Summary
Hier presenteren we een protocol voor een roman gap junction intercellulaire communicatie assay ontworpen voor de high-throughput screening van gap junction-modulerende chemicaliën voor drugontdekking en toxicologische beoordeling.
Abstract
Kloof kruispunten (GJs) zijn celmembraan kanalen waarmee verspreiding van moleculen kleiner dan 1 kDa tussen aangrenzende cellen. Als er fysiologische en pathologische rollen, moet er van high-throughput screening (HTS) tests om te identificeren GJ modulatoren in drug discovery en toxicologie testen. Een roman jodide-geel fluorescerende eiwit-gap junction-intercellulaire communicatie (I-YFP-GJIC) assay vervult deze behoefte. Het is een cel-gebaseerde test met inbegrip van de donor en acceptor cellen die zijn ontworpen om te stabiel express een gele fluorescerende eiwit (YFP)-variant, waarvan fluorescentie gevoelig door jodide, of SLC26A4, een transporter jodide, respectievelijk uitgeblust is. Wanneer jodide wordt toegevoegd aan een gemengde cultuur van de twee celtypes, zij voert de donor cellen via de SLC26A4 transporter en diffuus aan de cellen van de aangrenzende acceptor via GJs waar ze de YFP fluorescentie doven. YFP fluorescentie is goed door goed gemeten in een kinetische modus. De YFP blussen tarief weerspiegelt GJ activiteit. De test is betrouwbaar en snel genoeg om te worden gebruikt voor de HTS. Het protocol voor de ik-YFP-GJIC-assay met behulp van de LN215 cellen, menselijke glioma cellen, wordt beschreven.
Introduction
Kloof kruispunten (GJs) fungeren als intercellulaire kanalen om de verspreiding van kleine moleculen van < 1 kDa zoals voedingsstoffen en metabolieten signalering moleculen tussen aangrenzende cellen. De regulates elementen bevatten een hemichannel of connexon in elke cel en elke connexon vormt zes connexins (Cxs)1. GJs en Cxs zijn gebruikt in de toxicologie testen van kankerverwekkende stoffen zoals polycyclische aromatische koolwaterstoffen (PAK's), die GJ remmers,2,,3,4 zijn. Verstoorde GJIC is geassocieerd met nongenotoxic carcinogenese5,6. Als een potentiële therapeutisch doel, heeft in bijzonder subtypen van vangsten7,8, bescherming tegen hart- en hersenen ischemie/reperfusie letsel9, migraine met aura10GJ betrokkenheid gemeld drug-geïnduceerde lever schade6,11, en wond genezing van12. High-throughput screening (HTS) testen zijn vereist om GJ-modulerende chemicaliën of antilichamen voor drugontdekking, voor Toxicologie testen, te identificeren en te identificeren roman cellulaire regulatoren van GJ activiteit. HTS testen kunnen ook worden gebruikt om te onderzoeken van structuur-activiteit verhoudingen van GJ modulatoren2,13,14,15.
Sommige GJIC tests omvatten dye overdracht of dual patch-clamp technieken. Lucifer gele CH (LY) en calceïne acetoxymethyl ester (calceïne-AM) zijn gebruikt in dye-overdracht testen. Cellen zijn niet luchtdoorlatend LY, die is ingevoerd door microinjection, schraap laden of electroporation. Eenmaal in de cel, LY verspreidt in naburige cellen via GJs en GJ activiteit wordt bepaald door de omvang van de LY migratie16. Calceïne-AM testen is meestal sprake van herstel van de kloof-fluorescentie na photobleaching17,18. Calceïne-AM is een cel-permeant kleurstof die door een intrinsieke nte esterase intracellulair wordt omgezet in ondoordringbare calceïne. De bepaling vereist een confocal microscoop te observeren van de overdracht van calceïne-AM in een cel van die eromheen na laser photobleaching. Als functionele GJs aanwezig zijn, calceïne-AM in aangrenzende cellen binnenkomt de photobleached cellen en de fluorescentie wordt teruggewonnen. GJ activiteit wordt bepaald door de mate van herstel van de fluorescentie van de photobleached cellen. Dye-overdracht testen zijn moeizaam en tijdrovend of lage gevoeligheden. Dual patch klemmen is een elektrofysiologische methode die regulates geleidbaarheid maatregelen. Het is relatief gevoelig, met een directe afhankelijkheid van geleidbaarheid van het aantal open GJs19; echter, het is technisch veeleisende, tijdrovend en duur20. De ik-YFP-GJIC-assay werd ontwikkeld voor gebruik in de HTS.
Figuur 1 illustreert de onderdelen en de stappen van de ik-YFP-GJIC-test, die gebruik maakt van de acceptor cellen uiten een jodide-gevoelige YFP variant, rekening houdend met H148Q en I152L (YFPQL) en donor cellen uiten van een transporter jodide (SLC26A4)21 . De twee mutaties gedragen door YFPQL toestaan blussen van fluorescentie jodide22. Jodiden worden toegevoegd aan mede gekweekte acceptor en donor cellen; ze doen niet de acceptor cellen invoeren, maar worden overgenomen door de SLC26A4 vervoerders aanwezig op de donor cellen. Jodiden in de donor cellen verspreiden via functionerende GJs in aangrenzende acceptor cellen waar ze de YFPQL -fluorescentie quench. Als GJs gesloten of geblokkeerd door remmers, kunt geen jodide de acceptor cellen doven de fluorescentie invoeren. De YFPQL blussen tarief weerspiegelt GJ activiteit. De ik-YFP-procedure voor de bepaling van de GJIC is niet ingewikkeld of tijdrovend. Het is compatibel met HTS en kan worden gebruikt voor het testen van de effecten van een groot aantal verbindingen op GJ activiteit in een relatief korte periode. Het vereist alleen acceptor en donor cellen, en de twee evenwichtige zoutoplossingen. Het hieronder beschreven protocol is gebaseerd op de LN215 cellen waarvan grote Cx Cx4321 is. De LN215-YFPQL -receptor en de LN215-ik− donor cellen werden gegenereerd door transductie met lentivirussen YFPQL of SLC26A421,23te uiten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. generatie van lentivirussen YFPQL en SLC26A4
- Groeien HEK293T menselijke embryonale nier cellen tot 80% confluency op 100 mm cultuur platen. Dulbecco van bewerkt Eagle Medium (DMEM) aangevuld met 10% foetale runderserum, 100 U/mL penicilline en 100 µg/mL streptomycine is het medium van de cultuur in het gehele protocol gebruikt om HEK293T en andere cellen die hieronder vermeld.
- Jas 6-well cultuur platen door toevoeging van 2 mL van 0.005% van steriele poly-L-lysine (PLL) oplossing aan elk putje voor 10 min. de PLL-oplossing gecombineerd en spoel het oppervlak tweemaal met 2 mL steriel water.
- Wash de HEK293T cellen met 10 mL van fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) en behandelen van de cel monolayers in elke schotel 100 mm met 0,25% trypsine-EDTA-oplossing 2 mL bij 37 ° C gedurende 3 min. Voeg 5 mL gestolde voedingsbodem en resuspendeer de cellen.
- De cellen in een hemocytometer tellen en aanpassen van de dichtheid van de celsuspensie tot 250.000 cellen/mL in een cultuurmedium en 500.000 cellen in 2 mL gestolde voedingsbodem toevoegen aan elk lysine-gecoate goed voor 6-Wells-platen. Incubeer de cellen in een bevochtigde 5% CO2/95% lucht atmosfeer bij 37 ° C gedurende 24 uur en vervolgens vervangen door het kweekmedium DMEM zonder penicilline en streptomycine.
- In een buis 1,5 mL, Verdun 20 µL van transfectiereagens met 500 µL van DMEM zonder serum of antibiotica. Meng zachtjes door pipetteren en laat het staan bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten.
- Ondertussen, Pipetteer 250 µL van DMEM in elk van twee 1,5 mL tubes en voegt u 1500 ng van pLVX-EIP-YFPQL of pLenti6P-SLC26A4, 1225 ng van psPAX2 en 375 ng van pMD2.G aan elk. De twee lentivirale plasmiden geweest eerder beschreven21. 250 µL van verdunde transfectiereagens toevoegen aan elke buis plasmide, meng zachtjes en incubeer gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur.
- Na 20 min, voeg 500 µL van transfectie reagens en plasmide complexen in de 1,5 mL tubes ontkleuring aan elke cultuur plaat goed in stap 1.4 en meng door de plaat heen en weer schommelen. Incubeer de cellen bij 37 ° C in een CO2 incubator voor 12u.
- Vervang het medium met 2,5 mL verse voedingsbodem en incubeer gedurende een extra 48 uur. Plaats vervolgens de cultuur-plaat op ijs gedurende 5 minuten om te houden van het geconditioneerde medium met lentivirus gekoeld te handhaven infectiviteit.
- Het medium met lentivirussen oogsten en transfer naar 15 mL conische buizen. Centrifugeer bij 3000 x g bij 4 ° C gedurende 3 minuten en zwevende HEK293T cellen van het supernatant door filtratie op 0.4 µm.
- Bewaar het medium met lentivirussen bij 4 ° C voor gebruik binnen de 2 dagen. Opslaan voor later gebruik, 200 µL aliquots bij −80 ° C.
2. productie van LN215-YFPQL en LN215-ik− cellen door lentivirale transductie
- Groeien LN215 cellen in 100 mm cultuur platen tot 80% confluency in DMEM aangevuld met 10% foetale runderserum (FBS) 100 U/mL penicilline, en 100 µg/mL streptomycine zoals hierboven beschreven.
Opmerking: Als de ik-YFP-GJIC-test wordt uitgevoerd met behulp van een andere cellijn, gebruik het juiste kweekmedium. LN215-YFPQLen LN215-ik- cellen kunnen worden verstrekt door de Stichting van de Universiteit en bedrijfsleven, Yonsei Universiteit. Neem contact op met de betreffende auteur. - Één dag voor signaaltransductie, wassen de cellen tweemaal met 10 mL PBS, behandelen met 2 mL van 0,25% trypsine-EDTA bij 37 ° C gedurende 3 min. resuspendeer de cellen in 5 mL gestolde voedingsbodem met een serologische pipet 10 mL en aanpassen van de dichtheid tot 50.000 cellen/mL. 20.000 cellen in 400 µL van media toevoegen aan elk putje van de plaat van een 24-well cultuur voor behandeling als geen virus zeggenschap, YFPQLen SLC26A4 cellen.
- Na 24 uur incubatie bij 37 ° C, transduce twee putten door vervanging van het kweekmedium met 400 µL van een 1:1 mengsel van pLVX-EIP-YFPQL of pLenti6P-SLC26A4 lentivirus en verse kweekmedium aangevuld met polybrene op een eindconcentratie van 4 µg/mL. Voor geen besturingselementen virus vervangen door kweekmedium.
- Incubeer de cellen bij 37 ° C gedurende 15 h, gecombineerd het medium met lentivirussen toevoegen van verse cultuurmedium en Incubeer de cellen gedurende een extra 72 uur.
Let op: Om te voorkomen dat besmetting van lentivirus tussen putten, gebruik nieuwe tips of pipets voor elk putje wanneer u gecombineerd kweekmedium dat lentivirus of afzien van verse groeimedium. - Wash die de cellen in elk goed tweemaal met 0,5 mL PBS, met 300 µL trypsine-EDTA behandelen voor 3 min. resuspendeer de cellen in 2 mL gestolde voedingsbodem en plaat in zes-well cultuur platen met 2 µg/mL puromycin.
- Cultuur van de cellen in medium met 2 µg/mL puromycin totdat alle cellen in het besturingselement ook dood zijn (rond-gevormde of drijvende wanneer waargenomen in Microscoop), die duurt meestal een week. Het vernieuwen van de voedingsbodems met puromycin om de andere dag in de periode van de selectie. Als LN215-YFPQL of LN215-ik- culturen worden heuvels voordat selectie heeft voltooid, transfer de cellen tot 100 mm plaat en selectie zoals in stap 2.5 blijven.
3. bereiding van de oplossingen die nodig zijn voor de bepaling
- 500 mL C-oplossing (10 mM HEPES, 140 mM NaCl, glucose van 10 mM, 5 mM KCl, 1 mM MgCl2en 1 mM CaCl2) en 500 mL van oplossing (10 mM HEPES, 140 mM INR, 10 mM glucose, 5 mM KCl, en 1 mM CaCl2) voor te bereiden.
- Breng de pH van beide oplossingen aan 7.4 met 1 N NaOH, steriliseren van de oplossingen in filteringen op 0.4 µm voor opslag. Bewaren bij 4 ° C voor maximaal 1 maand. Controleer de pH alvorens te gebruiken.
4. plating de LN215-YFPQL en LN215-ik− cellen
- LN215-YFPQL en LN215 cultuur-ik− cellen in 100 mm platen afzonderlijk in een kweekvloeistof te bereiken de bevolking vereist voor assay. LN215-YFPQL en LN215-ik− cellen in 40% en 80% confluentie in 100 mm platen, respectievelijk, zijn voldoende voor een 96-wells-plaat assay.
- Één dag vóór het uitvoeren van de bepaling YFP GJIC, wassen elke 100 mm cultuur plaat met 10 mL PBS. Behandelen van elke plaat met 2 mL trypsine-EDTA-oplossing van 0,25% en Incubeer bij 37 ° C voor 5 min. resuspendeer de cellen in elk bord in 4 mL gestolde voedingsbodem en transfer naar 15 mL conische buizen.
- Pellet de cellen door centrifugeren bij 1.000 x g gedurende 3 min. negeren het supernatant en resuspendeer de pellet van elke cel met 5 mL gestolde voedingsbodem. De bosjes van elke cel in afzonderlijke cellen breken door pipetteren omhoog en omlaag ongeveer 20 keer met een serologische pipet 10 mL.
- De cellen in een hemocytometer tellen, en verdunnen van de cellen in het kweekmedium te maken cel schorsingen van LN215-YFPQL bij 80.000 cellen/mL en LN215-ik− bij 160.000 cellen/mL.
- Meng 7 mL LN215-YFPQL en 7 mL LN215-ik− cel schorsingen in een reservoir. Voeg 100 µL van het mengsel toe aan elk putje van een 96-Wells cel cultuur plaat met behulp van een meerkanaalspipet.
Opmerking: Om toe te voegen 100 µL van het mengsel in elk putje van 96-Wells cel plaat, ongeveer 10 mL celsuspensie gemengde nodig is. Het is aanbevolen om meer celsuspensie dan nodig. - Incubeer de cellen in bevochtigde 5% CO2/95% lucht bij 37 ° C gedurende 24 uur. De LN215-YFPQL en LN215-ik−celkweek moet 100% heuvels als de bepaling wordt verricht.
5. het uitvoeren van de bepaling van de GJIC -YFP
Opmerking: Gebruik een fluorescentie Microscoop met 20 x vergroting, en een GFP-filter om te controleren de 96-wells-platen om er zeker van te zijn dat er geen klontjes van LN215-YFPQL of LN215-SLC26A4 cellen zijn en dat de celculturen volledig confluente en goed verdeelde vóór het uitvoeren van de test.
- Ten minste 30 minuten voordat u de test, een microplate inschakelen en instellen tot 37 ° C.
- Was de buis van een geautomatiseerde injector met 3 mL 70% ethanol, 3 mL gedestilleerd water, en vervolgens 3 mL oplossing met een debiet van 300 µL/s.
- Warm de C - en ik-oplossingen tot 37 ° C in het waterbad.
Opmerking: Als 100 µL van elke oplossing nodig is voor elk putje van de 96-wells-plaat, is ongeveer 10 mL van elke oplossing nodig voor elke assay. Een extra 10 mL van de ik-oplossing is nodig voor priming elke plaat (totaal van 20 mL) en een extra 25 mL van de C-oplossing nodig is voor het wassen van elke plaat (in totaal 35 mL). - Het groeimedium gecombineerd of omkeren van de plaat om het leeg te maken; Tik uit residuele medium.
Opmerking: Residuele foetale runderserum in de groei-media achtergrond fluorescentie en een daling in assay kwaliteit veroorzaakt. - Voeg 200 µL van C-oplossing aan elk putje uit een reservoir met een meerkanaalspipet. De C-oplossing gecombineerd of omkeren van de plaat toe op lege en tik uit residuele oplossing.
- Voeg 50 µL µL C-oplossing, 1 µL van 2.5 mM chemische materieel (Zie tabel 1) of dimethylsulfoxide (DMSO) als een voertuig, en vervolgens 50 µL µL C-oplossing aan elk putje met een meerkanaalspipet.
Opmerking: De meeste reagentia in een chemische bibliotheek worden opgelost in DMSO en tot 1% (v/v) is toegestaan in de meeste cel-gebaseerde testen24. Zoals DMSO een hogere dichtheid dan water heeft, de reagentia opgelost in DMSO neiging naar beneden naar de onderkant wanneer toegevoegd aan de putjes van de plaat cultuur die de concentraties van de assay-oplossingen verstoort. Dit kan worden omzeild door het toevoegen van 50 µL van C-oplossing, reagentia in DMSO en 50 µL C - oplossing in volgorde. De laatste 50 µL van C-oplossing is voor het mengen. - Incubeer de cellen bij 37 ° C in de lucht, niet in de 5% CO2. De incubatietijd kan worden gewijzigd, maar 10 min is meestal voldoende voor ionkanaal modulatoren om op te treden.
- Tijdens de incubatie, stel het programma reader microplate te injecteren 100 µL van ik-oplossing aan elk putje op 1 s en voor het meten van de fluorescentie voor 10 s 0,4 s tussenpozen. Stel de lezer om te lezen van de fluorescentie van de bodem. De aanbevolen injectie snelheid is 135 µL/s. Set de excitatie golflengte 485 nm en lees de emissie bij de 520 nm.
Opmerking: Gedetailleerde instellingen voor de microplate lezer's zijn als volgt.- Klik op de knop beheren protocollen .
- Klik op de knop Nieuw . Selecteer de Intensiteit van de fluorescentie in het gedeelte ' methodiek ' meting, en Goed modus in de lezing sectie modus. Klik vervolgens op de knop OK . Nieuw tabblad verschijnt.
- In de Fundamentele Parameters (menu), stelt u de excitatie golflengte op 485 nm en de emissie bij de 520 nm. Selecteer de Onderste Optic te lezen van de fluorescentie van de bodem. Set meting begintijd worden "0 s", aantal intervallen als "25", aantal flitsen per putje, en interval als "20" en intervaltijd als "0,4 s".
- Tekenen in het menu lay-out regio van de plaat te lezen.
- Stel de microplate-lezer te injecteren 100 µL van ik-oplossing aan elk putje met 135 µL/s injectie snelheid in het menu van de Concentraties/Volumes/Shacking .
Opmerking: Vermijd sneller injectie snelheden omdat ze detachement van cellen kunnen opleveren. - In het menu van de injectie tijd , stel de begintijd van de injectie 1 s. Klik vervolgens op de knop Start meting .
- Na incubatie, plaatst u de 96-wells-platen in de microplate-lezer en start de meting door te klikken Start meting weer.
6. berekening van de GJIC activiteit
- De percentages van YFPQL blussen en GJIC activiteit als23 berekenen
YFPQL blussen (%) =
GJIC activiteiten (%) =
Opmerking: In principe GJIC activiteit moet worden berekend door het verschil tussen de percentages van YFP fluorescentie in putjes met acceptor cellen en cellen van donor en de bijbehorende acceptor-cel alleen wells. Als LN215-YFPQL cellen blijkt echter te verwaarlozen YFP blussen door jodide na 10 s, wij nemen niet de achtergrond YFP blussen rekening bij het uitvoeren van HTS met behulp van LN215-YFPQL en LN215-ik- cellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Negenentwintig cultuur van de 96-wells-platen werden gebruikt om het scherm 2.320 chemische stoffen ter identificatie van roman GJIC modulatoren door ik-YFP-GJIC bepaling met behulp van de LN215-YFPQL en LN215-ik− cellen. De resultaten van een representatieve plaat zijn afgebeeld in Figuur 2. Het percentage YFP fluorescentie in elk putje wordt weergegeven als een lijndiagram in afbeelding 2 en het percentage van de GJIC activiteit in elk putje wordt weergegeven in het staafdiagram in Figuur 2B. De negatieve en positieve controles en de 80 chemicaliën die waren gescreend worden weergegeven in tabel 1. Elk werd goed behandeld met 25 µM van een stof voor 10 min. Terbinafine geremd volledig GJIC en Homosalaat geremd ongeveer 50% van de GJIC. Terbinafine werd bevestigd als een GJ-remmer. De dosis-respons, omkeerbaarheid en andere experimentele resultaten zijn gepubliceerd elders23.
Figuur 1 : De onderdelen en de stappen van de bepaling van de GJIC-YFP (A) de gele en donker gele vijfhoeken vertegenwoordigen acceptor cellen uiten YFPQL vóór en na het blussen. De zwarte vijfhoeken zijn donor cellen uiten van SLC26A4. De blauwe staven zijn GJs en de rode balken zijn SLC26A4 vervoerders. De roze cirkels zijn jodiden. Wanneer de GJs zijn open (bovenste deelvenster), jodiden passeren van SLC26A4 en de donor cel invoeren. Jodiden migreren naar aangrenzende acceptor cellen via GJs. jodiden demping de fluorescentie van de YFP van de cellen van de acceptor. Als de GJs zijn gesloten (lagere paneel), jodiden invoeren van de donor cellen niet verplaatsen naar de naburige cellen van de acceptor, en alleen in de cellen van de donor blijven behouden. De fluorescentie van de YFP van de acceptor cellen niet aanzienlijk verminderd na de toevoeging van jodiden (B) fase contrast en fluorescerende beelden verkregen bij het doen van een ik-YFP-GJIC-bepaling. Bij het acceptor en donor cellen werden uitplaten aan een verhouding van 1:1, werd YFPQL blussen waargenomen 1 min nadat jodiden (bovenste deelvenster) werden toegevoegd. Wanneer alleen acceptor cellen werden verguld, leidde jodide behandeling voor 1 min niet tot significante YFPQL blussen van21. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2 : Vertegenwoordiger HTS resultaten met behulp van de bepaling van de ik-YFP-GJIC (A) schorsingen van 1:2 mengsels van LN215-YFPQL en LN215-ik− cellen waren verguld en ge¨ uncubeerd 24u, zoals beschreven in sectie 4 protocol. Cellen werden vervolgens gewassen en behandeld met voertuig of chemicaliën zoals in protocol sectie 5. Alle chemische stoffen werden vehiculumcontrolegroep als 25 µM monsters van 2.5 mM voorraadoplossingen in DMSO gedurende 10 minuten. Elk bevatte goed 1 µL DMSO en 100 µL van C-oplossing. De eerste en de laatste rij van de plaat werden toegewezen aan negatieve (medium) en positieve (Carbenoxolon) controles. De resterende 80 putten werden gebruikt om het scherm in tabel 1opgenomen chemische stoffen. Na de behandeling, werd de ik-YFP-GJIC-assay goed-door-goed uitgevoerd zoals in het protocol van sectie 5. Het percentage van de fluorescentie van de YFP in elk putje op elk tijdstip was genormaliseerd naar de waarde op 2 s en tegen de tijd uitgezet. De lijnen in de figuur geven de wijzigingen in YFP fluorescentie in elk putje. De fluorescentie van de YFP in de meeste goed bij 10 s varieerden van 70% tot 80%. Terbinafine en Homosalaat waren potentiële hits voor GJ remmers (B) het staafdiagram toont het percentage activiteit van de GJIC van elk van de 96 putten. Het percentage GJIC activiteit was berekend zoals aangegeven in stap 6.1 van de protocol en die zijn uitgezet in het staafdiagram tegen de goed nummers. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
| Goed nr. | Positie | Chemische stof | Goed nr. | Positie | Chemische stof |
| 1 | A01 | DMSO | 49 | E01 | DMSO |
| 2 | A02 | difloxacin hydrochloride | 50 | E02 | Propofol |
| 3 | A03 | betamethasone valerate | 51 | E03 | oleandomycine fosfaat |
| 4 | A04 | erytromycine | 52 | E04 | mianserin hydrochloride |
| 5 | A05 | Cyproheptadine waterstofchloride | 53 | E05 | valsartan |
| 6 | A06 | liothyronine | 54 | E06 | salsalate |
| 7 | A07 | theofylline | 55 | E07 | Hydrocortison |
| 8 | A08 | tolnaftate | 56 | E08 | rifaximin |
| 9 | A09 | trimethobenzamide hydrochloride | 57 | E09 | adrenolone hydrochloride |
| 10 | A10 | cefamandole nafate | 58 | E10 | Imiquimod |
| 11 | A11 | Dimethylfumaraat | 59 | E11 | nonoxynol-9 |
| 12 | A12 | CBX | 60 | E12 | CBX |
| 13 | B01 | DMSO | 61 | F01 | DMSO |
| 14 | B02 | Piracetam | 62 | F02 | Ranolazine |
| 15 | B03 | Gluconolacton | 63 | F03 | danthron |
| 16 | B04 | azlocillin natrium | 64 | F04 | acedapsone |
| 17 | B05 | Cholinechloride | 65 | F05 | Atomoxetine waterstofchloride |
| 18 | B06 | Atorvastatine calcium | 66 | F06 | Desoxycorticosterone acetaat |
| 19 | B07 | oxyphencyclimine hydrochloride | 67 | F07 | tramadol waterstofchloride |
| 20 | B08 | propafenone hydrochloride | 68 | F08 | Terbinafine hydrochloride |
| 21 | B09 | Fluconazol | 69 | F09 | Topiramaat |
| 22 | B10 | Lovastatine | 70 | F10 | gemifloxacin mesylaat |
| 23 | B11 | Bleomycine (bleomycine b2 weergegeven) | 71 | F11 | Pravastatine natrium |
| 24 | B12 | CBX | 72 | F12 | CBX |
| 25 | C01 | DMSO | 73 | G01 | DMSO |
| 26 | C02 | acesulfaam kalium | 74 | G02 | levalbuterol hydrochloride |
| 27 | C03 | teniposide | 75 | G03 | metformine waterstofchloride |
| 28 | C04 | looizuur | 76 | G04 | pregabaline |
| 29 | C05 | Carprofen | 77 | G05 | Topotecan waterstofchloride |
| 30 | C06 | Hydroxychloroquine sulfaat | 78 | G06 | phenoxybenzamine hydrochloride |
| 31 | C07 | pentoxifylline | 79 | G07 | arecoline hydrobromide |
| 32 | C08 | mepivacaine hydrochloride | 80 | G08 | mepartricin |
| 33 | C09 | nilutamide | 81 | G09 | Pantoprazol |
| 34 | C10 | aminolevulinic zuur waterstofchloride | 82 | G10 | loperamide waterstofchloride |
| 35 | C11 | aniracetam | 83 | G11 | Podofilox |
| 36 | C12 | CBX | 84 | G12 | CBX |
| 37 | D01 | DMSO | 85 | H01 | DMSO |
| 38 | D02 | metaxalone | 86 | H02 | levodopa |
| 39 | D03 | chloroguanide hydrochloride | 87 | H03 | ethisterone |
| 40 | D04 | claritromycine | 88 | H04 | enrofloxacin |
| 41 | D05 | modaline sulfaat | 89 | H05 | sparteïne sulfaat |
| 42 | D06 | protirelin | 90 | H06 | testosteron propionaat |
| 43 | D07 | theobromine | 91 | H07 | pyridostigmine bromide (en) |
| 44 | D08 | Rosiglitazon maleaat | 92 | H08 | imazalil-sulfaat |
| 45 | D09 | Losartan | 93 | H09 | betamethasone natriumfosfaat |
| 46 | D10 | Homosalaat | 94 | H10 | azaserine |
| 47 | D11 | salicylanilide | 95 | H11 | acrisorcin |
| 48 | D12 | CBX | 96 | H12 | CBX |
Tabel 1. Lijst van chemische stoffen onderzocht in deze studie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De ik-YFP-GJIC-bepaling kan worden gebruikt voor HTS omdat het robuuste, snelle en goedkope. Een HTS-assay robuuste wordt beschouwd als de Z'-factor 0,525bedraagt. Zie Zhang et al. erkend voor een beschrijving van de statistische analyse gebruikt voor de beoordeling van de geschiktheid van HTS assays25. Toen LN215 cellen werden gebruikt, de Z'-factor was > 0,5 zonder enige assay-optimalisatie. Als andere celtypes worden gebruikt in de bepaling en de Z'-factor is < 0,5, de robuustheid kan worden verbeterd door uitbreiding van de assay tijd21. LN215 en HOS, menselijke Osteosarcoom cellen, cellen hoeft slechts 10 s te verkrijgen van een Z'-factor > 0,521. De bepaling vereist alleen donor en acceptor cellen, de ik-oplossing en de C-oplossing. Geen extra reagentia, zoals LY en calceïne-AM nodig zijn. Een ander voordeel van deze bepaling van de GJIC is dat het meet de totale activiteit van het GJIC van de cellen in een enkele goed, wat in lage tussen-well variabiliteit resulteert. Microinjection, gap-fluorescentie herstel na photobleaching (FRAP), en dual patch klem vitrotests, kan een cel in het getest aanzienlijk invloed hebben op de waardering. Hoewel schrapen laden assays GJIC over een relatief groot gebied evalueren, kan het schrapen-laden-procedure leiden tot aanzienlijke variabiliteit26.
De kritische stappen voor het succesvolle verloop van de bepaling van de ik-YFP-GJIC zijn als volgt. De pH van de C - en ik-oplossingen moet worden aangepast aan 7.4 vóór elk gebruik. YFPQL fluorescentie is sterk beïnvloed door pH en halogeniden22. Een pH-verschil tussen de twee oplossingen kan leiden tot afwijkende verandering in YFP fluorescentie na toevoeging van de ik-oplossing. De donor en acceptor cellen moeten volledig worden losgekoppeld voordat plating. Bosjes van donor of acceptor cellen verstoren de bepaling. De samenvloeiing van de gemengde cultuur moet 100% om te maximaliseren van de vorming van GJs tussen cellen. De verhouding van de acceptor naar donor cellen zijn ook van invloed op de resultaten van de test zoals beschreven door Lee et al.. 21. als alleen acceptor cellen YFP fluorescentie hebben, de verhouding en de rangschikking van cellen van de donor en acceptor gemakkelijk kunnen worden gecontroleerd met een fluorescentie Microscoop voor het uitvoeren van de bepaling. Het is belangrijk om te wassen de co cultuur met C-oplossing voor het verwijderen van de resterende medium vóór de behandeling met voertuig of chemicaliën. Residuele serum of fenol rood uit het kweekmedium wellicht een bron van achtergrond fluorescentie- of een ongewenste fluorescentie quencher, respectievelijk. Zij kunnen dus de ik-YFP-GJIC-assay onderbreken. Groeifactoren aanwezig in de FBS kunnen ook remmen GJIC27. Aan de andere kant, kan serum honger uiteindelijk leiden apoptosis28, die ook kan worden versneld door chemische behandeling. In onze ervaring waren de donor en acceptor cellen gezond na behandeling door meest vertoond chemicaliën op 25 µM in C-oplossing zonder serum voor 10 min. Sommige chemische stoffen waren niet toxische zelfs na de behandeling gedurende 4 uur. Als chemische toxiciteit varieert, moet de conditie van de cellen worden zorgvuldig gecontroleerd wanneer behandeling voor langere perioden vereist is. Als de cellen niet gezond zijn, een duidelijke vermindering van de fluorescentie van de YFP die binnen 1 optreedt s na invoering van de ik-oplossing uit mobiele-detachement voortvloeien kan. Dat kan worden bevestigd door microscopische observatie van het betrokken goed.
De cellen die worden gebruikt in de ik-YFP-GJIC-test moeten voldoen aan verschillende eisen. Ze moeten uitdrukken GJs endogeen of worden geïnduceerd aan formulier GJs. Zoals kanalen samengesteld uit Cx43 vrijwel even luchtdoorlatend atomaire kationen en anionen29 zijn, kunnen jodiden migreren via de kanalen in ik-YFP-GJIC in de LN215 cellen aanwezig. Als de Cx-zenders in de cellen van belang lage jodide permeabiliteit hebben maar vrij verspreiding van Ca2 +, de ik-YFP-GJIC-test niet mogelijk. Het ontbreken van jodide opname activiteit is een vereiste. De cellen die uitdrukking geven aan functionele anion kanalen en opname jodide snel zijn niet geschikt voor deze test. Celgroei is een andere eis. De donor en acceptor cellen worden gegenereerd door transductie van lentivirussen uitdrukken YFPQL of SLC26A4 en selectie met puromycin voor ten minste 1 week19. Cellen die langzaam groeien of hebben beperkte groei zoals primaire hepatocyten zijn niet geschikt voor deze test. Hechting van de cellen aan de oppervlakte van de ware kunststof cultuur is ook belangrijk. Cellen die niet stevig, zoals HEK293 cellen, aanhangen zijn gemakkelijk losgemaakt door invoering van de ik-oplossing. Dit kan worden verholpen door de coating van 96-wells-platen met PLL voordat plating. Echter coating platen is een vervelende stap, en het vermijden van die soorten cellen wordt aanbevolen. In principe zijn de primaire cellen zoals astrocyten, hepatocyten en keratinocyten toxicologisch, fysiologisch, en farmacologisch relevanter dan kankercellen zoals de cellen van glioma, hepatoma en basale cel carcinoom. Echter laten hun beperkte groeicijfers ongeschikt voor de bepaling. Toekomstige ontwikkelingen in de cultuur van de cel waarmee groei van primaire cellen die voldoet aan de bovenstaande vereisten voor langere perioden, zou het verbreden van de farmacologische, toxicologische en fysiologische evaluaties mogelijk met deze test.
De bepaling van de GJIC-YFP kan worden gebruikt, niet alleen voor HTS, maar ook om te bepalen of een celtype endogeen functionele GJs spreekt. De cellen hebben geen GJs, de YFPQL blussen tarief waargenomen in cocultured acceptor als donor cellen zou niet verschillen van die waargenomen wanneer alleen de acceptor cellen werden verguld. Als er een significant verschil in de blussen tarieven, dan met de oorspronkelijke cellen functionele GJs uitdrukken. Als het verschil de neiging om te verhogen met de tijd zoals weergegeven in Figuur 2, heeft deze bepaling een grotere gevoeligheid voor het detecteren van zwakke GJIC activiteit dan Schraap-laden of kloof-FRAP testen. Cursus tijdgegevens, dosis-respons relaties en beoordeling van de omkeerbaarheid van GJ modulatoren kunnen worden verkregen met de ik-YFP-GJIC assay23,30. Door de uitdrukking van een Cx van belang in de cellen verstoken van functionele GJs inducerende en vervolgens het genereren van acceptanten en donoren, kunnen de specifieke Cx-GJIC-YFP assays gevestigde23. Deze bepaling maakt het dus mogelijk IC50 waarden van een chemische stof op een specifiek type van Cx bepalen.
Zoals de meeste HTS testen, kan de ik-YFP-GJIC-assay vals-positieve resultaten als gevolg van veranderingen in de SLC26A4, YFPQLof cellulaire jodide permeabiliteit produceren. Zoals valse GJ remming uit de remming van SLC26A4 of desensibilisatie van YFPQL jodide voortvloeien kan, moet elke potentiële GJ-remmer worden getest met behulp van cellen die coexpress YFPQL en SLC26A4. Als een potentiële GJ-inhibitor een SLC26A4 blocker of een YFP desensitizer, is YFP blussen verzwakt. Integendeel, een ware GJ-remmer heeft geen invloed op YFP blussen. Elektrofysiologische methoden of gezuiverde YFPQL kan onderscheid maken tussen SLC26A4-blokkers en YFP desensitizers. GJ activators die YFP aan jodide sensibiliseren of jodide permeabiliteit via anion kanalen, Cx hemichannels, of door niet-specifieke toxische effecten te verhogen zal ook vals-positieve resultaten geven. Het moet worden bepaald of potentiële GJ activators YFP blussen verbeteren wanneer alleen acceptor cellen zijn verguld. Als een chemische stof YFPQL sensibiliseert of jodide permeabiliteit verhoogt, zal dan het verhogen YFPQL blussen in celculturen acceptor zonder donoren. De twee soorten valse GJ activators kunnen worden onderscheiden in andere GJ testen, zoals schrapen laden of FRAP of met behulp van gezuiverde YFPQL eiwit.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben geen conflicten van belang om te vermelden.
Acknowledgments
Dit onderzoek werd gesteund door de fundamentele wetenschap Research Program via de nationale onderzoek Stichting van Korea (NRF) gefinancierd door het ministerie van onderwijs (2011-0023701, 2016R1D1A1A02937397, en 2018R1A6A1A03023718).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96-well plate | SPL | 30096 | |
| Calcium chloride (CaCl2) | Sigma | C5670 | I-solution |
| D-(+)-Glucose | Sigma | G7021 | C-solution, I-solution |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | sigma | 276855 | |
| HEPES | Sigma | RES6003H-B7 | C-solution, I-solution |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668-027 | transfection reagent |
| Magnesium chloride hexahydrate (MgCl2 6H2O) | Sigma | M2393 | C-solution |
| Microplate reader | BMG LabTech | POLARstar Omega 415-1618 | |
| pMD2.G | Addgene | #12259 | |
| Polybrene | sigma | H9268 | |
| Poly-L-lysine solution | sigma | P4707 | |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma | P5405 | C-solution, I-solution |
| psPAX2 | Addgene | #12260 | |
| Puromycin Dihydrochloride | sigma | P8833 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma | S5886 | C-solution, I-solution |
| Sodium hyroxide (NaOH) | Sigma | S2770 | |
| Sodium Iodide (NaI) | Sigma | 383112 | I-solution |
References
- Goodenough, D. a, Goliger, J. a, Paul, D. L. Connexins, connexons, and Intercellular Communication. Annual Review of Biochemistry. 65, 475-502 (1996).
- Upham, B. L., Weis, L. M., Trosko, J. E. Modulated Gap Junctional Intercellular Communication as a Biomarker of PAH Epigenetic Toxicity: Structure-Function Relationship. Environmental Health Perspectives. 106, 975 (1998).
- U, J. E. T., Chang, C., Upham, B., Wilson, M. Epigenetic toxicology as toxicant-induced changes in intracellular signalling leading to altered gap junctional intercellular communication. Toxicology Letters. , 71-78 (1998).
- Yamasaki, H. Role of disrupted gap junctional intercellular communications in detection and characterization of carcinogens. Mutation Research - Reviews in Genetic Toxicology. , (1996).
- Yamasaki, H., et al. Gap junctional intercellular communication and cell proliferation during rat liver carcinogenesis. Environmental Health Perspectives. 101, suppl 5 191-197 (1993).
- Vinken, M., et al. Gap junctional intercellular communication as a target for liver toxicity and carcinogenicity. Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology. 44, 201-222 (2009).
- Fonseca, C. G., Green, C. R., Nicholson, L. F. B. Upregulation in astrocytic connexin 43 gap junction levels may exacerbate generalized seizures in mesial temporal lobe epilepsy. Brain Research. 929 (1), 105-116 (2002).
- Garbelli, R., et al. Expression of connexin 43 in the human epileptic and drug-resistant cerebral cortex. Neurology. 76 (10), 895-902 (2011).
- Schulz, R., et al. Connexin 43 is an emerging therapeutic target in ischemia/reperfusion injury, cardioprotection and neuroprotection. Pharmacology and Therapeutics. 153, 90-106 (2015).
- Sarrouilhe, D., Dejean, C., Mesnil, M. Involvement of gap junction channels in the pathophysiology of migraine with aura. Frontiers in Physiology. , (2014).
- Patel, S. J., et al. Gap junction inhibition prevents drug-induced liver toxicity and fulminant hepatic failure. Nature Biotechnology. 30 (2), 179-183 (2012).
- Kandyba, E. E., Hodgins, M. B., Martin, P. E. A murine living skin equivalent amenable to live-cell imaging: analysis of the roles of connexins in the epidermis. Journal of Investigative Dermatology. 128 (4), 1039-1049 (2008).
- Upham, B. L., et al. Differential roles of 2 , 6 , and 8 carbon ceramides on the modulation of gap junctional communication and apoptosis during carcinogenesis. Cancer Letters. 191, 27-34 (2003).
- Upham, B. L., et al. Structure-activity-dependent regulation of cell communication by perfluorinated fatty acids using in vivo and in vitro model systems. Environmental Health Perspectives. 117 (4), 545-551 (2009).
- Weis, L. M., et al. Bay or Baylike Regions of Polycyclic Aromatic Hydrocarbons Were Potent Inhibitors of Gap Intercellular Communication. Environmental Health Perspectives. 106 (1), 17-22 (1998).
- el-Fouly, M. H., Trosko, J. E., Chang, C. C. Scrape-Loading and Dye Transfer: A Rapid and Simple Technique to Study Gap Junctional Intercellular Communication. Experimental Cell Research. 168 (2), 422-430 (1987).
- Wade, M. H., Trosko, J. E., Schindler, M. Photobleaching Assay of Gap Junction- Mediated Communication Between Human Cells. Advancement of Science. 232 (4749), 525-528 (2010).
- Abbaci, M., et al. In vitro characterization of gap junctional intercellular communication by gap-FRAP technique. Proceedings of SPIE. , 585909 (2005).
- Neyton, J., Trautmann, A. Single-channel currents of an intercellular junction. Nature. 317 (6035), 331-335 (1985).
- Wilders, R., Jongsma, H. J. Limitations of the dual voltage clamp method in assaying conductance and kinetics of gap junction channels. Biophysical Journal. 63 (4), 942-953 (1992).
- Lee, J. Y., Choi, E. J., Lee, J. A new high-throughput screening-compatible gap junctional intercellular communication assay. BMC Biotechnology. 15 (1), 1-9 (2015).
- Galietta, L. J. V., Haggie, P. M., Verkman, A. S. Green fluorescent protein-based halide indicators with improved chloride and iodide affinities. FEBS Letters. 499 (3), 220-224 (2001).
- Lee, J. Y., Yoon, S. M., Choi, E. J., Lee, J. Terbinafine inhibits gap junctional intercellular communication. Toxicology and Applied Pharmacology. 307, 102-107 (2016).
- Hughes, J., Rees, S., Kalindjian, S., Philpott, K.
- Zhang, J. H., Chung, T. D. Y., Oldenburg, K. R. A simple statistical parameter for use in evaluation and validation of high throughput screening assays. Journal of Biomolecular Screening. 4 (2), 67-73 (1999).
- Upham, B. L. Role of Integrative Signaling Through Gap Junctions in Toxicology. Current Protocols in Toxicology. , (2011).
- Schalper, K. A., et al. Modulation of gap junction channels and hemichannels by growth factors. Molecular BioSystems. 8 (3), 685-698 (2012).
- Kulkarni, G. V., Mcculloch, C. A. G. Serum deprivation induces apoptotic cell death in a subset of Balb / c 3T3 fibroblasts. Journal of Cell Science. 1179, 1169-1179 (1994).
- Harris, A. L., Locke, D.
- Choi, E. J., Yeo, J. H., Yoon, S. M., Lee, J. Gambogic Acid and Its Analogs Inhibit Gap. Junctional Intercellular Communication. 9, 1-10 (2018).
