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Biology

Un saggio di comunicazione intercellulare Junction ioduro-giallo fluorescente proteina-Gap

Published: February 1, 2019 doi: 10.3791/58966
Automatic Translation
1, 1
1College of Pharmacy, Yonsei Institute of Pharmaceutical Sciences, Yonsei University

Summary

Qui, presentiamo un protocollo per un dosaggio di comunicazione intercellulare di romanzo gap junction progettato per lo screening ad alta resa di prodotti chimici di gap junction-modulanti per drug discovery e valutazione tossicologica.

Abstract

Giunzioni di Gap (GJs) sono i canali della membrana cellulare che permettono la diffusione delle molecole più piccolo di 1 kDa tra celle adiacenti. Come hanno ruoli fisiologici e patologici, c'è necessità di high throughput screening (HTS) saggi di identificare modulatori GJ in drug discovery e tossicologia saggi. Un saggio di comunicazione intercellulare di giunzione (I-YFP-GJIC) romanzo ioduro-giallo fluorescente proteina-gap soddisfa questa esigenza. È un'analisi basata su celle tra cui accettore e donatore di cellule che sono state progettate per esprimere stabilmente una variante della proteina fluorescente gialla (YFP), cui fluorescenza sensibile è spenta mediante ioduro o SLC26A4, un trasportatore di ioduro, rispettivamente. Quando lo ioduro viene aggiunto a una coltura mista di due tipi cellulari, entrano le cellule erogarici tramite il trasportatore SLC26A4 e diffusa alle celle adiacenti acceptor tramite GJs dove essi placare la fluorescenza YFP. YFP fluorescenza è misurata pozzetto da altro in modalità cinetica. Il tasso d'estinzione YFP riflette l'attività GJ. Il test è affidabile e abbastanza veloce da utilizzarsi per HTS Il protocollo per il dosaggio di-YFP-GJIC utilizzando le cellule LN215, cellule di glioma umano, è descritto.

Introduction

Giunzioni di Gap (GJs) fungono da canali intercellulari per consentire la diffusione di piccole molecole di < 1 kDa come nutrienti, metaboliti e molecole di segnalazione tra celle adiacenti. Gli elementi giunzionali includono un hemichannel o una connessone in ogni cellula e ogni connessone costituisce sei connexins (Cxs)1. GJs e Cxs sono stati utilizzati nelle analisi di tossicologia degli agenti cancerogeni quali idrocarburi policiclici aromatici (PAH), che sono GJ inibitori2,3,4. GJIC interrotte è stato associato con nongenotoxic carcinogenesi5,6. Come un potenziale bersaglio terapeutico, GJ partecipazione è stata segnalata in particolari sottotipi di sequestri7,8, protezione da cardiaco e cervello ischemia/riperfusione pregiudizio9, emicrania con aura10, danno epatico farmaco-indotto6,11e12di guarigione della ferita. High throughput screening (HTS) saggi sono tenuti a identificare le sostanze chimiche GJ-modulanti o anticorpi per la scoperta di nuovi farmaci, per le analisi di tossicologia e per identificare nuovi regolatori cellulari della attività GJ. Saggi di HTS è utilizzabile anche per indagare le relazioni struttura-attività di GJ modulatori2,13,14,15.

Alcuni saggi GJIC includono trasferimento della tintura o tecniche di dual patch clamp. Lucifero giallo CH (LY) ed estere di calceina acetossimetil (calceina-AM) sono stati utilizzati nelle analisi di dye-transfer. Le cellule non sono permeabili a LY, che è stato introdotto da microiniezione, raschiare caricamento o elettroporazione. Una volta all'interno della cellula, LY si diffonde nelle vicine cellule via GJs e attività GJ è analizzata dalla misura del LY migrazione16. Saggi di calceina-AM coinvolgono di solito recupero di gap-fluorescenza dopo photobleaching17,18. Calceina-AM è un cellulare-permeante colorante che è convertito intracellulare in calceina impermeabile da un intrinseco dell'esterasi. Il test richiede un microscopio confocale per osservare il trasferimento di calceina-AM in una cella da coloro che la circondano dopo laser photobleaching. Se GJs funzionale sono presenti, la fluorescenza viene recuperata e calceina-AM in celle adiacenti entra nelle cellule photobleached. Attività GJ è analizzata dalla misura di recupero di fluorescenza delle cellule photobleached. Sublimazione saggi sono laboriosa e che richiede tempo o hanno basse sensibilità. Dual patch di bloccaggio è un metodo elettrofisiologico che misura di conduttanza giunzionale. È relativamente sensibile, con una dipendenza diretta della conduttanza al numero di open GJs19; Tuttavia, è tecnicamente esigente, richiede tempo e costoso20. L'analisi YFP-GJIC è stata sviluppata per l'uso in HTS

La figura 1 illustra i componenti e i passaggi del test GJIC-YFP, che utilizza celle acceptor esprimendo una variante YFP ioduro sensibili cuscinetto H148Q e I152L (YFPQL) e le cellule erogarici esprimendo un trasportatore di ioduro (SLC26A4)21 . Le due mutazioni di YFPQL consentono tempra di fluorescenza di ioduro22. Gli ioduri vengono aggiunti al co-coltivate acceptor e cellule del donatore; Essi non entrano le cellule accettore, ma sono presi dai trasportatori SLC26A4 presenti sulle cellule del donatore. Gli ioduri nelle cellule del donatore si diffondono attraverso GJs funzionante in celle adiacenti acceptor dove essi placare la fluorescenza YFPQL . Se GJs sono chiuso o bloccato dagli inibitori, ioduro non può entrare nelle cellule di acceptor per placare la fluorescenza. Il tasso d'estinzione YFPQL riflette l'attività GJ. La procedura di dosaggio-YFP GJIC è né complicato né in termini di tempo. È compatibile con HTS e può essere utilizzato per verificare gli effetti di un gran numero di composti su GJ attività in un periodo relativamente breve. Richiede solo acceptor e cellule del donatore e due soluzioni saline bilanciate. Il protocollo descritto di seguito è basato su cellule LN215 cui principali Cx è Cx4321. Il ricevitore di LN215-YFPQL e LN215-sono cellule erogarici− sono state generate da trasduzione con lentivirus esprimere YFPQL o SLC26A421,23.

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Protocol

1. generazione di lentivirus esprimere YFPQL e SLC26A4

  1. Crescere le cellule embrionali umane del rene di HEK293T all'80% confluenza su piastre di coltura di 100 mm. Per volta Eagle Medium (DMEM di Dulbecco) completati con 10% siero bovino fetale, 100 U/mL di penicillina e 100 µ g/mL di streptomicina è il terreno di coltura utilizzato in tutto il protocollo per mantenere HEK293T ed altre cellule di seguito indicate.
  2. Cappotto 6 pozzetti cultura piastre con l'aggiunta di 2 mL di 0,005% di soluzione di sterile poli-L-lisina (PLL) ad ogni pozzetto per 10 min. aspirare la soluzione di PLL e sciacquare la superficie due volte con 2 mL di acqua sterile.
  3. Lavare il HEK293T cellule con 10 mL di fosfato tampone salino (PBS) e trattano i monostrati di cellule umane in ogni piatto di 100 mm con 2 mL di soluzione di tripsina-EDTA 0,25% a 37 ° C per 3 min. aggiungere 5 mL di terreno di coltura e risospendere le cellule.
  4. Contare le celle in un emocitometro e regolare la densità della sospensione delle cellule a 250.000 cellule/mL nel terreno di coltura e aggiungere 500.000 cellule in 2 mL di terreno di coltura ad ogni bene di piastre da 6 pozzetti rivestite con lisina. Incubare le cellule in un 5 umidificata CO295% aria atmosfera a 37 ° C per 24 h e quindi sostituire il terreno di coltura con DMEM senza penicillina e streptomicina.
  5. In una provetta da 1,5 mL, diluire 20 µ l di reagente di transfezione con 500 µ l di DMEM senza siero o antibiotici. Mescolare delicatamente pipettando e lasciate riposare a temperatura ambiente per 5 min.
  6. Nel frattempo, dispensare 250 µ l di DMEM in ciascuna delle due provette da 1,5 mL e quindi aggiungere 1500 ng di pLVX-EIP-YFPQL o pLenti6P-SLC26A4, 1225 ng di psPAX2 e 375 ng di pMD2.G a ciascuno. I due plasmidi lentivirali sono stati descritti in precedenza21. Aggiungere 250 µ l di reagente di transfezione diluito in ogni provetta di plasmide, mescolare delicatamente e incubare per 20 minuti a temperatura ambiente.
  7. Dopo 20 minuti, aggiungere 500 µ l di complessi di reagente e plasmide di transfezione nelle provette da 1,5 mL goccia a goccia per ogni piastra di coltura ben al punto 1.4 e mix da dondolo avanti e indietro la piastra. Incubare le cellule a 37 ° C in un incubatore a CO2 per 12 h.
  8. Sostituire il mezzo con 2,5 mL di terreno nuovo e incubare per 48 h. Quindi posizionare la piastra di coltura sul ghiaccio per 5 min mantenere il medium condizionato contenente lentivirus refrigerate per mantenere infettività.
  9. I supporti contenenti il lentivirus di prelievo e trasferimento a provette coniche da 15 mL. Centrifugare a 3.000 x g a 4 ° C per 3 min e quindi rimuovere il galleggiante HEK293T cellule dal surnatante mediante filtrazione a 0,4 µm.
  10. Conservare i supporti contenenti il lentivirus a 4 ° C per l'uso entro 2 giorni. Per un uso successivo, conservare le 200 µ l aliquote a − 80 ° C.

2. generazione di LN215-YFPQL e LN215-io− cellule attraverso la trasduzione lentivirale

  1. Crescere le cellule LN215 in piastre di coltura di 100 mm a 80% confluenza in DMEM completati con 10% siero bovino fetale (FBS) 100 U/mL di penicillina e 100 µ g/mL di streptomicina come descritto sopra.
    Nota: Se il dosaggio YFP-GJIC è condotto utilizzando una linea cellulare diverso, utilizzare il terreno di coltura appropriato. LN215-YFPQLe LN215-io– cellule possono essere fornite dalla Fondazione Università-industria, Università di Yonsei. Si prega di contattare l'autore corrispondente.
  2. Un giorno prima di trasduzione, lavare le cellule con 10 mL di PBS, trattano due volte con 2 mL di tripsina-EDTA 0,25% a 37 ° C per 3 min. Risospendere le cellule in 5 mL di terreno di coltura con una pipetta sierologica 10ml e regolare la densità a 50.000 cellule/mL. Aggiungere 20.000 celle in 400 µ l di media in ciascun pozzetto di una piastra di coltura 24 pozzetti per trattamento nessun virus control, YFPQLe SLC26A4 cellule.
  3. Dopo 24 h di incubazione a 37 ° C, trasduce due pozzi sostituendo il terreno di coltura con 400 µ l di una miscela 1:1 di pLVX-EIP-YFPQL o pLenti6P-SLC26A4 lentivirus e terreno di coltura fresco completati con polybrene ad una concentrazione finale di 4 µ g/mL. Per nessun controllo virus, sostituire con terreno di coltura.
  4. Incubare le cellule a 37 ° C per 15 h, aspirare il supporto contenente lentivirus, aggiungere il terreno di coltura fresco e incubare le cellule per 72 h.
    Attenzione: Per evitare la contaminazione di lentivirus tra pozzi, utilizzare nuovi suggerimenti o pipette per ciascun pozzetto quando si aspirare il terreno di coltura contenente lentivirus o dispensa il terreno di coltura fresco.
  5. Lavare che le cellule in ciascuna ben due volte con 0,5 mL di PBS, trattano con 300 µ l di tripsina-EDTA per 3 min. Risospendere le cellule in 2 mL di terreno di coltura e piastra in piastre di coltura sei pozzetti con 2 con puromicina µ g/mL.
  6. Coltura le cellule in media che contengono 2 con puromicina µ g/mL, fino a quando tutte le celle nel controllo bene sono morte (forma rotonda o galleggianti quando osservato nel microscopio), che richiede solitamente una settimana. Aggiornare i terreni di coltura contenente con puromicina ogni altro giorno durante il periodo di selezione. Se LN215-YFPQL o LN215-I– confluenti culture diventare prima che abbia completato la selezione, il trasferimento alle cellule di 100 mm piattino e continuano selezione come descritto al punto 2.5.

3. preparazione delle soluzioni necessarie per il dosaggio

  1. Preparare 500 mL di soluzione C (10 mM HEPES, 140 mM NaCl, glucosio di 10 mM, 5 mM KCl, 1 mM MgCl2e 1 mM CaCl2) e 500 mL di soluzione (10 mM HEPES, 140mm NaI, glucosio di 10 mM, 5 mM KCl e 1 mM CaCl2).
  2. Regolare il pH di entrambe le soluzioni a 7.4 con 1 N NaOH, sterilizzare le soluzioni di filtrazioni a 0,4 µm per l'archiviazione. Conservare a 4 ° C fino a 1 mese. Controllare il pH prima dell'uso.

4. placcatura del LN215-YFPQL e LN215-io− cellule

  1. Cultura LN215-YFPQL e LN215-io− cellule in piastre 100 mm separatamente in terreno di coltura per raggiungere le popolazioni necessarie per l'analisi. LN215-YFPQL e LN215-io− cellule nel 40% e 80% confluenza nelle piastre di 100 mm, rispettivamente, sono sufficienti per l'analisi di una piastra a 96 pozzetti.
  2. Un giorno prima di condurre l'analisi GJIC-YFP, lavare ogni piastra di coltura di 100 mm con 10 mL di PBS. Trattare ogni piatto con 2 mL di soluzione di tripsina-EDTA di 0,25% e incubare a 37 ° C per 5 min. Risospendere le cellule in ogni piatto in 4 mL di terreno di coltura e trasferimento in provette coniche da 15 mL.
  3. Agglomerare le cellule mediante centrifugazione a 1.000 x g per 3 min. scartare il supernatante e risospendere ogni cellulare con 5 mL di terreno di coltura. Rompere eventuali grumi di cellule in singole celle pipettando su e giù circa 20 volte con una pipetta sierologica di 10 mL.
  4. Contare le celle in un emocitometro e diluire le cellule nel terreno di coltura per rendere le sospensioni delle cellule di LN215-YFPQL a 80.000 cellule/mL e LN215-io− a 160.000 cellule/mL.
  5. Mescolare 7 mL di LN215-YFPQL e 7 mL di LN215-ho− sospensioni di cellule in un serbatoio. Aggiungere 100 µ l della miscela in ciascun pozzetto di una piastra di coltura cellulare di 96 pozzetti usando una pipetta multicanale.
    Nota: Per aggiungere 100 µ l della miscela in ciascun pozzetto della piastra a 96 pozzetti delle cellule, è necessario circa 10 mL di sospensione cellulare mista. Si consiglia di rendere più sospensione cellulare rispetto a quello necessario.
  6. Incubare le cellule a umidificare aria di 95% di 5% CO2a 37 ° C per 24 h. Il LN215-YFPQL e LN215-io−coltura cellulare dovrebbe essere 100% confluenti quando l'analisi è condotta.

5. condurre l'analisi GJIC -YFP

Nota: Utilizzare un microscopio a fluorescenza con 20 ingrandimenti e un filtro GFP per controllare le piastre da 96 pozzetti per essere sicuri che non ci sono nessun ciuffi di LN215-YFPQL o LN215-SLC26A4 cellule e che le colture cellulari sono completamente confluenti e ben distribuite prima condurre l'analisi.

  1. Almeno 30 min prima di fare il dosaggio, girare su una micropiastra e impostare a 37 ° C.
  2. Lavare il tubo di un iniettore automatico con 3 mL di etanolo al 70%, da 3 mL di acqua distillata e quindi 3 mL di soluzione a una portata di 300 µ l/s.
  3. Caldo il C-io-soluzioni e a 37 ° C nel bagno d'acqua.
    Nota: Come 100 µ l di ogni soluzione è necessaria per ciascun pozzetto della piastra 96 pozzetti, circa 10 mL di ciascuna soluzione è necessario per ogni dosaggio. Un ulteriore 10 mL della soluzione è necessaria per l'innesco di ogni piatto (totale di 20 mL) e un ulteriore 25 mL della soluzione-C è necessaria per il lavaggio di ogni piatto (totale di 35 mL).
  4. Aspirare il terreno di coltura o capovolgere la piastra per svuotarlo; Tocca fuori residuo medio.
    Nota: Siero bovino fetale residuo nei media crescita causa fluorescenza di fondo e un declino nella qualità di analisi.
  5. Aggiungere 200 µ l di soluzione C in ciascun pozzetto da un serbatoio usando una pipetta multicanale. Aspirare la soluzione di C o capovolgere la piastra per svuotare e toccare soluzione residua.
  6. Aggiungere 50 µ l µ l C-soluzione, 1 µ l di brodo chimico 2,5 mM (Vedi tabella 1) o dimetilsulfossido (DMSO) come un veicolo e poi 50 µ l µ l C-soluzione ad ogni pozzetto con una pipetta multicanale.
    Nota: Maggior parte dei reagenti in una libreria di chimica sono dissolto in DMSO e fino a 1% (v/v) è consentito nella maggior parte delle analisi cell-based24. Come DMSO ha una densità maggiore rispetto all'acqua, reagenti dissolti in DMSO tendono ad andare giù verso il basso quando aggiunto ai pozzetti della piastra cultura, che disturba le concentrazioni delle soluzioni di saggio. Questo può essere aggirato aggiungendo 50 µ l di soluzione C, reagenti in DMSO e 50 µ l C di - soluzione nell'ordine. L'ultima 50 µ l di soluzione C è per la miscelazione.
  7. Incubare le cellule a 37 ° C in aria, non in 5% CO2. Il tempo di incubazione possa essere modificato, ma 10 min è solitamente sufficiente per modulatori di canale ionico ad agire.
  8. Durante l'incubazione, impostare il programma di lettore di micropiastre per iniettare 100 µ l di soluzione ad ogni pozzetto a 1 s e per misurare la fluorescenza per 10 s a intervalli di 0,4 s. Impostare il lettore a leggere fluorescenza dal basso. La velocità d'iniezione consigliata è 135 µ l/s. Set la lunghezza d'onda di eccitazione a 485 nm e leggere l'emissione a 520 nm.
    Nota: Le impostazioni dettagliate per i programmi di lettore di micropiastre sono come segue.
    1. Fare clic sul pulsante Gestisci protocolli .
    2. Fare clic sul pulsante nuovo . Selezionare l' Intensità di fluorescenza nella sezione metodo di misura e Modalità di bene nella lettura sezione modalità. Successivamente, fare clic sul pulsante OK . Verrà visualizzata la nuova scheda.
    3. Nel menu dei Parametri di base , impostare la lunghezza d'onda di eccitazione a 485 nm e l'emissione a 520 nm. Selezionare il Fondo ottica a fluorescenza di leggere dal basso. Set misura ora di inizio a essere "0 s", il numero di intervalli per essere "25", numero di lampeggi per pozzetto e intervallo di essere "20" e intervallo di tempo di essere "0,4 s".
    4. Dal menu Layout , Disegna regione della piastra per essere letto.
    5. Nel menu delle Concentrazioni/volumi/Shacking , impostare il lettore di micropiastre per iniettare 100 µ l di soluzione ad ogni pozzetto con 135 µ l/s di velocità di iniezione.
      Nota: Evitare velocità di iniezione più veloce perché possono causare distacco delle cellule.
    6. Nel menu tempo di iniezione , impostare l'ora di inizio iniezione a 1 s. Quindi, fare clic sul pulsante Avvia la misurazione .
  9. Dopo l'incubazione, posizionare le piastre da 96 pozzetti nel lettore di micropiastre e avviare la misurazione facendo nuovamente clic tasto di Inizio misurazione .

6. calcolo dell'attività GJIC

  1. Calcolare le percentuali di YFPQL tempra e attività GJIC come23
    YFPQL tempra (%) =Equation 1
    Attività GJIC (%) =Equation 2
    Nota: In linea di principio, GJIC attività dovrebbe essere calcolata dalla differenza delle percentuali di fluorescenza YFP in pozzetti con cellule accettore e donatore e accettore-cella corrispondente solo pozzi. Tuttavia, come LN215-YFPQL cellule mostrano trascurabile YFP tempra di ioduro dopo 10 s, non prendiamo la sfondo YFP tempra in considerazione quando lo svolgimento di HTS utilizzando LN215-YFPQL e LN215-io– cellule.

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Representative Results

Ventinove cultura 96 pozzetti piastre sono state utilizzate per lo screening di 2.320 prodotti chimici per identificare nuovi modulatori GJIC dall'analisi GJIC-YFP utilizzando il LN215-YFPQL e LN215-io− cellule. I risultati ottenuti con un piatto rappresentativo sono mostrati nella Figura 2. La percentuale di fluorescenza YFP in ciascun pozzetto viene visualizzata come un grafico a linee in Figura 2A e la percentuale di attività GJIC in ciascun pozzetto è mostrata nel grafico a barre in Figura 2B. I controlli positivi e negativi e le 80 sostanze chimiche che sono state selezionate sono mostrate nella tabella 1. Ogni bene è stato trattato con 25 µM di un composto per 10 min Terbinafine completamente inibito GJIC e homosalate inibito circa il 50% di GJIC. Terbinafine è stata confermata come un inibitore GJ. Sua dose-risposta, reversibilità e altri risultati sperimentali sono stati pubblicati altrove23.

Figure 1
Figura 1 : I componenti e passaggi del dosaggio GJIC-YFP (A), il ricettore di pentagoni giallo scuro e giallo rappresentano le cellule che esprimono YFPQL prima e dopo tempra. I pentagoni neri sono cellule erogarici esprimendo SLC26A4. Le barre blu sono GJs e le barre rosse sono SLC26A4 trasportatori. I cerchi rosa sono gli ioduri. Quando sono GJs aprire (pannello superiore), ioduri passano attraverso SLC26A4 ed entrano nella cellula donatrice. Ioduri migrano a acceptor adiacenti cellule tramite tempra GJs. ioduri fluorescenza delle cellule accettore YFP. Se GJs sono chiusi (pannello inferiore), ioduri entrando le cellule del donatore non possono spostare alle cellule vicine acceptor e vengono mantenuti solo nelle cellule del donatore. La fluorescenza YFP delle cellule accettore non è significativamente ridotta dopo l'aggiunta di contrasto di fase ioduri (B) e immagini fluorescenti ottenuto durante l'esecuzione di un test YFP-GJIC. Quando accettore e donatore cellule erano cromate con un rapporto di 1:1, YFPQL tempra è stato osservato 1 min dopo gli ioduri sono stati aggiunti (pannello superiore). Quando solo le celle acceptor erano cromate, trattamento di ioduro per 1 min non ha condotto ad significativo YFPQL tempra21. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2 : Rappresentante HTS risultati usando l'analisi YFP-GJIC Sospensioni (A) di 1:2 miscele di LN215-YFPQL e LN215-io− cellule erano placcate ed incubate per 24 h, come descritto nel protocollo sezione 4. Le cellule erano quindi lavate e trattate con veicolo o sostanze chimiche come protocollo sezione 5. Tutti i prodotti chimici sono stati analizzati come campioni di 25 µM dalle soluzioni di riserva di 2,5 mM in DMSO per 10 min. Ogni bene contenuta 1 µ l DMSO e 100 µ l di soluzione C. La prima e l'ultima riga della piastra sono stata assegnata ai controlli positivi (carbenoxolone) e negativo (veicolo). I restanti 80 pozzi sono stati utilizzati per lo screening di sostanze chimiche elencate nella tabella 1. Dopo il trattamento, il dosaggio YFP-GJIC è stato condotto bene-di-bene come protocollo sezione 5. La percentuale di fluorescenza YFP in ciascun pozzetto in ogni momento è stata normalizzata al valore a 2 s e tramato contro il tempo. Le linee nella figura rappresentano le modifiche in fluorescenza YFP in ciascun pozzetto. La fluorescenza YFP in maggior parte ben 10 s variava dal 70% al 80%. Terbinafine e homosalate erano potenziali hit per inibitori GJ (B), il grafico a barre Mostra l'attività GJIC percentuale di ciascuno dei 96 pozzetti. L'attività GJIC percentuale è stata calcolata come illustrato nel passaggio protocol 6.1 e tracciata nel grafico a barre contro i numeri ben. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Beh, no. Posizione Prodotto chimico Beh, no. Posizione Prodotto chimico
1 A01 DMSO 49 E01 DMSO
2 A02 difloxacina cloridrato 50 E02 propofol
3 A03 Betamethasone valerate 51 E03 oleandomicina fosfato
4 A04 eritromicina 52 E04 il mianserin hydrochloride
5 A05 cloridrato di ciproeptadina. 53 E05 Valsartan
6 A06 Liothyronine 54 E06 salsalato
7 A07 teofillina 55 E07 idrocortisone
8 A08 Tolnaftate 56 E08 Rifaximin
9 A09 cloridrato di Trimethobenzamide 57 E09 adrenolone cloridrato
10 A10 cefamandole nafate 58 E10 Imiquimod
11 A11 il dimetilfumarato 59 E11 nonoxynol-9
12 A12 CBX 60 E12 CBX
13 B01 DMSO 61 F01 DMSO
14 B02 Piracetam 62 F02 ranolazina
15 B03 Gluconolattone 63 F03 Danthron
16 B04 azlocillina sodio 64 F04 Acedapsone
17 B05 cloruro di colina 65 F05 Atomoxetine hydrochloride
18 B06 atorvastatina calcio 66 F06 desoxycorticosterone acetate
19 B07 oxyphencyclimine cloridrato 67 F07 tramadolo cloridrato
20 B08 Propafenone cloridrato 68 F08 Terbinafina cloridrato
21 B09 Fluconazole 69 F09 Topiramato
22 B10 Lovastatin 70 F10 Gemifloxacin mesylate
23 B11 bleomicina (bleomicina b2 mostrato) 71 F11 pravastatina sodica
24 B12 CBX 72 F12 CBX
25 C01 DMSO 73 G01 DMSO
26 C02 potassio di acesulfame 74 G02 cloridrato levalbuterol
27 C03 teniposide 75 G03 metformina cloridrato
28 C04 acido tannico 76 G04 Pregabalin
29 C05 carprofen 77 G05 topotecan cloridrato
30 C06 idrossiclorochina solfato 78 G06 cloridrato di fenoxibenzammina
31 C07 pentossifillina 79 G07 Arecoline hydrobromide
32 C08 mepivacaina cloridrato 80 G08 mepartricin
33 C09 Nilutamide 81 G09 Pantoprazole
34 C10 acido aminolevulinico cloridrato 82 G10 Loperamide cloridrato
35 C11 Aniracetam 83 G11 Podofilox
36 C12 CBX 84 G12 CBX
37 D01 DMSO 85 H01 DMSO
38 D02 Metaxalone 86 H02 levodopa
39 D03 chloroguanide cloridrato 87 H03 etisteronum
40 D04 claritromicina 88 H04 enrofloxacina
41 D05 Samantik solfato 89 H05 solfato di Sparteina
42 D06 protirelin 90 H06 testosterone propionato
43 D07 teobromina 91 H07 Piridostigmina bromuro
44 D08 rosiglitazone maleato 92 H08 solfato di enilconazolo
45 D09 Losartan 93 H09 betametasone sodio fosfato
46 D10 Homosalate 94 H10 azaserine
47 D11 salicylanilide 95 H11 acrisorcin
48 D12 CBX 96 H12 CBX

Tabella 1. Elenco dei prodotti chimici proiettati in questo studio.

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Discussion

L'analisi YFP-GJIC può essere usata per HTS perché è robusto, veloce e poco costoso. Un'analisi HTS è considerata robusta se la Z'-factor è superiore a 0,525. Vedere Zhang et per una descrizione dell'analisi statistica utilizzata per valutare l'idoneità del sistema HTS dosaggi25. Quando le cellule LN215 sono state usate, la Z'-fattore era > 0,5 senza alcuna ottimizzazione del dosaggio. Se vengono utilizzati altri tipi di cella nel dosaggio e suo Z'-fattore è < 0,5, la robustezza può essere migliorata estendendo il tempo di dosaggio21. LN215 e HOS, cellule di osteosarcoma umano, le cellule necessità solo 10 s per ottenere un Z'-fattore > 0,521. Il test richiede solo accettore e donatore di cellule, la soluzione e la soluzione C. Nessun altri reagenti, come LY e calceina-AM sono necessari. Un altro vantaggio di questo test GJIC è che misura l'attività totale di GJIC delle cellule in un singolo pozzo, che si traduce in bassa variabilità tra bene. In microiniezione, recupero di gap-fluorescenza dopo photobleaching (FRAP) e saggi di dual patch clamp, una cella nell'area analizzato può incidere significativamente la misurazione. Anche se raschiare caricamento analisi valutano GJIC in un'area relativamente vasta, la procedura di caricamento raschiatura può introdurre variabilità significativa26.

I passaggi critici per il positivo svolgimento del test YFP-GJIC sono come segue. Il pH della C - e io-soluzioni deve essere regolato a 7.4 prima di ogni utilizzo. Fluorescenza di YFPQL è fortemente influenzata dal pH, nonché da alogenuri22. Una differenza di pH tra le due soluzioni può portare al cambiamento aberrante in fluorescenza YFP dopo l'aggiunta della soluzione. Le cellule del donatore e accettore devono essere dissociate completamente prima di placcatura. Grumi di cellule del donatore o accettore disturbano il dosaggio. Alla confluenza della cultura mista dovrebbe essere 100% per massimizzare la formazione di GJs fra le cellule. Il rapporto tra ricettore di cellule erogarici colpisce anche i risultati del saggio come descritto da Lee et al.. 21. come solo le celle acceptor hanno fluorescenza YFP, il rapporto e la disposizione delle cellule del donatore e accettore può essere facilmente controllati con un microscopio a fluorescenza prima di condurre l'analisi. È importante lavare la co-cultura con C-soluzione per rimuovere il residuo medio prima del trattamento con veicolo o prodotti chimici. Siero residuo o fenolo rosso dal terreno di coltura può essere una fonte di fluorescenza di fondo o un quencher di fluorescenza indesiderati, rispettivamente. Essi così possono interrompere il dosaggio YFP-GJIC. Fattori di crescita presenti in FB possono anche inibire GJIC27. D'altra parte, inedia del siero può finalmente condurre apoptosi28, che può anche essere accelerato mediante un trattamento chimico. Nella nostra esperienza, le cellule del donatore e accettore erano sane dopo trattamento di proiettato più prodotti chimici 25 µm in C-soluzione senza siero per 10 min. Alcune sostanze chimiche non erano tossici anche dopo il trattamento per 4 h. Come tossicità chimica varia, la condizione delle cellule dovrebbe verificare accuratamente quando è richiesto un trattamento per periodi più lunghi. Se le cellule non sono sane, un'evidente riduzione della fluorescenza YFP che si verifica entro 1 s dopo introduzione della soluzione può derivare da distacco cellulare. Che può essere confermata dall'osservazione al microscopio del coinvolti ben.

Le celle utilizzate nell'analisi della-YFP-GJIC devono soddisfare alcuni requisiti. Essi dovrebbero esprimere GJs in modo endogeno o essere indotti a forma GJs. Come canali composti di Cx43 sono quasi altrettanto permeabile all'atomiche cationi e anioni29, ioduri possono migrare attraverso i canali presenti in-YFP GJIC in cellule LN215. Se i canali Cx in celle di interesse hanno permeabilità bassa ioduro ma liberamente permettono la diffusione di Ca2 +, l'analisi YFP-GJIC può non essere possibile. L'assenza di attività di captazione dello ioduro è un requisito. Le cellule che esprimono canali funzionali anionici e ioduro di assorbimento rapidamente non sono appropriate per questo test. Crescita delle cellule è un altro requisito. Le cellule del donatore e accettore generate da trasduzione di lentivirus esprimere YFPQL o SLC26A4 e selezione con con puromicina per almeno 1 settimana19. Le cellule che crescono lentamente o hanno limitato la crescita come epatociti primari non sono adatte per questo test. Adesione delle cellule alla superficie della merce di plastica cultura è anche importante. Le cellule che non aderiscono saldamente, come cellule HEK293, si staccano facilmente introducendo la soluzione. Questo può essere superato da rivestimento piastre da 96 pozzetti con PLL prima di placcatura. Tuttavia, piastre di rivestimento è un passo noioso ed evitare quei tipi di cellule è raccomandato. In linea di principio, le cellule primarie come astrociti, epatociti e cheratinociti sono sotto il profilo tossicologico, fisiologicamente e farmacologicamente più rilevanti che le cellule tumorali come cellule di carcinoma delle cellule basali, glioma e del tumore epatico. Tuttavia, i tassi di crescita limitata li rendono inadeguato per il dosaggio. Futuri progressi nella coltura delle cellule che permettono la crescita di cellule primarie che soddisfano i requisiti di cui sopra per periodi più lunghi, amplierebbe le valutazioni tossicologiche, fisiologiche e farmacologiche possibili con questo test.

L'analisi GJIC-YFP può essere usata non solo per HTS, ma anche per determinare se un tipo di cellula esprime in modo endogeno GJs funzionale. Se le cellule non hanno GJs, il tasso d'estinzione YFPQL osservato in cocultured acceptor e cellule del donatore non sarebbe diverse da quello osservato quando solo le celle acceptor erano cromate. Se c'era una differenza significativa nei tassi di tempra, celle originali rapidi GJs funzionale. Poiché la differenza tende ad aumentare con il tempo come mostrato in Figura 2A, questo saggio ha una maggiore sensibilità per rilevare attività GJIC debole rispetto a raschiare-caricamento o gap-FRAP saggi. Dati di corso del tempo, le relazioni dose-risposta e valutare la reversibilità dei modulatori GJ può essere ottenuti con il test YFP-GJIC23,30. Indurre l'espressione di un Cx di interesse nelle cellule prive di GJs funzionale e generando quindi accettori e donatori, specifici saggi Cx-GJIC-YFP possono essere stabilito23. Questo saggio rende così possibile determinare i valori di IC50 di una sostanza chimica su un tipo specifico di Cx.

Come la maggior parte delle analisi di HTS, il saggio YFP-GJIC può produrre risultati falsi positivi derivanti da variazioni SLC26A4, YFPQLo permeabilità cellulare ioduro. Come falsa inibizione GJ può derivare da inibizione di SLC26A4 o desensibilizzazione di YFPQL a ioduro, ogni potenziale inibitore GJ deve essere verificati utilizzando celle che coesprimere YFPQL e SLC26A4. Se un potenziale inibitore GJ è un bloccante SLC26A4 o desensitizer YFP, YFP tempra è attenuato. Al contrario, un inibitore GJ vero non influisce YFP tempra. Metodi elettrofisiologici o purificata YFPQL può discriminare tra SLC26A4 bloccanti e desensibilizzanti YFP. Attivatori GJ che sensibilizzano YFP allo ioduro o aumentano la permeabilità di ioduro tramite canali anionici, Cx adenosina, o dagli effetti tossici aspecifici darà anche risultati falsi positivi. Si deve stabilire se potenziali attivatori GJ migliorare YFP tempra quando solo le celle accettore sono placcate. Se una sostanza chimica sensibilizza YFPQL o aumenta la permeabilità di ioduro, quindi aumenterà YFPQL tempra in colture di cellule di accettore senza donatori. I due tipi di attivatori GJ falsi si possono distinguere in altri saggi GJ, come raschiare caricamento o FRAP o utilizzando la proteina purificata di YFPQL .

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Disclosures

Gli autori non hanno conflitti di interesse a divulgare.

Acknowledgments

Questa ricerca è stata sostenuta dal programma di ricerca di scienza base attraverso la nazionale Ricerca Fondazione della Corea (NRF) finanziato dal Ministero della pubblica istruzione (2011-0023701, 2016R1D1A1A02937397 e 2018R1A6A1A03023718).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
96-well plate SPL 30096
Calcium chloride (CaCl2) Sigma C5670 I-solution
D-(+)-Glucose Sigma G7021 C-solution, I-solution
Dimethyl sulfoxide (DMSO) sigma 276855
HEPES Sigma RES6003H-B7 C-solution, I-solution
Lipofectamine 2000 Invitrogen 11668-027 transfection reagent
Magnesium chloride hexahydrate (MgCl2 6H2O) Sigma M2393 C-solution
Microplate reader  BMG LabTech  POLARstar Omega 415-1618
pMD2.G  Addgene #12259
Polybrene sigma H9268
Poly-L-lysine solution sigma P4707
Potassium chloride (KCl) Sigma P5405 C-solution, I-solution
psPAX2  Addgene  #12260
Puromycin Dihydrochloride sigma P8833
Sodium chloride (NaCl) Sigma S5886 C-solution, I-solution
Sodium hyroxide (NaOH) Sigma S2770
Sodium Iodide (NaI) Sigma 383112 I-solution

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References

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Biologia problema 144 Gap junction comunicazione intercellulare di giunzione di spacco connessina high throughput screening proteina fluorescente gialla ioduro
Un saggio di comunicazione intercellulare Junction ioduro-giallo fluorescente proteina-Gap
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Yeo, J. H., Lee, J. An Iodide-Yellow Fluorescent Protein-Gap Junction-Intercellular Communication Assay. J. Vis. Exp. (144), e58966, doi:10.3791/58966 (2019).

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