 SLC26A4 전송 통해 기증자 세포를 입력 하 고 어디 그들이 YFP 형광 담금질 GJs 통해 인접 수락자 셀에 확산. YFP 형광 운동 모드에서 잘에 의해 잘 측정 된다. YFP 냉각 속도 글리제 활동을 반영합니다. 분석 결과 신뢰성과 HTS.에 사용 될 만큼 빠른 인간의 glioma 세포, LN215 세포를 사용 하 여 YFP-GJIC 분석 결과 대 한 프로토콜을 설명 합니다.
Introduction
간격 접속점 (GJs) 역할의 작은 분자의 확산을 허용 하도록 작성 채널 < 영양소, 대사 산물, 등 인접 한 셀 사이의 신호 분자 1 kDa. 접합 요소는 각 셀에 hemichannel 또는 connexon 포함 하 고 각 connexon 구성 6 connexins (Cxs)1. GJs 및 Cxs 글리제 억제제2,,34인 내는 다 환 방향족 탄화수소 (PAH) 등 발암 물질의 독성 분석 실험에 사용 되었습니다. 교란된 GJIC nongenotoxic 발암5,6와 연결 되었습니다. 잠재적인 치료 대상으로 GJ 참여 발작7,8, 심장 및 뇌 허 혈/reperfusion 상해9, 오 라10, 편두통에서에서 보호의 특정 하위에서 보고 되었습니다. 약물 유발 간 부상6,11, 그리고 상처 치유12. 높은 처리량 검열 (HTS) 분석 실험은 글리제 변조 화학 물질이 나 독성 분석 실험에 대 한 약물 발견에 대 한 항 체를 식별 하 고 글리제 활동의 소설 셀룰러 레 귤 레이 터를 식별 하기 위해 필요 합니다. HTS 분석 또한 글리제 변조기2,13,,1415의 구조 활동 관계를 조사 하기 위해 사용할 수 있습니다.
일부 GJIC 분석 실험 염료 전송 또는 듀얼 패치 클램프 기술 포함. 루시퍼 노란색 채널 (LY)와 calcein acetoxymethyl 에스테 르 (calcein-오전) 염료 전송 분석 실험에 사용 되었습니다. 셀 정, microinjection, 로드, 흠집이 나 electroporation에 의해 도입에 융 화 되지 않습니다. 일단 셀 안에 서둘러 이웃 셀 통해 GJs에 확산 하 고 글리제 활동 LY 마이그레이션16의 범위에 의해 분석 키를 누릅니다. Calcein 오전 분석 실험은 일반적으로 photobleaching17,18후 갭 형광 복구를 포함 한다. Calcein 오전은 침으로 스며들 지 않는 calcein에 의해 변환 본질적인 esterase 셀 permeant 염료 이다. 분석 결과 관찰 된 레이저 photobleaching 다음에서 셀에 calcein 오전의 전송 하는 confocal 현미경을 필요 합니다. 기능 GJs 존재 하는 경우 인접 한 셀에 calcein 오전 photobleached 세포를 입력 하 고 형광 복구 됩니다. 글리제 활동은 photobleached 셀의 형광 복구의 범위에 의해 분석 됩니다. 염료 전송 분석 힘들고 시간이 걸리는 또는 낮은 감도 있다. 이중 패치 클램핑 접합 계수 측정 electrophysiological 방법입니다. 그것은 상대적으로 민감한, 오픈 GJs19; 수에 전도성의 직접적인 의존 그러나, 그것은 기술적으로 요구, 시간이 소모 및 비싼20. YFP-GJIC 분석 결과 HTS.에 사용 하기 위해 개발 되었다
그림 1 에서는 구성 요소와 베어링 H148Q 및 I152L 요오드 화물-민감한 YFP variant를 표현 하는 수락자 셀을 이용 하는-YFP GJIC 분석 결과의 단계 (YFPQL) 및 기증자 세포는 요오드 화물 운송업 자 (SLC26A4) 표현21 . 두 돌연변이 YFPQL에 의해 수행 요오드 화22형광의 냉각 허용 합니다. Iodides 공동 경작된 수락자와 기증자 세포;에 추가 됩니다. 그들은 수락자 셀을 입력 하지 마십시오 하지만 기증자 세포에 존재 SLC26A4 전송기에 의해 채택 됩니다. Iodides 기증자 세포에서 인접 한 수락자 세포 어디 그들이 YFPQL 형광 담금질로 작동 GJs 통해 확산 한다. 만약 GJs 폐쇄 또는 억제제에 의해 차단, 요오드 화물 수락자 셀 형광 담금질을 입력할 수 없습니다. YFPQL 냉각 속도 글리제 활동을 반영합니다. YFP GJIC 분석 결과 절차는 복잡 하지도 않고 시간이 소요. HTS와 호환 이며, 상대적으로 짧은 기간에 글리제 활동에 많은 화합물의 효과 테스트 하는 데 사용할 수 있습니다. 수락자와 기증자 세포, 그리고 두 개의 균형된 소금 솔루션을 필요합니다. 아래에서 설명 하는 프로토콜의 주요 Cx는 Cx4321LN215 셀을 기반으로 합니다. LN215-YFPQL 수용 체 및 LN215-내가− 기증자 세포는 lentiviruses YFPQL 또는 SLC26A421,23표현으로 변환에 의해 생성 된.
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Protocol
1. YFPQL 와 SLC26A4는 lentiviruses 세대
- 100mm 문화 접시에 confluency 80 %HEK293T 인간 미 발달 신장 세포를 성장 한다. Dulbecco의 수정이 글 중간 (DMEM) 10% 태아 둔감 한 혈 청, 100 U/mL 페니실린와 100 µ g/mL 스 보충은 HEK293T 아래에 언급 된 다른 셀을 유지 하기 위해 전체 프로토콜 사용 문화 매체 이다.
- 10 분에 대 한 각 잘을 멸 균 폴 리-L-리 신 (PLL) 솔루션의 0.005%의 2 개 mL를 추가 하 여 코트 6-잘 배양 배지 PLL 솔루션을 발음 하 고 표면 살 균 물 2 mL로 두 번 씻어.
- 워시는 HEK293T 셀 10 mL의 인산 염과 식 염 수 (PBS)를 버퍼링 문화 매체의 3 분 추가 5 mL에 대 한 37 ° C에서의 0.25% trypsin EDTA 용액 2 mL와 함께 각 100 mm 접시에 셀 monolayers를 치료 하 고 셀 resuspend.
- hemocytometer에 셀 문화 매체에 250, 000 셀/mL로 세포 현 탁 액의 밀도 조정 하 고 lysine 코팅 6 잘 플레이트의 각 문화 매체의 2 mL에 500000 셀을 추가. 습도 5 셀을 품 어 % CO2/95 %24 h에 대 한 37 ° C에서 공기와 다음 페니실린 이나 스 없이 DMEM 문화 매체를 바꿉니다.
- 1.5 mL 튜브에 20 µ L transfection 시 약의 혈 청 또는 항생제 없이 DMEM의 500 µ L로 희석. Pipetting으로 부드럽게 혼합 하 고 실 온에서 5 분 동안 서 보자.
- 한편, 각 2 개의 1.5 mL 튜브에 DMEM의 250 µ L 플라스틱 하 고 1500 ng pLVX EIP YFPQL 또는 pLenti6P SLC26A4, psPAX2의 1225 ng, 375의 추가 각각 pMD2.G ng. 두 lentiviral 플라스 미드는 앞에서 설명한21있다. 각 플라스 미드 튜브를 희석된 transfection 시 약의 250 µ L을 추가 하 고 부드럽게 섞어 실 온에서 20 분 동안 품 어.
- 20 분 후 추가 transfection 시 약 및 플라스 미드 단지의 500 µ L 1.5 mL 튜브에 dropwise 단계 1.4 및 혼합에서 잘 각 문화 접시에 접시와 락 여. 37 ° c 12 h에 대 한 CO2 배양 기에서 세포를 품 어.
- 2.5 mL 신선한 매체와 매체를 대체 하 고는 추가 48 h에 대 한 품 어. 다음 5 분 유지 조건된 매체 infectivity 유지 하기 위해 냉장 lentivirus를 포함 하는 얼음에 문화 접시를 놓습니다.
- 포함 하는 lentiviruses 미디어를 수확 하 고 15 mL 원뿔 튜브에 전송. 3 분 4 ° C에서 3000 x g 에서 centrifuge 고 0.4 µ m에서 여과 하 여는 상쾌한에서 부동 HEK293T 셀 제거.
- 2 일 이내에 사용 하기 위해 4 ° C에서는 lentiviruses를 포함 하는 미디어를 저장 합니다. 나중에 사용 하기 위해 저장 −80 ° C에서 200 µ L aliquots
2. LN215-YFPQL 및 LN215의 생성-난 lentiviral 변환에 의해− 셀
- 80%로 100 mm 배양 배지에서 LN215 셀 성장 DMEM 10% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS) 100 U/mL 페니실린와 100 µ g/mL 스 위에서 설명한 대로 보충에 confluency.
참고: 다른 셀 라인을 사용 하 여 YFP-GJIC 시험을 실시 하는 경우 적절 한 문화 매체를 사용 합니다. LN215 YFPQL및 LN215-- 나 셀 연세대 대학-산업 재단에 의해 제공 될 수 있습니다. 해당 저자에 문의 하십시오. - 하루 전에 변환, 세척 셀 두 번 10 mL PBS의,와 함께 치료 0.25 %trypsin-EDTA 3 분 동안 37 ° C에서의 2 mL와 5 ml와 10 mL 혈 청 학적인 피 펫 문화 매체의 셀 Resuspend 고 50, 000 셀/ml 밀도 조정 합니다. 미디어의 400 µ L에 바이러스 컨트롤, YFPQL, 및 SLC26A4 세포 치료에 대 한 24-잘 문화 판의 각 잘 20000 셀을 추가 합니다.
- 후 37 ° C에 외피의 24 h, pLVX-EIP-YFPQL 또는 pLenti6P SLC26A4 lentivirus 및 polybrene 4 µ g/mL의 최종 농도에 보충 하는 신선한 문화 매체의 1:1 혼합물의 400 µ L와 문화 매체를 대체 하 여 두 개의 우물 transduce. 아니 바이러스 컨트롤에 대 한 문화 매체를 바꿉니다.
- 15 h 37 ° C에서 세포를 품 어, 매체를 포함 하는 lentiviruses 발음, 신선한 문화 매체를 추가 하 고 추가 72 h에 대 한 셀을 품 어.
주의: 우물 사이 lentivirus의 오염 방지를 사용 하 여 새로운 팁 또는 pipets 각 잘 lentivirus를 포함 하는 문화 매체를 발음 하거나 신선한 성장 매체를 걸 때. - 각 셀을 두 번 잘 0.5 mL PBS의,와 함께 치료 트립 신-EDTA의 300 µ L 3 분 Resuspend 문화 매체의 2 mL에 셀과 접시 2 µ g/mL puromycin 6-잘 문화 접시에 대 한 세척.
- 때까지 컨트롤의 모든 셀 잘 죽은 2 µ g/mL puromycin 포함 된 미디어에 셀 문화 (라운드 모양 또는 현미경에서 관찰 될 때 부동), 일반적으로 1 주일 소요. 문화 미디어 포함 puromycin 선택 기간 동안 매일 새로 고칩니다. 만약 LN215 YFPQL 또는 LN215-I- 문화 될 합칠 선택 완료 되기 전에, 100 mm 셀 접시와 선택 단계 2.5에서 계속 전송.
3. 분석 결과에 필요한 솔루션의 준비
- C-솔루션 (10 mM HEPES, 140 mM NaCl, 포도 당 10 m m, 5mm KCl, 1 mM MgCl2, 및 1mm CaCl2)의 나-솔루션 (10 mM HEPES, 140 m NaI, 포도 당 10 m m, 5 m KCl, m 및 1 m CaCl2m m)의 500 mL 500 mL를 준비 합니다.
- 1 N NaOH와 7.4에 두 솔루션의 pH 조정, 저장을 위해 0.4 µ m에 filtrations에 의해 솔루션을 소독. 최대 1 개월 4 ° C에서 저장 합니다. 사용 하기 전에 pH를 확인 합니다.
4. 도금 LN215 YFPQL , LN215-내가− 셀
- LN215-YFPQL 및 LN215 문화-나 시험에 필요한 인구를 도달 하 문화 매체에 별도로 100 mm 접시에− 셀. LN215-YFPQL 및 LN215-내가− 셀 40%와 80% confluency 100 mm 접시에는 각각 96 잘 접시 분석 결과 대 한 충분 한 있습니다.
- YFP GJIC 분석 결과 수행 하기 전에 1 일 각 100 m m 문화 접시 10 mL의 PBS로 세척. 각 플레이트의 0.25% trypsin EDTA 용액 2 mL를 취급 하 고 5 분 Resuspend 문화 매체와 전송 15 mL 원뿔 튜브 4 mL에 각 접시에 셀에 대 한 37 ° C에서 품 어.
- 작은 셀 공의 3 분 삭제에 대 한 1000 x g 에서 원심 분리 하 여는 상쾌한 고 문화 매체의 5 mL으로 각 셀 펠 릿 resuspend. 10 mL 혈 청 학적인 피 펫으로 약 20 배를 위아래로 pipetting으로 단일 세포로 어떤 세포 덩어리를 헤어.
- Hemocytometer, 셀을 계산 하 고 희석 LN215 YFPQL 80000 셀/mL 및 LN215의 셀 정지 수 있도록 문화 매체에 셀-나 160000 셀/mL에서− .
- 7 mL LN215 YFPQL 의 및 LN215의 7 mL를 혼합-내가 저수지에− 셀 정지. 멀티 채널 피 펫을 사용 하 여 셀 96 잘 문화 판의 각 우물에 혼합물의 100 µ L를 추가 합니다.
참고: 96-잘 셀 플레이트의 각 음에 혼합물의 100 µ L를 추가, 혼합된 세포 현 탁 액의 약 10 mL 필요 하다. 필요한 것 보다 더 많은 셀 정지 하 게 하는 것이 좋습니다. - 셀을 품 어에 24 h에 대 한 37 ° C에서 5% CO2/95% 공기 습도. LN215-YFPQL 및 LN215-내가−세포 배양 분석 실험을 실시 하는 경우 100% 합칠 이어야 한다.
5. 실시-YFP GJIC 분석 결과
참고: 사용 20 x 확대와 함께 형광 현미경 및 확실 하 게 거기 96 잘 접시를 확인 하는 GFP 필터는 LN215 YFPQL 또는 LN215 SLC26A4 세포의 아무 덩어리와 셀 문화는 완전히 confluent 하 고 전에 잘 분산 분석 결과 실시합니다.
- 분석 결과, 일을 하기 전에 적어도 30 분은 미 판 설정 하 고 37 ° c.로 설정
- 300 µ L/s 흐름 속도에 70% 에탄올의 3 mL, 3 mL 증류수, 그리고-솔루션의 3 mL와 자동된 인젝터의 튜브를 세척.
- C-와 나-솔루션 물 목욕에서 37 ° C에 따뜻한.
참고: 각 솔루션의 100 µ L 96 잘 접시의 각 음에 대 한 필요에 따라 약 10 mL 각 솔루션의 각 분석 결과 대 한 필요 하다. 내가 솔루션의 추가 10 mL 못쓰게 각 접시 (20 mL의 총)에 대 한 필요 하 고 C-솔루션의 추가 25 mL 각 접시 (35 mL의 총) 세척 필요. - 성장 매체를 발음 또는 반전; 빈 접시 잔여 중간에 밖으로 누릅니다.
참고: 성장 매체에서 잔여 태아 둔감 한 혈 청 원인과 배경 형광 감소 분석 결과 품질에. - 멀티 채널 피 펫을 사용 하 여 저수지에서 각 음을 C 솔루션의 200 µ L를 추가 합니다. C 솔루션을 발음 하거나 빈에 잔여 솔루션 밖으로 접시를 반전 합니다.
- 추가 50 µ L µ L C-솔루션, 2.5 m m 화학 주식 1 µ L ( 표 1참조) 또는 dimethylsulfoxide (DMSO)는 차량으로, 그리고 다음 50 µ L µ L C-솔루션을 다중 채널 피 펫과 각 영역.
참고: 대부분 시 약 화학 라이브러리에 DMSO에 해산 하 고 최대 1% (v/v) 대부분 세포 기반 분석24에 허용 됩니다. DMSO는 물 보다 더 높은 밀도, DMSO에 용 해 시 약 분석 결과 솔루션의 농도 방해 문화 판 우물에 추가 될 때 바닥에 내려가 경향이 있다. 이 순서로 C 솔루션, DMSO, 시 약 및의-솔루션 50 µ L C 50 µ L을 추가 하 여 피할 수 있습니다. C 솔루션의 마지막 50 µ L 혼합입니다. - 공기에서 5% CO2안에 37 ° C에서 세포를 품 어. 보육 시간을 수정할 수 있습니다, 하지만 10 분은 보통 이온 채널 변조기 행동에 대 한 충분 한.
- 외피, 동안 설정-솔루션을 각 영역 100 µ L 1에 삽입 microplate 리더 프로그램의 10에 대 한 형광을 측정 하 고 0.4 s 간격 s. 바닥에서 형광을 읽을 독자를 설정 합니다. 권장된 사출 속도 µ L/s 세트 485 nm 및 읽기 520에서 방출 흥분 파장의 135 nm.
참고: microplate 리더 프로그램에 대 한 세부 설정은 다음과 같습니다.- 관리 프로토콜 을 클릭 합니다.
- 새로 만들기 단추를 클릭 합니다. 독서에 형광 강도 측정 방법 섹션, 그리고 잘 모드 에서 선택 모드 섹션. 그런 다음 확인 버튼을 클릭 합니다. 새 탭이 표시 됩니다.
- 기본 매개 변수 메뉴에서 설정 여기 파장 485 nm 및 520에서 방출 nm. 하단 광섬유 바닥에서 형광을 읽을 선택 합니다. 설정된 측정 시작 될 시간 "0 s", "25", 섬광의 수 음, 당 수 및 "20", 될 간격 간격과 간격 시간을의 숫자 "0.4 s".
- 레이아웃 메뉴에서 읽을 수 판의 영역을 그립니다.
- 농도/볼륨/Shacking 메뉴에서 microplate 리더 135 µ L/s 사출 속도-솔루션을 각 영역 100 µ L를 주사를 설정 합니다.
참고: 셀의 분리 될 수 있습니다 때문에 빠른 사출 속도를 피하십시오. - 1 주입 시작 시간 설정 주입 시간 메뉴에 s. 그런 다음 측정 시작 버튼을 클릭 합니다.
- 부 화, 후 96 잘 접시 microplate 리더에 놓고 다시 측정 시작 버튼을 클릭 하 여 측정을 시작 합니다.
6입니다. GJIC 활동의 계산
- YFPQL 냉각 및23 GJIC 활동의 비율을 계산
YFPQL 냉각 하는 (%) =
GJIC 활동 (%) =
참고: 원칙적으로, GJIC 활동 계산 해야 셀 수락자와 기증자 세포 우물 YFP 형광의 백분율의 차이에서 그리고 해당 수락자 셀만 우물. 그러나, LN215 YFPQL 셀 표시 무시할 YFP 냉각 요오드 화물에 의해 10 후 s, 우리가 갖지는 배경 YFP 냉각 계정으로 할 때 LN215 YFPQL 및 LN215를 사용 하 여 HTS-- 세포 나.
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Representative Results
29 96 잘 문화 접시-YFP GJIC 분석 결과 LN215 YFPQL LN215를 사용 하 여 2320 화학 소설 GJIC 변조기를 식별 하기 위해 화면을 사용 했다-난− 셀. 대표 한 접시와 함께 얻은 결과 그림 2에 표시 됩니다. 각 잘에서 YFP 형광의 비율 그림 2A 에서 선 그래프로 표시 되 고 각 잘에서 GJIC 활동의 비율 그림 2B에 막대 그래프에 표시 됩니다. 부정적이 고 긍정적인 컨트롤 및 상영 했다 80 화학 물질은 표 1에 표시 됩니다. 각 잘 대우 되었다 화합물의 25 µ M로 10 분 Terbinafine 완전히 저해 GJIC과 homosalate GJIC의 약 50% 저해. Terbinafine는 글리제 억제제로 확인 됐다. 그것의 복용량 응답, 반전 기능, 및 다른 실험 결과 되었습니다23다른 곳에서 출판.
그림 1 : 구성 요소와 단계-YFP GJIC 분석 결과의 (A) 노 랗 고와 어두운 노란색 오각형 대표 수락자 셀 냉각 전후 YFPQL 를 표현. 검은 오각형은 기증자 세포 SLC26A4를 표현. 파란색 막대는 GJs 되며 빨간색 막대 SLC26A4 전송기. 핑크 원형 iodides 있습니다. 언제는 GJs는 (위 패널)를 열고, iodides SLC26A4 통과 하 고 기증자 셀을 입력 하십시오. Iodides 마이그레이션할 인접 수락자 셀 통해 GJs Iodides 끄다 수락자 셀 YFP 형광. 경우는 GJs (하단 패널) 폐쇄, iodides 기증자 세포를 입력 이웃 수락자 셀을 이동할 수 없습니다 그리고 기증자 세포에만 유지 됩니다. 수락자 셀 YFP 형광은 iodides (B) 단계 대조 및 형광 이미지의 추가 후 YFP-GJIC 분석 결과 할 때 크게 감소 되지 않는다. 수락자와 기증자 세포는 1: 1의 비율로 도금 했다 때 YFPQL 냉각 관찰 되었다 1 분 후 iodides (위 패널)를 추가 했다. 수락자 셀만 도금 했다 때 1 분에 대 한 요오드 화물 치료 상당한 YFPQL 21냉각을 지도 하지 않았다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2 : 대표 HTS YFP-GJIC 분석 결과 사용 하 여 결과 LN215-YFPQL 및 LN215의 1:2 혼합물의 (A) 정지-난− 셀 도금 되었고 알을 품을 24 h에 대 한 프로토콜 섹션 4에서에서 설명한 대로. 셀 씻어 그리고 차량 또는 프로토콜 섹션 5에서 화학 제품으로 대우 했다. 모든 화학 물질은 10 분 동안 DMSO에 2.5 m m 재고 솔루션에서 25 µ M 샘플으로 분석 했다. 각 잘 포함 된 1 µ L DMSO 100 µ L C-솔루션의. 접시의 첫 번째 및 마지막 행 제외 (차량)와 긍정적인 (carbenoxolone) 컨트롤에 할당 했다. 나머지 80 웰 스는 표 1에 나열 된 화학 물질에 사용 되었다. 치료 후, YFP-GJIC 분석 결과 프로토콜 섹션 5에서 잘에 의해 잘을 실시 했다. 각 시간에 각 잘에서 YFP 형광의 백분율 2에 값을 정규화 되었는지 s 플롯 시간에 대 한. 그림에 선 각 잘에서 YFP 형광 변화를 나타냅니다. 10 시에 대부분 잘 YFP 형광의 70%에서 80%에 배열 했다. Terbinafine와 homosalate GJ 억제제 (B) 막대 그래프 표시 96 웰 스의 각각의 백분율 GJIC 활동에 대 한 잠재적인 안타를 했다. %GJIC 활동 프로토콜 단계 6.1에서에서와 같이 계산 되었고 잘 숫자에 대 한 막대 그래프에 플롯. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
| 잘 제 | 위치 | 화학 | 잘 제 | 위치 | 화학 |
| 1 | A01 | DMSO | 49 | E01 | DMSO |
| 2 | A02 | difloxacin 염 산 염 | 50 | E02 | propofol |
| 3 | A03 | 디 valerate | 51 | E03 | oleandomycin 인산 염 |
| 4 | A04 | 리스로 마이 신 | 52 | E04 | mianserin 염 산 염 |
| 5 | A05 | cyproheptadine 염 산 염 | 53 | E05 | valsartan |
| 6 | A06 | liothyronine | 54 | E06 | salsalate |
| 7 | A07 | theophylline | 55 | E07 | 날린 |
| 8 | A08 | tolnaftate | 56 | E08 | rifaximin |
| 9 | A09 | trimethobenzamide 염 산 염 | 57 | E09 | adrenolone 염 산 염 |
| 10 | A10 | cefamandole nafate | 58 | E10 | imiquimod |
| 11 | A11 | 디 메 틸 fumarate | 59 | E11 | nonoxynol-9 |
| 12 | A12 | CBX | 60 | E12 | CBX |
| 13 | B01 | DMSO | 61 | F01 | DMSO |
| 14 | B02 | 피라세탐 | 62 | F02 | ranolazine |
| 15 | B03 | gluconolactone | 63 | F03 | danthron |
| 16 | B04 | azlocillin 나트륨 | 64 | F04 | acedapsone |
| 17 | B05 | 콜린 염화 물 | 65 | F05 | atomoxetine 염 산 염 |
| 18 | B06 | 틴이 칼슘 | 66 | F06 | desoxycorticosterone 아세테이트 |
| 19 | B07 | oxyphencyclimine 염 산 염 | 67 | F07 | tramadol 염 |
| 20 | B08 | propafenone 염 산 염 | 68 | F08 | terbinafine 염 |
| 21 | B09 | fluconazole | 69 | F09 | topiramate |
| 22 | B10 | 로 바 스타 틴 | 70 | F10 | gemifloxacin mesylate |
| 23 | B11 | bleomycin (bleomycin b2 표시) | 71 | F11 | 로 나트륨 |
| 24 | B12 | CBX | 72 | F12 키 | CBX |
| 25 | C01 | DMSO | 73 | G01 | DMSO |
| 26 | C 02 | acesulfame 칼륨 | 74 | G02 | levalbuterol 염 산 염 |
| 27 | C03 | teniposide | 75 | G03 | metformin 염 |
| 28 | C04 | 타 닌 산 | 76 | G04 | pregabalin |
| 29 | C05 | carprofen | 77 | G05 | topotecan 염 |
| 30 | C06 | hydroxychloroquine 황산 | 78 | G06 | phenoxybenzamine 염 |
| 31 | C07 | pentoxifylline | 79 | G07 | arecoline hydrobromide |
| 32 | C08 | mepivacaine 염 산 염 | 80 | G08 | mepartricin |
| 33 | C09 | nilutamide | 81 | G09 | pantoprazole |
| 34 | C10 | aminolevulinic 산 성 염 | 82 | G10 | 변에 염 |
| 35 | C11 | 애니라세탐 | 83 | G11 | podofilox |
| 36 | C12 | CBX | 84 | G12 | CBX |
| 37 | D01 | DMSO | 85 | H01- | DMSO |
| 38 | D02 | metaxalone | 86 | H02 | levodopa |
| 39 | D03 | chloroguanide 염 산 염 | 87 | H03 | ethisterone |
| 40 | D04 | clarithromycin | 88 | H04 | enrofloxacin |
| 41 | D05 | modaline 황산 | 89 | H05 | sparteine 황산 |
| 42 | D06 | protirelin | 90 | H06 | 남성 호르몬 프로 피 온 산 |
| 43 | D07 | 브로민 | 91 | H07 | pyridostigmine 브 로마 이드 |
| 44 | D08 | rosiglitazone maleate | 92 | H08 | enilconazole 황산 |
| 45 | D09 | losartan | 93 | H09 | 디 나트륨 인산 염 |
| 46 | D 10 | homosalate | 94 | H10 | azaserine |
| 47 | D11 | salicylanilide | 95 | H11 | acrisorcin |
| 48 | D12 | CBX | 96 | H12 | CBX |
표 1입니다. 이 연구에서 상영 하는 화학 물질의 목록입니다.
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Discussion
YFP-GJIC 분석 결과 때문에, 급속 한, 강력 하 고 저렴 한 HTS에 대 한 사용할 수 있습니다. HTS 분석 결과 강력한 간주 됩니다 경우 Z'-요소 0.525이상입니다. 참조 장 그 외 여러분 HTS 분석25의 적합성을 평가 하는 데 사용 하는 통계 분석에 대 한. LN215 셀 사용 했다 Z'-요소 > 어떤 분석 결과 최적화 없이 0.5. 다른 세포 유형 분석 결과 및 그것의 Z에 사용 됩니다 '-요소는 < 0.5, 견고성은21의 시험 시간 확장 하 여 향상 시킬 수 있습니다. Z를 LN215 및 호, 인간의 다리 셀, 셀 필요만 10 s'-팩터 > 0.521. 분석 결과는 기증자와 수락자 셀만, I-솔루션, C 솔루션 필요합니다. 광 등 calcein 오전 없습니다 추가 시 약이 필요 합니다. 이 GJIC 분석 결과의 또 다른 장점은 단일 음, 낮은 음 사이 변화 귀착되는 셀의 총 GJIC 활동 측정. microinjection, photobleaching (FRAP), 그리고 듀얼 패치 클램프 분석 후 갭 형광 복구 assayed 영역의 셀 측정 영향을 크게 수 있습니다. 긁어 로드 분석 비교적 넓은 지역 GJIC를 평가, 비록 근 근이 로딩 절차 상당한 가변성26를 발생할 수 있습니다.
YFP-GJIC 분석 결과의 성공적인 행위에 대 한 중요 한 단계는 다음과 같습니다. PH의 C-그리고 난-솔루션 각 사용 하기 전에 7.4에 조정 해야 합니다. YFPQL 형광 할로겐22뿐만 아니라 산도 의해 강하게 영향을. 두 솔루션의 pH 차이 YFP 형광 나 솔루션의 추가 후에 탈 선 변경 될 수 있습니다. 기증자 및 수락자 셀 도금 하기 전에 완전 하 게 해리 했다 수 해야 합니다. 기증자 또는 수락자 세포의 대단히 짧은 시간 분석 결과 방해. 혼합 문화의 합류 셀 사이의 GJs의 형성을 최대화 하기 위해 100% 이어야 한다. 수락자 기증자 세포의 비율으로 리 외. 을 설명 된 대로 시험 결과를도 영향을 줍니다. 21. 수락자 셀만 YFP 형광으로, 비율과 수락자와 기증자 세포의 배열 수 있습니다 쉽게 검사할 형광 현미경으로 분석 결과 수행 하기 전에. 그것은 자동차와 화학 치료 전에 잔여 매체를 제거 하려면 C 솔루션 공동 문화를 세척 하는 것이 중요입니다. 잔여 혈 청 또는 문화 매체에서 페 놀 레드 각각 배경 형광 또는 원치 않는 형광 끄는의 원천이 될 수 있습니다. 그들은 따라서 YFP-GJIC 분석 결과 방해 수 있습니다. 성장 인자는 FBS에 또한 GJIC27을 억제 수 있습니다. 다른 한편으로, 혈 청 기아 apoptosis28을 또한 화학 처리에 의해 가속 될 수 있다는 발생할 결국 수 있습니다. 우리의 경험에서는, 수락자와 기증자 세포 치료로 대부분 10 분에 대 한 혈 청 하지 않고 C-솔루션에서 25 µ M에서 화학 물질 상영 후 건강 한 했다. 4 h에 대 한 치료 후에 일부 화학 물질 독성 되지 않았습니다. 화학 독성 다릅니다로 긴 기간에 대 한 치료를 할 때 신중 하 게 셀의 상태 확인 한다. 셀, 건강 하지 않은 경우 1에 내에서 발생 하는 YFP 형광의 명백한 감소 s 후 나 솔루션의 도입 셀 분리에서 발생할 수 있습니다. 그는 참여의 현미경 관찰에 의해 확인 될 수 있다 잘.
셀 YFP-GJIC 시험에 사용 되는 몇 가지 요구 사항을 충족 해야 합니다. 그들은 해야 GJs endogenously 또는 양식에 GJs 유도. Cx43의 구성 하는 채널은 원자 양이온 및 음이온29에 거의 동등 하 게 융 화, iodides-YFP GJIC LN215 세포에에 채널을 통해 마이그레이션할 수 있습니다. 만약 관심의 셀에 Cx 채널 낮은 요오드 화물 침투성 하지만 자유롭게 캘리포니아2 +의 유포를 허용, YFP-GJIC 분석 결과 가능 하지 않을 수 있습니다. 요오드 화물 통풍 관 활동의 부재는 요구 사항입니다. 기능성 음이온 채널 및 요오드 화물 통풍 관을 빠르게 표현 하는 셀은이 분석 결과 대 한 적합 합니다. 세포의 성장을 또 다른 요구 사항입니다. 수락자와 기증자 세포는 lentiviruses YFPQL 또는 SLC26A4와 적어도 1 주19puromycin와 선택의 변환에 의해 생성 됩니다. 느리게 성장 또는 기본 hepatocytes 같은 성장을 제한 하는 셀이 분석이 결과 대 한 적합 하지 않습니다. 플라스틱 문화 도자기의 표면에 세포의 접착도 중요 하다. HEK293 세포 등, 확고 하 게 고착 하지 않는 세포는 I-솔루션의 도입으로 쉽게 분리 된다. 이 도금 하기 전에 PLL 96 잘 접시를 코팅 하 여 극복할 수 있습니다. 그러나, 코팅 접시 지루한 단계 이며 이러한 유형의 셀을 피하는 것이 좋습니다. 원칙적으로, 이다, hepatocytes, keratinocytes 같은 1 차 셀은 toxicologically, 생리학, 약리학 glioma은, 그리고 기저 세포 암 종 세포와 같은 암 세포 보다 더 적절 하 고. 그러나, 그들의 한정 된 성장 속도 그들을 분석 결과 대 한 부적 절 한 만들. 긴 기간에 대 한 위의 요구 사항을 충족 하는 기본 세포의 성장을 허용 하는 세포 배양에 미래 발전 가능이 분석 결과, 생리, 독성 및 약리 평가 확대 것 이다.
HTS 뿐만 아니라 셀 형식을 endogenously 기능 GJs을 표현 여부 결정-YFP GJIC 분석 결과 사용할 수 있습니다. 셀 GJs 없다면 YFPQL 냉각 속도 cocultured 수락자에서 관찰 하 고 기증자 세포와 다른 수락자 셀만 도금 했다 때 관찰 하지 않을 것 이다. 냉각 속도에 큰 차이, 원래 세포 기능 GJs을 표현 한다. 차이 시간 그림 2A와 같이 증가 하는 경향이 있다,이 분석 결과 긁어 로드 보다 약한 GJIC 활동을 감지 또는 분석 간격 졸라 큰 감도 있다. YFP-GJIC 분석 결과23,30시간 과정 데이터, 복용량 응답 관계와 글리제 변조기의 가역 평가 얻을 수 있습니다. 기능 GJs 없는 세포로 관심의 Cx의 식을 유도 하 여 수락자와 기증자 생성-YFP 특정 cx는-GJIC 분석 실험 설립된23일 수 있다. 이 분석 결과 따라서 가능 하 게 그것은 Cx의 특정 유형에 대 한 화학의 IC50 값을 결정 하.
대부분 HTS 분석 처럼 YFP-GJIC 분석 결과 거짓 긍정적인 결과 SLC26A4, YFPQL또는 요오드 화물 세포 침투성에 있는 변화에서 결과 생성할 수 있습니다. 로 거짓 글리제 저해 요오드 화물 SLC26A4의 억제 또는 YFPQL 의 둔감에서 발생할 수 있습니다, 모든 잠재적인 글리제 억제제 셀 YFPQL 및 SLC26A4 coexpress를 사용 하 여 테스트 해야 합니다. 잠재적인 글리제 억제제는 SLC26A4 차단기 또는 YFP desensitizer 이면 YFP 냉각 감쇠입니다. 그와 반대로, 진정한 글리제 억제제 YFP 냉각 적용 되지 않습니다. Electrophysiological 메서드 또는 정화 YFPQL SLC26A4 차단제와 YFP desensitizers 사이 차별 수 있습니다. 글리제 활성 YFP 요오드 화물을 민감하게 또는 요오드 화물 침투성 Cx hemichannels 음이온 채널을 통해 또는 일반적인 독성 효과 증가 또한 거짓 긍정적인 결과 줄 것 이다. 그것은 잠재적인 글리제 활성 YFP 냉각 때 수락자 셀만 도금 강화 여부를 결정 합니다. 경우 화학 YFPQL sensitizes 또는 요오드 화물 침투성 증가, 그것은 YFPQL 없이 기증자 수락자 세포 배양에서 냉각을 증가할 것 이다. 두 가지 유형의 거짓 글리제 활성 긁어 로드 또는 FRAP 순화 YFPQL 단백질을 사용 하 여 다른 글리제 분석 실험에 구분할 수 있습니다.
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Disclosures
저자는 공개 관심의 없습니다 충돌 있다.
Acknowledgments
이 연구는 기본 과학 연구 프로그램을 통해 국가 연구 재단의 한국 (NRF) 교육부의 재정 지원에 의해 지원 되었다 (2011-0023701, 2016R1D1A1A02937397, 및 2018R1A6A1A03023718).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96-well plate | SPL | 30096 | |
| Calcium chloride (CaCl2) | Sigma | C5670 | I-solution |
| D-(+)-Glucose | Sigma | G7021 | C-solution, I-solution |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | sigma | 276855 | |
| HEPES | Sigma | RES6003H-B7 | C-solution, I-solution |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668-027 | transfection reagent |
| Magnesium chloride hexahydrate (MgCl2 6H2O) | Sigma | M2393 | C-solution |
| Microplate reader | BMG LabTech | POLARstar Omega 415-1618 | |
| pMD2.G | Addgene | #12259 | |
| Polybrene | sigma | H9268 | |
| Poly-L-lysine solution | sigma | P4707 | |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma | P5405 | C-solution, I-solution |
| psPAX2 | Addgene | #12260 | |
| Puromycin Dihydrochloride | sigma | P8833 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma | S5886 | C-solution, I-solution |
| Sodium hyroxide (NaOH) | Sigma | S2770 | |
| Sodium Iodide (NaI) | Sigma | 383112 | I-solution |
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