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Developmental Biology

인간 다능성 줄기 세포를 간 세포로 효율적으로 분화

doi: 10.3791/58975 Published: June 11, 2019

Summary

이 프로토콜은 18일 만에 인간 만능 줄기 세포(hPSCs)로부터 간세포 유사 세포를 효율적으로 생성하는 단층, 무혈청 방법을 상세히 기술한다. 이것은 hPSCs가 간세포 같이 세포를 형성하기 전에 원시적인 선미, 결정적인 내배엽, 후방 포인및 간 싹 선조와 같은 중간 세포 모형으로 순차적으로 분화하는 것과 같이 6단계를 수반합니다.

Abstract

간은 유해 물질을 해독하고, 중요한 단백질을 분비하며, 주요 대사 활동을 실행하여 생명을 유지합니다. 따라서 만성 알코올 섭취, 간염, 급성 중독 또는 기타 모욕으로 인해 발생할 수 있는 간 부전은 출혈, 황달, 혼수 상태 및 결국 사망에 이르는 심각한 상태입니다. 그러나, 간 기능 및 질병의 연구 뿐만 아니라 간 부전을 치료 하는 접근, 인간의 간 세포의 풍부한 공급의 부족에 의해 부분적으로 stymied 되었습니다. 이를 위해 이 프로토콜은 인간 다능성 줄기 세포(hPSCs)를 간세포와 같은 세포로 효율적으로 분화하는 것을 상세히 설명하며, 6개의 연속적인 분화 단계에 걸쳐 간 운명이 어떻게 지정되는지를 설명하는 개발 로드맵에 의해 안내된다. 간 분화를 촉진하고 원치 않는 세포 운명의 형성을 명시적으로 억제하기 위해 발달 신호 경로를 조작함으로써,이 방법은 효율적으로 일 6에 의해 인간의 간 꽃 봉오리 선조와 간세포 같은 세포의 인구를 생성 PSC 차별화의 18. 이것은 혈청이 없는 배양 매체에 있는 작은 분자 그리고 성장 인자에 의해 발휘된 발달 신호 통로의 시간적으로 정확한 통제를 통해 달성됩니다. 이 시스템의 분화는 단층에서 발생하고 특징적인 간세포 효소를 발현하고 만성 간 기능 부전의 마우스 모델을 생착시키는 능력을 가진 간세포와 같은 세포를 산출합니다. 효율적으로 생체 외에서 인간의 간 세포의 큰 숫자를 생성 하는 능력은 간 부전의 치료에 대 한 파급 효과, 약물 검사에 대 한, 그리고 간 질환의 기계론 연구에 대 한.

Introduction

이 프로토콜의 목적은 인간 다능성 줄기 세포(hPSCs)를 간 싹 선조 및 간세포 유사 세포의 농축된 집단으로 효율적으로 분화하는 것입니다 2. 인간의 간 전구체와 간세포 같은 세포의 준비 공급에 대한 액세스는 간 기능 과 질병을 조사하기위한 노력을 가속화하고 간부전을위한 새로운 세포 이식 치료를 가능하게 할 수 3,4, 5. 이것은 hPSCs (배아 및 유도 만능 줄기 세포를 포함하는)가 인체의 모든 세포 유형으로 분화 할 수 있기 때문에 과거에 도전적인 것으로 입증되었습니다. 결과적으로, 간세포6과같은 단일 세포형의 순수한 집단으로 이들을 독점적으로 분화하는 것이 어려웠다.

hPSCs를 간 세포로 정확하게 분화하려면 먼저 간 세포가 지정되는 방법뿐만 아니라 비 간 세포 유형이 어떻게 발달하는지 이해하는 것이 중요합니다. 비간 세포가 어떻게 발달하는지에 대한 지식은 분화 동안 비 간 혈통의 형성을 논리적으로 억제하는 것이중요하며, 따라서 독점적으로 간 운명을 향한 hPSCs를 유도2. 둘째, hPSC가 간 운명을 향해 차별화되는 다중 발달 단계를 묘사하는 것이 필수적입니다. hPSC는 간세포 유사 세포(HEP)를 형성하기 전에 원시적 줄무늬(APS), 최종 내배엽(DE), 후방 포구트(PFG) 및 간 꽃봉오리 전구(LB)로 알려진 여러 세포 유형으로 순차적으로 분화하는 것으로 알려져 있습니다. 이전 작품은 각 발달 혈통 선택 2에서 간 운명을 지정하는 신호와 대체 비 간 세포 유형 (위, 췌장 및 장 전구체 포함)의 형성을 억제한 신호를 밝혀냈습니다2. 7명 , 8.

전체적으로, 이러한 통찰력은 원시적 인 줄무늬, 최종 내배엽, 후방 포레트, 간 싹 선조 및 마지막으로, 간 세포형 세포2를 향해 hPSCs를분화하는 무혈청, 단층 방법을 초래하였다. 전반적으로 방법은 적절한 밀도에서 단층에서 hPSCs의 시드를 포함, 분화 매체의 여섯 칵테일을 준비 (다양한 발달 신호 경로를 조절 성장 인자와 작은 분자를 포함), 순차적으로 이들 매체를 첨가하여 18일의 과정을 통해 분화를 유도한다. 이 과정에서 세포를 통과하지 못했습니다. 참고로, 이 방법은 비간 세포 유형의 형성을 억제하는 신호를 명시적으로 포함하기 때문에, 이 분화 접근법1은 현존하는 세포에 비해 간 전구체및 간세포 유사 세포를 보다 효율적으로 생성합니다. 차별화 방법2,9,10,11,12. 더욱이, 이 본문에 기술된 프로토콜은 궁극적으로 다른 프로토콜 9,10에 의해 생성된 것보다 더 높은 수준의 간 전사 인자와 효소를 발현하는 간세포의 빠른 생성을 가능하게한다. , 11세 , 12.

여기에 설명된 프로토콜은 현재 의분화 프로토콜에 비해 특정 한 장점이 있습니다. 첫째, hPSCs의 단층 분화는 배아체(13)에 의존하는 것과 같은 3차원 분화 방법에 비해 기술적으로더 간단하다. 둘째, 이 방법은 최근 진행된 사전을 통해 최종 내배엽 세포(간 세포의 초기 전구체)가 hPSC 분화2,7일이내에 효율적이고 빠르게 생성될 수 있어 후속 세포가 가능하도록 한다. 순도가 증가한 간세포 의 생산. 셋째, 나란히 비교에서, 이 방법에 의해 생성된 간세포형 세포2는 다른 방법에서 생성된 간세포에 비해 더 많은 ALBUMIN을 생성하고 더 높은 수준의 간 전사 인자와 효소를 발현한다10, 11,12.

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Protocol

1. 차별화 매체 준비

참고: 사용되는 재료 및 시약에 대한 제조업체 정보는 재료 표를 참조하십시오.

  1. 염기 화학적으로 정의된 매체(CDM)의 준비
    참고:
    CDM2, CDM3, CDM4 및 CDM5는 다양한 단계에서 hPSCs를 간 세포로 분화하기 위한 기본 매체로 사용되는 화학적으로 정의된 매체입니다. 이러한 매체의 구성은 표 1에서찾을 수 있습니다.
    1. CDM2 또는 CDM3를 만들려면 폴리 비닐 알코올(PVA)이 포함된 스톡 용액을 준비합니다. 이스코브의 변형 된 덜베코 의 매체 (IMDM)의 50 mL에 PVA 분말 0.5 g을 용해하여 10 mg / mL PVA 스톡을 생성합니다.
      참고: PVA가 쉽게 용해되지 않기 때문에, 가열 패드에 ~ 50 °C에서 연속 교반원 플라스크에 PVA / IMDM 혼합물을 준비; 교반은 자기 교반기로 쉽게 달성 될 수있다.
    2. PVA가 IMDM에 균일하게 용해된 후, 가열 패드에서 PVA 용액을 제거하고 실온으로 식힙니다.
    3. 멸균 0.2 μm 필터를 사용하여 PVA 용액을 필터링합니다.
    4. 1.1.1단계에서 필터링된 PVA와 표 1 재료표에 설명된 바와 같이 다양한 상업적으로 구입한 구성요소를 결합하여 CDM2 및 CDM3를 준비한다. 멸균, 0.2 μm 필터 유닛을 사용하여 모든 매체를 필터링하십시오.
      참고: 염기 배지는 4°C에서 보관할 수 있지만 2개월 이상 보관할 수 없습니다.
    5. 표 1다음에 나머지 베이스 미디어 CDM4 및 CDM5를 준비한다.
  2. 분화 매체의 준비
    1. 소분자 및 성장 인자에 대한 재고 솔루션을 준비하려면 제조업체의 권장 사항에 따라 재구성하십시오. 보관을 위해, 동결 해동 주기를 줄이고 -20 °C 또는 권장대로 유지하기 위해 멸균 튜브에 aliquot.
      참고: 다양한 분화 단계에서 사용되는 분화 배지의 조성은 표 2 및 다음 단계에 기재되어 있다.
    2. 분화 매체를 준비하려면 먼저 냉동 된 소분자 및 / 또는 성장 인자를 실온에서 해동하십시오. 다음으로, 필요한 양의 염기 배지를 aliquot. 마지막으로, 지정된 소분자 및 성장 인자를 적절한 농도에서 기저 배지에 첨가하여최종 분화 매체를 준비한다(표 2).
      참고: 신선하게 준비된 분화 매체는 이상적으로 같은 날에 사용되어야 한다; 그렇지 않으면 4°C에서 보관하고 3일 이내에 사용할 수 있다.
    3. 파이펫 팁을 사용하여 분화 배지를 여러 번 혼합하여 보충제가 세포에 배지를 추가하기 전에 균질하게 분포되도록 합니다(예를 들어, 12웰 플레이트의 각 웰에 분화 배지 1mL를 추가).

2. 분화를 위한 정의된 밀도에서 플레이트에 종자 hPSCs

  1. hPSCs로 파종하는 데 사용되는 코팅 세포 배양 플라스틱.
    1. 매트릭스(예를 들어, 겔트렉스)를 사용 일 전날 밤에 4°C에서 해동합니다.
    2. 다음 날, 차가운 덜베코의 수정 된 독수리의 매체 (DMEM)/ F12의 50mL에 매트릭스의 500 μL을 추가하여 매트릭스 1:100을 희석하십시오. 매트릭스는 실온에 노출될 때 비가역적으로 중합되는 하이드로겔이기 때문에 매트릭스로 작업할 때항상 매트릭스 튜브와 매미를 얼음 위에 보관합니다.
    3. 참고: DMEM/F12에서 용해된 매트릭스는 4°C에서 보관할 수 있지만 2개월 이내에 사용해야 합니다.
    4. 매트릭스로 배양 플레이트를 코팅하기 위해, 희석된 매트릭스를 웰의 표면을 덮기 위해 충분한 양의 매트릭스 용액을 사용하여 필요한 수의 웰로 피펫(예를 들어, 12웰 플레이트의 1개 웰에 0.5 mL 또는 1mL의 웰을 6-1-웰에 추가) 잘 접시). 필요한 경우 플레이트를 부드럽게 흔들어 매트릭스 용액이 우물 바닥을 완전히 덮었는지 확인합니다.
    5. 매트릭스 코팅 플레이트를 37°C 인큐베이터에 적어도 60분 동안 방치한다. 이 온도에서, 매트릭스는 우물의 바닥에 박막을 형성하기 위해 중합한다.
    6. 참고: 매트릭스 코팅 플레이트는 37°C 인큐베이터에 보관될 수 있으며 매트릭스가 건조되지 않는 한 3일 이내에 사용할 수 있다.
    7. hPSC로 웰을 파종하기 직전에 코팅 된 우물에서 나머지 매트릭스 용액을 흡인합니다.
  2. hPSCsNOTE로 코팅 된 플레이트를 통과하고 파종 : 해리 에이전트는 세포를 해리하는 효소를 포함하고 가능한 한 짧은 시간 동안 해리 에이전트에 hPSCs를 두는 것이 중요합니다.
    1. 분화 전에 hPSCs를 가진 종자 매트릭스 코팅 배양 플레이트에, 제조 업체의 프로토콜에 따라 시판되는 mTeSR1 배지(재료표)에서 미분화 hPSCs를 70 % 동률로 성장시다. hPSC가 높은 합류에서 자발적으로 분화할 수 있기 때문에 hPSC가 완전히 수렴되기 전에 hPSC를 통과하는 것이 중요합니다.
      참고 : hPSCs는 실험을 위해 사용하기 전에 염색체 이상이 없는지 확인하기 위해 karyotyped해야합니다. 이러한 분화 프로토콜에 사용된 hPSCs는 mTeSR1 미디어에서 유지되고 KARyotypic 이상을 최소화하기 위해 EDTA와 덩어리로 통과되었다. Karyo전형 이상 hPSCs는 비정상적으로 빨리 증식할 수 있기 때문에 분화에 사용해서는 안됩니다. 따라서 여기에서 권장되는 세포-시딩 밀도는 전형적으로 비정상적인 세포에 적합하지 않다.
    2. 분화를 위한 종자 hPSCs를 위해, 크게 동봉된 hPSC 배양판으로부터 의흡흡한 mTeSR1을 첨가하고 상업적으로 구입한 해리제(표재료)를 추가하여 hPSC를 해리하고, 충분히 해리제를 사용하여 표면을 덮는다. 잘 또는 세포가 성장하는 접시 (예를 들어, 12 웰 플레이트의 웰 당 해리제의 0.5 mL, 6 웰 플레이트의 웰 당 1 mL 또는 10cm 접시 당 3 mL를 추가하십시오).
    3. 해리제에서 hPSCs를 37°C에서 5분 동안 또는 일부 콜로니가 분리되기 시작할 때까지 배양합니다. 부드럽게 우물 / 판의 바닥을 여러 번 누릅니다; 해리의 몇 분 후, 대부분의 hPSC 식민지자유롭게 정지에 와서한다.
    4. 플레이트에서 분리된 hPSC를 빼내려면 6웰 플레이트(또는 12웰 플레이트로 작업하는 경우 1mL/웰)로 작업하는 경우 DMEM/F12의 2mL/well을 추가하여 해리제를 희석합니다. 5 mL 의 혈청학적 파이펫을 사용하여 우물 표면에서 모든 세포를 씻어 내고 여러 번 위아래로 부드럽게 피펫을 피펫하십시오. 50 mL 원엽 튜브에 다시 일시 중단 된 단일 세포를 수집합니다. 모든 hPSC의 회복을 보장하기 위해 동일한 부피의 DMEM/F12로 플레이트를 두 번째로 세척하십시오.
    5. 세포를 포함하는 50 mL 원엽 관에, DMEM/F12를 추가하여 해리제의 원래 부피를 1:5-1:10으로 희석합니다(예: 해리제의 원래 부피가 1mL인 경우, DMEM/F12로 셀 현탁액의 총 부피를 10mL로 조정하여 희석 1:10에서 해리 에이전트)
    6. 수집된 hPSCs를 펠릿 세포에 4°C에서 350 x g에서 350 x g에서 50 mL 원추형 튜브에 수집하였다.
    7. 펠렛에 세포를 기다리는 동안, hPSCS가 시드될 플레이트로부터 의 자수 매트릭스. 다음으로, 시판적으로 얻어진 티아조비빈(약리학적록 억제제)의 1 μM으로 보충된 충분한 양의 mTesR1을 수용자 웰에 첨가합니다(예를 들어, 웰당 0.5 mL mTeSR1을 추가하여 12웰 플레이트 또는 6웰 플레이트당 mTeSR1의 mTeSR1 1mL).
      참고: 낮은 농도에서 티아조비빈은 단일 세포 생존을 향상시키기 위해이 단계에서 포함되고 따라서 hPSCs의 후속 시드 밀도.
    8. hPSCs를 원심 분리 한 후 상월체를 조심스럽게 흡인하고 펠릿 hPSCs를 원추형 튜브의 바닥에 남습니다. 상봉은 hPSCs의 후속 부착을 억제하는 해리제를 포함하고, 따라서, 진행하기 전에 상수의 대부분을 흡인하는 것이 중요하다.
    9. 티아조비빈 1 μM으로 보충된 mTeSR1의 세포 펠릿을 다시 중단시. p1000 파이펫을 사용하여 2-3회 부드럽게 삼중화하여 세포 펠릿을 단일 셀 현탁액으로 고르게 재혼합니다. 과도한 기계적 힘이 hPSC를 손상시키고 가난한 세포 생존으로 이어질 수 있기 때문에 세포 펠릿을 과도하게 삼중화하지 마십시오.
    10. hPSCs의 재현탁 후, 즉시 10 μL의 현탁액을 혈전계내로 피펫하고 세포 수를 카운트한다. 중력은 hPSCs가 50 mL 튜브의 바닥에 자연스럽게 침전되어 정확한 세포 계수를 혼동하기 때문에 가능한 한 빨리 계산하기 위해 파이펫 셀을 하는 것이 중요합니다.
    11. 티아조비빈 보충 mTeSR1로 재일시 중단된 hPSCs의 부피를 조절하여 도금에 필요한 세포 농도를 달성합니다. 예를 들어, 재중단된 hPSCs의 부피를 조정한 후, 12웰 플레이트의 각 웰에 160,000-250,000 셀을 시드하기 위해 웰당 0.5 mL의 셀 현탁액을 첨가하고, 따라서 각 웰에서 1 mL의 총 부피를 달성하였다(0.5 mL의 매질은 2.7단계에서 웰에 첨가되었다). 더 크거나 작은 웰을 사용하는 경우 셀 번호/미디어 볼륨을 그에 따라 늘리거나 줄입니다.
      참고: 표시된 세포 밀도에서 hPSCs를 시드하는 것이 중요합니다. 지나치게 동시성 hPSCs는 효율적으로 차별화되지 않으며, 과소 응고된 hPSCs는 분화 중에 도용되지 않을 것이다.
    12. 크로스 패턴(왼쪽, 오른쪽, 앞으로, 뒤로)으로 판을 여러 번 흔들어 세포가 플레이트/웰에 고르게 분포되도록 합니다. 세포가 플레이트/웰의 중앙에 정착하므로 원형으로 플레이트를 돌리지 마십시오. 전형적으로, hPSCs는 ~3-30 분 안에 우물의 표면에 응고하기 시작합니다. 분화를 개시하기 전에 세포가 적어도 24 시간 동안 성장할 수 있도록.

3. 내피 세포와 간 전구로 hPSCs의 분화

  1. hPSCs가 적어도 24 시간 동안 도금 된 후 (단계 2.2.12에 설명 된 바와 같이), 분화를 진행하기 전에, 도금 된 hPSC 콜로니의 직경과 밀도에 특정 강조와 함께, 위상 대비 현미경에서 세포의 형태를 확인합니다.
    참고: 이상적으로는 3.2단계 이전에 적절한 크기와 밀도를 쉽게 간격을 두어야 합니다. hPSCs의 큰 (약 >400 μm) 또는 작은 콜로니 (약 <200 μm)는 분화에 사용할 수 없습니다(그림4). 분화 신호는 큰 hPSC 콜로니 전반에 걸쳐 균등하게 작용하지 않아 비효율적인 분화로 이어집니다. 너무 작은 콜로니는 이 분화 프로토콜에서 hPSC 분화의 처음 3일 동안 잘 살아남지 못한다. 시드 hPSCs의 밀도가 정확하다면, hPSC 콜로니는 종종 그들 사이의 세포의 "다리"를 형성하고 전체 합류는 1 일 분화 배지를추가하기 전에 ~ 30-50 %가 될 것입니다 (그림 4).
  2. 콜로니 크기가 3.1 단계에서 이상적인 경우, hPSC를 전방 원시 줄무늬(APS)로 분화하는 분화 의 1일째로 진행합니다.
  3. 제1일 APS 분화 배지는 CDM 2(표 1 섹션 1.2)를 염기 배지로서 사용하여 2에 설명된 모든 시약을 혼합하여 준비한다. 파이펫은 매체에 구성 요소의 균일 한 분포를 보장하기 위해 여러 번 혼합합니다.
  4. 도금된 hPSCs로부터 티아조비빈 보충 mTeSR1을 제거하고 IMDM 매체로 hPSCs를 간략하게 세척한다. PBS는 칼슘 이온이 부족하기 때문에 IMDM 대신 인산완식염수(PBS)로 세척하지 마십시오(Ca2+)는 hPSC에 독성이 있습니다. 그것은 세포 형태를 방해할 것입니다.
  5. 간단한 IMDM 세척 후, hPSC에 1일차 배지를 추가합니다. 37°C 인큐베이터에 세포를 다시 시간과 장소 기록
  6. 후속 분화 단계를 계속(표2)및 각각의 분화 배지를 각각의 일(24 시간 간격)에 세포에 첨가하여 일의 동일한 시간에 분화한다(도 1). 연속적인 분화 일들이 동일한 분화 매체를 사용하는 경우에도 매일 신선한 미디어로 교체하십시오. 배지 변경 사이에 IMDM 배지로 셀을 한 번 세척하여 죽은 세포와 이전 배지 구성 요소의 잔재를 제거합니다.
  7. 분화가 간 싹 단계를 넘어 진행됨에 따라, 세포 수가 증가하고 따라서, 분화 인자와 영양소의 양이 제한되지 않도록 하기 위해 판의 각 웰에 더 많은 매체를 추가합니다. 예를 들어, 12-well의 각 웰에 1 mL 분화 배지를 1~6일 분화하고 분화의 후반일에 1.5-2 mL의 후속 분화 매체를 추가한다(일 7~ 18분화).

4. 면역 염색에 의한 내피 세포 및 간 전조의 특성화

  1. 차단 완충제 준비: 10% 당나귀 혈청 + 0.1% 트리톤 X100 탈이온화된 인산염 완충식염수(DPBS).
  2. 염색 완충제 준비: DPBS에서 1% 당나귀 세럼 + 0.1% 트리톤 X100.
  3. 12 웰 플레이트에서 세포로부터 배지를 흡인한다.
  4. 실온에서 15분 동안 4% 파라포름알데히드(DPBS)를 넣고 세포를 고치고 DPBS로 세포를 두 번 세척합니다.
  5. 고정 된 셀을 차단하고 투과하기 위해 실온에서 1 시간 동안 차단 버퍼를 추가하십시오.
  6. 차단 용액을 흡인하고 염색 완충액에서 희석된 1차 항체를 첨가한다. (항체의 희석비율은 물질 표 를 참조하십시오.)
  7. 세포를 4 °C에서 밤새 얼룩.
  8. DPBS에서 0.1 % 트리톤 X100으로 세포를 세 번 씻습니다.
  9. 실온에서 1 시간 동안 염색 버퍼에 이차 항체 얼룩을 추가하십시오. (이차 항체의 희석은 재료 표 를 참조하십시오.)
  10. 이차 항체를 제거하고 실온에서 5분 동안 DAPI를 추가하여 핵 카운터스테인을 수행합니다.
  11. DPBS에서 0.1% 트리톤 X100으로 두 번 세척하여 과잉 항체와 DAPI를 제거합니다.
  12. 자이스 옵저버 D1로 형광 현미경 검사법을 실시합니다. 또는 이미징이 수행될 때까지 플레이트를 4°C로 저장합니다. 예상 된 결과 참조 그림 3.

5. 형광 활성화 세포 선별 (FACS) 분석에 의한 간 전조의 특성 분석

참고: FACS를 사용하여 분화 6일째까지 나타나는 AFP+ 분화 LB 세포의 백분율을 정확하게 정량화합니다. 동일한 단계를 수행하여 ALB+ 분화 한 간세포의 백분율을 분화 의 18 일까지 정량화하십시오.

  1. 반 AFP 항체를 공액화한다.
  2. R-phycoerythrin 컨쥬게이션 키트를 사용하여 (0.55 μg/μL)의 농도로 항 AFP 항체에 R-phycoerythrin을 추가합니다 (재료 참조).
    참고: 항체가 정제되고 아민을 포함하지 않는 완충제에서 재구성되었는지 확인하십시오. 표지 반응에 사용되는 항체의 양이 PE의 양보다 적어야 하는지 확인합니다(즉, PE의 100 μg를 가진 항체의 60 μg). 항체의 불쌍한 융합은 믿을 수 없는 결과로 이끌어 낼 수 있습니다.
  3. 표지될 항체의 10 μL에 대한 수식기 시약 1 μL을 추가합니다. 부드럽게 섞으세요.
  4. R-PE 혼합물(100 μL)을 제거하고 상기 혼합물을 용서화된 R-PE 물질에 직접 피펫한다.
  5. 뚜껑을 다시 놓고 실온에서 어두운 곳에서 3 시간 동안 유리병을 둡니다.
  6. 3시간 이상 인큐베이션한 후, 사용된 항체의 10 μL에 대해 1 μL의 퀘이셔 시약을 첨가한다. 컨쥬게이트는 30분 후에 사용할 수 있습니다.
  7. 공액 항체를 4°C에서 저장합니다.
  8. DMEM/F12로 차별화되거나 미분화되지 않은 hPSC를 6웰 형식으로 세척합니다.
  9. 세포가 분리 될 때까지 실온에서 5 분 동안 해리 제 (6 웰 플레이트에 1 mL / 잘)로 간략하게 치료하십시오. 미분화 hPSC 및 분화 간 전구 세포를 동일하게 수확하고 염색하고 동일한 실험에서 병렬로 분석하여 항체 염색의 특이성을 보장합니다.
  10. 페트리 접시를 부드럽게 눌러 세포를 분리합니다. p1000 파이펫을 사용하여 플레이트에서 세포를 분리하고 50mL 원추형 튜브에서 셀을 수집합니다. 다음 단계를 진행하기 전에 셀이 대부분 분리되었는지 확인합니다. 그 후, 잔류 세포를 수집하기 위해 1xDPBS 버퍼로 우물을 두 번 더 세척하십시오.
  11. 50mL 원엽 튜브에서, 1x DPBS 완충액의 ~5 부피로 해리제를 희석한다. 모든 세포가 단일 세포로 해리되도록 p1000 파이펫으로 3-4 회 엄격하게 트리튜레이트하십시오.
    참고: 원심 분리 또는 덩어리가 나중에 쉽게 해리 될 수 없습니다 전에 단일 세포를 생성하는 것이 필수적이다. 그러나 셀 무결성을 손상시킬 수 있기 때문에 지나치게 삼중화하지 마십시오. 세포 수를 계산하고 이전에 최소한의 배경 및 최대 신호 검출을 위해 최적화 된 항체 비율에 세포의 권장 비율을 사용합니다.
  12. 4°C에서 5분 동안 300 x g에서 세포 현탁액을 함유하는 원심분리기 원심분리기.
  13. 세포 펠릿을 방해하지 않도록주의하여 상월체를 흡인합니다.
  14. 단일 세포 현탁액을 생성하고 20 분 동안 4 °C에서 얼음에 고정하기 위해 고정 / 파마 버퍼에 철저하게 세포 펠릿을 다시 일시 중단. 또한, 이 단계에서 2 mL 마이크로 원심 분리 튜브를 사용하면 셀 펠릿이 튜브의 V 자형 모서리에 증착되어 세차 중 세포 손실을 최소화할 수 있습니다.
  15. 각 펠릿을 1.8 mL의 파마/세척 버퍼로 두 번 세척합니다. p1000 파이펫과 6회 혼합하여 파마/세척 버퍼에 셀 펠릿을 철저히 재놓습니다. 그런 다음 원심 분리기를 제거하고 1.8 mL의 파마 / 세척 버퍼로 세척 과정을 반복하십시오.
  16. 100 μL/개별 얼룩이 있을 수 있도록 파마/세척 버퍼에 세포 펠릿을 다시 일시 중단하고 세포 현탁액을 2 mL 마이크로 원심 분리튜브로 옮김을 옮김으로 옮김을 옮김시 다.
    참고: 항체 염색 전에 이 단계에서 단일 세포 현탁액을 생성하는 것이 필수적이다. 세포의 응집체는 염색되지 않으므로 FACS 분석을 혼동합니다. 또한, 이 단계에서 2 mL 마이크로 원심 분리 튜브를 사용하면 셀 펠릿이 튜브의 V 자형 모서리에 증착되어 세차 중 세포 손실을 최소화할 수 있습니다.
  17. FACS 버퍼에서 세포를 재중단한 후, 개별 2 mL 튜브로 세포를 aliquot(스테인드되지 않은 제어 및 항체 염색 샘플 모두).
  18. 안티 AFP-PE 0.33 μL 150,000 세포 당 얼룩 30 어두운 실내 온도에서 분. 예를 들어, 100 μL 개별 얼룩의 경우, 다음과 같이 얼룩: a-AFP PE의 0.33 μL 및 100 μL의 파마/세척 버퍼. p200 파이펫으로 셀을 재중단하여 얼룩을 제거합니다.
    참고: 파이펫-혼합만이 단백질 안정성을 감소시킬 수 있기 때문에 와류를 하지 않는다.
  19. 파마/워시 버퍼(1.9 mL/개별 얼룩)의 1-2 mL에서 세포를 두 번 세척하고 원심분리기를 4°C에서 5분 동안 800 x g으로 세척하고 다시 두 번 중단합니다. 충분한 세척을 보장하기 위해 파마 / 세척 버퍼의 1-2 mL 이하로 세포를 씻어.
    참고: 피펫만 혼합하고 와류를 하지 않으면 단백질 안정성을 감소시킬 수 있다. 원심 분리 후, 세포가 디스로징되는 것을 방지하고 항체 이월을 최소화하고 보다 완전한 세척을 보장하기 위해 가능한 한 많은 상상화를 제거하기 위해 신중하게 흡인하십시오.
  20. 파마/세척 버퍼의 300 μL에서 각 세척 된 펠릿을 다시 중단하고 FACS 분석 전에 세포의 큰 덩어리를 변형시키기 위해 FACS 튜브에 100 μm 필터를 통해 변형.
  21. PE 채널에서 FACS 아리아 유동 세포측정에 대한 세포를 분석합니다. 각 개별 얼룩에 대해 최소 10,000개의 이벤트를 분석하고 FSC-A/SSC-A 분석을 통해 이벤트를 구문 분석하고, FSC-W/FSC-H를 게이팅하여 셀 싱글을 선택하고 SSC-H/SSC-W를 선택합니다.

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Representative Results

APS 분화의 24 시간 후에, 식민지는 일반적으로 hPSC 식민지를 할례하는 밝은 경계의 손실과 수반되는 미분화 콜로니와는 다른 형태를 채택할 것입니다. 형태학적으로, 원시 줄무늬 세포는 일반적으로 비정형 테두리를 가지고 있으며 hPSCs보다 더 많이 퍼지고 덜 컴팩트합니다 -이것은 다능성 epiblast 세포가 원형으로 분화하고 침투함에 따라 상피 - 중간엽 전이를 연상시킵니다. 생체 내에서 줄무늬. 분화 전에 hPSCs의 콜로니 크기가 너무 크면, 미분화 세포를 포함하는 과도하게 제기된 중심이 있을 것이다. 이러한 큰 덩어리를 포함하는 배양은 버려야 하며, 이 미분화된 식민지 중심은 후속의 분화를 혼동할 것이다. 정확한 크기 및 밀도의 덩어리가 도금된 경우, APS 분화는 매우 재현성이 높고 균일하며, 99.3±0.1% MIXL1-Gfp+ 원시 줄무늬 집단(MIXL1은 원시 줄무늬 마커)을 생성한다. 일부 세포 사멸은 APS 분화 24시간 후에 관찰됩니다.

분화의 2일째에, 원시 줄무늬 세포는 2일째에 최종 내배엽 세포로 분화하였고,그 중 대부분은 SOX17(도 2) 및 FOXA2를 발현한다. 14개의 hESC 및 hiPSC 라인(H1, H7, H9, HES2, HES3, BJC1, BJC3, HUF1C4 및 HUF58C4 포함)을 가진 수십 개의 독립적인 실험에서, 이 접근법은 순수한결산군 집단(94.0% ±3.1%)을 확장적으로, 일관되고 효율적으로 생성하였다. 이 방법은 hPSCs로부터 확실한 내배엽을 생성하는 CXCR4+PDGFRA-내피 성 집단의 높은 백분율을 산출한다- 다른 내배엽 형성 접근법 2,14.

분화의 3일째에, 내배엽은 다각형 모양으로 나타나는 포구트 선조로분화되었다(그림 1). 이후, 분화 6일까지, 포구선 전구는 AFP, TBX3 및 HNF4A를 발현하는 간부선으로분화한다(그림 3). 3개의 hESC 라인(H1, H7, H9 hESCs)에 걸쳐, 이 방법은 89.0±3.1%의 효율로 6일째 AFP+ 간 전구 형성을 생성한다(도 2). 마지막으로, hPSCs로부터 의 간 분화 18 일 후에, ALBUMIN+ 간세포 유사 세포가 나타난다. 형태학적으로, 그들은 담즙 canaliculi를 연상시키는 밝은 테두리를형성하는 상피 나타납니다 (그림 1). 이 단계에서, 18 hPSC 유래 간세포의 세포질은 핵보다 어둡게 나타난다(도 1).

Figure 1
도 1: 미분화 hPSCs의 분화 전략 및 형태, 내배엽 및 간세포 유사 세포를 분화하는 회로도. 차별화 프로세스와 타임라인이 표시되었습니다. 약어: d= 일, hPSC = 인간 다능성 줄기 세포, APS = 전방 원시적 줄무늬, DE = 최종 내배엽, PFG = 후방 포위트, LB = 간 부동 선조, HP = 간세포 전구체, HEP = 간세포 세포와 같은 세포. 배율 막대 = 400 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 2
그림 2: 1일째 MIXL1+ 원시적 행진, 2일째 SOX17+ 확정(def) 내배엽, 6일째 AFP+ 간새 싹 선조 및 FACS에 의해 나타난 바와 같이 ALB+ 간세포 집단의 백분율. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 3
그림 3: 6일째 간 선조의 면역 염색 분석. hPSC는 먼저 간싹 전구체로 분화하였고, 이는 간부드 전사 인자 HNF4A(적색), TBX3(녹색) 뿐만 아니라 세포질 간 새싹 마커 AFP(빨강)에 대해 면역으로 염색되었다. 핵은 총 세포 수를 평가하기 위해 DAPI(청색)로 반태시켰다. 배율 막대 = 50 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 4
그림 4: hPSCs의 셀 시드 밀도. 낮은 (왼쪽) 및 적절한 (중간 및 오른쪽) 세포의 밀도 시드. 배율 막대 = 1,000 μm. 화살표는 세포의 식민지 사이의 "다리"를 가리킵니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

기본 매체 기본 매체의 구성
CDM2 1:1 IMDM/F12, 0.1% m/v PVA, 1% 농축 지질, 0.7 μg/mL 인간 재조합 인슐린, 15 μg/mL 트랜스퍼린, 18 nM 1-티오글리세롤
CDM3 1:1 IMDM/F12, 0.1% m/v PVA, 1% 농축 지질, 10% KOSR
CDM4 1:1 IMDM/F12, 1% 농축 지질, 15 μg/mL 트랜스퍼린
CDM5 CMRL, 코스피 10%, 글루타맥스 1%

표 1: 화학적으로 정의된 매체 CDM2, CDM3, CDM4 및 CDM5의 조성.

차별화 단계 기간 요인 복용량 기본 매체
1일차 원시 행진 1일 액티빈 (주) 100 ng/mL
CHIR99201 3 μM CDM2
PI103 50 nM
FGF2 10 ng/mL
2일차 결정적 내배 1일 액티빈 (주) 100 ng/mL
DM3189 250 nM CDM2
PI103 50 nM
3일차 포레구트 1일 A83-01 1 μM
TTNPB 75 nM CDM3
BMP4 30 ng/mL
FGF2 10 ng/mL
제6일 간부 선조 2일 액티빈 (주) 10 ng/mL
C59 1 μM CDM3
BMP4 30 ng/mL
산림 (미국) 1 μM
1일 액티빈 (주) 10 ng/mL
CHIR99201 1 μM CDM3
BMP4 30 ng/mL
산림 (미국) 1 μM
일 12 간 선조 6일 간 BMP4 10 μg/mL
Osm 10 ng/mL
덱사메타손 10 μM
산림 (미국) 10 μM CDM4
Ro4929097 2 μM
AA2P 200 μg/mL
인슐린 10 μg/mL
일 18 간세포 6일 간 덱사메타손 10 μM
산림 (미국) 10 μM CDM4 또는
Ro4929097 2 μM CDM5
AA2P 200 μg/mL
인슐린 10 μg/mL

표 2: 분화 매체의 조성.

문제 가능한 이유 제안 된 솔루션
식민지의 중심에 있는 세포는 분화하지 않습니다 i) 콜로니 크기가 지나치게 컸고, 큰 식민지 중간에 있는 세포는 분화 신호에 접근할 수 없었다. i) 셀 카운팅 테크니큐를 확인합니다.
ii) 매우 큰 식민지를 형성, 우물 (또는 주변의 중심에 함께 병합 덩어리의 고르지 분포) ii) 도금 중에 덩어리를 고르게 분배하기 위해 크로스 방식으로 접시를 흔들고 인큐베이터에 넣기 전에 현미경으로 확인하십시오.
iii) 세포가 불충분한 분화 신호를 수신했습니다. iii) 분화 매체의 적절한 볼륨을 추가 : 12 웰 플레이트에 잘 당 매체의 1 mL을 추가하고 6 웰 플레이트에 잘 당 3 mL
차별화의 효율성 저하 i) 세포 배양 시작 부분 분화 i) 미분화 hPSCs의 새로운 고품질 배치 사용
ii) 콜로니는 너무 조밀하게 씨를 뿌리고, 세포의 동시 시트를 형성했다. ii) 종자 세포와 분화를 위해 세포를 정확하게 계산하고 균등하게 흔들어 서 분배합니다.
iii) 부적절한 세척으로 인해 잔류 매물 및 원치 않는 신호가 세척되지 않았습니다. iii) 분화의 이전 단계에서 잔류 mTeSR1 또는 유도 매체는 분화를 차단합니다; 분화 매체를 추가하기 전에 IMDM으로 셀을 세척
iv) 너무 가혹한 세척; 부적절한 세척 조건은 세포 형태를 심각하게 방해합니다. iv) 분화 매체를 추가하기 전에 IMDM으로 간략하게 세척하십시오. DPBS(또는 다른 삼투성 또는 냉방매체가 있는 매체) 또는 연장된 세척을 사용하면 세포 형태와 생존능력이 저하됩니다.
v) 분화 단계의 연장 또는 단축 기간, 권장보다 길거나 짧은 기간. v) 차별화의 각 단계에 대해 권장되는 타이밍을 준수합니다.

표 3: 잠재적인 문제와 그 가능한 원인과 해결책.

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Discussion

이 방법은 hPSCs에서 간 꽃 봉오리 선조, 그리고 이후에 간세포 와 같은 세포의 농축 된 집단의 생성을 가능하게합니다. 인간 간 세포의 풍부한 인구를 생성 하는 능력은 이러한 세포의 실제적인 활용에 대 한 중요 하다. hPSCs로부터 간세포를 생성하는 이전 방법은 설치류로 이식시, 간 조직15이외에 뼈와 연골을 산출하는 간 및 비간 세포를 모두 포함하는 불순한 세포 집단을 산출하였다. 따라서 비 간 분화의 명시적 억제는 다양한 응용 프로그램에 적합 할 수있는 풍부한 간 인구를 생성하는 것이 중요합니다.

특히, 첫 번째 단계에서 hPSCs의 제어된 도금은 효율적인 다운스트림 분화를 위해 필수적입니다. 분화를 위해 특정 밀도로 hPSC를 정확하게 플레이트하고 도금 공정 중에 이러한 hPSCs를 웰 또는 플레이트에 고르게 분배하는 것이 중요합니다. 예를 들어, 12웰 플레이트의 각 웰에 대해, 웰당 160,000~ 250,000 hPSCs를 시드; 전반적으로, 세포 시딩 밀도를 적정하고 궁극적으로 각 세포주에 적합한 세포 밀도를테스트하는 것이 필수적이다(도 4). 너무 많은 hPSCs가 잘 당 시드되는 경우에, 그(것)들은 큰 식민지를 형성할 것입니다, 큰 식민지의 중간에 있는 세포가 주변의 가까운 세포에 비해 분화 신호에 보다 적게 접근하기 때문에, 분화 효율성에 부정적인 영향을 미칠 것입니다; 이질적인 크기의 식민지도 비슷한 문제를 제시할 것입니다. 세포 밀도가 너무 낮으면 (예를 들어, 12 웰 플레이트의 200,000 세포 / 우물 이하), 분화를위한 충분한 물질이 없을 수 있으며 광범위한 세포 사멸이 관찰 될 수 있습니다. 위에서 설명한 패싱 및 시드 방법은 다운스트림 분화에 적합한 크기의 hPSC 덩어리를 일관되게 생성합니다.

이 방법의 한 가지 제한은 생성된 간세포 유사 세포가 성인 간세포와 동일하지 않다는 것입니다. 더욱이, CYP3A4 효소 활성은 1차 성인 인간 간세포에 비해 이들 hPSC 유래 간세포 유사 세포에서 약 55배 낮다. 다가오는 도전은 완전히 본격적인, 성숙한 세포로 이 hPSC 파생된 간세포 같이 세포를 성숙하는 것입니다. 두 번째 제한은 효율적인 분화가 세포의 시작 밀도에 매우 의존하므로 권장 밀도로 시드를 균등하게 분산시키는 것이매우 중요하다는 것입니다(표 3).

전반적으로, 이 프로토콜은 적어도 3 hPSC 라인에서 89.0±3.1% 순도에서 간 싹 선조 및 간세포 유사 세포를 생성합니다. 둘째, 간세포유사 세포는 간 효소를 발현하고, 인간 ALBUMIN을 분비하고, 현존하는 분화 접근법을 사용하여 생성된 세포보다 더 높은 수준의 간 유전자를 발현하였다. 마지막으로, 결과 간세포 와 같은 세포는 시험관 내에서 특정 간세포 기능을 나타낼뿐만 아니라, 가장 중요한 것은 만성 간 손상의 마우스 모델을 이식하고 단기 생존을 향상시킬 수 있기 때문에 생체 내에서 어느 정도 기능 할 수 있습니다2 .

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Disclosures

저자는 공개 할 것이 없다.

Acknowledgments

우리는 토론과 줄기 세포 생물학 & 인프라 지원을위한 재생 의학에 대한 스탠포드 연구소 빙 림 에게 감사드립니다. 이 작품은 재생 의학에 대한 캘리포니아 연구소에 의해 지원되었다 (DISC2-10679) 스탠포드 - UC 버클리 시벨 줄기 세포 연구소 (L.T.A. 및 K.M.L.에) 분자 및 유전 의학뿐만 아니라 익명에 대한 스탠포드 베크만 센터, 박스터와 디제노바 가족 (K.M.L.에).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
 Geltrex Thermofisher Scientific A1569601
1:1 DMEM/F12 Gibco 11320033
0.2 μm pore membrane filter Millipore GTTP02500
mTeSR1 Stem Cell Technologies 5850
Thiazovivin Tocris Bioscience 3845
 Accutase Gibco or Millipore  Gibco A11105, Millipore  SCR005
IMDM, GlutaMAX™ Supplement Thermofisher Scientific 31980030
Ham's F-12 Nutrient Mix, GlutaMAX™ Supplement Thermofisher Scientific 31765035
KOSR, Knockout serum replacement Thermofisher Scientific 10828028
Poly(vinyl alcohol) Sigma-Aldrich   P8136
Transferrin  Sigma-Aldrich   10652202001
Chemically Defined Lipid Concentrate Thermofisher Scientific 11905031
Human Activin R&D 338-AC
CHIR99201 Tocris 4423
PI103 Tocris 2930/1
Human FGF2 R&D 233-FB
DM3189 Tocris 6053/10
A83-01 Tocris 2939/10
Human BMP4 R&D 314-BP
C59 Tocris 5148
TTNPB Tocris 0761/10
Forskolin Tocris 1099/10
Oncostatin M R&D 295-OM
Dexamethasone Tocris 1126
Ro4929097 Selleck Chem S1575
AA2P Cayman chemicals 16457
Human recombinant Insulin Sigma-Aldrich   11061-68-0

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References

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인간 다능성 줄기 세포를 간 세포로 효율적으로 분화
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Loh, K. M., Palaria, A., Ang, L. T. Efficient Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Liver Cells. J. Vis. Exp. (148), e58975, doi:10.3791/58975 (2019).More

Loh, K. M., Palaria, A., Ang, L. T. Efficient Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Liver Cells. J. Vis. Exp. (148), e58975, doi:10.3791/58975 (2019).

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