Summary

Эффективная дифференциация стволовых клеток человека в клетки печени

Published: June 11, 2019
doi:

Summary

Этот протокол детализирует монослой, метод без сыворотки для эффективного создания гепатоцитов, как клетки из человеческих плюрипотентных стволовых клеток (HPSCs) в 18 дней. Это влечет за собой шесть шагов, как hPSCs последовательно дифференцировать в промежуточных клеточных типов, таких как примитивные полосы, окончательный эндодерм, задний предтечут и печень бутон прародителей до формирования гепатоцитов, как клетки.

Abstract

Печень детоксикации вредных веществ, выделяет жизненно важные белки, и выполняет ключевые метаболические деятельности, тем самым поддерживая жизнь. Следовательно, печеночная недостаточность, которая может быть вызвана хроническим потреблением алкоголя, гепатитом, острым отравлением или другими оскорблениями– является тяжелым заболеванием, которое может привести к кровотечению, желтухе, коме и, в конечном счете, смерти. Тем не менее, подходы к лечению печеночной недостаточности, а также исследования функции печени и болезни, были загнаны в тупик отчасти из-за отсутствия обильных поставок клеток печени человека. С этой целью в этом протоколе подробно описывается эффективная дифференциация плюрипотентных стволовых клеток человека (hPSCs) в гепатоцитные клетки, руководствуясь дорожной картой развития, которая описывает, как судьба печени определяется через шесть последовательных шагов дифференциации. Путем манипулировать путями сигнализации развития для того чтобы повысить дифференциацию печенки и точно подавить образование излишних судеб клетки, этот метод эффектно производит населенности потомков бутона печени человека и гепатоцит-как клетки днями 6 и 18 дифференциации PSC, соответственно. Это достигается за счет временно точного контроля путей сигнализации развития, оказываемого малыми молекулами и факторами роста в среде культуры, свободной от сыворотки. Дифференциация в этой системе происходит в монослойных и дает гепатоцитов, как клетки, которые выражают характерные ферменты гепатоцитов и имеют возможность привить мыши модель хронической печеночной недостаточности. Способность эффективно генерировать большое количество клеток печени человека in vitro имеет последствия для лечения печеночной недостаточности, для скрининга наркотиков, а также для механистических исследований заболеваний печени.

Introduction

Цель этого протокола заключается в эффективной дифференцировать человека плюрипотентных стволовых клеток (hPSCs) в обогащенных популяций печени бутон прародителей и гепатоцитов, как клетки2. Доступ к готовым поставкам человеческих протеже печени и гепатоцитов, как клетки ускорят усилия по исследованию функции печени и болезни и может позволить новые клеточные трансплантации терапии для печеночной недостаточности3,4, 5. Это оказалось сложной задачей в прошлом, так как hPSCs (которые включают эмбриональных и индуцированных плюрипотентных стволовых клеток) может дифференцироваться во все клетки типов человеческого тела; следовательно, было трудно исключительно дифференцировать их в чистую популяцию одного типа клеток, таких как клетки печени6.

Для точнодифференцировать hPSCs в клетки печенки, сперва критическое для того чтобы понять not only как клетки печенки определены но также как non-liver клетк-типы превращаются. Знание как non-liver клетки превращаются важно логически подавить образование non-liver lineages во время дифференциации, тем самым исключительно направляя hPSCs к судьбе печенки2. Во-вторых, важно разграничивать многочисленные шаги развития, через которые hPSCs дифференцировать к судьбе печени. Известно, что hPSCs последовательно дифференцировать в несколько типов клеток, известных как примитивные полосы (APS), окончательный эндодерм (DE), задний предтечу (PFG) и печени зародытели (LB) до формирования гепатоцитов, как клетки (HEP). Более ранняя работа выявила сигналы, указывающие на судьбу печени и сигналы, которые подавляли образование альтернативных не-печенных клеточных типов (включая желудок, поджелудочной железы и кишечных прародителей) на каждом выборе линии развития2, 7 (г. , 8.

В совокупности, эти идеи привели к сыворотке свободной, монослой метод дифференцировать hPSCs к примитивной полосы, окончательный эндодерм, задний предтечу, печень бутон прародителей и, наконец, гепатоцитов, как клетки2. В целом метод включает в себя посев hPSCs в монослой при соответствующей плотности, подготовка шести коктейлей дифференциации средств (содержащих факторы роста и малых молекул, которые регулируют различные пути развития сигнализации), и последовательно добавляя эти средства массовой информации, чтобы вызвать дифференциацию в течение 18 дней. Во время процесса, не проходя клеток не требуется. Следует отметить, потому что этот метод явно включает в себя сигналы, которые подавляют образование не-печенных клеточных типов, этот подход дифференциации1 более эффективно генерирует печени прародителей и гепатоцитов, как клетки по сравнению с сохранившимся методы дифференциации2,9,10,11,12. Кроме того, протокол, описанный в этом тексте, позволяет быстрее выражать гепатоциты, которые в конечном счете выражают более высокие уровни печеночных транскрипционных факторов и ферментов, чем те, которые производятся другими протоколами9,10 , 11 Год , 12.

Описанный здесь протокол имеет определенные преимущества по сравнению с текущими протоколами дифференциации. Во-первых, это влечет за собой монослойную дифференциацию гПСК, что технически проще по сравнению с трехмерными методами дифференциации, такими как те, которые полагаются на эмбриональные тела13. Во-вторых, этот метод использует недавнее продвижение которой окончательные клетки эндодерма (ранний предшественник клеток печени) могут быть эффективно и быстро генерируется в течение 2 дней hPSC дифференциации2,7, таким образом, что позволяет последующее производство гепатоцитов с повышенной чистотой. В-третьих, в бок о бок сравнения, гепатоцитов, как клетки, производимые этим методом2 производят больше ALBUMIN и выразить более высокие уровни печеночной транскрипции факторов и ферментов по сравнению с гепатоцитов, производимых в других методах10, 11,12.

Protocol

1. Подготовка дифференциации СМИ ПРИМЕЧАНИЕ: Обратитесь к таблице материалов для получения информации о материалах и реагентах, используемых. Подготовка базовых химически определенных носителей (CDM)ПРИМЕЧАНИЕ: CDM2, CDM3, CDM4 и CDM5 являются х…

Representative Results

После 24 ч дифференциации APS, колонии, как правило, принимают различные морфологии, чем недифференцированные колонии сопутствующей с потерей яркой границы, которая обычно ограничивает hPSC колоний. Морфологически, примитивные полосы клетки, как правило, оборванные грани…

Discussion

Этот метод позволяет выравнять из гПСК обогащенные популяции пенитобудников, а затем и гепатоцитов. Способность генерировать обогащенные популяции клеток печени человека имеет важное значение для практического использования таких клеток. Предыдущие методы генерации гепатоцитов из …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Мы благодарим Бинг Лим за дискуссии и Стэнфордский институт биологии стволовых клеток и регенеративной медицины для поддержки инфраструктуры. Эта работа была поддержана Калифорнийским институтом регенеративной медицины (DISC2-10679) и Институтом стволовых клеток Стэнфорд-UC Berkeley Siebel (в L.T.A. и K.M.L.) и Стэнфордским Центром молекулярной и генетической медицины Бекмана, а также Anonymous, Семьи Бакстер и Дигенова (к K.M.L.).

Materials

 Geltrex Thermofisher Scientific A1569601
1:1 DMEM/F12 Gibco 11320033
0.2 μm pore membrane filter Millipore GTTP02500
mTeSR1 Stem Cell Technologies 5850
Thiazovivin Tocris Bioscience 3845
 Accutase Gibco or Millipore  Gibco A11105, Millipore  SCR005
IMDM, GlutaMAX™ Supplement Thermofisher Scientific 31980030
Ham's F-12 Nutrient Mix, GlutaMAX™ Supplement Thermofisher Scientific 31765035
KOSR, Knockout serum replacement Thermofisher Scientific 10828028
Poly(vinyl alcohol) Sigma-Aldrich   P8136
Transferrin  Sigma-Aldrich   10652202001
Chemically Defined Lipid Concentrate Thermofisher Scientific 11905031
human Activin R&D 338-AC
CHIR99201 Tocris 4423
PI103 Tocris 2930/1
human FGF2 R&D 233-FB
DM3189 Tocris 6053/10
A83-01 Tocris 2939/10
Human BMP4 R&D 314-BP
C59 Tocris 5148
TTNPB Tocris 0761/10
Forskolin Tocris 1099/10
Oncostatin M R&D 295-OM
Dexamethasone Tocris 1126
Ro4929097 Selleck Chem S1575
AA2P Cayman chemicals 16457
human recombinant Insulin Sigma-Aldrich   11061-68-0

References

  1. Bernal, W., Wendon, J. Acute Liver Failure. New England Journal of Medicine. 369, 2525-2534 (2013).
  2. Ang, L. T., et al. A Roadmap for Human Liver Differentiation from Pluripotent Stem Cells. Cell Reports. 22, 2190-2205 (2018).
  3. Fisher, R. A., Strom, S. C. Human Hepatocyte Transplantation: Worldwide Results. Transplantation. 82, 441-449 (2006).
  4. Dhawan, A. Clinical human hepatocyte transplantation: Current status and challenges. Liver transplantation. 21, S39-S44 (2015).
  5. Salama, H., et al. Autologous Hematopoietic Stem Cell Transplantation in 48 Patients with End-Stage Chronic Liver Diseases. Cell Transplantation. 19, 1475-1486 (2017).
  6. Tan, A. K. Y., Loh, K. M., Ang, L. T. Evaluating the regenerative potential and functionality of human liver cells in mice. Differentiation. 98, 25-34 (2017).
  7. Loh, K. M., et al. Efficient Endoderm Induction from Human Pluripotent Stem Cells by Logically Directing Signals Controlling Lineage Bifurcations. Cell Stem Cell. 14, 237-252 (2014).
  8. Loh, K. M., et al. Mapping the Pairwise Choices Leading from Pluripotency to Human Bone, Heart, and Other Mesoderm Cell Types. Cell. , 451-467 (2016).
  9. Zhao, D., et al. Promotion of the efficient metabolic maturation of human pluripotent stem cell-derived hepatocytes by correcting specification defects. Cell Research. 23, 157-161 (2012).
  10. Si Tayeb, K., et al. Highly efficient generation of human hepatocyte-like cells from induced pluripotent stem cells. Hepatology. 51, 297-305 (2010).
  11. Carpentier, A., et al. Hepatic differentiation of human pluripotent stem cells in miniaturized format suitable for high-throughput screen. Stem Cell Research. 16, 640-650 (2016).
  12. Avior, Y., et al. Microbial-derived lithocholic acid and vitamin K2 drive the metabolic maturation of pluripotent stem cells-derived and fetal hepatocytes. Hepatology. 62, 265-278 (2015).
  13. Ogawa, S., et al. Three-dimensional culture and cAMP signaling promote the maturation of human pluripotent stem cell-derived hepatocytes. Development. 140, 3285-3296 (2013).
  14. Rostovskaya, M., Bredenkamp, N., Smith, A. Towards consistent generation of pancreatic lineage progenitors from human pluripotent stem cells. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 370, 20140365 (2015).
  15. Haridass, D., et al. Repopulation Efficiencies of Adult Hepatocytes, Fetal Liver Progenitor Cells, and Embryonic Stem Cell-Derived Hepatic Cells in Albumin-Promoter-Enhancer Urokinase-Type Plasminogen Activator Mice. The American Journal of Pathology. 175, 1483-1492 (2009).

Play Video

Cite This Article
Loh, K. M., Palaria, A., Ang, L. T. Efficient Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Liver Cells. J. Vis. Exp. (148), e58975, doi:10.3791/58975 (2019).

View Video