Denne protokol beskriver en monolayer, serum-fri metode til effektivt at generere hepatocyte-lignende celler fra humane pluripotente stamceller (hPSCs) i 18 dage. Dette indebærer seks trin som hpscs sekventielt differentiere til mellemliggende celle-typer såsom primitive streak, definitive endoderm, posterior foregut og lever opløbet forfædre før dannelse hepatocyte-lignende celler.
Leveren afgifte skadelige stoffer, udskiller vitale proteiner, og udfører vigtige metaboliske aktiviteter, dermed opretholde livet. Derfor leversvigt — som kan være forårsaget af kronisk indtagelse af alkohol, hepatitis, akut forgiftning, eller andre fornærmelser — er en alvorlig tilstand, der kan kultivere i blødning, gulsot, koma, og i sidste ende døden. Men, tilgange til behandling af leversvigt, samt undersøgelser af leverfunktion og sygdom, er blevet forpurret delvis af manglen på en rigelig forsyning af humane leverceller. Med henblik herpå indeholder denne protokol en detaljeret beskrivelse af den effektive differentiering af humane pluripotente stamceller (hPSCs) i hepatocytter-lignende celler, som styres af en udviklings køreplan, der beskriver, hvordan lever skæbnen specificeres i seks på hinanden følgende differentierings trin. Ved at manipulere udviklingsmæssige signalerings veje for at fremme lever differentiering og eksplicit undertrykke dannelsen af uønskede celle skæbner, genererer denne metode effektivt populationer af humane lever opløbet progenitorer og hepatocytter-lignende celler ved dage 6 og 18 i henholdsvis PSC-differentieringen. Dette opnås gennem den tidsmæssigt præcise kontrol af udviklingsmæssige signalerings veje, der udøves af små molekyler og vækstfaktorer i et serumfrit kulturmedium. Differentiering i dette system forekommer i monolag og udbytter hepatocyt-lignende celler, der udtrykker karakteristiske hepatocyt enzymer og har evnen til at forankret en musemodel af kronisk leversvigt. Evnen til effektivt at generere et stort antal humane leverceller in vitro har forgreninger til behandling af leversvigt, for Drug screening, og for Mekanistiske undersøgelser af leversygdom.
Formålet med denne protokol er effektivt at differentiere humane pluripotente stamceller (hpscs) til berigede populationer af lever opløbet forfædre og hepatocyte-lignende celler2. Adgang til en klar levering af humane lever progenitorer og hepatocyte-lignende celler vil fremskynde bestræbelserne på at undersøge leverfunktion og sygdom og kunne muliggøre nye cellulære transplantations terapier for leversvigt3,4, 5. Dette har vist sig udfordrende i fortiden, da hPSCs (som omfatter embryonale og inducerede pluripotente stamceller) kan differentiere i alle celle-typer af den menneskelige krop; Det har derfor været vanskeligt udelukkende at skelne dem til en ren population af en enkelt celletype, såsom leverceller6.
For præcist at differentiere hPSCs i leverceller, først er det afgørende at forstå ikke kun hvordan leverceller er specificeret, men også hvordan ikke-lever celle-typer udvikle. Viden om, hvordan ikke-leverceller udvikle er vigtigt at logisk undertrykke dannelsen af ikke-leveren nedstamningens under differentiering, og dermed udelukkende vejlede hpscs i retning af en lever skæbne2. For det andet er det vigtigt at afgrænse de mange udviklingsmæssige trin, hvorigennem hPSCs differentierer mod en lever skæbne. Det er kendt, at hpscs sekventielt differentiere i flere celle-typer kendt som primitive streak (APS), definitive endoderm (de), posterior foregut (PFG) og lever bud forfædre (lb) før danner hepatocyte-lignende celler (HEP). Tidligere arbejde afslørede de signaler, der specificerer leveren skæbne og de signaler, som undertrykt dannelsen af alternative ikke-leveren celle-typer (herunder mave, bugspytkirtel, og tarm progenitors) på hver udviklingsmæssige Lineage valg2, 7 , 8.
Kollektivt, disse indsigter har givet anledning til en serum-fri, enkeltlags metode til at differentiere hpscs mod primitive streak, definitive endoderm, posterior forgut, lever bud forfædre og endelig, hepatocyte-lignende celler2. Samlet metoden indebærer såning af hpscs i en enkeltlags i en passende tæthed, forbereder seks cocktails af differentiering medier (indeholdende vækstfaktorer og små molekyler, der regulerer forskellige udviklingsmæssige signalering veje), og sekventielt tilføje disse medier til at inducere differentiering i løbet af 18 dage. Under processen, ingen passaging af celler er nødvendig. Bemærk, fordi denne metode eksplicit omfatter signaler, der undertrykker dannelsen af ikke-lever celle-typer, denne differentiering tilgang1 mere effektivt genererer lever progenitorer og hepatocyte-lignende celler i forhold til eksisterende differentierings metode2,9,10,11,12. Desuden giver den protokol, der er beskrevet i denne tekst, mulighed for hurtigere generering af hepatocytter, som i sidste ende udtrykker højere niveauer af hepatiske transkriptionsfaktorer og enzymer end dem, der produceres af andre protokoller9,10 , 11 , 12.
Den her beskrevne protokol har visse fordele i forhold til de nuværende differentierings protokoller. For det første, det indebærer enkeltlags differentiering af hpscs, som er teknisk enklere i forhold til tredimensionelle differentierings metoder, såsom dem, der er afhængige af embryooide organer13. For det andet udnytter denne metode et nyligt fremskyndet, hvorved definitive endoderm-celler (en tidlig forløber for leverceller) kan genereres effektivt og hurtigt inden for 2 dage efter hpsc-differentiering på2,7, hvilket gør det muligt at fremstilling af hepatocytter med øget renhed. For det tredje, i side-by-side sammenligninger, hepatocyte-lignende celler produceret af denne metode2 PRODUCERE mere ALBUMIN og udtrykke højere niveauer af hepatiske transkriptionsfaktorer og enzymer i forhold til hepatocytter produceret i andre metoder10, 11,12.
Denne metode muliggør generering af berigede populationer af lever opløbet progenitors, og efterfølgende hepatocyte-lignende celler, fra hPSCs. Evnen til at generere berigede populationer af humane leverceller er vigtig for den praktiske anvendelse af sådanne celler. Tidligere metoder til at generere hepatocytter fra hPSCs gav uren cellepopulationer, der indeholder både leveren og ikke-leveren celler, der, ved transplantation til gnavere, gav knogle og brusk i tillæg til leveren væv15. Derf…
The authors have nothing to disclose.
Vi takker Bing lim for diskussioner og Stanford Institute for stamcelle biologi & regenerativ medicin til infrastruktur støtte. Dette arbejde blev støttet af California Institute for regenerative Medicine (DISC2-10679) og Stanford-UC Berkeley Siebel Stem Cell Institute (til L.T.A. og K.M.L.) og Stanford Beckman Center for molekylær og genetisk medicin samt den anonyme, Baxter og DiGenova familier (til K.M.L.).
Geltrex | Thermofisher Scientific | A1569601 | |
1:1 DMEM/F12 | Gibco | 11320033 | |
0.2 μm pore membrane filter | Millipore | GTTP02500 | |
mTeSR1 | Stem Cell Technologies | 5850 | |
Thiazovivin | Tocris Bioscience | 3845 | |
Accutase | Gibco or Millipore | Gibco A11105, Millipore SCR005 | |
IMDM, GlutaMAX™ Supplement | Thermofisher Scientific | 31980030 | |
Ham's F-12 Nutrient Mix, GlutaMAX™ Supplement | Thermofisher Scientific | 31765035 | |
KOSR, Knockout serum replacement | Thermofisher Scientific | 10828028 | |
Poly(vinyl alcohol) | Sigma-Aldrich | P8136 | |
Transferrin | Sigma-Aldrich | 10652202001 | |
Chemically Defined Lipid Concentrate | Thermofisher Scientific | 11905031 | |
human Activin | R&D | 338-AC | |
CHIR99201 | Tocris | 4423 | |
PI103 | Tocris | 2930/1 | |
human FGF2 | R&D | 233-FB | |
DM3189 | Tocris | 6053/10 | |
A83-01 | Tocris | 2939/10 | |
Human BMP4 | R&D | 314-BP | |
C59 | Tocris | 5148 | |
TTNPB | Tocris | 0761/10 | |
Forskolin | Tocris | 1099/10 | |
Oncostatin M | R&D | 295-OM | |
Dexamethasone | Tocris | 1126 | |
Ro4929097 | Selleck Chem | S1575 | |
AA2P | Cayman chemicals | 16457 | |
human recombinant Insulin | Sigma-Aldrich | 11061-68-0 |