Summary
Este protocolo detalla un método monocapa y libre de suero para generar eficientemente células similares a hepatocitos a partir de células madre pluripotentes humanas (hPSC) en 18 días. Esto implica seis pasos a medida que los hPSCs se diferencian secuencialmente en tipos celulares intermedios como la raya primitiva, el endodermo definitivo, los progenitores posteriores del antebrazo y del brote hepático antes de formar células similares a los hepatocitos.
Abstract
El hígado desintoxica sustancias nocivas, secreta proteínas vitales y ejecuta actividades metabólicas clave, sosteniendo así la vida. En consecuencia, la insuficiencia hepática, que puede ser causada por la ingesta crónica de alcohol, hepatitis, intoxicación aguda u otros insultos, es una afección grave que puede culminar en sangrado, ictericia, coma y eventualmente la muerte. Sin embargo, los enfoques para tratar la insuficiencia hepática, así como los estudios de la función hepática y la enfermedad, se han visto obstaculizados en parte por la falta de un abundante suministro de células hepáticas humanas. Con este fin, este protocolo detalla la diferenciación eficiente de las células madre pluripotentes humanas (hPSC) en células similares a hepatocitos, guiadas por una hoja de ruta de desarrollo que describe cómo se especifica el destino hepático en seis pasos de diferenciación consecutivos. Mediante la manipulación de vías de señalización del desarrollo para promover la diferenciación hepática y suprimir explícitamente la formación de destinos celulares no deseados, este método genera eficientemente poblaciones de progenitores de cogollos hepáticos humanos y células similares a hepatocitos en los días 6 y 18 de diferenciación psC, respectivamente. Esto se logra a través del control temporal-preciso de las vías de señalización del desarrollo, ejercido por pequeñas moléculas y factores de crecimiento en un medio de cultivo libre de suero. La diferenciación en este sistema se produce en monocapas y produce células similares a hepatocitos que expresan enzimas de hepatocitos características y tienen la capacidad de injertar un modelo de ratón de insuficiencia hepática crónica. La capacidad de generar eficientemente un gran número de células hepáticas humanas in vitro tiene ramificaciones para el tratamiento de la insuficiencia hepática, para la detección de drogas, y para estudios mecánicos de enfermedad hepática.
Introduction
El propósito de este protocolo es diferenciar eficientemente las células madre pluripotentes humanas (hPSC) enpoblaciones enriquecidas de progenitores de cogollos hepáticos y células similares a hepatocitos 2. El acceso a un suministro listo de progenitores hepáticos humanos y células similares a hepatocitos acelerará los esfuerzos para investigar la función hepática y la enfermedad y podría permitir nuevas terapias de trasplante celular para la insuficiencia hepática3,4, 5. Esto ha demostrado ser difícil en el pasado ya que los hPSC (que incluyen células madre pluripotentes embrionarias e inducidas) pueden diferenciarse en todos los tipos celulares del cuerpo humano; consecuentemente, ha sido difícil diferenciarlos exclusivamente en una población pura deun solo tipo celular, como las células hepáticas 6.
Para diferenciar con precisión los hPSC en células hepáticas, primero es fundamental entender no sólo cómo se especifican las células hepáticas, sino también cómo se desarrollan los tipos de células no hepáticas. El conocimiento de cómo se desarrollan las células no hepáticas es importante para suprimir lógicamente la formación de linajes no hepáticos durante la diferenciación, guiando así exclusivamente a los hPSC hacia un destino hepático2. En segundo lugar, es esencial delinear los múltiples pasos de desarrollo a través de los cuales los hPSCs se diferencian hacia un destino hepático. Se sabe que los hPSC s diferencian secuencialmente en múltiples tipos de células conocidas como la raya primitiva (APS), el endoderm definitivo (DE), el anteegut posterior (PFG) y los progenitores de los cogollos hepáticos (LB) antes de formar células similares a hepatocitos (HEP). Trabajos anteriores revelaron las señales que especificaban el destino hepático y las señales que suprimieron la formación de tipos alternativos de células no hepáticas (incluidos los progenitores estomacales, pancreáticos e intestinales) en cada opción de linaje del desarrollo2, 7 , 8.
Colectivamente, estos conocimientos han dado lugar a un método monocapa libre de suero para diferenciar los hPSC hacia la racha primitiva, endoderm definitivo, la proegut posterior, los progenitores de los cogollos hepáticos y, por último, las células similares a los hepatocitos2. En general, el método consiste en la sembración de hPSCs en monocapa a una densidad adecuada, preparando seis cócteles de medios de diferenciación (que contienen factores de crecimiento y moléculas pequeñas que regulan diversas vías de señalización del desarrollo), y consecuentemente añadiendo estos medios para inducir la diferenciación en el transcurso de 18 días. Durante el proceso, no se necesita pasar las células. Cabe destacar que este método incluye explícitamente señales que suprimen la formación de tipos de células no hepáticas, este enfoque de diferenciación1 genera de manera más eficiente progenitores hepáticos y células similares a hepatocitos en comparación con los existentes métodos de diferenciación2,9,10,11,12. Además, el protocolo descrito en este texto permite la generación más rápida de hepatocitos que, enúltima instancia, expresan niveles más altos de factores y enzimas de transcripción hepática que los producidos por otros protocolos 9,10 , 11 , 12.
El protocolo descrito aquí tiene ciertas ventajas sobre los protocolos de diferenciación actuales. En primer lugar, implica la diferenciación monocapa de los hPSC, que es técnicamente más simple en comparación con los métodos de diferenciación tridimensional, como los que se basan en cuerpos embrionarios13. En segundo lugar, este método aprovecha un avance reciente mediante el cual las células de endodermo definitivas(un precursor temprano de las células hepáticas) pueden generarse de manera eficiente y rápida dentro de los 2 días posteriores a la diferenciación de hPSC 2,7, permitiendo así la posterior producción de hepatocitos con mayor pureza. En tercer lugar, en comparaciones en paralelo, las células similares a los hepatocitos producidas por este método2 producen más ALBUMIN y expresan niveles más altos de factores de transcripción hepática y enzimas en comparación con los hepatocitos producidos en otros métodos10, 11,12.
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Protocol
1. Preparación de medios de diferenciación
NOTA: Consulte la Tabla de materiales para obtener información sobre el fabricante sobre los materiales y reactivos utilizados.
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Preparación de medios de base definidos químicamente (CDM)
NOTA: CDM2, CDM3, CDM4 y CDM5 son medios definidos químicamente que se utilizan como medios base para diferenciar los hPSC a las células hepáticas en varias etapas. La composición de estos medios se puede encontrar en la Tabla1.- Para hacer CDM2 o CDM3, prepare una solución en stock que contenga alcohol polivinílico (PVA). Disolver 0,5 g de polvo de PVA en 50 ml del medio modificado de Dulbecco (IMDM) de Iscove para generar un stock de PVA de 10 mg/ml.
NOTA: Puesto que el PVA no se disuelve fácilmente, prepare la mezcla de PVA/IMDM en un matraz cónico con agitación continua a 50 oC en una almohadilla de calentamiento; agitación se puede lograr fácilmente utilizando un agitador magnético. - Después de que el PVA se disuelva homogéneamente en IMDM, retire la solución de PVA de la almohadilla de calentamiento y deje que se enfríe a temperatura ambiente.
- Utilice un filtro estéril de 0,2 m para filtrar la solución de PVA.
- Preparar el CDM2 y el CDM3 combinando el PVA filtrado del paso 1.1.1 y varios componentes comprados comercialmente como se describe en el Cuadro 1 y la Tabla de Materiales. Utilice unidades de filtro estériles de 0,2 m para filtrar todos los medios.
NOTA: El medio base se puede almacenar a 4 oC, pero durante no más de 2 meses. - Prepare los medios base restantes CDM4 y CDM5 siguiendo el Cuadro1.
- Para hacer CDM2 o CDM3, prepare una solución en stock que contenga alcohol polivinílico (PVA). Disolver 0,5 g de polvo de PVA en 50 ml del medio modificado de Dulbecco (IMDM) de Iscove para generar un stock de PVA de 10 mg/ml.
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Preparación de medios de diferenciación
- Para preparar soluciones de stock para las moléculas pequeñas y los factores de crecimiento, reconstituirlas según las recomendaciones de los fabricantes. Para el almacenamiento, alícuota en tubos estériles para reducir los ciclos de congelación-descongelación y mantener a -20 oC o según lo recomendado.
NOTA: La composición del medio de diferenciación que se utilizará en varias etapas de diferenciación se describe en la Tabla 2 y en los pasos siguientes. - Para preparar el medio de diferenciación, primero descongelar las moléculas pequeñas congeladas y/o los factores de crecimiento a temperatura ambiente. A continuación, alícuota la cantidad requerida de medio base. Por último, preparar los medios de diferenciación final es añadiendo las moléculas pequeñas y los factores de crecimiento especificados al medio base a las concentraciones adecuadas (Tabla 2).
NOTA: El medio de diferenciación recién preparado debe utilizarse idealmente el mismo día; de lo contrario, puede almacenarse a 4 oC y utilizarse en un plazo de tres días. - Usando una punta de pipeta, mezcle el medio de diferenciación varias veces para asegurar que los suplementos se distribuyan homogéneamente antes de añadir el medio a las células (por ejemplo, agregue 1 ml de medio de diferenciación a cada pocal de una placa de 12 pocillos.)
- Para preparar soluciones de stock para las moléculas pequeñas y los factores de crecimiento, reconstituirlas según las recomendaciones de los fabricantes. Para el almacenamiento, alícuota en tubos estériles para reducir los ciclos de congelación-descongelación y mantener a -20 oC o según lo recomendado.
2. Semillas hPSCs en Placas en Densidades Definidas para Diferenciación
- Plásticos de cultivo celular de recubrimiento que se utilizarán para la sembración con hPSCs.
- Descongelar la matriz (p. ej., Geltrex) a 4oC durante la noche antes del día de uso.
- Al día siguiente, diluir la matriz 1:100 añadiendo 500 l de la matriz en 50 ml de medio de águila modificada (DMEM) /F12 de Dulbecco en frío. Dado que la matriz es un hidrogel que polimeriza irreversiblemente al exponerse a la temperatura ambiente, cuando se trabaja con la matriz, mantenga siempre los tubos de matriz y los medios en hielo.
- NOTA: La matriz disuelta 1:100 en DMEM/F12 se puede almacenar a 4 oC, pero debe utilizarse en un plazo de 2 meses.
- Para recubrir una placa de cultivo con la matriz, pipetear la matriz diluida en el número requerido de pozos utilizando el volumen suficiente de solución de matriz para cubrir la superficie del pozo (por ejemplo, añadir 0,5 ml de matriz a un pozo de una placa de 12 pocillos o 1 ml a un pozo de 6- bien. Si es necesario, agitar la placa suavemente para asegurarse de que la solución de matriz ha cubierto completamente la parte inferior del pozo.
- Deje la placa recubierta de matriz en una incubadora de 37 oC durante al menos 60 minutos. A esta temperatura, la matriz se polimeriza para formar una película delgada en la parte inferior del pozo.
- NOTA: Las placas recubiertas de matriz se pueden mantener en la incubadora de 37 oC y se pueden utilizar en un plazo de 3 días, siempre y cuando la matriz no se haya secado.
- Aspirar la solución de matriz restante de los pozos recubiertos inmediatamente antes de sembrar los pozos con hPSCs.
- Pasar y sembrar las placas recubiertas con hPSCsNOTA: El agente de disociación contiene enzimas que disocian las células y es importante dejar los hPSC en el agente de disociación durante lo más corto posible.
- Para las placas de cultivo recubiertas con matriz de semillas con hPSCs antes de la diferenciación, crezca hPSCs indiferenciados hasta >70% de confluencia en el medio mTeSR1 disponible comercialmente (Tablade Materiales)según el protocolo del fabricante. Es fundamental para el paso de los hPSCs antes de que se vuelvan completamente confluentes, ya que los hPSC pueden diferenciarse espontáneamente en alta confluencia.
NOTA: los hPSC deben ser cariotipos para asegurarse de que no hay anomalías cromosómicas antes de usarlos para experimentos. Los hPSC utilizados para este protocolo de diferenciación se mantuvieron en medios mTeSR1 y se pasaron como grupos con EDTA para minimizar las anomalías cariotípicas. Los hPSC karyotípicamente anormales no deben utilizarse para la diferenciación, ya que pueden proliferar anormalmente rápidamente; por lo tanto, las densidades de semilla celular recomendadas aquí no son apropiadas para las células anormalmente anormales. - Para la semilla de hPSCs para la diferenciación, aspirar mTeSR1 de la placa de cultivos hPSC de gran confluente y añadir agente de disociación comprado comercialmente (Tabla de Materiales) para disociar los hPSC, utilizando el agente de disociación suficiente para cubrir la superficie de la bien o plato en el que las células están creciendo (por ejemplo, añadir 0,5 ml del agente de disociación por pozo de un plato de 12 pocillos, 1 ml por pozo de un plato de 6 pocillos o 3 ml por plato de 10 cm).
- Incubar hPSCs en el agente de disociación a 37 oC durante 5 min o hasta que algunas colonias comiencen a desprenderse. Toque suavemente la parte inferior del pozo/placa varias veces; después de varios minutos de disociación, la mayoría de las colonias de hPSC deben entrar libremente en suspensión.
- Para desalojar los hPSC disociados de la placa, añada 2 ml/pozo de DMEM/F12 si trabaja con una placa de 6 pocillos (o 1 ml/bien si trabaja con una placa de 12 pocillos) para diluir el agente de disociación. Utilice una pipeta serológica de 5 ml para pipetear suavemente hacia arriba y hacia abajo varias veces para lavar todas las células de la superficie del pozo; recoger células individuales resuspendidas en un tubo cónico de 50 ml. Lave la placa por segunda vez con el mismo volumen de DMEM/F12 para asegurar la recuperación de todos los hPSC.
- Al tubo cónico de 50 ml que contiene las células, agregue DMEM/F12 para diluir el volumen original del agente de disociación por 1:5-1:10 (por ejemplo, si el volumen original del agente de disociación fue de 1 ml, ajuste el volumen total de la suspensión celular a 10 ml con DMEM/F12 para diluir el agente de disociación a la 1:10)
- Centrifugar los hPSC recogidos en un tubo cónico de 50 ml a 350 x g durante 3 minutos a 4 oC a células de pellets.
- Mientras espera a que las células pelet, aspirar la matriz de la placa en la que se sembrará el hPSCS. A continuación, añadir cantidades suficientes de mTesR1 suplementado con 1 M de tiazovivin obtenido comercialmente (un inhibidor farmacológico de ROCK) a los pozos receptores para cubrirlos (por ejemplo, añadir 0,5 ml de mTeSR1 por pozo de una placa de 12 pocillos o 1 ml de mTeSR1 por pozo de una placa de 6 pocillos).
NOTA: La tiazovivina a una baja concentración se incluye en este paso para mejorar la supervivencia de una sola célula y por lo tanto la densidad de sembración posterior de los hPSC. - Después de centrifugar los hPSC, aspirar cuidadosamente el sobrenadante, dejando los hpPC peletizares en la parte inferior del tubo cónico. El sobrenadante contiene agente de disociación que inhibirá la adhesión posterior de los HPSC y, por lo tanto, es importante aspirar a la gran mayoría del sobrenadante antes de proceder.
- Resuspenda el pellet celular en mTeSR1 complementado con 1 M de tiazovivin. Con una pipeta p1000, triturar suavemente 2-3 veces para resuspender uniformemente el pellet celular en una suspensión de una sola célula. No sobre-triturar el pellet celular como fuerza mecánica excesiva dañará los hPSC y conducir a la supervivencia celular deficiente.
- Después de la resuspensión de los hPSCs, pipetee inmediatamente 10 l de la suspensión en un hemocitómetro y cuente el número de células. Es importante pipetear las células para contar lo más rápido posible, ya que la gravedad conducirá a que los hPSC se asienten naturalmente en la parte inferior del tubo de 50 ml, lo que confundirá un conteo de células preciso.
- Ajuste el volumen de los hPSC resuspendidos con mTeSR1 suplementado con tiazovivin para lograr la concentración celular deseada para el revestimiento. Por ejemplo, después de ajustar el volumen de hPSC resuspendidos, agregue 0,5 ml de la suspensión celular por pozo a la semilla de 160.000 a 250.000 celdas en cada pozo de una placa de 12 pocillos, logrando así un volumen total de 1 ml en cada pozo (0,5 ml de medios se añadieron al pozo en el paso 2.2.7). Si se utilizan pozos más grandes o más pequeños, escale los números de celda/volúmenes de medios hacia arriba o hacia abajo en consecuencia.
NOTA: Es importante sembrar hPSCs en la densidad celular indicada. Los hPSC con un sobreflujo no diferenciarán de manera eficiente y los hPSC confluentes no sobrevivirán bien durante la diferenciación. - Agitar la placa en un patrón cruzado (izquierda, luego derecha; hacia adelante, luego hacia atrás) varias veces para asegurarse de que las células se distribuyen uniformemente a través de la placa / bien. No gire la placa en un movimiento circular, ya que las células se asentarán en el centro de la placa / pozo. Típicamente, los hPSC comenzarán a adherirse a la superficie del pozo dentro de 3-30 min. Permitir que las células crezcan durante al menos 24 horas antes de iniciar la diferenciación.
- Para las placas de cultivo recubiertas con matriz de semillas con hPSCs antes de la diferenciación, crezca hPSCs indiferenciados hasta >70% de confluencia en el medio mTeSR1 disponible comercialmente (Tablade Materiales)según el protocolo del fabricante. Es fundamental para el paso de los hPSCs antes de que se vuelvan completamente confluentes, ya que los hPSC pueden diferenciarse espontáneamente en alta confluencia.
3. Diferenciación de hPSCs en células endodérmicas y progenitores hepáticos
- Después de que los hPSC hayan sido chapados durante al menos 24 horas (como se describe en el paso 2.2.12), antes de proceder con la diferenciación, compruebe la morfología de las células bajo un microscopio de contraste de fase, con énfasis específico en el diámetro y la densidad de las colonias de hPSC chapadas.
NOTA: Idealmente, los grumos deben estar fácilmente espaciados y de tamaño y densidad apropiados en todo el pozo antes del paso 3.2. Las colonias grandes (aproximadamente >400 m) o pequeñas (aproximadamente <200 m) de hPSC no son utilizables para la diferenciación (Figura4). Las señales de diferenciación no actuarán uniformemente a lo largo de grandes colonias de hPSC, lo que conduce a una diferenciación ineficiente. Las colonias que son demasiado pequeñas no sobreviven bien durante los primeros 3 días de diferenciación de hPSC en este protocolo de diferenciación. Si la densidad de los hPSC sembrados es correcta, las colonias de hPSC a menudo formarán "puentes" de células entre ellas y la confluencia general será de 30-50% antes de agregar el medio de diferenciación del día 1 (Figura4). - Si los tamaños de las colonias son ideales en el paso 3.1, proceda al día 1 de la diferenciación, que implica la diferenciación de los hPSC en la raya primitiva anterior (APS).
- Prepare el medio de diferenciación APS del día 1 mezclando todos los reactivos descritos en la Tabla 2 utilizando CDM 2 (Tabla 1 y sección 1.2) como medio base. Pipet a mezclar varias veces para asegurar una distribución uniforme de los componentes en el soporte.
- Aspirar para eliminar el tiazovivin complementado mTeSR1 de los hPSC chapados y lavar brevemente los hPSC con medios IMDM. No lavar con solución salina tamponada de fosfato (PBS) en lugar de IMDM, ya que PBS carece de iones de calcio (Ca2+) y por lo tanto es tóxico para los hPSC; interrumpirá la morfología celular.
- Después del breve lavado de La MdmE, agregue el medio del día 1 a los hPSC. Registre el tiempo y coloque las celdas de nuevo en la incubadora de 37 oC
- Continuar con los pasos de diferenciación subsiguientes preparando (Tabla 2) y añadiendo el medio de diferenciación respectivo a las células en los días respectivos (a intervalos de 24 h) de diferenciación alrededor de la misma hora del día (Figura1). Reemplazar con medios frescos diariamente, incluso si días consecutivos de diferenciación utilizan los mismos medios de diferenciación. Entre los cambios de medios, lave las células una vez con medios IMDM para eliminar las células muertas y el remanente de los componentes medios anteriores.
- A medida que la diferenciación progresa más allá de la etapa de la yema hepática, el número de células aumenta y, por lo tanto, agrega más medios a cada pocal de la placa para asegurar que la cantidad de factores de diferenciación y nutrientes no es limitante. Por ejemplo, añadir 1 ml de medio de diferenciación a cada pozo de 12 pozos inicialmente en los días 1 a 6 de diferenciación, pero añadir 1,5-2 ml de medios de diferenciación posteriores en días posteriores de diferenciación (días 7 a 18 de diferenciación).
4. Caracterización de células endodérmicas y progenitores hepáticos por inmunostaining
- Preparar tampón de bloqueo: 10% suero de burro + 0,1% Triton X100 en solución salina tamponada de fosfato desionizado (DPBS).
- Preparar tampón de tinción: 1% suero de burro + 0.1% Triton X100 en DPBS.
- Aspirar el medio de las células en la placa de 12 pocillos.
- Agregue un 4% de paraformaldehído (en DPBS) durante 15 minutos a temperatura ambiente para fijar las células y luego lave las células dos veces con DPBS.
- Agregue el tampón de bloqueo durante 1 h a temperatura ambiente para bloquear y permeabilizar las celdas fijas.
- Aspirar la solución de bloqueo y añadir anticuerpos primarios diluidos en el tampón de tinción. (Véase la Tabla de Materiales para ver las proporciones de dilución de anticuerpos.)
- Manchar las células durante la noche a 4oC.
- Lave las células tres veces con 0.1% Triton X100 en DPBS.
- Añadir la mancha de anticuerpos secundarios en el tampón de tinción durante 1 h a temperatura ambiente. (Véase la Tabla de Materiales para las diluciones de anticuerpos secundarios.)
- Retire el anticuerpo secundario y agregue DAPI durante 5 minutos a temperatura ambiente para realizar contramanchas nucleares.
- Lavar dos veces con 0.1% Triton X100 en DPBS para eliminar el exceso de anticuerpos y DAPI.
- Realice una microscopía de fluorescencia con un Zeiss Observer D1. Alternativamente, almacene la placa a 4 oC hasta que se realice la toma de imágenes. Para obtener los resultados esperados, consulte la Figura3.
5. Caracterización de progenitores hepáticos por fluorescencia activada de clasificación celular (FACS) Análisis
NOTA: Utilice FACS para cuantificar con precisión el porcentaje de células LB diferenciadas AFP+ que surgen para el día 6 de diferenciación. Siga los mismos pasos para cuantificar el porcentaje de hepatocitos diferenciados ALB+ para el día 18 de diferenciación.
- Conjugar un anticuerpo anti-AFP.
- Añadir R-ficoerythrina al anticuerpo anti-AFP a una concentración de (0,55 g/L) utilizando el kit de conjugación de R-ficoerythrina (ver Tabla de Materiales).
NOTA: Asegúrese de que los anticuerpos estén purificados y reconstituidos en tampones que no contengan aminas. Asegúrese de que la cantidad de anticuerpos utilizados en una reacción de etiquetado debe ser inferior a la cantidad de PE (es decir, 60 g de anticuerpo con 100 g de PE). Una conjugación deficiente de anticuerpos puede conducir a resultados poco fiables. - Añadir 1 l de reactivo modificador para 10 ml de anticuerpo que se va a etiquetar. Mezclar suavemente.
- Retire la mezcla de R-PE (100 l) y pipetee la mezcla anterior directamente en el material Liofilizado R-PE.
- Coloque la tapa hacia atrás y deje el vial de pie durante 3 h en la oscuridad a temperatura ambiente.
- Después de incubar durante 3 h o más, añadir 1 l de reactivo de quencher para 10 l de anticuerpo utilizado. El conjugado se puede utilizar después de 30 min.
- Conservar los anticuerpos conjugados a 4oC.
- Lave los hPSC diferenciados o indiferenciados en formato de 6 polos con DMEM/F12.
- Tratar brevemente con agente de disociación (1 ml/pozo en una placa de 6 pocillos) durante 5 minutos a temperatura ambiente hasta que las células se seden. Cosecha y tinción tanto de hPSC indiferenciado como de células progenitoras hepáticas diferenciadas de forma idéntica y analizan en paralelo en el mismo experimento para asegurar la especificidad de la tinción de anticuerpos.
- Toque suavemente el plato Petri para separar las células. Utilice una pipeta p1000 para separar las células de la placa y recoger las células en un tubo cónico de 50 ml. Asegúrese de que las celdas se hayan separado en su mayoría antes de continuar con el siguiente paso. Posteriormente, lave los pozos dos veces más con el búfer 1xDPBS para recoger las células residuales.
- En el tubo cónico de 50 ml, diluya el agente de disociación en 5 volúmenes de 1 búfer DPBS. Triturar rigurosamente 3-4 veces con una pipeta p1000 para asegurar se da cuenta de que todas las células se disocien en células individuales.
NOTA: Es imperativo generar células individuales antes de la centrifugación o los grumos posteriormente no se pueden disociarse con facilidad. Sin embargo, no sobretriturar, ya que esto puede dañar la integridad celular. Cuente el número de células y utilice la proporción recomendada de células a la relación de anticuerpos, que ha sido previamente optimizada para un fondo mínimo y la detección máxima de señal. - Tubo cónico centrífuga que contiene la suspensión celular a 300 x g durante 5 min a 4 oC.
- Aspirar al sobrenadante con cuidado de no molestar el pellet celular.
- Resuspenda el grántbol celular a fondo en el tampón de fijación/perm para generar una suspensión de una sola célula y fijar en hielo a 4 oC durante 20 minutos. Nota para transferir a un tubo de microcentrífuga de 2 ml. Además, el uso de un tubo de microcentrífuga de 2 ml en este paso permite que el pellet celular se deposite en la esquina en forma de V del tubo, minimizando la pérdida de células durante los lavados.
- Lave cada pellet con 1,8 ml de perm/tampón de lavado dos veces. Resuspenda bien el pellet celular en tampón de perm/lavado mezclando 6 veces con una pipeta p1000. Luego, centrifugar, eliminar el sobrenadante y repetir el proceso de lavado con 1,8 ml de tampón de perm/lavado.
- Resuspenda el gránulo celular en un tampón de perm/lavado para que haya una mancha individual de 100 ml y, posteriormente, transfiera la suspensión celular a un tubo de microcentrífuga de 2 ml.
NOTA: Es imperativo generar una suspensión de una sola célula en este paso antes de la tinción de anticuerpos. Los agregados de células no se teñirán y, por lo tanto, confundirán el análisis FACS. Además, el uso de un tubo de microcentrífuga de 2 ml en este paso permite que el pellet celular se deposite en la esquina en forma de V del tubo, minimizando la pérdida de células durante los lavados. - Después de resuspender las células en el tampón FACS, alístalas en tubos individuales de 2 ml (tanto para muestras de control no manchadas como para muestras manchadas de anticuerpos).
- Mancha con anti-AFP-PE 0,33 l por 150.000 células durante 30 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad. Por ejemplo, para una mancha individual de 100 ml, manchar de la siguiente manera: 0,33 ml de a-AFP PE y 100 ml de tampón de perm/lavado. Resuspenda las células con p200 pipeta bien para asegurar una tinción uniforme.
NOTA: Sólo pipeta-mezcla y no vórtice ya que esto puede reducir la estabilidad de las proteínas. - Lavar, resuspender las células dos veces en 1-2 ml de tampón de perm/lavado (1,9 ml/mancha individual) y centrifugar a 800 x g durante 5 min a 4 oC. Lave las células con no menos de 1-2 ml de tampón de perm/lavado para asegurar un lavado suficiente.
NOTA: Sólo mezcla de pipetas y no vórtice ya que esto puede reducir la estabilidad de las proteínas. Después de la centrifugación, aspirar sobrenadante cuidadosamente para evitar que las células se desalojen y retire tanto sobrenadante como sea posible para minimizar el arrastre de anticuerpos y asegurar un lavado más completo. - Resuspenda cada gránulo lavado en 300 ml de tampón de perm/lavado y colarlo a través de un filtro de 100 m en un tubo FACS para tensar grandes grupos de células antes del análisis facS.
- Analice las células en una citometría de flujo FACS Aria en el canal PE. Analice un mínimo de 10,000 eventos para cada mancha individual, y analice eventos en virtud del análisis FSC-A/SSC-A, seleccione singletes de celda haciendo un paso en FSC-W/FSC-H seguido de SSC-H/SSC-W.
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Representative Results
Después de 24 h de diferenciación APS, las colonias generalmente adoptarán una morfología diferente a las colonias indiferenciadas concomitantes con una pérdida de la frontera brillante que típicamente circunscribe las colonias hPSC. Morfológicamente, las células primitivas tienen bordes irregulares y son más extendidas y menos compactas que los hPSC-esto evoca una transición epitelial a mesenquimal como células epiblastantes pluripotentes se diferencian y ingresan en las células primitivas del epiblasto racha in vivo. Si el tamaño de la colonia de los hPSC antes de la diferenciación era demasiado grande, habrá un centro excesivamente elevado que comprende células indiferenciadas. Los cultivos que contienen grupos tan grandes deben descartarse, ya que estos centros de colonias indiferenciados confundirán la diferenciación posterior. Si se nivelaron los grupos del tamaño y la densidad correctos, la diferenciación de APS es altamente reproducible y uniforme, generando una población MIXL1-Gfp+ racha primitiva del 99,3 a 0,1% (MIXL1 es un marcador de rayas primitivas)7. Tenga en cuenta que se observa alguna muerte celular después de 24 h de diferenciación apS.
Para el día 2 de diferenciación, las células primitivas de raya se han diferenciadoen células de endodermo definitivas del día 2, la gran mayoría de las cuales expresan SOX17 (Figura 2) y FOXA2. En docenas de experimentos independientes con 14 líneas hESC y hiPSC (incluyendo H1, H7, H9, HES2, HES3, BJC1, BJC3, HUF1C4 y HUF58C4), este enfoque generó poblaciones de endodermos definitivos puros de manera escalosa, consistente y eficiente (94,0% a 3,1%)7. Este método para generar endodermo definitivo a partir de hPSCs produce porcentajes más altos de CXCR4+PDGFRA- poblaciones endodérmicas en comparación con otros enfoques formados de endoderm2,14.
Para el día 3 de diferenciación, endoderm se ha diferenciado en progenitores foregut que parecen de forma poligonal (Figura1). Más tarde, por 6 días de diferenciación, los progenitores foregut se diferencian en progenitores de cogollos hepáticos que expresan AFP, TBX3 y HNF4A (Figura3). En tres líneas hESC (H1, H7, H9 hESC), este método genera el día 6 AFP+ progenitores hepáticos que se forman con una eficiencia de 89,0 a 3,1% (Figura2). Finalmente, después de 18 días de diferenciación hepática de los hPSC, aparecen ALBUMIN+ células similares a hepatocitos. Morfológicamente, aparecen epiteliales, formando bordesbrillantes que recuerdan a los canales biliares (Figura 1). En esta etapa, el citoplasma del día 18 hepatocitos derivados de hPSC parece más oscuro que el núcleo (Figura1).
Figura 1: Esquema de estrategia de diferenciación y morfología de hPSCins indiferenciados, diferenciando endoderm y células similares a hepatocitos. Se mostraron el proceso de diferenciación y la cronología. Abreviaturas: d -día, hPSC - células madre pluripotentes humanas, APS - raya primitiva anterior, DE - endoderm definitivo, PFG - antebrazo posterior, LB - progenitores de la yema hepática, HP - progenitores de hepatocitos, HEP - hepatocitos como células. Barra de escala a 400 m. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Porcentaje de la racha primitiva MIXL1+ del día 1, día 2 SOX17+ endoderm definitivo (def), progenitores de cogollos de cogollos hepáticos del día 6 AFP+ y poblaciones de hepatocitos ALB+ como lo muestra FACS. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Análisis de inmunostaining de progenitores hepáticos del día 6. el hPSC primero se diferenciaron en progenitores de los cogollos hepáticos, que fueron inmunomanchados para los factores de transcripción de los cogollos hepáticos HNF4A (rojo), TBX3 (verde) así como el marcador de brotes hepáticos citoplasma AFP (rojo). Los núcleos fueron contra-retenidos con DAPI (azul) para evaluar el número total de celdas. Barra de escala a 50 m. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Densidad de sembración celular de hPSCs. Baja (izquierda) y densidad apropiada (media y derecha) de las células sembradas. Barra de escala a 1.000 m. Flecha apunta a "puentes" entre colonias de células. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Medio base | Composición del medio base |
| CDM2 | 1:1 IMDM/F12, 0,1% m/v PVA, 1% lípidos concentrados, insulina recombinante humana de 0,7 g/ml, 15 g/ml de transferrina, 18 nM 1-tioglicerol |
| CDM3 | 1:1 IMDM/F12, 0,1% m/v PVA, 1% de lípidos concentrados, 10% KOSR |
| CDM4 | 1:1 IMDM/F12, 1% de lípidos concentrados, 15 g/ml de transferrina |
| CDM5 | CMRL, 10% KOSR, 1% Glutamax |
Tabla 1: Composición de medios definidos químicamente CDM2, CDM3, CDM4 y CDM5.
| Etapas de diferenciación | Duración | Factores | Dosis | Medio base |
| Día 1 Racha primitiva | 1 día | Activin | 100 ng/mL | |
| CHIR99201 | 3 M | CDM2 | ||
| PI103 | 50 nM | |||
| FGF2 | 10 ng/mL | |||
| Día 2 Endoderm definitivo | 1 día | Activin | 100 ng/mL | |
| DM3189 | 250 nM | CDM2 | ||
| PI103 | 50 nM | |||
| Día 3 Trasero Foregut | 1 día | A83-01 | 1 M | |
| TTNPB | 75 nM | CDM3 | ||
| BMP4 | 30 ng/mL | |||
| FGF2 | 10 ng/mL | |||
| Día 6 Progenitores de Liver Bud | 2 días | Activin | 10 ng/mL | |
| C59 | 1 M | CDM3 | ||
| BMP4 | 30 ng/mL | |||
| Forskoline | 1 M | |||
| 1 día | Activin | 10 ng/mL | ||
| CHIR99201 | 1 M | CDM3 | ||
| BMP4 | 30 ng/mL | |||
| Forskoline | 1 M | |||
| Día 12 Progenitores hepáticos | 6 días | BMP4 | 10 g/ml | |
| Osm | 10 ng/mL | |||
| Dexametasona | 10 m | |||
| Forskoline | 10 m | CDM4 | ||
| Ro4929097 | 2 M | |||
| AA2P | 200 g/ml | |||
| Insulina | 10 g/ml | |||
| día 18 Hepatocitos | 6 días | Dexametasona | 10 m | |
| Forskoline | 10 m | CDM4 o | ||
| Ro4929097 | 2 M | CDM5 | ||
| AA2P | 200 g/ml | |||
| Insulina | 10 g/ml |
Tabla 2: Composición de los medios de diferenciación.
| Problema | Posible razón | Solución proffered |
| Las células en el centro de la colonia no diferencian | i) El tamaño de la colonia era excesivamente grande, las células en medio de grandes colonias no eran accesibles a las señales de diferenciación | i) Compruebe la tecnología de conteo celular. |
| ii) Distribución desigual de grumos que se fusionaron en el centro del pozo (o su periferia), formando colonias muy grandes | ii) Agitar la placa de forma cruzada para distribuir uniformemente los grumos durante el enchapado, y comprobar bajo un microscopio antes de colocarla en la incubadora | |
| iii) Las células recibieron señales de diferenciación insuficientes | iii) Añadir volúmenes adecuados de medios de diferenciación: añadir 1 mL de medio por pozo en una placa de 12 pocillos y 3 ml por pozo en una placa de 6 pocillos | |
| Mala eficiencia de la diferenciación | i) Inicio del cultivo celular parcialmente diferenciado | i) Utilizar un nuevo lote de hPSCines indiferenciados |
| ii) Las colonias estaban demasiado densamente sembradas, formando una hoja confluente de células | ii) Células de semillas y células de recuento con precisión para la diferenciación, y agitar uniformemente para distribuirlas | |
| iii) Los medios residuales y las señales no deseadas no se lavaron debido a un lavado inadecuado | iii) El mTeSR1 residual o los medios de inducción de la etapa anterior de diferenciación bloquearán la diferenciación; células de lavado con IMDM antes de añadir un medio de diferenciación | |
| iv) Lavar demasiado duro; condiciones de lavado inapropiadas interrumpirán gravemente la morfología celular | iv) Antes de añadir cualquiera de los dos medios de diferenciación, lave brevemente con IMDM. El uso de DPBS (o medios con diferentes osmolaridades o medios fríos) o lavado prolongado, comprometerá la morfología celular y la viabilidad | |
| v) Período prolongado o acortado de las etapas de diferenciación, más largo o más corto de lo recomendado. | v) Adherirse a los tiempos recomendados para cada etapa de diferenciación. |
Tabla 3: Problemas potenciales y sus posibles causas y soluciones.
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Discussion
Este método permite la generación de poblaciones enriquecidas de progenitores de cogollos de cogollos hepáticos, y posteriormente células similares a hepatocitos, a partir de hPSCs. La capacidad de generar poblaciones enriquecidas de células hepáticas humanas es importante para la utilización práctica de dichas células. Los métodos anteriores para generar hepatocitos a partir de hPSC produjeron poblaciones de células impuras que contenían células hepáticas y no hepáticas que, al transplantarse en roedores, producieron hueso y cartílago además del tejido hepático15. Por lo tanto, la supresión explícita de la diferenciación no hepática es fundamental para generar poblaciones hepáticas enriquecidas que podrían ser adecuadas para una variedad de aplicaciones.
En particular, el revestimiento controlado de hPSCs en el primer paso es esencial para una diferenciación descendente eficiente. Es importante placar con precisión los hPSC a una cierta densidad para la diferenciación, y distribuir uniformemente estos hPSC a través del pozo o placa durante el proceso de chapado. Por ejemplo, para cada pozo de una placa de 12 pocillos, semilla de 160.000 a 250.000 hPSCs por pozo; en general, es imperativo valorar la densidad de semilla celular y, en última instancia, probar la densidad celular que es apropiada para cada línea celular (Figura4). Si se sembran demasiados hPSC por pozo, formarán grandes colonias, lo que afectará negativamente a las eficiencias de diferenciación, ya que las células en medio de grandes colonias son menos accesibles a las señales de diferenciación en comparación con las células cercanas a la periferia; colonias de tamaños heterogéneos también presentarán problemas similares. Si las densidades celulares son demasiado bajas (por ejemplo, por debajo de 200.000 células/pozo de una placa de 12 pocillos), entonces puede que no haya suficiente material para la diferenciación y se pueda observar una muerte celular extensa. El método de paso y sembrado descrito anteriormente genera consistentemente grumos hPSC de tamaño adecuado para la diferenciación aguas abajo.
Una limitación de este método es que las células similares a los hepatocitos generadas no son idénticas a los hepatocitos adultos, ya que las células derivadas de hPSC todavía expresan el marcador hepático inmaduro AFP. Además, la actividad enzimática del CYP3A4 es aproximadamente 55 veces menor en estas células derivadas de hepatocitos derivados del hPSC en comparación con los hepatocitos humanos adultos primarios. Un desafío que se avecina será madurar estas células derivadas de hepatocitos derivados de hPSC en células adultas de pleno derecho. Una segunda limitación es que la diferenciación eficiente depende en gran medida de la densidad inicial de las células y, por lo tanto, es muy importante sembrar a la densidad recomendada y dispersarlas uniformemente a través de la placa (Tabla3).
En general, este protocolo produce progenitores de la yema hepática y células similares a hepatocitos a una pureza del 89,0 a 3,1% en al menos 3 líneas de hPSC. En segundo lugar, las células similares a los hepatocitos expresaron enzimas hepáticas, secretan ALBUMIN humano y expresaron niveles más altos de genes hepáticos que las células generadas utilizando enfoques de diferenciación existente. Por último, las células similares a hepatocitos resultantes no sólo exhiben ciertas funciones de hepatocitos in vitro, pero lo más importante es que pueden funcionar hasta cierto punto in vivo, ya que pueden injertar un modelo de ratón de lesión hepática crónica y mejorar la supervivencia a corto plazo2 .
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Agradecemos a Bing Lim por las discusiones y al Instituto Stanford de Biología de Células Madre y Medicina Regenerativa por el apoyo a la infraestructura. Este trabajo fue apoyado por el Instituto de Medicina Regenerativa de California (DISC2-10679) y el Stanford-UC Berkeley Siebel Stem Cell Institute (a L.T.A. y K.M.L.) y el Stanford Beckman Center for Molecular and Genetic Medicine, así como el Anonymous, Familias Baxter y DiGenova (a K.M.L.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Geltrex | Thermofisher Scientific | A1569601 | |
| 1:1 DMEM/F12 | Gibco | 11320033 | |
| 0.2 μm pore membrane filter | Millipore | GTTP02500 | |
| mTeSR1 | Stem Cell Technologies | 5850 | |
| Thiazovivin | Tocris Bioscience | 3845 | |
| Accutase | Gibco or Millipore | Gibco A11105, Millipore SCR005 | |
| IMDM, GlutaMAX™ Supplement | Thermofisher Scientific | 31980030 | |
| Ham's F-12 Nutrient Mix, GlutaMAX™ Supplement | Thermofisher Scientific | 31765035 | |
| KOSR, Knockout serum replacement | Thermofisher Scientific | 10828028 | |
| Poly(vinyl alcohol) | Sigma-Aldrich | P8136 | |
| Transferrin | Sigma-Aldrich | 10652202001 | |
| Chemically Defined Lipid Concentrate | Thermofisher Scientific | 11905031 | |
| Human Activin | R&D | 338-AC | |
| CHIR99201 | Tocris | 4423 | |
| PI103 | Tocris | 2930/1 | |
| Human FGF2 | R&D | 233-FB | |
| DM3189 | Tocris | 6053/10 | |
| A83-01 | Tocris | 2939/10 | |
| Human BMP4 | R&D | 314-BP | |
| C59 | Tocris | 5148 | |
| TTNPB | Tocris | 0761/10 | |
| Forskolin | Tocris | 1099/10 | |
| Oncostatin M | R&D | 295-OM | |
| Dexamethasone | Tocris | 1126 | |
| Ro4929097 | Selleck Chem | S1575 | |
| AA2P | Cayman chemicals | 16457 | |
| Human recombinant Insulin | Sigma-Aldrich | 11061-68-0 |
References
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