Summary
इस प्रोटोकॉल का वर्णन एक कोशिका छंटाई आधारित विधि के शोधन और संस्कृति के लिए फ्लोरोसेंट GABAergic या ग्लूटामैटेजिक ंयूरॉंस से neocortex और बाद में चूहों या चूहों के हिप्पोकैम्पस ।
Abstract
इस प्रोटोकॉल का समग्र लक्ष्य या तो gabaergic या glutamatergic ंयूरॉंस से व्युत्पंन शुद्ध न्यूरोनल संस्कृतियों उत्पंन है । शुद्ध ंयूरॉंस विट्रो में 16 दिनों के लिए परिभाषित मीडिया में सुसंस्कृत जा सकता है और किसी भी आमतौर पर वियोजित संस्कृतियों पर प्रदर्शन किया विश्लेषण करने के लिए उत्तरदायी हैं, सहित इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल, रूपात्मक और उत्तरजीविता विश्लेषण । इन संस्कृतियों का प्रमुख लाभ यह है कि विशिष्ट कोशिका प्रकार के रूप में जटिल बाहरी प्रभावों के अभाव में अध्ययन किया जा सकता है, ऐसे glial कोशिकाओं या अंय ंयूरॉन प्रकार से उत्पंन होने के रूप में । जब शुद्ध कोशिकाओं के साथ प्रयोग की योजना बना, तथापि, यह ध्यान दें कि ंयूरॉंस दृढ़ता से glia पर निर्भर अपने विकास और अस्तित्व के लिए वातानुकूलित मीडिया महत्वपूर्ण है । इसके अलावा, ग्लूटामैटेजिक न्यूरॉन्स synaptic संचरण की स्थापना के लिए गलिया-स्रावित कारकों पर भी निर्भर करता है । इसलिए हम यह भी वर्णन करते हैं कि एक गैर-संपर्क व्यवस्था में तंत्रिका कोशिकाएँ और तंत्रिकाओं के लिए एक विधि है । इन पद्धतियों का प्रयोग करते हुए हमने गैवाजिक और ग्लूटामैटेजिक न्यूरोनल नेटवर्कों के विकास के बीच प्रमुख अंतरों की पहचान की है । इस प्रकार, शुद्ध ंयूरॉंस के अध्ययन संस्कृतियों कैसे तंत्रिका तंत्र विकसित और कार्य के बारे में हमारी समझ को आगे बढ़ाने के लिए महान क्षमता है । इसके अलावा, शुद्ध संस्कृतियों औषधीय एजेंटों के प्रत्यक्ष कार्रवाई की जांच के लिए उपयोगी हो सकता है, विकास कारकों या विशिष्ट कोशिका प्रकार पर आनुवंशिक जोड़तोड़ के परिणामों की खोज के लिए । के रूप में अधिक से अधिक ट्रांसजेनिक जानवरों उपलब्ध हो जाते हैं, अतिरिक्त विशिष्ट सेल प्रकार के ब्याज लेबलिंग, हम उंमीद है कि प्रोटोकॉल यहां वर्णित उनकी प्रयोज्यता और क्षमता में वृद्धि होगी ।
Introduction
कोशिका छंटाई कोशिकाओं के एक विषम मिश्रण से ब्याज की कोशिकाओं के रहने के अलगाव के लिए एक शक्तिशाली उपकरण है । कोशिकाओं के आकार और आकार मापदंड के आधार पर हल किया जा सकता है, साथ ही फ्लोरोसेंट मार्करों की अभिव्यक्ति1,2। अक्सर, fluorophore-संयुग्मित एंटीबॉडी कोशिका विशिष्ट सतह एंटीजन3,4को लक्षित करके अलग सेल प्रकार के लेबल के लिए उपयोग किया जाता है । वैकल्पिक रूप से, ट्रांसजेनिक जानवरों या वायरल डिलीवरी सिस्टम को सेल-स्पेसिफिक प्रमोटरों के तहत फ्लोरोफोर्स को व्यक्त करने के लिए इंजीनियर किया गया है5,6. ऐतिहासिक रूप से ट्रांसजेनिक टूल्स और जानवरों का विकास महंगा और समय लेने वाला था । हाल ही में, कम लागत और कम तकनीकी कठिनाइयों उपलब्ध रिपोर्टर लाइनों की संख्या में एक नाटकीय वृद्धि करने के लिए नेतृत्व किया है । ट्रांसजेनिक उपकरणों और रिपोर्टर जानवरों की उपलब्धता के रूप में विकसित करने के लिए जारी है, तो भी प्रतिदीप्ति की उपयोगिता और प्रयोज्यता-आधारित सेल छंटाई के तरीकों चाहिए ।
हम हाल ही में प्रदर्शन किया है कि सेल ट्रांसजेनिक पशुओं से छंटाई नियमित रूप से सेल7संस्कृति के लिए तैयार करने में प्राथमिक ंयूरॉंस शुद्ध करने के लिए लागू कर सकते हैं । या तो चूहों या चूहों से कोशिकाओं की छंटाई करके, हम को अलग करने और संस्कृति फ्लोरोसेंट ंयूरॉंस, जो विशेष रूप से या तो gabaergic या glutamatergic ंयूरॉंस6,8,9में फ्लोरोसेंट रिपोर्टर प्रोटीन व्यक्त कर रहे थे । इन शुद्ध न्यूरोनल संस्कृतियों का अध्ययन करके, हम रास्ते में एक महत्वपूर्ण अंतर की पहचान करने में सक्षम थे gabaergic और glutamatergic न्यूरॉन्स synaptic संचरण की स्थापना के लिए glia-स्रावित कारकों पर निर्भर करता है7. इसके अतिरिक्त, सह द्वारा शुद्ध ंयूरॉंस के साथ glial कोशिकाओं को culturing, हम पिछले महत्वपूर्ण भूमिका है कि glial कोशिकाओं के विकास और10,11ंयूरॉंस के अस्तित्व में खेलने का प्रदर्शन टिप्पणियों पर विस्तार कर रहे थे । इस प्रकार, कोशिका छंटाई और कोशिका संस्कृति के संयोजन के माध्यम से, हम न केवल विशिष्ट ंयूरॉन प्रकार के अलगाव में विकास का अध्ययन करने में सक्षम थे, लेकिन उनके समारोह पर glial कोशिकाओं के प्रभाव की जांच कर रहे थे ।
हम यहाँ एक प्रोटोकॉल के शुद्धि और GABAergic और ग्लूटामेजिक न्यूरॉन्स के प्रांतस्था और हिप्पोकैम्पस से ट्रांसजेनिक चूहों या चूहों की संस्कृति के लिए प्रस्तुत करते हैं । हम भी गैर के लिए एक विधि-संपर्क सह शुद्ध ंयूरॉंस और glial कोशिकाओं की संस्कृति, Geissler एट अल.12से अनुकूलित उपस्थित । आदेश में शुद्ध GABAergic संस्कृतियों उत्पंन करने के लिए, हम VGAT से फ्लोरोसेंट ंयूरॉंस हल-वीनस-एक Wistar चूहों8 या Vgat-वीनस13चूहों, जो चुनिंदा एक बढ़ाया पीला फ्लोरोसेंट प्रोटीन संस्करण (वीनस) के > 95% में व्यक्त कॉर्टिकल गैबएरोजिक न्यूरॉन्स । शुद्ध glutamatergic संस्कृतियों उत्पंन करने के लिए, हम NexCre से फ्लोरोसेंट ंयूरॉंस हल किया है; Ai9 चूहों6,9, जो वल्कुट ग्लूटामैटरजिक ंयूरॉंस में tdटमाटो व्यक्त करते हैं । पूरे छंटाई और संस्कृति की प्रक्रिया 3-4 एच के भीतर प्रदर्शन किया जा सकता है और प्रतिकृति के सैकड़ों विद्युत शारीरिक, रूपात्मक और सेल उत्तरजीविता विश्लेषण के लिए उपयुक्त को उत्पंन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । विधि सरल है, reproducible और शुद्ध न्यूरोनल संस्कृतियों है कि ब्याज की सेल प्रकार के लिए ९७% शुद्ध से अधिक कर रहे है का उत्पादन कर सकते हैं ।
Protocol
सभी प्रक्रियाओं और पशु रखरखाव संस्थागत दिशा निर्देशों के अनुसार प्रदर्शन किया गया, जर्मन पशु कल्याण अधिनियम और यूरोपीय परिषद के निर्देश 86/609/EEC पशुओं की सुरक्षा के बारे में, स्थानीय से अनुमति की उपस्थिति में अधिकारियों (LaGeSo बर्लिन, टी-0215/
नोट: इस प्रोटोकॉल एक ट्रांसजेनिक माउस या चूहा पिल्ला से शुद्ध ंयूरॉंस की संस्कृति का वर्णन (प्रसवोत्तर दिन 0-2) । सभी तकनीकों बाँझ शर्तों के तहत किया जाना चाहिए । सभी समाधान एक ०.२ μm फ़िल्टर का उपयोग कर निष्फल किया जाना चाहिए ( सामग्री की तालिकादेखें) । ग्लास coverslips और विच्छेदन उपकरण १८५ डिग्री सेल्सियस पर 3 ज के लिए निष्फल गर्मी होना चाहिए ।
1. पाली-एल-lysine के साथ कोटिंग ग्लास Coverslips
- २०० μg/एमएल पाली-एल-lysine (PLL) समाधान के एक 5 मिलीलीटर aliquot defrosting द्वारा ग्लास coverslips तैयार करते हैं । शुद्ध इंजेक्शन ग्रेड पानी की ४५ मिलीलीटर जोड़कर इस स्टॉक समाधान को 20 μg/mL से पतला करें । एक नए ५० एमएल शंक्वाकार नली में विलयन को निबंधरहित करें । "PLL बाँझ" के रूप में इस ट्यूब लेबल.
नोट: Defrosting प्रक्रिया को गति देने के लिए कमरे के तापमान पर संग्रहित पानी का उपयोग करें । - बाँझ PLL समाधान करने के लिए १०० बाँझ, गोल, 12 मिमी ग्लास coverslips जोड़ें । हर 5-10 मिनट के लिए, 2-3 मिनट के लिए, यहां तक कि कोटिंग सुनिश्चित करने के लिए उत्तेजित करना । कोट 1 ज के लिए इस तरह से coverslips ।
नोट: जर्मन दौर कांच coverslips निर्मित (व्यास = 12 मिमी) पसंद कर रहे हैं, के रूप में वे एक विश्वसनीय संस्कृति की सतह प्रदान करते है और एक 24 के कुओं में आसानी से फिट सेल संस्कृति प्लेट । - PLL कोटिंग के ४० मिनट के बाद, टिशू पेपर के 2 टुकड़े ले लो और उंहें प्रवाह कैबिनेट में फ्लैट रखना । ७०% इथेनॉल का उपयोग कर कागज जीवाणुरहित, तो creases को हटाने और सूखी छोड़ समतल ।
- PLL के साथ 1 एच के लिए ग्लास coverslips कोटिंग के बाद, अतिरिक्त PLL समाधान निकालें और बाँझ इंजेक्शन ग्रेड पानी जोड़ें । 2-3 एस के लिए coverslips धीरे उत्तेजित करने के लिए अतिरिक्त PLL के हटाने की अनुमति । दोहराएं इस rinsing कदम 2 अतिरिक्त बार ।
- अतिरिक्त पानी निकालें, और फिर बाँझ टिशू पेपर करने के लिए coverslips हस्तांतरण । ध्यान से प्रत्येक coverslip घुमावदार संदंश का उपयोग कर अलग और सूखी छोड़ दें ।
नोट: Coverslips कि आसानी से अलग नहीं है छोड़ दिया जा सकता है । वैकल्पिक रूप से, पानी की एक छोटी राशि जुदाई मदद करने के लिए जोड़ा जा सकता है । - एक बार सूखी, एक 24-well संस्कृति थाली को coverslips हस्तांतरण ।
नोट: Coverslips तैयार किया जाना चाहिए लगभग 30 मिनट-1 ज विच्छेदन प्रक्रिया शुरू करने से पहले. प्लेटों को एक इंक्यूबेटर में ३७ डिग्री सेल्सियस और 5% CO2 में संग्रहीत किया जा सकता है जब तक आवश्यक है ।
2. हिप्पोकैम्पल और वल्कुट ऊतक वियोजन
- सेल संस्कृति समाधान की तैयारी
- तंत्रिका ऊतक के पृथक्करण के लिए, पहले एक ४० मिलीलीटर की कोशिका संस्कृति बफर (संरचना [मिमी में] के aliquot: ११६ NaCl, ५.४ केसीएल, 26 NaHCO3, १.३ नाह2पो4, 1 mgso4· 7h2ओ, 1 cacl 2 · 2h2 o, ०.५ edta · 2Na · 2Na2ओ और 25 डी-ग्लूकोज, पीएच = ७.४) । एक 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब के लिए 12 मिलीलीटर कोशिका संस्कृति बफर के बाहर उपाय; "BSA" के रूप में लेबल । एक अलग 15 मिलीलीटर ट्यूब के लिए सेल संस्कृति बफर के 5 मिलीलीटर बाहर उपाय; "papain" के रूप में लेबल । ३७ डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए एक पानी स्नान में दोनों ट्यूबों सेते ।
- फ़िल्टर-शेष सेल संस्कृति बफर, लेबल के रूप में बफर और स्टोर 4 डिग्री सेल्सियस पर आवश्यक जब तक ।
- वजन १२० गोजातीय सीरम Albumin (BSA) की मिलीग्राम और "BSA" लेबल ट्यूब में जोड़ें । बाहर वजन 7 papain मिलीग्राम और "papain" लेबल ट्यूब में जोड़ें । 15 मिनट के लिए पानी स्नान करने के लिए दोनों ट्यूबों लौटें ।
नोट: यह पापेन पाउडर के हस्तांतरण की सुविधा के लिए नाव तौलना करने के लिए बफर की एक छोटी राशि जोड़ने के लिए उपयोगी है । - एक बार सभी चूर्ण भंग कर दिया है, फ़िल्टर-एक ताजा 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब के लिए प्रत्येक समाधान जीवाणुरहित । ट्यूब papain के लिए, "papain-बांझ" के रूप में फ़िल्टर्ड समाधान लेबल । ट्यूब BSA के लिए, 3 ट्यूबों में बीएसए समाधान विभाजित, बीएसए समाधान के 4 मिलीलीटर युक्त प्रत्येक । "BSA-बांझ" और या तो "1", "2" या "3" के रूप में प्रत्येक ट्यूब लेबल । वापस पानी स्नान करने के लिए सभी ट्यूबों वापसी और जब तक ३७ डिग्री सेल्सियस पर सेने को जारी रखने के लिए आवश्यक है ।
- ऊतक विच्छेदन के लिए तैयार
- ३५ मिमी फिल्टर कागज का एक टुकड़ा ले लो ( सामग्री की मेजदेखें) और ७०% इथेनॉल के साथ बांझ; एक १०० mm पेट्री डिश के ढक्कन में सूखी छोड़ दो, एक प्रवाह कैबिनेट में ।
- कैंची, संदंश, स्केलपेल और रंग बाहर लेआउट ( सामग्री की मेजदेखें) हिप्पोकैम्पस और प्रांतस्था के विच्छेदन के लिए आवश्यक है ।
- प्लेस २ ३५ mm पेट्री व्यंजन और एक १०० mm पेट्री डिश प्रवाह कैबिनेट के केंद्र में एक सुलभ स्थान में बाँझ फिल्टर कागज युक्त ।
- ट्रांसजेनिक NexCre लीजिए; Ai9 और VGAT वीनस माउस पिल्ले कि dissected किया जाना है । उपयुक्त उत्तेजना और उत्सर्जन फिल्टर के साथ एक फ्लोरोसेंट लैंप का प्रयोग करें ( सामग्री की तालिकादेखें) को जंगली प्रकार littermates से फ्लोरोसेंट पिल्ले भेदभाव ।
- तुरंत पशुओं विदारक से पहले, एक ३५ मिमी पेट्री पकवान ठंडा, बाँझ कोशिका संस्कृति बफर के साथ भरें ।
नोट: एक पेट्री डिश dissections के बीच उपकरणों की सफाई के लिए है, और अंय हिप्पोकैम्पस और प्रांतस्था इकट्ठा करने के लिए है ।
- ऊतक विच्छेदन
- जैसे ही सेल संस्कृति बफर डाला जाता है, एक postप्रसवदिवस 0-2 ट्रांसजेनिक माउस या चूहे पिल्ला बड़े, तेज कैंची का उपयोग और प्रवाह कैबिनेट में सिर हस्तांतरण करने के लिए एक बाँझ १०० मिमी पेट्री डिश का उपयोग करें सिर काटना । Forceps, कैंची और एक रंग का उपयोग करने के लिए ध्यान से एक ट्रांसजेनिक पिल्ला के मस्तिष्क बाँझ फिल्टर कागज के हस्तांतरण करने के लिए ।
- एक प्रकार का प्रयोग करें 22 स्केलपेल दूर सेरिबैलम को काटना और 2 गोलार्द्धों अलग । गोलार्द्धों laterally रोल करने के लिए एक छोटा सा रंग का उपयोग करें । प्रत्येक गोलार्द्ध पर, प्रेस नीचे धीरे ताकि कॉर्टेक्स फिल्टर कागज के संपर्क में आता है । धीरे से मध्य मस्तिष्क क्षेत्रों हिप्पोकैम्पस और प्रांतस्था प्रकट करने के लिए कदम ।
नोट: बहुत अधिक दबाव लागू करने के लिए नहीं सावधान रहना जब गोलार्द्धों या कोशिकाओं पर नीचे दबाने कुचल हो सकता है । - प्रत्येक गोलार्द्ध से हिप्पोकैम्पस और कॉर्टेक्स को अलग करने के लिए एक स्केलपेल या स्पैटला का उपयोग करें । एक ३५ mm पेट्री डिश जिसमें ठंडा सेल कल्चर बफर होता है, को विच्छेदार ऊतक स्थानांतरित करता है ।
नोट: यदि कई जानवरों विदारक, बर्फ पर एक ५० मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में बाँझ सेल संस्कृति बफर की दुकान । प्रत्येक विच्छेदन के बाद, ठंडा कोशिका संस्कृति बफर को विच्छेदित ऊतक स्थानांतरण । - Cortico-hippocampal ऊतक के सफल विच्छेदन के बाद, जल स्नान से बाँझ papain समाधान प्रवाह कैबिनेट के लिए स्थानांतरण । विच्छेदार हिप्पोकैम्पस और कॉर्टेक्स को बाँझ ३५ एमएम पेट्री डिश के ढक्कन में ट्रांसफर करने के लिए 3 एमएल पाश्र पिपेट का इस्तेमाल करें । एक criss-पार गति में काटना, एक प्रकार के फ्लैट भाग का उपयोग कर 22 स्केलपेल, जब तक ऊतक छोटे टुकड़ों में है ।
- पेट्राइन डिश के ढक्कन से कटे हुए टिश्यू को पैपेन ट्यूब में ट्रांसफर करने के लिए थोड़ी मात्रा में पैपेन सॉल्यूशन का इस्तेमाल करें । पानी स्नान करने के लिए papain ट्यूब वापसी और 25 मिनट के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस पर ऊतक सेते ।
- Papain ऊष्मायन के दौरान, बनाओ पूर्ण प्रतिदीप्ति मीडिया समाधान । B27 के 1 मिलीलीटर aliquot, Glutamax के एक ०.५ मिलीलीटर aliquot और एक ०.५ मिलीलीटर aliquot कलम Strep के defrost । Aliquot ४८.५ मिलीलीटर एक कम प्रतिदीप्ति मीडिया हाइबरनेट करने के लिए एक ५० मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब । समाधान के लिए B27, Glutamax और कलम Strep जोड़ें । हल अच्छी तरह से हिला, तो फ़िल्टर-जीवाणुरहित और लेबल के रूप में "एक पूरा मीडिया हाइबरनेट" (तिथि और प्रथमीक्षर के साथ) । एक जल स्नान में ३७ ° c पर सेते ।
- Papain ऊष्मायन के बाद, प्रवाह कैबिनेट के लिए papain ट्यूब और बाँझ बीएसए-ट्यूबों हस्तांतरण । 1 मिलीलीटर पाश्तूर पिपेट का उपयोग केवल पैपेन ट्यूब से बीएसए-ट्यूब 1 में कॉर्टिको-हिप्पोकैम्पल ऊतक निकालने के लिए करें ।
नोट: ध्यान रखना अतिरिक्त papain समाधान के हस्तांतरण को कम करने के लिए ।
- कोशिकाओं का वियोजन
- ऊतक के किसी भी बड़े clumps को तोड़ने के लिए, ऊतक triturate कई बार एक 1 मिलीलीटर पाश्चर पिपेट का उपयोग कर । इसके बाद, ऊतक triturate 7 बार एक ठीक टिप पाश्चर पिपेट का उपयोग कर । ऊतक छोड़ 30 एस के लिए खड़े करने के लिए, तलछट के लिए ऊतक के बड़े टुकड़े की अनुमति ।
- 30 एस के बाद, समाधान और ऊतक के निचले 1 मिलीलीटर बीएसए-ट्यूब 1 से बीएसए-ट्यूब 2 स्थानांतरण । एक महीन टिप पाश्चर pipette का उपयोग कई बार बीएसए-ट्यूब 2 में ऊतक triturate ।
- Trituration के बाद, स्थानांतरण फिर से ऊतक और समाधान के निचले 1 मिलीलीटर से बीएसए-ट्यूब 1, लेकिन अब BSA-ट्यूब 3 करने के लिए । एक महीन टिप पाश्चर पिपेट का उपयोग कर कई बार बीएसए-ट्यूब 3 में ऊतक triturate ।
- Trituration के बाद, ट्यूब 2 और 3 से बीएसए-ट्यूब 1 में सभी समाधान और ऊतक स्थानांतरण । एक और 2-3 बार triturate और 3 मिनट के लिए ३,००० एक्स जी पर केंद्राभ ।
- अपकेंद्रण के दौरान, पूरा तंत्रिका बेसल एक मीडिया (एनबीए मीडिया) बनाते हैं । Aliquot ४८.५ एक ५० मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब के लिए एनबीए मीडिया के एमएल और एक जल स्नान में ३७ डिग्री सेल्सियस पर सेने । इस ट्यूब लेबल "केवल एनबीए" । इसके अलावा, B27 के 1 एमएल aliquot, glutamax के एक ०.५ मिलीलीटर aliquot और कमरे के तापमान पर कलम strep की एक ०.५ मिलीलीटर aliquot डिफ्रॉस्ट ।
- अपकेंद्रण के बाद, ध्यान से पेलेटेड ऊतक से supernatant को हटाने और 2 मिलीलीटर पूरा मीडिया में कोशिकाओं को फिर से निलंबित । ऊतक को ऊपर और नीचे 20 बार triturate करने के लिए एक P1000 पिपेट का उपयोग करें ।
नोट: ध्यान रखना कोशिकाओं को भी सख्ती से पिपेट नहीं है । यदि बहुत अधिक दबाव लागू किया जाता है, तो कोशिकाएं क्षतिग्रस्त हो सकती हैं । - एक 30 μm सेल छलनी के माध्यम से एक polystyrene नमूना ट्यूब में सेल निलंबन फिल्टर करने के लिए एक 1 मिलीलीटर पाश्र पिपेट का उपयोग करें ।
नोट: सेल निलंबन तुरंत सेल चलनी के माध्यम से पारित नहीं करता है, तो यह प्रवाह शुरू करने के लिए एक बाँझ दस्ताने के साथ छलनी के शीर्ष पर प्रेस करने के लिए आवश्यक हो सकता है । इस महत्वपूर्ण कदम सेल सॉर्टर के clogging रोकता है । - छंटाई के बाद ंयूरॉंस इकट्ठा करने के लिए, पूरा मीडिया के ३०० μL pipetting द्वारा संग्रह ट्यूबों तैयार polypropylene ट्यूबों के लिए आवश्यक संख्या ।
- अब सेल का निलंबन छांटने के लिए सेल सॉर्टर के पास ले जाने की तैयारी है । सेल निलंबन ले लो, अतिरिक्त संग्रह ट्यूबों और नमूने के कमजोर पड़ने के मामले में पूरा मीडिया पुर्जों की आवश्यकता है ।
3. सेल शुद्ध GABAergic या Glutamatergic ंयूरॉंस की छंटाई
नोट: सॉर्टर के नमूना टयूबिंग कुल्ला के दौरान बैक्टीरियल संदूषण की संभावना को कम से कम 5 मिनट के लिए ७०% इथेनॉल छंटाई करने से पहले । विस्तृत छंटाई मापदंडों उपकरणों के बीच बदलती हैं, मौलिक विचार इस प्रकार हैं ।
- पहले सेल सॉर्ट के दौरान, एक जंगली प्रकार जानवर से छंटनी और कोशिकाओं की तुलना द्वारा अवेलेबल कोशिकाओं से पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति के स्तर की स्थापना ।
- प्रत्येक फ्लोरोसेंट सेल प्रकार के लिए सॉर्ट किया जा करने के लिए, उपयुक्त उत्तेजना और उत्सर्जन फिल्टर चुनें । Excite वीनस और Tdटमाटटो प्रोटीन क्रमशः ४८८ एनएम या ५३१ एनएम उत्तेजना तरंग दैर्ध्य का उपयोग कर । 530/40 और 575/30 उत्सर्जन फिल्टर सेट के माध्यम से उत्सर्जित प्रकाश का पता लगाने, क्रमशः ।
- Polypropylene संग्रह ट्यूबों जोड़ें, पूर्ण मीडिया के ३०० μL युक्त, सेल संग्रह के लिए सेल सॉर्टर के लिए ।
- उच्च शुद्धता के लिए, प्रकार चमकीले फ्लोरोसेंट कोशिकाओं (उदाहरण के लिए चित्रा 1b देखें सॉर्ट कोशिकाओं के डॉट भूखंडों).
- छंटाई के बाद, इष्टतम परिणामों के लिए, शुद्धता के स्तर का अनुमान करने के लिए छांटे गए कोशिकाओं की शुद्धता परीक्षण करते हैं । ध्यान दें कि सॉर्टिंग निंन कक्षों की सामांय पुनर्प्राप्ति दर के बीच है 70 – 80% ।
- प्रत्येक संग्रह ट्यूब में सॉर्ट किए गए कक्षों की संख्या नोट करें । यह मान कक्ष सॉर्टिंग इंस्ट्रूमेंट द्वारा दिया जाता है ।
नोट: सेल छंटाई एक ७० μm नोक (७० साई म्यान द्रव दबाव) या एक १०० μm नोक (20 साई म्यान द्रव दबाव) का उपयोग कर किया जा सकता है ।
4. छांटे गए ंयूरॉंस के culturing
- सेल छंटाई के बाद, एक 1 मिलीलीटर पाश्र पिपेट का उपयोग कर 2 मिलीलीटर दौर नीचे अपकेंद्रित्र ट्यूबों के लिए कोशिकाओं को एकत्र हस्तांतरण । ३,००० x g पर कोशिकाओं को 3 मिनट के लिए सेंट्रलाइज करने के लिए एक सेल गोली के रूप में ।
नोट: मदद करने के लिए सेल गोली के स्थान की पहचान, जावक का सामना करना पड़ ढक्कन के काज के साथ दौर नीचे अपकेंद्रित्र ट्यूबों मालूम, जो सेल गोली के लिए अपकेंद्रित्र ट्यूब के पीछे फार्म की अनुमति देता है (यानी, टिकी के रूप में ट्यूब के एक ही पक्ष पर) । - अपकेंद्रण के दौरान, B27 के 1 मिलीलीटर जोड़ने, Glutamax के ०.५ मिलीलीटर और कलम के ०.५ मिलीलीटर-Strep पूर्व गरम एनबीए मीडिया के ४८.५ मिलीलीटर के लिए । हल अच्छी तरह से हिला, तो और लेबल के रूप में एनबीए पूरा मीडिया (तिथि और प्रथमीक्षर के साथ) फ़िल्टर । पानी स्नान करने के लिए आवश्यक जब तक लौटें ।
- अपकेंद्रण के बाद, एक 1 मिलीलीटर पाश्चर पिपेट एक अलग सेंट्रलाइज ट्यूब को supernatant हस्तांतरण करने के लिए उपयोग (supernatant इनकेस सेल गोली परेशान किया गया था बनाए रखने)। फिर से निलंबित सेल गोली के लिए आवश्यक राशि में पूर्व गरम पूरा एनबीए मीडिया १,००० कोशिकाओं के एक सेल घनत्व को प्राप्त करने के लिए/P200 या P1000 pipetting के साथ ऊपर और नीचे pipetting द्वारा कोशिकाओं को फिर से निलंबित ।
- अलग कोशिकाओं की उपस्थिति की पुष्टि करने के लिए, एक खुर्दबीन के नीचे सेल समाधान की जाँच करें, एक 4x या 10x उद्देश्य लेंस का उपयोग. वैकल्पिक रूप से, एक coverslip पर सेल समाधान की एक छोटी राशि पिपेट और खुर्दबीन के नीचे की जाँच करें. यदि कक्षों की बड़ी संख्या मौजूद है, तो चरण ४.३ से supernatant छोड़ा जा सकता है ।
- एक भी सेल निलंबन सुनिश्चित करने के लिए 2 – 3 एस के लिए एक मध्यम गति पर कोशिकाओं, भंवर चढ़ाना से पहले. Vortexing के बाद, जल्दी से प्रत्येक coverslip के केंद्र के लिए सेल निलंबन के 10 μl पिपेट । कोशिकाओं pipetting के बाद, जल्दी से इनक्यूबेटर (5% CO2/३७ डिग्री सेल्सियस) के लिए प्रत्येक थाली वापस और 1 ज के लिए सेते ।
नोट: यदि एकाधिक 24-well प्लेटों के लिए कोशिकाओं को जोड़ने, प्लेटों के बीच कोशिकाओं vortexing द्वारा भी सेल घनत्व सुनिश्चित करते हैं । - 1 ज के बाद, पूर्व गरम पूरा एनबीए मीडिया के ५०० μL के साथ कोशिकाओं को खिलाने और इनक्यूबेटर पर लौटें ।
नोट: जब कोशिकाओं खिला, यह मीडिया पिपेट करने के लिए महत्वपूर्ण है धीरे से नीचे की ओर से अच्छी तरह से सेल टुकड़ी से बचने के लिए । अल्प प्रयोगों (< 16 दिनों) के लिए उपरोक्त घनत्व में भोजन करना आवश्यक नहीं है । जब कोशिकाओं का एक बड़ा घनत्व चढ़ाना, अधिक लगातार खिला अंतराल ( चर्चादेखें) की आवश्यकता हो सकती है ।
5. खगोल cyte समृद्ध Glial समर्थन संस्कृतियों
नोट: Glial संस्कृतियों का उत्पादन14 और सेल संस्कृति आवेषण का उपयोग पहले से12वर्णित किया गया है । संक्षेप में, खगोल कोशिका समृद्ध गलिया संस्कृतियों cortico से प्राप्त कर रहे हैं-hippocampal ऊतक (मेनिन्जेस के साथ हटा दिया; P2-P5), जो एक सप्ताह के लिए एक 20 μg/एमएल PLL-लेपित 6-कूप प्लेटों पर, सीरम पूरक DMEM मीडिया में सुसंस्कृत गया है ।
- सह करने के लिए संस्कृति शुद्ध ंयूरॉंस और glial कोशिकाओं, पारित होने सेल संस्कृति आवेषण (०.४ μm पोर आकार की आवश्यक संख्या के लिए संगम glial कोशिकाओं- सामग्री की मेजदेखें) । कोशिकाओं को पारित करने के लिए, इनक्यूबेटर से संगम glial कोशिकाओं से युक्त एक 6-कूप प्लेट हटाने और 2 कुओं, 2 बार पूर्व गरम (३७ डिग्री सेल्सियस) फॉस्फेट buffered खारा (PBS) के 2 मिलीलीटर के साथ धोने ।
- पीबीएस समाधान और एक P1000 पिपेट का उपयोग करने के लिए पूर्व के 1 मिलीलीटर गरम जोड़ने (37 डिग्री सेल्सियस) trypsin (1:250)/ एक अच्छी तरह से समाधान ।
- 6-कूप प्लेट को इनक्यूबेटर में लौटाएं और प्रत्येक 2-3 मिनट की जांच सेल टुकड़ी के लिए करें ।
- एक बार महत्वपूर्ण सेल टुकड़ी हुई है, पिपेट कोशिकाओं और सेल समाधान धीरे ऊपर और नीचे एक ठीक टिप pasteur पिपेट का उपयोग कर, आगे और टुकड़ी अलग कोशिकाओं की जुदाई में मदद करने के लिए ।
- सेल समाधान एक 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब और अपकेंद्रित्र के लिए ३,००० x g पर 3 मिनट के लिए स्थानांतरण ।
- एक P1000 पिपेट का उपयोग कर कोशिकाओं को फिर से निलंबित पूर्व गर्म (३७ डिग्री सेल्सियस) एनबीए पूरा मीडिया द्वारा धीरे पिपेट ऊपर और नीचे जब तक सेल गोली समाधान में है ।
- किसी हीमोसाइटोमीटर या किसी स्वचालित कक्ष काउंटर का उपयोग करके कोई कक्ष गणना निष्पादित करें ।
नोट: संस्कृति में 7 दिनों के बाद, लगभग 750000-1000000 कोशिकाओं एक 6 अच्छी तरह से थाली के प्रत्येक अच्छी तरह से काटा जा सकता है । - प्लेट ४०,००० glial कोशिकाओं को प्रत्येक कोशिका संस्कृति में डालने के लिए एक ५०० μl बिंदकी (८० कोशिकाओं/μl) ।
- कोशिकाओं 1 एच के लिए पालन करने के लिए अनुमति देने के बाद, 24-अच्छी तरह से शुद्ध ंयूरॉंस युक्त प्लेटों को glial-कवर सेल संस्कृति आवेषण हस्तांतरण करने के लिए बाँझ संदंश का उपयोग करें । अतिरिक्त मीडिया को सेल कल्चर इंसर्ट (लगभग ३०० μL) की सतह से निकालें ।
नोट: के रूप में हवा बुलबुले अक्सर सेल संस्कृति आवेषण के नीचे फंस सकता है, यह धीरे इन बुलबुले बेदखल करने के लिए आवेषण झुकाव के लिए आवश्यक हो सकता है । यदि अधिक glial कोशिकाओं कोशिका संस्कृति डालने के लिए जोड़ रहे हैं, आगे धोने और अपकेंद्रित्र कदम अतिरिक्त trypsin, जो सेल अस्तित्व के लिए हानिकारक हो सकता है हटाने के लिए आवश्यक हो सकता है ।
Representative Results
वियोजन और ट्रांसजेनिक माउस या चूहा cortico से फ्लोरोसेंट ंयूरॉंस की छंटाई कोशिका-hippocampal ऊतक लगभग 3-4 एच में किया जा सकता है । परिणाम अत्यधिक शुद्ध फ्लोरोसेंट ंयूरॉंस की आबादी है, जो 16 दिनों के लिए संस्कृति में उगाया जा सकता है ।
शुद्ध संस्कृतियों उत्पंन करने के लिए, ट्रांसजेनिक पशुओं पहले उपयुक्त फिल्टर सेट के साथ एक फ्लोरोसेंट लैंप का उपयोग कर की पहचान की गई (फ्लोरोसेंट नवजात VGAT वीनस और NexCre के उदाहरण हैं; Ai9 माउस पिल्ले चित्र 1aमें दिखाए जाते हैं) । ट्रांसजेनिक जानवरों की पहचान के बाद, विच्छेदित ऊतक विच्छेदित था, और सबसे दृढ़ता से फ्लोरोसेंट ंयूरॉंस के लिए एक शुद्ध सेल आबादी का उत्पादन हल किया गया । उदाहरण के लिए, NexCre के लिए फ्लोरोसेंस तीव्रता डॉट भूखंडों; Ai9 और VGAT वीनस माउस ंयूरॉंस, FACS के दौरान प्राप्त, चित्र 1bमें दिखाए जाते हैं । जब अनुकूलित, यह प्रांतस्था और व्यक्ति के हिप्पोकैम्पस से ५००,००० और ८००,००० कोशिकाओं के बीच फसल के लिए संभव है-2 NexCre; Ai9 या VGAT वीनस चूहों. कोशिकाओं को ६०० घटनाओं के ऊपर की ओर एक गति से हल किया जा सकता है । सेल शुद्धता का अनुमान एक परमाणु मार्कर के रूप में DAPI का उपयोग कर प्रदर्शन किया गया (चित्रा 1 सी). जोरदार सकारात्मक कोशिकाओं की छंटाई करके, अधिक से अधिक ९७% की शुद्धता नियमित रूप से7हासिल किया जा सकता है ।
सफल छंटाई के बाद, मढ़वाया ंयूरॉंस के आकार में दौर दिखाई देना चाहिए, एक चिकनी झिल्ली है और लगभग के बाद neurites अंकुरित देखा जाना चाहिए 1 ज इन विट्रो में (चित्रा 2a, B) । विट्रो में 7 दिनों के द्वारा, हालांकि कुछ कोशिका मृत्यु स्पष्ट हो सकता है, व्यवहार्य कोशिकाओं को सभी संस्कृति की स्थिति में मौजूद होना चाहिए (चित्र 2c, D) । 12 – 16 दिनों में विट्रो में, पूरे सेल पैच-क्लैंप रिकॉर्डिंग और biocytin-भरने15का उपयोग कर, यह शुद्ध न्यूरॉन्स के रूपात्मक और इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल विकास की जांच करने के लिए संभव है (चित्रा 3). शुद्ध संस्कृतियों के विश्लेषण से पता चलता है कि दोनों glutamatergic और GABAergic ंयूरॉंस के लिए अपने सेल निकायों से axons और dendrites विस्तार कर रहे थे (चित्रा3 ए, बी) और के जवाब में कार्रवाई क्षमता उत्पंन करने की क्षमता बनाए रखने अधिदेहली विध्रुवण धारा इंजेक्शन (चित्र 3C, D) । विशेष रूप से, तथापि, शुद्धि के बाद, केवल GABAergic न्यूरॉन्स सहज synaptic संचरण की महत्वपूर्ण मात्रा में प्राप्त किया, और ग्लूटामैटजिक न्यूरॉन्स glial कोशिकाओं की अनुपस्थिति में बहुत कम synaptic संचरण प्राप्त (चित्रा 3E , च) ७।
जैसा कि हम पहले रिपोर्ट किया है, शुद्ध संस्कृतियों में कोशिकाओं को और अधिक खराब नहीं सॉर्ट संस्कृतियों में उन लोगों की तुलना में जीवित रहने के लिए करते है और काफी छोटे dendrites और7axons है । इन घाटे को दूर करने के लिए, हम अनुकूलित और glial कोशिकाओं12,14के साथ शुद्ध संस्कृतियों के विकास के समर्थन के लिए तरीके लागू किया है । हमारे glial समर्थन संस्कृतियों (DIV7) के सेलुलर संरचना चित्र 4aमें दिखाया गया है । इन संस्कृतियों मुख्यतः glial तंतुक अंलीय प्रोटीन (GFAP) सकारात्मक astrocytes निहित है, लेकिन यह भी भेदभाव अणु के कुछ क्लस्टर (CD11b) सकारात्मक microglia और myelin बुनियादी प्रोटीन (MBP) सकारात्मक oligodendrocytes निहित । DIV 7 के बाद, इन कोशिकाओं को सेल संस्कृति आवेषण के लिए गैर-शुद्ध ंयूरॉंस का समर्थन संपर्क प्रदान passaged किया जा सकता है (चित्रा 4B, सी) । Glia के विश्लेषण-ंयूरॉन सह संस्कृतियों से पता चलता है कि लगभग ४०,००० glial कोशिकाओं को लंबे समय तक जीवित रहने और दोनों शुद्ध glutamatergic और GABAergic ंयूरॉंस के विकास में सुधार करने के लिए पर्याप्त थे (चित्रा 4d, ई)7। इसके अलावा, इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल विश्लेषण से पता चलता है कि ग्लूटामेजिक ंयूरॉंस, glial कोशिकाओं के साथ सह संवर्धित, अत्यधिक सक्रिय थे और जोरदार नेटवर्क गतिविधि (glial समर्थित glutamatergic ंयूरॉंस का प्रतिशत कार्रवाई के फटने की वृद्धि हुई थी क्षमता: ६२%; द = 28; चित्रा 4F , छ) । Glial समर्थन इसलिए न केवल ंयूरॉन वृद्धि और अस्तित्व को बढ़ावा देने के लिए महत्वपूर्ण है, लेकिन यह भी synaptic संचरण को बढ़ावा देने और glutamatergic संस्कृतियों में नेटवर्क गतिविधि की स्थापना के लिए ।
चित्र 1: ग्लूटामैटेजिक और गैबएरोजिक न्यूरॉन्स का शुद्धिकरण । (क) नेक्ससीआरआर में टीटटमाटर की ट्रांसजीन अभिव्यक्ति से प्रतिदीप्त संकेत दर्शाने वाली छवियां; Ai9 चूहों (ऊपर) और वीनस में VGAT वीनस चूहों (नीचे). स्केल पट्टियां = 5 मिमी । (ख) ताप-हिप्पोकैम् पल की टीटटमाटर और वीनस प्रतिदीप्ति के प्रकीर्णन से वियोजित कोशिकाएं Ai9 चूहों (ऊपर) और VGAT वीनस चूहों (नीचे). दृढ़ता से प्रतिदीप्त TdTomato या वीनस ंयूरॉंस छंटाई के लिए चुने गए थे (gating बक्से द्वारा संकेत) । (ग, बाएं) हल TdTomato (ऊपर) और वीनस (नीचे) सकारात्मक ंयूरॉंस की confocal छवियां । (ग, दाएं) मर्ज की गई छवि प्रदर्शित करने वाले कक्षों में DAPI के साथ सह-दाग (नीली स्यूडोकोलैर में) । TdTomato प्रतिदीप्ति अंतर्जात है और निर्धारण के बावजूद मजबूत रहता है (magenta स्यूडोकोलन में). वीनस अभिव्यक्ति GFP और Alexa Fluor-४८८-संयुग्मित माध्यमिक एंटीबॉडी (हरी स्यूडोकोलैर में) के खिलाफ निर्देशित एक प्राथमिक एंटीबॉडी का एक संयोजन का उपयोग कर बढ़ाया है । इस आंकड़े का बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।
चित्रा 2: शुद्ध glutamatergic या GABAergic ंयूरॉंस के सेल संस्कृति । (क) संयुक्त अवरक्त (उज्ज्वल क्षेत्र) छवियां और अध्यारोपित प्रतिदीप्त संकेत tdtomato (बाएं) और वीनस (दाएं) धनात्मक न्यूरॉन्स के लिए सुसंस्कृत 1 ज इन विट्रो । सफेद तीर बढ़ती न्यूलाइट्स के स्थान से संकेत मिलता है । (ब) 1 ज इन विट्रो के लिए टीटटमाटर (बाएँ) और वीनस (दाएँ) धनात्मक न्यूरॉन्स की संनाभि छवियां । (ग, घ) उज्ज्वल क्षेत्र (ऊपर) और संयुक्त उज्ज्वल क्षेत्र और Tdटमॅटो के फ्लोरोसेंट छवियों (नीचे) (सी) और वीनस सकारात्मक ंयूरॉंस (डी) में 7 दिनों के लिए सभ्य (DIV) । सफेद तीर मृत कोशिकाओं से संघनित नाभिक का स्थान दिखाते हैं । रंगीन तीर फ्लोरोसेसतापूर्वक लेबल किए गए ंयूरॉंस की पहचान करते हैं । इस आंकड़े का बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।
चित्रा 3: रूपात्मक, इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल और शुद्ध ंयूरॉंस के synaptic गुण । (क, ख) TdTomato की confocal छवियां (ए) और वीनस सकारात्मक ंयूरॉंस (बी) DIV 13 और 14 DIV, क्रमशः में । कोशिकाओं काले रंग में प्रस्तुत कर रहे है एक उल्टे देखो अप करने के लिए neurite दृश्य सहायता तालिका का उपयोग कर । इनसेट्स में पहचाने गए न्यूरॉन्स द्वारा व्यक्त फ्लोरोसेंट सिग्नल दिखाई देता है । (ग, घ) एक Tdटमाटो (सी) और वीनस सकारात्मक ंयूरॉन से वोल्टेज प्रतिक्रिया (डी) hyperpolarizing करने के लिए (२०० फिलीस्तीनी अथॉरिटी 20 फिलीस्तीनी अथॉरिटी कदम में), और depolarizing (२०० फिलीस्तीनी अथॉरिटी) वर्तमान दालों, पूरे सेल पैच-दबाना रिकॉर्डिंग द्वारा प्राप्त की । Insets इसी रिकॉर्ड ंयूरॉंस दिखाओ । प्रत्येक कोशिका के आराम झिल्ली की क्षमता रिकॉर्डिंग ट्रेस के बाईं ओर संकेत दिया है । (अ, च) प्रतिनिधि वोल्ट-क्लैंप रिकॉर्डिंग (10 एस) TdTomato से प्राप्त (ई) और वीनस सकारात्मक ंयूरॉंस (एफ) । स्वत स्फूर्त उत्तेजक postsynaptic घटनाओं (EPSCs) Tdटमाटो सकारात्मक ंयूरॉंस से दर्ज की गई, ५० एमवी की जोत क्षमता पर बनाए रखा । अनायास होने वाली निरोधात्मक postsynaptic घटनाओं (IPSCs) वीनस पॉजिटिव न्यूरॉन्स से एक धारण क्षमता पर बनाए रखा 0 mV की दर्ज की गई. इस आंकड़े का बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।
चित्रा 4: glial सह के साथ ंयूरॉन विकास का समर्थन संस्कृति । (क) glial संस्कृतियों के confocal छवियां immunolabeled के लिए glial तंतुक अंलीय प्रोटीन (gfap, बाएं), भिंनता अणु के क्लस्टर (CD11b, मध्य) और myelin बुनियादी प्रोटीन (mbp, सही) । Glial कोशिकाओं DIV 7 के लिए सभ्य थे । (ख) कोशिका संस्कृति की छवियां, एक गैर संपर्क व्यवस्था में शुद्ध ंयूरॉंस के साथ सह संस्कृति glial कोशिकाओं के लिए इस्तेमाल किया । (ग) स्थानिक व्यवस्था की एक योजनाबद्ध जो सह-संस्कृति न्यूरॉन्स तथा गैलिया के लिए प्रयुक्त होती है । (घ, ङ) TdTomato की confocal छवियां (D) और वीनस सकारात्मक ंयूरॉंस (ई), 14 दिनों के लिए हो, अनुपस्थिति (बाएं) या glial समर्थन की उपस्थिति (दाएं) में । (च, छ) वर्तमान-दबाना रिकॉर्डिंग (६० s) Tdटमाटो (एफ) और वीनस सकारात्मक ंयूरॉंस (छ) अनुपस्थिति (ऊपर) या glial समर्थन की उपस्थिति (नीचे) में 14 दिनों के लिए सभ्य । ंयूरॉंस उनके आराम झिल्ली क्षमता पर दर्ज की गई (प्रत्येक रिकॉर्डिंग ट्रेस के बाईं ओर प्रस्तुत) । इस आंकड़े का बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।
Discussion
हम यहां एक तरीका है कि छंटाई और प्राथमिक ंयूरॉंस के संवर्धन शुद्ध न्यूरोनल कोशिका संस्कृतियों उत्पंन का उल्लेख का वर्णन । इस विधि के आसपास लेता है 1 अधिक से अधिक एक ठेठ प्राथमिक वियोजित न्यूरोनल संस्कृति प्रोटोकॉल अभी तक दोहराने की सैकड़ों की पीढ़ी के लिए अनुमति देता है विशेष न्यूरोनल प्रकार युक्त संस्कृतियों की नकल । शुद्ध ंयूरॉंस, जो अलग से 16 दिनों के लिए अलगाव में उगाया जा सकता axons और dendrites विस्तार और कार्रवाई की क्षमता की दोहरावदार गाड़ियों आग कर सकते है (चित्रा 2 और 3 चित्रा) । महत्वपूर्ण बात, इन कोशिकाओं को नियमित रूप से प्राथमिक वियोजित न्यूरोनल संस्कृतियों के रूप में एक ही प्रयोगात्मक विश्लेषण करने के लिए उत्तरदायी हैं, विद्युत शारीरिक, रूपात्मक और अस्तित्व के विश्लेषण सहित. इन शुद्ध संस्कृतियों के साथ काम करने का एक प्रमुख लाभ यह है कि विशिष्ट कोशिका प्रकार के विकास के अलगाव में अध्ययन किया जा सकता है । शुद्ध संस्कृतियों के विकास का समर्थन करने के लिए, हम भी ग्लाइअल कोशिकाओं के साथ शुद्ध ंयूरॉंस सह-culturing के लिए एक प्रोटोकॉल मौजूद । के रूप में पहले से दिखाया गया है, सह glial कोशिकाओं के साथ शुद्ध ंयूरॉंस-culturing उनके अस्तित्व, विकास में सुधार और नेटवर्क गठन7 (चित्रा 4) को बढ़ावा कर सकते हैं । इस प्रकार, हम यहां तरीकों का एक संयोजन है कि आगे glia के अध्ययन-ंयूरॉन बातचीत करना चाहिए और विकास और ब्याज के अंय प्रकार के सेल के बीच बातचीत के अध्ययन के लिए उपयोगी साबित हो सकता है ।
शुद्ध glutamatergic ंयूरॉंस की संस्कृतियों पर अध्ययन के रास्ते में मौलिक अंतर्दृष्टि से पता चला है glial कोशिकाओं कारक है कि न्यूरोनल नेटवर्क और synapse गठन के विकास को बढ़ावा देने के छिपाना16,17,18 . सामांय में, शुद्ध विशिष्ट ंयूरॉन प्रकार के लिए तरीके और अधिक सफलतापूर्वक किया गया है glutamatergic ंयूरॉंस के बजाय GABAergic ंयूरॉंस के विकास का अध्ययन । इससे हमारी समझ में असमानता आई है कि इन दो कोशिका प्रकारों का विकास कैसे होता है । यह देखते हुए कि GABAergic और glutamatergic ंयूरॉंस उनके शरीर रचना विज्ञान, शरीर विज्ञान और विकासात्मक मूल के संदर्भ में काफी अलग है, यह महत्वपूर्ण है कि हम अपने ही अधिकार में GABAergic ंयूरॉंस का अध्ययन, बेहतर उनके समारोह और शरीर क्रिया विज्ञान को समझने के लिए । यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल का उपयोग करते हुए, हमने पहले इस तरह से महत्वपूर्ण भिन्नताओं की पहचान की है, जैसे कि गैवाजिक और ग्लूटामेजिक न्यूरॉन्स synaptic संचरण की स्थापनाके लिए गैलिया-स्रावित कारकों पर निर्भर करते हैं । इस प्रोटोकॉल को प्रकाशित करके हम आशा करते है कि अंय ंयूरॉंस और glial कोशिकाओं के बीच महत्वपूर्ण बातचीत में आगे अंतर्दृष्टि कर सकते हैं ।
इस प्रोटोकॉल में, हम एक प्रवाह कोशिका मिति आधारित कोशिका छंटाई पद्धति का वर्णन करते हैं, जिसका उपयोग हमने विभिन्न ट्रांसजेनिक कृंतक रेखाओं से गैवाजिक या ग्लूटामैटेजिक न्यूरॉन्स को शुद्ध करने के लिए किया है । वीनस सकारात्मक GABAergic ंयूरॉंस से हल किया गया VGAT वीनस चूहों13 या चूहों8 और tdटमाटटमाटर सकारात्मक ग्लूटामैटेजिक न्यूरॉन्स nexcre से हल किया गया; Ai9 चूहों (मूलतः NexCre9 और Ai9 रिपोर्टर लाइनों6से नस्ल, turko एट अल., २०१८7देखें) । हाल के वर्षों में, तकनीकी प्रगति के कारण, ट्रांसजेनिक जानवरों का उत्पादन काफी आसान हो गया है । इस प्रकार, कई विभिन्न कोशिका प्रकारों में फ्लोरोसेंट अणुओं को व्यक्त करने वाले जंतुओं की उपलब्धता तेजी से बढ़ी है । यह, बारी में, उपयोग और फ्लोरोसेंट सक्रिय सेल छंटाई के प्रयोज्यता बढ़ गई है । हालांकि ब्याज की कोशिकाओं को अलग करने के लिए वैकल्पिक तरीकों वर्तमान में मौजूद है16,19,20, वे स्वाभाविक रूप से होने वाली सतह के लिए उपयुक्त एंटीबॉडी की उपलब्धता पर उनकी निर्भरता से कुछ हद तक रुकावट हैं एंटीजन. यह उनकी बहुमुखी प्रतिभा की सीमा जब प्रतिदीप्ति आधारित सेल छंटाई विधियों, जो पहले से ही कई सेल विशिष्ट ट्रांसजेनिक रिपोर्टर जानवरों है कि पहले से ही उपलब्ध हैं से कोशिकाओं को सॉर्ट करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है के साथ तुलना में । फिर भी, जब अनुकूलित, एंटीबॉडी आधारित छंटाई तरीकों तेजी से हो सकता है और उच्च उपज है, और बेहतर सेल शरीर रचना की रक्षा कर सकते हैं, उनके axons और dendrites21के साथ कोशिकाओं के शुद्धिकरण की अनुमति देकर । प्रतिपिंड छंटाई विधि इसलिए अभी भी जब एक छंटाई रणनीति पर निर्णय लेने पर विचार किया जाना चाहिए । अंत में, ब्याज की कोशिका प्रकार, आयु जिस पर कोशिकाओं को हल किया जाना है, ट्रांसजेनिक जानवरों या सतह एंटीजन की उपलब्धता और आवश्यक कोशिकाओं की संख्या सबसे उपयुक्त छंटाई रणनीति का चयन करते समय निर्धारित कारक होगा ।
यद्यपि प्रतिदीप्ति-आधारित कोशिका छंटाई, कोशिकाओं को शुद्ध करने के लिए एक सरल और पुनरुत्पनीय विधि है, लेकिन सेल की गुणवत्ता को संरक्षित करने के लिए प्रोटोकॉल के कुछ चरणों के दौरान सावधानी बरती जानी चाहिए । उदाहरण के लिए, प्रत्येक अपकेंद्रण कदम के बाद, यह सुनिश्चित करें कि सेल गोली फिर से संभव के रूप में जल्दी से निलंबित कर दिया है और कि कोशिकाओं को सफलतापूर्वक बरामद किया गया है बनाने के लिए महत्वपूर्ण है । कभी-कभार, supernatant को हटाने के दौरान सेल गोली परेशान किया जा सकता है । इसलिए यह सलाह दी जाती है, केंद्रायन कदम के बीच, माइक्रोस्कोप के तहत कोशिकाओं की उपस्थिति की जांच करने के लिए बाहर किसी भी व्यापक कोशिका हानि शासन । सेल चढ़ाना के बाद, कोशिकाओं को खिलाने से पहले कम से 1 घंटे के लिए पालन करने की अनुमति दी जानी चाहिए । यदि कोशिकाओं को बहुत जल्द खिलाया जाता है, कुछ कोशिकाओं coverslip से विस्थापित हो सकता है, जिससे संस्कृति घनत्व को कम करने. संस्कृति में 1 ज के बाद, सेल स्वास्थ्य का आकलन करने में समझदारी है । यदि कोशिकाओं को स्वस्थ (स्वस्थ कोशिकाओं का एक उदाहरण चित्र 2aमें दिखाया गया है) प्रकट नहीं होता है, या एक महत्वपूर्ण कोशिका मृत्यु है, तो यह पृथक्करण या छंटाई प्रक्रिया के दौरान एक समस्या का संकेत हो सकता है । एक और महत्वपूर्ण विचार है, जब किसी भी सेल प्रकार के संवर्धन, देखभाल जब सेल संस्कृति मीडिया के प्रबंध है । एनबीए मीडिया phenol लाल है, जो एक पीएच संकेतक22के रूप में कार्य करता है । यदि मीडिया रंग में भी पीला हो जाता है, तो यह इंगित करता है कि पीएच भी अंलीय है; यदि मीडिया बहुत गुलाबी हो जाता है, तो यह इंगित करता है कि समाधान बहुत alkaline है । स्टॉक समाधान लंबी अवधि के लिए खुला, विशेष रूप से शंक्वाकार ट्यूबों में aliquoted मीडिया, समय के साथ और अधिक alkaline हो जाते हैं । इसलिए यह नए सिरे से पूरा एनबीए मीडिया प्रत्येक सप्ताह और पूरा मीडिया बनाने की सलाह दी है हर दो सप्ताह (वायुमंडलीय परिस्थितियों में मध्यम बफ़र्स और इसलिए अधिक स्थिर होना चाहिए) । ध्यान में इन बिंदुओं को ले यह सेल छंटाई और सेल संस्कृति उपकरण के उपयोग के साथ किसी भी प्रयोगशाला में शुद्ध कोशिका संस्कृतियों की स्थापना संभव होना चाहिए ।
हमारे प्रयोगों के बहुमत में हम एक ही जानवर से शुद्ध संस्कृतियों का उत्पादन किया । हालांकि, जब जैव रासायनिक विश्लेषण के लिए कोशिकाओं को शुद्ध, यह छंटाई के लिए एक साथ कई जानवरों के पूल के लिए आवश्यक हो सकता है । हम सफलतापूर्वक ऊपर प्रोटोकॉल का उपयोग कर 8 भ्रूणीय चूहों (भ्रूणीय दिन 13 जानवरों) को हल किया है (डेटा नहीं दिखाया गया है) । हालांकि, अगर अधिक पशुओं को हल किया जा रहे हैं, यह दोनों papain और बीएसए समाधान की मात्रा में वृद्धि (2.1.1 चरण में वर्णित-2.1.4) के लिए ऊतक राशि में वृद्धि को समायोजित करने के लिए आवश्यक हो सकता है । इसके अतिरिक्त, यदि अधिक कोशिकाओं संस्कृति में चढ़ाया जाता है, तो एक अधिक बार खिला अनुसूची की आवश्यकता हो सकती है । एक प्रारंभिक बिंदु के रूप में, कोशिकाओं को हर 7 दिन अनुकूलित मीडिया के १०० μL को हटाने और ताजा पूरा एनबीए मीडिया के २०० μL जोड़ने के द्वारा खिलाया जा सकता है । ंयूरॉन व्यवहार्यता के लिए, यदि अधिक पशुओं छंटाई, सोचा था कि जितना संभव हो उतना समय कम से कम करने के लिए दिया जाना चाहिए । यह अक्सर शुद्ध कोशिकाओं के कुशल उपयोग के लिए डाउनस्ट्रीम विश्लेषण के सावधान अनुकूलन की आवश्यकता है । हम नियमित रूप से ६०० घटनाओं की दरों पर माउस ंयूरॉंस हल/s, 500000 तक-पशु प्रति 800000 कोशिकाओं (प्रसवोत्तर दिन 0-2) । हालांकि, यह छंटाई गति और शर्तों के व्यापक अनुकूलन के बिना था । इसलिए सॉर्टिंग स्पीड और यील्ड में और सुधार संभव होना चाहिए ।
शुद्ध ंयूरॉंस उनके अस्तित्व के लिए glia-वातानुकूलित मीडिया की आवश्यकता है । यह पहले से ही ंयूरॉंस और glial कोशिकाओं के साथ अलग से प्रदर्शन किया गया है, glial वातानुकूलित मीडिया10के साथ ंयूरॉंस उपचार से पहले । हमारे प्रयोगों में, हम अर्द्ध पारगनीय सेल संस्कृति आवेषण, जो कोशिका संस्कृति थाली के अंदर रखा जाता है पर glial कोशिकाओं को संवर्धन द्वारा शुद्ध ंयूरॉंस का समर्थन करने का फैसला किया । इस पद्धति को सफलतापूर्वक glia व्युत्पंन extracellular मैट्रिक्स प्रोटीन और12ंयूरॉंस के साथ उनकी बातचीत का अध्ययन करने के लिए लागू किया गया है । गैर संपर्क, लेकिन लगातार इस विधि द्वारा प्रदान की समर्थन जब कोशिकाओं की अलग संस्कृति की तुलना में लाभ की एक संख्या है । सबसे विशेष रूप से, सह ंयूरॉंस के साथ glial कोशिकाओं के संस्कृति सतत विनियमन और सेल संस्कृति मीडिया है, जो और अधिक बारीकी से vivo स्थिति में जैसा दिखता है की कंडीशनिंग के लिए अनुमति देता है । इसके अलावा, निरंतर सह कोशिकाओं के संस्कृति ंयूरॉंस और glia, जो अलग संस्कृतियों में संभव नहीं है के बीच संकेत संभावित प्रतिक्रिया के लिए अनुमति देता है । हमारे प्रोटोकॉल में, यदि आवश्यक हो, सतत सह संस्कृति विधि आसानी से छोड़ा जा सकता है और glia-वातानुकूलित मीडिया के साथ ंयूरॉंस के एक शास्त्रीय उपचार किया जा सकता है ।
संक्षेप में, यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल के लिए एक ठोस नींव से वे अपने शुद्ध कोशिका संस्कृति प्रयोग स्थापित कर सकते है के साथ पाठक प्रदान करना है । हम भविष्यवाणी करते हैं कि निकट भविष्य के लिए ट्रांसजेनिक जानवरों और वायरल निर्माणों की उपलब्धता में वृद्धि जारी रहेगी । इसलिए, कोशिका छँटाई तकनीक प्रतिदीप्ति के आधार पर और भी अधिक व्यापक रूप से इस्तेमाल किया और मूल्यवान बनने की संभावना है ।
Disclosures
लेखकों की घोषणा है कि वे कोई प्रतिस्पर्धी वित्तीय हितों की है ।
Acknowledgments
लेखकों के लिए उत्कृष्ट तकनीकी प्रवाह Cytometry कोर सुविधा, Deutsches रियोमा Forschungszentrum, बर्लिन में जेनी Kirsch और एना Teichmüller द्वारा प्रदान की सहायता का शुक्रिया अदा करना चाहूंगा । हम जीवन रक्षा विश्लेषण के साथ उसकी मदद के लिए Jie गीत शुक्रिया अदा करना चाहूंगा । हम भी उसे फ्लोरोसेंट चूहों और ईसाई Ebner के प्रोटोकॉल के महत्वपूर्ण पढ़ने के लिए छवियों पर कब्जा करने में मदद के लिए रीता Loureiro शुक्रिया अदा करना चाहूंगा । VGAT-वीनस ट्रांसजेनिक चूहों डीआरएस द्वारा उत्पन्न किया गया. वाई Yanagawa, एम Hirabayashi और राष्ट्रीय शारीरिक विज्ञान के लिए संस्थान में, Okazaki, जापान, pCS2 का उपयोग कर-वीनस डॉ. ए. मियाजगानी द्वारा प्रदान की. इस काम के जर्मन अनुसंधान परिषद (ड्यूश Forschungsgemeinschaft, DFG EXC २५७ से चतुर्थ) द्वारा समर्थित था ।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Neural Basal A media (NBA) | ThermoFisher Scientific | 10888022 | Cell Culture Buffer |
| B27 | ThermoFisher Scientific | 17504001 | Culture supplement |
| Glutamax | ThermoFisher Scientific | 35050-038 | Culture supplement |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | ThermoFisher Scientific | 15140-122 | Antibiotic |
| Poly-L-Lysine | SIGMA | P1399 | Coverslip coating |
| Papain | SIGMA | P4762-1G | Enzyme |
| Bovine Serum Albumin | SIGMA | A3294-100G | Serum |
| Hibernate A low fluorescence media | Brain Bits Ltd | HALF | Cell Transport media |
| Dulbeccos Modified Eagles Medium (DMEM) | Biochrom | F0435 | Glial Culture Buffer |
| Fetal Calf Serum (FCS) | Biochrom | S0115 | Serum |
| Trypsin/EDTA | Biochrom | L2163 | Enzyme |
| Fine Tip Pasteur Pipette | Neo Labs | - | Used for trituration of cells |
| 24-well plates | BD | 353047 | Culture plate |
| 50 mL Falcon tubes | BD | 352070 | - |
| 15 mL Falcon tubes | BD | 352096 | - |
| Glass coverslips: 12 mm round | Roth | P231.1 | - |
| 35 mm Petri dish | Corning | 353001 | - |
| 100 mm Petri dish | Corning | 353003 | - |
| 30 µm CellTrics Cell Sieve | sysmex | 04-004-2326 | To remove cell clumps before cell sorting |
| Round bottom polystyrene tubes | BD | 352054 | Transport tube for sorted cells |
| Round bottom polypropylyne tubes | BD | 352063 | Collection tube for sorted cells |
| Cell culture inserts – 0.4 µm transparent PET | Falcon | 353 095 | For the co-culture of neurons and glia |
| Extra fine Bonn Scissors | Fine Scientific Tools | 14084-08 | To remove overlying skin and bone of mice |
| Extra narrow Scissors | Fine Scientific Tools | 14088-10 | To remove overlying skin and bone of rats |
| Forceps | Fine Scientific Tools | 11242-40 | To hold the head in place |
| Spatula (130 mm long/5 mm tip width) | Fine Scientific Tools | 3006.1 | To remove the brain to filter paper |
| Scalpel Blades | Swan-Morton | #0308 | To mechanically dissociate neural tissue |
| Haemocytometer (Neubauer Imroved) | Optik Labor | - | To cell count dissociated cells |
| Fluorescent Miners Goggles (excitation light) | Biological Laboratory Equipment Maintenance and Servce Ltd (BLS) |
FHS/LS-1G | To excite TdTomato |
| Fluorescent Miners Goggles (emission filter) | Biological Laboratory Equipment Maintenance and Servce Ltd (BLS) |
FHS/EF-4R2 | Td Tomato compatible emission filter |
| Fluorescent Miners Goggles (excitation light) | Biological Laboratory Equipment Maintenance and Servce Ltd (BLS) |
FS/ULS-02B2 | To excite Venus |
| Fluorescent Miners Goggles (emission filter) | Biological Laboratory Equipment Maintenance and Servce Ltd (BLS) |
FS/TEF-3GY1 | Venus compatible emission filter |
| Mouse-Anti-GFP primary antibodies | UC Davis | 75-132 | To enhance Venus signal following fixation |
| Mouse-Anti-GFAP primary antibodies | SIGMA | G-3893 | The identification of reactive astrocytes |
| Rabbit-Anti-CD11b primary antibodies | Southern Biotech | 1561-15 | The identification of microglial cells |
| Rabbit-Anti-MBP primary antibodies | Millipore | AB980 | The identification of oligodendrocyes |
References
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