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Chemistry

मल्टीसेगमेंट इंजेक्शन का उपयोग करके उच्च थ्रूपुट और व्यापक ड्रग निगरानी-केशिका इलेक्ट्रोफोरेसिस मास स्पेक्ट्रोमेट्री

Published: April 23, 2019 doi: 10.3791/58986
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 2, 3, 3, 1
1Department of Chemistry and Chemical Biology, McMaster University, 2Agilent Technologies Inc., 3Seroclinix Corporation

ERRATUM NOTICE

Summary

यहां हम व्यापक दवा निगरानी के लिए एक उच्च throughput विधि का वर्णन है कि बेहतर समाधान और दुरुपयोग और उनके चयापचयों की दवाओं के बड़े पैनलों का पता लगाने के लिए अनुमति देता है, गुणवत्ता नियंत्रण के साथ multisegment इंजेक्शन पर आधारित-केशिका वैद्युत्-संचलन-मास स्पेक्ट्रोमेट्री.

Abstract

नई विश्लेषणात्मक तरीकों के लिए तत्काल उच्च throughput, अभी तक व्यापक दवा स्क्रीनिंग, सार्वजनिक स्वास्थ्य में एक खतरनाक opioid और पर्चे दवा संकट दिया सक्षम करने के लिए आवश्यक हैं । पारंपरिक मूत्र दवा परीक्षण के आधार पर एक दो स्तरीय immunoassay स्क्रीन के बाद एक गैस क्रोमेटोग्राफी-मिलकर मास स्पेक्ट्रोमेट्री (जीसी-एमएस/एमएस) या तरल क्रोमेटोग्राफी-टैंडम मास स्पेक्ट्रोमेट्री (LC-MS/MS) विधि महंगे होते हैं और पूर्वाग्रह से ग्रस्त हैं, जबकि (क) से (ा) ाी, हां । इस के साथ साथ, हम दवा निगरानी के लिए एक बेहतर तरीका है कि संकल्प और DoA का एक विस्तारित पैनल का पता लगाने के लिए अनुमति देता है रूपरेखा और उनके चयापचयों multisegment इंजेक्शन का उपयोग करते समय-केशिका electrophoresis-मास स्पेक्ट्रोमेट्री (MSI-CE-MS). (< 3 मिनट/नमूना) CE द्वारा एक गुणवत्ता नियंत्रण के साथ दस मूत्र नमूने के multiplexed विभाजन सकारात्मक आयन मोड खोज के तहत एक समय की उड़ान मास स्पेक्ट्रोमीटर (TOF-MS) का उपयोग कर पूर्ण स्कैन डेटा अधिग्रहण के साथ संयोजन के रूप में पहचान के लिए अनुमति देता है और उपर्युक्त स्तर की सिफारिश की गई है । दवा समावयवों और isobars के एक उत्कृष्ट संकल्प, पृष्ठभूमि interferences सहित, नमूना खंडों के बीच एक इलेक्ट्रोकाइनेटिक स्पेसर के साथ MSI-CE-MS का उपयोग करते समय प्राप्त कर रहे हैं, जहां एक के comigration के साथ सही द्रव्यमान/ एक या एक से अधिक जैव रूपांतरित चयापचयों का पता लगाना ड्यूटेरेटेड आंतरिक मानक और एक व्यापक पता लगाने खिड़की पर DoA पहचान की सुविधा का मिलान । इसके अतिरिक्त, मूत्र नमूने जटिल नमूना workup बिना तेजी से स्क्रीनिंग के लिए एंजाइम deconjugation के बिना सीधे विश्लेषण किया जा सकता है । MSI-CE-MS DoA की एक व्यापक स्पेक्ट्रम की निगरानी सक्षम बनाता है कि उच्च जोखिम वाले रोगियों के उपचार की निगरानी के लिए आवश्यक है, निर्धारित दवा पालन की पुष्टि सहित, अवैध नशीली दवाओं के उपयोग का खुलासा/ के रूप में परिशुद्धता चिकित्सा में नए अग्रिमों के लिए आवश्यक है ।

Introduction

के दुरुपयोग और पुराने दर्द के प्रबंधन के लिए opioids के लिए लत में एक खतरनाक वृद्धि सार्वजनिक स्वास्थ्य के लिए एक बढ़ती खतरे का प्रतिनिधित्व करता है, ७०,००० से अधिक दवा की ओवरडोज मौतों में संयुक्त राज्य अमेरिका में अनुमानित २०१७1। इसी प्रकार, विभिन्न अन्य नशीली दवाओं भी व्यापक रूप से चिंता, अवसाद, और मानसिक स्वास्थ्य के मुद्दों के उपचार के लिए बच्चों और युवा वयस्कों के लिए निर्धारित कर रहे हैं2. नतीजतन, मूत्र दवा परीक्षण के तरीके, व्यापक रूप से कार्यस्थल और फोरेंसिक विष विज्ञान के लिए विकसित, निर्धारित दवाओं है कि सहिष्णुता और निर्भरता से ग्रस्त हैं की चिकित्सकीय निगरानी के लिए महत्वपूर्ण महत्व है3,4. इसका पालन, इष्टतम चिकित्सीय प्रभावकारिता और रोगी सुरक्षा सुनिश्चित करने के लिए आवश्यक है, जबकि अवैध या गैर-निर्धारित दवा दुरुपयोग सहित संभावित प्रतिस्थापन का खुलासा । वर्तमान में, मूत्र औषधि परीक्षण DoA के लिए एक दो tiered दृष्टिकोण पर भरोसा करते हैं, बिंदु के माध्यम से एक प्रारंभिक प्रतियोगी immunoassay स्क्रीन के शामिल-देखभाल उपकरणों या प्रयोगशाला ANALYZERS, जीसी पर आधारित अधिक विशिष्टता के साथ एक पुष्टिकारक परीक्षण के बाद-ms/ और, तेजी से, LC-MS/MS5। हालांकि, immunoassays हैं पूर्वाग्रह से ग्रस्त हैं, के रूप में एंटीबॉडी अभिकर्मक एक प्रकल्पित स्क्रीन-सकारात्मक परिणाम है, जो एक विश्वसनीय पहचान और विशिष्ट दवाओं या जटिल दवा की मात्रा को रोकता है उत्पन्न करने के लिए nonspecifically विभिन्न दवा वर्गों के लिए बाध्य 6मिक्सचर । इस संदर्भ में, और अधिक सटीक मूत्र दवा परीक्षण तत्काल व्यापक पॉलीड्रग स्क्रीन की अत्यधिक लागत, डिजाइनर दवाओं और सिंथेटिक मूत्र उत्पादों है कि पारंपरिक लक्षित assays है कि बचना सहित7 की जरूरत है ।

उच्च-विभेदन एमएस (एचआरएमएस) के संयोजन में उच्च-दक्षता पृथक्करण, पॉलीफार्मेसी के एक युग में ड्रग निगरानी के लिए गैर-लक्षित रणनीति के रूप में और doa8,9 के विस्तार पैनलों का उपयोग करके tof या . हालांकि, पारंपरिक नियंत्रण रेखा से अलग करने के लिए धीमी गति से कर रहे है (> 15 मिनट) doa और उनके चयापचयों के रासायनिक विविध वर्गों के संकल्प के लिए लंबे समय से समाधान समय के कारण ढाल क्षालन प्रोग्राम है, जो नियमित दवा स्क्रीनिंग के लिए नमूना throughput सीमा का उपयोग कर । वैकल्पिक रूप से, विशोषण आयनन (देसी)10 और लेजर डायोड थर्मल विशोषण (ldtd) के आधार पर सीधे विश्लेषण तरीकों11जुदाई के बिना तेजी से दवा स्क्रीनिंग के लिए अनुमति देते हैं । हालांकि, इन परिवेश आयनन विधियों isobaric/isomeric हस्तक्षेप जब जटिल मूत्र नमूनों का विश्लेषण करने के लिए प्रवण हैं, इस प्रकार स्वतंत्र पुष्टि परीक्षण की आवश्यकता होती है ।

हमारी प्रयोगशाला ने हाल ही में एक बहुसंकेतन पृथक्करण मंच का विकास किया है, जिसमें नमूना प्रवाह को बढ़ाने के लिए MSI-CE-MS12पर आधारित एक उच्च-दक्षता पृथक्करण के रिज़ॉल्यूशन और डेटा तदरूपता को बनाए रखना है । उपंयास डेटा वर्कफ़्लोज़ MSI-CE-MS में nonलक्ष्यित metabolite प्रोफाइलिंग के लिए डिजाइन किया जा सकता है (यानी, metabolomics) मात्रा प्रतिबंधित biospecimens, जबकि गुणवत्ता नियंत्रण (QC) बैच सुधार के लिए अनुमति के रूप में बड़े पैमाने पर जनसंख्या के लिए आवश्यक अध्ययन13। इस मामले में, पृथक्करण एक isocratic बफर के साथ स्थिर राज्य विलायक शर्तों के तहत होने वाली एक पारंपरिक म्यान तरल इंटरफेस है, जो एक एकल के भीतर 10 या अधिक नमूनों के सीरियल इंजेक्शन DoA के विभिंन वर्गों की तेजी से अभी तक चयनात्मक स्क्रीनिंग के लिए भागो और उनकी14चयापचयों । इस अध्ययन का ध्यान और अधिक MSI-CE के प्रत्यक्ष विश्लेषण के लिए एमएस मांय है नैदानिक अवसादग्रस्त रोगियों के एक प्रतिनिधि पलटन से एक "पतला और गोली मार" विधि है कि एंजाइम हाइड्रोलिसिस के लिए की जरूरत से बचा जाता है का उपयोग कररहे है । इसके अतिरिक्त, MSI-CE-MS16 में सीरियल नमूना प्लग के बीच एक इलेक्ट्रोकाइनेटिक स्पेसर के कार्यांवयन के लिए आगे विभिंन दवा isomers के समाधान में सुधार किया गया/ क्रॉस-interferences जब DoA के बड़े पैनलों स्क्रीनिंग । जब MSI-CE-MS का उपयोग करते हुए ड्यूरेटेड आंतरिक मानकों (d-IS) का उपयोग करते हुए मूत्र नमूनों में DoA की पूर्ण मात्रा का प्रदर्शन किया है । यह दृष्टिकोण भी दवा की पहचान की सुविधा, साथ ही स्क्रीन पॉजिटिव मामलों की सही नमूना स्थिति निगलकर जब सिफारिश की स्क्रीनिंग कट-ऑफ स्तर पर एक दवा पैनल मिश्रण की तुलना में भी एक आंतरिक संदर्भ के रूप में कार्य करता है/ एक ही रन ।

Protocol

अंधा मूत्र के नमूनों कृपया सेंट जोसेफ अस्पताल (हैमिल्टन, पर, कनाडा), जिसका अध्ययन हैमिल्टन एकीकृत अनुसंधान नैतिकता बोर्ड द्वारा अनुमोदित किया गया था पर मूड विकार क्लिनिक से डॉ Zainab समोआन द्वारा प्रदान की गई ।

1. अभिकर्मकों और नमूना समाधान तैयारी

  1. पृष्ठभूमि इलेक्ट्रोलाइट तैयारी
    1. एक कार्बनिक संशोधक के रूप में 15% v/v acetonitrile के साथ पृष्ठभूमि इलेक्ट्रोलाइट (BGE) biweekly, 1 एम फॉर्मिक एसिड, पीएच १.८ के ५० मिलीलीटर तैयार करें ।
    2. Aliquot १.९ मिलीलीटर की केंद्रित फॉर्मिक एसिड स्टॉक (२६.५ मीटर) एक ५० मिलीलीटर आयतनी फ्लास्क में और जोड़ने के ७.५ मिलीलीटर की acetonitrile और ४०.६ मिलीलीटर विआयनीकृत पानी की कुल मात्रा को लाने के लिए ५० मिलीलीटर । फिर, 15 मिनट के लिए समाधान sonicate और यह तंग सील के साथ एक निष्फल बोतल के लिए स्थानांतरण ।
  2. म्यान तरल तैयारी
    1. तैयार २०० की म्यान तरल समाधान साप्ताहिक, ०.१% फॉर्मिक एसिड शामिल 60:40 में (meoh: एच2ओ) ।
    2. Aliquot २०० μl of फॉर्मिक एसिड (२६.५ एम स्टॉक) एक बोतल में meoh की १२० मिलीलीटर और एच2ओ के ८० मिलीलीटर युक्त म्यान तरल बनाने के लिए और यह 15 मिनट के लिए देगास ।
    3. इसके बाद, प्रत्येक संदर्भ आयनों, प्यूरीन और हैक्साइस (2, 2, 3, 3-टेट्राफ्लोप्रोपोक्सी) फ़ॉ९२२.००९७९ १२१.०५०८७ सफिन (एचपी-९२१) में से प्रत्येक के 10-l- क्रमशः.
      नोट: उन संदर्भ आयनों वास्तविक समय जन सुधार के लिए अनुमति देते है और यह भी संभावित मैट्रिक्स-प्रेरित आयन दमन या जुदाई के दौरान वृद्धि प्रभाव के लिए निगरानी ।
  3. मानक तैयारी
    1. एक मानक समाधान है जिसमें 3x नैदानिक स्क्रीनिंग कट-ऑफ स्तर (L6)14 मेथेनॉल के 1 मिलीलीटर में, एक रासायनिक आपूर्तिकर्ता से खरीदे गए दवा मानकों का उपयोग करते हुए एक ८४-दवा पैनल मिश्रण तैयार करें । अलग से ४८ मिलान ड्यूटेरेटेड आंतरिक दवा मानक (डी-ISs) के मिश्रण को एक 10 से अधिक-८४-मेथनॉल के 1 मिलीलीटर में दवा के मिश्रण से अधिक एकाग्रता की तैयारी । इसके अलावा, एक स्टॉक सॉल्यूशन तैयार करें जिसमें 1 मिलीलीटर में 4-फ्लोरो-एल-फेनिल लानाइन (एफ-पीएचई) और 3-क्लोरो-एल-टायरोसीन (सीएल-टीएचआर) का २०० μm है ।
    2. ऊपर उल्लिखित ८४-दवा मिश्रण (20 μl) और ४८ d-ISs (20 μl) के एक पंचगुना कमजोर पड़ने प्रदर्शन, के रूप में अच्छी तरह से एक दस गुना कमजोर पड़ने के रूप में 4-fluorophenylalanine (एफ-पीएचई, 10 μl) और 3-क्लोरोटाइरोसाइन (Cl-tyr, 10 μl) एक प्रमाणित सिंथेटिक मूत्र मैट्रिक्स (४० μl) में कुल बनाने के लिए एक २५० μL अपकेंद्रित्र ट्यूब में १०० μL की मात्रा ।
  4. बाहरी अंशांकन वक्र तैयारी
    1. पांच सूत्री बाह्य अंशांकन घटता (नीचे वर्णित के रूप में) एक 20 गुना गतिशील रेंज से अधिक ८४-दवा मानक मिश्रण और उनके इसी डी के ४८ में बनाया-ISs के चरण 1.3.1. उदाहरण के लिए, पांच सूत्री बाह्य अंशांकन वक्र बनाने के लिए, ८४-औषध मिश्रण (L6, चरण 1.3.1) को 2-, 4-, 10-, 20-और ४०-गुना तक कम करना सुनिश्चित करें, जबकि इसके अनुरूप डी-आईएसएस (20 μL) और 4-एफ-पीएचई ( 10 μL) और सीएल-Tyr (10 μL) एक अतिरिक्त के रूप में एक सिंथेटिक मूत्र मैट्रिक्स में है १०० μL की कुल मात्रा बनाने के लिए । मामलों में जब एक मेल डी-है एक विशिष्ट दवा के लिए उपलब्ध नहीं है, का उपयोग करें 4-F-एक किराए के रूप में पीएचई डेटा सामांयीकरण के लिए है ।
      नोट: अतिरिक्त डी-आईएसएस के शामिल किए जाने से बचें कि क्रॉस-हस्तक्षेप (isobaric) पैनल के भीतर अंय DoA के साथ यदि वे पूरी तरह से CE जुदाई से हल नहीं कर रहे हैं ।
  5. मूत्र नमूना तैयारी
    1. Thaw के एक ज्ञात पर्चे दवा के इतिहास के साथ दस चिकित्सकीय अवसादग्रस्त रोगियों के एक प्रतिनिधि पलटन से सुबह मूत्र नमूने deidentified । संग्रह के बाद-८० डिग्री सेल्सियस पर मूत्र के नमूनों की दुकान जब तक वे विश्लेषण के लिए thawed हो गया है ।
      नोट: कुछ DoA चयापचयों और उनके conjugates की रासायनिक स्थिरता पर उनके प्रभाव के कारण संग्रह के बाद मूत्र के कई फ्रीज-गल चक्र या कमरे के तापमान पर एक विलंबित भंडारण से बचें ।
    2. भंवर 30 एस और, तो, उंहें अवसादन के लिए १४,००० x g पर 1 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र के लिए सुबह मूत्र नमूने deidentified । इसके बाद, उपरोक्त संसाधित मूत्र के 10 μl, d-IS के 10-l, और F-Phe/Cl-tyr के 5-एल और 25 μl विआयनीकृत एच2ओ, और भंवर 1 मिनट के लिए (तकनीकी परिशुद्धता का आकलन करने के लिए तीन प्रतियों में इन चरणों को दोहराएं) । विश्लेषण के लिए एक polypropylene शीशी के लिए ऊपर वर्णित मिश्रण का एक 20 μL aliquot स्थानांतरण ।

2. CE-TOF-MS प्रणाली का सेटअप

  1. अनकोटेड फुप्रयुक्त-सिलिका केशिका कंडीशनिंग पैरामीटर्स
    1. सुनिश्चित करें कि सभी मानकों, बाहरी अंशांकन घटता है, और मूत्र नमूने वर्गों १.३-१.५ में तैयार एक अनकोटेड खुले ट्यूबलर संगलित त सिलिका polyimide के एक आंतरिक व्यास के साथ लेपित केशिका का उपयोग कर अलग कर रहे हैं ५० μm, ३६० μm का एक बाहरी व्यास, और एक १३५ सेमी की कुल केशिका लंबाई ।
      नोट: एक हीरे कटर उपकरण के अनुरूप केशिकाओं कि आगे एक फ्लश और चिकनी कटौती सुनिश्चित करने के लिए निरीक्षण कर रहे है सुनिश्चित करने के लिए प्रयोग किया जाता है ।
    2. दोनों बाहर की केशिका समाप्त होता है से polyimide कोटिंग के बारे में 7 मिमी निकालें, एक केशिका विंडो निर्माता का उपयोग करने के लिए नमूना ले-ओवर कम करने के लिए और संभावित polyimide सूजन को रोकने के लिए जब कार्बनिक विलायक के साथ संपर्क में.
    3. को ce स्प्रेयर सुई से बाहर केशिका आउटलेट के 2 मिमी के बारे में फैलाना सुनिश्चित करें और २ ३६० ° बदल जाता है द्वारा ce कारतूस में केशिका प्रवेश स्थापित करें । फिर, ध्यान से ce में ce कारतूस स्थापित और आयन स्रोत से बाहर CE स्प्रेयर जगह जब केशिका कंडीशनिंग ।
      नोट: केशिका आउटलेट लगातार कटौती के रूप में यह एक स्थिर electrospray जब एमएस को युग्मित वर्तमान सुनिश्चित करने के लिए महत्वपूर्ण है । दो अलग स्प्रेयर इस काम में इस्तेमाल किया गया: एक CE छिड़कनेवाला यंत्र नमूना विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया गया था, और एक नियंत्रण रेखा स्प्रेयर मास अंशांकन के लिए इस्तेमाल किया गया था.
    4. आयन स्रोत में नहीं रखा CE स्प्रेयर के साथ केशिका कंडीशनिंग प्रदर्शन करने के लिए सुनिश्चित करें. आयन स्रोत में LC स्प्रेयर रखो ।
      नोट: यह बाद में TOF-MS के लिए युग्मित है कि समाक्षीय म्यान तरल इंटरफेस के किसी भी संदूषण से परहेज करते हुए बड़े पैमाने पर अंशांकन के लिए अनुमति देता है.
    5. हालत नई केशिकाओं फ्लश समारोह (९४० mbar) का चयन करने के लिए उपकरण को नियंत्रित करने के लिए इस्तेमाल किया और 30 मिनट पर फ्लश की अवधि निर्धारित निंनलिखित क्रम में चार अलग सॉल्वैंट्स के लिए प्रत्येक: मेथनॉल, 1m naoh, विआयनीकृत पानी, और BGE । केशिका कंडीशनिंग अवधि के दौरान स्टैंडबाय पर isocratic पंप डाल करने के लिए सुनिश्चित करें ।
    6. एक ऊतक पोंछने के साथ CE-MS स्प्रेयर पोंछ MeOH में भिगोया/
    7. नमूनों का विश्लेषण करने से पहले CE-MS प्रणाली के दैनिक preventative रखरखाव करते हैं । (Inlet पर) CE इलेक्ट्रोड के नीचे पोंछ करने के लिए मेथनॉल का प्रयोग करें, लेकिन एक isopropanol और पानी (50:50) मिश्रण का उपयोग करने के लिए CE-एमएस इंटरफेस है, जो नमक बनाने से बचने के लिए महत्वपूर्ण है साफ करने के लिए और संभावित नमूना ले-ओवर सीमा ।
    8. आयन स्रोत से LC स्प्रेयर निकालें और CE-MS के लिए समाक्षीय म्यान तरल इंटरफेस में एक नव वातानुकूलित केशिका के साथ साफ स्प्रेयर की स्थिति ।
    9. पर isocratic पंप मुड़ें और 15 मिनट के लिए 30 केवी की एक वोल्टेज लागू करने के लिए सुनिश्चित करें कि एक स्थिर CE वर्तमान प्रोफ़ाइल मूत्र विश्लेषण करने से पहले प्राप्त की है ।
  2. इंजेक्शन और जुदाई शर्तों CE का उपयोग
    1. CE मापदंडों सेट और प्रीकंडीशनिंग कदमका चयन करने के लिए साधन को नियंत्रित करने के लिए इस्तेमाल किया विक्रेता सॉफ्टवेयर खोलें. ६०० एस के लिए फ्लश समारोह सेट और एक bge शीशी स्थिति निर्दिष्ट करें ।
      नोट: एक बाहरी पानी छिल्लर का अभाव नमूना ट्रे शीतलन सुविधाओं की कमी CE प्रणालियों के लिए कनेक्ट करने की आवश्यकता हो सकती है, के रूप में यह मात्रा प्रतिबंधित नमूनों की बड़ी बैचों का विश्लेषण जब नमूना वाष्पीकरण को रोकने के लिए आवश्यक है ।
    2. इंजेक्शन कार्य सेट करने के लिए १०० mbar पर 5 एस के लिए और इलेक्ट्रोकिमीकली bge spacers ७५ के लिए 30 केवी में इंजेक्षन नमूने हाइड्रोडायनामिक
      नोट: इस प्रक्रिया (एक अलग शीशी की स्थिति से) एक BGE स्पेसर द्वारा पीछा किया (एक ही शीशी की स्थिति से) है कि स्वचालित रूप से 11 असतत नमूनों की कुल के लिए सॉफ्टवेयर पर एक विधि कार्यक्रम के भीतर की गई है कि प्रत्येक नमूना इंजेक्शन के साथ दोहराया जाता है में विश्लेषण एक MSI स्वरूप का उपयोग करते समय चलाएँ । विश्लेषण के बाद यादृच्छिक क्रम में 10 मूत्र नमूने स्क्रीनिंग में एक ८४ पैनल दवा मिश्रण बंद स्तर प्रत्येक MSI-CE-MS चलाने के लिए पहली नमूना स्थिति के रूप में इंजेक्शन है ।
    3. एप्लाइड वोल्टेज सेट करने के लिए 30 केवी, कारतूस तापमान 25 डिग्री सेल्सियस हो, और कुल रनटाइम ४० मिनट होना करने के लिए । समय सारिणी का प्रयोग, जुदाई के दौरान 0 मिनट से ४० मिनट के लिए 2 mbar/
      नोट: एक ढाल दबाव के पृथक्करण के दौरान लागू किया जाता है धीमी गति से पलायन दवाओं, जो कुछ कमजोर, बुनियादी बेंजोडिज़ेडिन और तटस्थ/ हालांकि, सबसे बुनियादी doa और उनके चयापचयों 25 मिनट के भीतर संचार के रूप में प्रवास, amphetamines सहित, opioids, और alkaloids के अन्य वर्गों.
    4. नमूना अधिग्रहण पूरा होने के बाद, BGE के साथ एक कम दबाव (५० mbar) पर अगले दिन तक केशिका कुल्ला करने के लिए सुनिश्चित करें । अंयथा, पानी के साथ एक उच्च दबाव (९०० mbar) में ६०० एस के लिए केशिका कुल्ला और फिर हवा के साथ ६०० एस के लिए, और यह एक स्प्रेयर धारक में अगले प्रयोग तक की दुकान ।
  3. समघाती पंप और आच्छद द्रव
    1. एक इंफिनिटी Isocratic पंप और एक इंफिनिटी Degasser का उपयोग करने के लिए म्यान तरल उद्धार (60:40 MeOH: एच2ओ ०.१% v/
  4. TOF-MS सेटिंग्स
    1. सुनिश्चित करें कि एक समाक्षीय म्यान तरल electrospray आयन स्रोत और गर्म नाइट्रोजन गैस के साथ एक TOF-MS, एक CE इकाई के साथ सुसज्जित है.
    2. TOF-एमएस सकारात्मक आयन का पता लगाने कि ५०० एमएस/स्पेक्ट्रम की एक डेटा अधिग्रहण दर के साथ m/z ५०-१,७०० के एक बड़े पैमाने पर फैला के तहत संचालित । सुनिश्चित करें कि प्रोफ़ाइल और केंद्रक डेटा दोनों एक ". d" फ़ाइल स्वरूप में संग्रहीत की जाती हैं ।
    3. इलेक्ट्रोस्प्रे आयनन की स्थिति निर्धारित करने के लिए: vcap और नोक २,००० V पर वोल्टेज, 10 psi पर छिटकानेवाला गैस, और सुखाने गैस पर वितरित 8 L १९५ ३.५ ३००/ इसके अलावा, १२०, ६५, और ७५० V क्रमशः के लिए एमएस वोल्टेज सेटिंग्स fragmentor, पौना, और Oct1 आरएफ सेट ।
      नोट: vcap और नोक वोल्टेज, के रूप में के रूप में अच्छी तरह से छिटकानेवाला गैस धारावाहिक नमूना इंजेक्शन MSI-CE-MS में इस्तेमाल अनुक्रम के दौरान बंद कर दिया गया था, लेकिन electrospray के लिए 1 मिनट पर वापस कर दिया जा करने के लिए क्रमादेशित किया गया था चालू रोकने के लिए electrophoretic जुदाई की दीक्षा के बाद त्रुटियों suctioning प्रभाव के कारण ।
    4. उपकरण नियंत्रण और डेटा अधिग्रहण विक्रेता के सॉफ्टवेयर का उपयोग कर प्रदर्शन (सामग्री की तालिका) ।
  5. आँकड़ा विश् लेषण
    1. प्रसंस्करण, डेटा चौरसाई सहित विक्रेता सॉफ्टवेयर, का उपयोग कर MSI-CE-MS डेटा का विश्लेषण, और प्रतिनिधि DoA और उनके चयापचयों के लिए निकाले आयन electropherograms (EIEs) के एकीकरण.
    2. सॉफ़्टवेयर खोलें और निंन पैरामीटर्स सेट करें ।
      1. Chromatogramsके अंतर्गत, निष्कर्षण डेटा स्वरूपका चयन करें, और प्रोफ़ाइल मोड में वर्णलेख और मास स्पेक्ट्रल डेटा स्वरूप .
      2. का चयन करें द्विघात/घन के लिए और 15 अंक के लिए समारोह चौड़ाई कार्य चौरसाई के तहत ।
      3. फिर, एकीकृत (MS), क्लिक करें Integrator चुस्तहोना करने के लिए सेट, और शिखर फिल्टरके तहत सबसे बड़ा 11 के लिए चोटियों की अधिकतम सीमा का चयन करें ।
      4. देखेंक्लिक करें, एकीकरण पीक सूचीक्लिक करें, और पीक नंबर, अवधारण समय (RT), पीक क्षेत्र, पीक ऊंचाई, और सिग्नल-से-शोर अनुपात (snr) का चयन करें ।
      5. इन पैरामीटर्स को एक अनंय विधि नाम के अंतर्गत सहेजें । प्रक्रिया करने के लिए इस विधि लागू करें और प्रत्येक डेटा सेट की व्याख्या ।
        नोट: पीक नंबर, RT, पीक क्षेत्र और ऊंचाई, और SNR दाईं ओर पर प्रदर्शित करता है के साथ एक सारांश तालिका । डेटा सामान्यीकरण मापा आरटी और प्रत्येक DoA के लिए एकीकृत पीक क्षेत्र के लिए या तो एक मेल d-IS या (यदि उपलब्ध नहीं है) F-Phe करने के लिए विश्लेषणात्मक शुद्धता में सुधार करने के लिए निष्पादित करें ।

3. मूत्र के नमूनों और बाहरी अंशांकन घटता का विश्लेषण

  1. अलग धारावाहिक इंजेक्शन विंयास MSI-CE-MS में इस्तेमाल किया
    1. पहले सीरियल नमूना इंजेक्शन विंयास के लिए, दवा isomer/isomer संकल्प का प्रदर्शन करने के लिए इस्तेमाल किया (चित्र 1a), यह सुनिश्चित करें कि पांच दोहराया इंजेक्शन डी-IS और 4-एफ-पीएचई/सीएल-tyr के साथ ८४ दवा मानकों के मिश्रण पर किया जाता है, और उसके बाद एक छठी इंजेक्शन, जो सिंथेटिक मूत्र में एक खाली नमूना है, और मानक दवा मिश्रण के पांच अतिरिक्त इंजेक्शन.
    2. दूसरा धारावाहिक नमूना इंजेक्शन विन्यास के लिए, एक ज्ञात पर्चे के साथ रोगियों से व्यक्तिगत मूत्र के नमूनों में DoA का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया (चित्रा 2a), यह सुनिश्चित करें कि पहले नमूना प्लग एक में ८४-दवा मानक मिश्रण का एक मिश्रण है 1x कट-बंद स्क्रीनिंग स्तर (सकारात्मक नियंत्रण) 10 रोगियों से पतला मूत्र के नमूनों की एक यादृच्छिक इंजेक्शन द्वारा पीछा: #293, #88, #309, #43, #281, #64, #221, #208, #183, और #50.
    3. तीसरे धारावाहिक नमूना इंजेक्शन विन्यास के लिए, एक ही रन में बाहरी अंशांकन घटता का अधिग्रहण वर्णन करने के लिए इस्तेमाल किया, सुनिश्चित करें कि DoA के लिए कैलिब्रेशन समाधान एक 20-गुना रैखिक गतिशील रेंज 0.25 x, 0.5 एक्स, 1x, 2.5 x के लिए इसी पर तैयार कर रहे हैं, और 5x कट-बंद एकाग्रता के स्तर, के साथ मिलकर डी है और एफ-पीएचई/सीएल-Tyr अतिरिक्त के रूप में एक सिंथेटिक मूत्र मैट्रिक्स में है (n = 4) ।

Representative Results

MSI-CE-MS जटिल वाद्य संशोधनों, स्तंभ स्विचन कार्यक्रमों, या महंगा बुनियादी ढांचे के बिना throughput (< 3 मिनट/नमूना) को बढ़ाता है, जो एक ही रन के भीतर दस या अधिक असतत नमूने के सीरियल इंजेक्शन सक्षम बनाता है निवेश (चित्र 1क) । BGE के नमूने और इलेक्ट्रोकाइनेटिक स्पेसर के हाइड्रोडायनेमिक इंजेक्शन की एक बारी श्रृंखला एक असंशोधित-सिलिका केशिका के भीतर किया जाता है, जहां आयनों के जोनल इलेक्ट्रोफोरेटिक विभाजन दृढ़ता से अम्लीय इलेक्ट्रोलाइट स्थितियों (पीएच १.८). विलेय आयनन भी स्थिर अवस्था की स्थितियों में होता है । इस मामले में एक समाक्षीय म्यान तरल, एक बड़े पैमाने पर अंशशोधन के साथ, एक अंतरफलक के रूप में CE-MS के लिए एक इंटरफ़ेस के रूप में उपयोग किया जाता है के साथ सकारात्मक आयन मोड का पता लगाने के साथ न्यूनतम आयन दमन या वृद्धि प्रभाव के रूप में बड़े पैमाने पर क्षमता आयनों संकेत द्वारा निगरानी. TOF एक मजबूत अभी तक लागत प्रभावी HRMS का प्रतिनिधित्व करता है एक तेजी से डेटा अधिग्रहण आदर्श गैर लक्षित स्क्रीनिंग के लिए उपयुक्त/ उदाहरण के लिए, विभिंन isobaric/isomeric doa और उनके चयापचयों, तीन opioid संरचनात्मक समावयवों, अर्थात् norhydrocodone, hydromorphone, और अफ़ीम के संरचनात्मक समावयवों सहित के लिए प्रभावशाली संकल्प हासिल की है (चित्र 1b) । इस मामले में, एक दवा मिश्रण के 10 स्वतंत्र नमूनों से 30 हल चोटियों नमूना ले-ओवर के बिना पाया जाता है. एक सिंथेटिक मूत्र रिक्त/नकारात्मक मूत्र नियंत्रण भी धारावाहिक इंजेक्शन श्रृंखला (नमूना स्थिति #6) के भीतर शामिल है । इसके अलावा, दो अंय समदाबी opioids, अर्थात् 6-acetylmorphine (एक निष्क्रिय हेरोइन metabolite) और naloxone (एक opioids रिसेप्टर विरोधी opioids ओवरडोज के आपातकालीन उपचार के लिए इस्तेमाल किया) पूरी तरह से 20 के रूप में हल कर रहे हैं-स्कैन डेटा अधिग्रहण के साथ अलग चोटियों ( चित्र 1 ग) । इसी तरह, दो एम्फैसिस स्थितीय समावयव पूरी तरह से MSI-CE-MS में हल कर रहे है phentermine के संभावित दुरुपयोग से अवैध methamphetamine दुरुपयोग भेद करने के लिए, एक निर्धारित उत्तेजक है कि वजन घटाने के लिए एक भूख suppressant के रूप में प्रयोग किया जाता है.

Figure 1
चित्रा 1: निकाली गई आयन की एक श्रृंखला प्रतिनिधि DoA आइसोमर्स के लिए (EIE)/isobars MSI-CE-MS द्वारा दस नमूने और एक ही रन के भीतर एक खाली का विश्लेषण करके हल कर रहे हैं. (क) MSI-CE-MS की योजनाबद्ध कि सीरियल इंजेक्शन विन्यास सिंथेटिक मूत्र में एक ८४-doa पैनल के लिए इस्तेमाल दर्शाया गया है । इस बहुसंकेतन पृथक्करण विधि में 11 विविक्त नमूनों के हाइड्रोडायनेमिक इंजेक्शन की प्रत्यावर्ती श्रृंखला का उपयोग किया जाता है और पूर्ण-स्कैन डेटा के बाद आयनों के आंचलिक वैद्युतरगतिक पृथक्करण को आरंभ करने के लिए बफर के इलेक्ट्रोकाइनेटिक इंजेक्शन से खाली किया जाता है । सकारात्मक आयन मोड का पता लगाने के साथ TOF-MS द्वारा अधिग्रहण । (ख) के तीन समदाबी कार्यात्मक समूह opioid समावयवों (m/z २८६.१४३८), CE द्वारा अलग, 10 असतत नमूना इंजेक्शन से 30 हल चोटियों शामिल, norhydrocodone सहित, hydromorphone, और मॉर्फिन. (ग) दो आइसोबेरिक ओपिओइड औषधें और उनके चयापचयों (एम/जेड ३२८.१५४३), जिन्हें सीई द्वारा अलग किया गया है, जिसमें 20 हल की गई चोटियां 10 विविक्त प्रतिदर्श इंजेक्शनों से शामिल हैं, जिनमें 6 एसिटाइलमॉर्फिन (हेरोइन मेटाबेलाइट) और नालोक्वन शामिल हैं । (घ) दो समदाबी कार्यात्मक समूह एम्फैसिस isomers, CE द्वारा अलग, 10 असतत नमूना इंजेक्शन से 20 हल चोटियों शामिल, methamphetamine और phentermine सहित. सभी मामलों में, नकारात्मक मूत्र को नियंत्रित करता है और MSI-CE-MS में छठी नमूना स्थिति पर शुरू की है नमूना ले-ओवर के नगण्य सबूत था । इस आंकड़े का बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।

DoA, MSI-CE-MS में एक धारावाहिक इंजेक्शन विंयास के लिए एक ८४-अनुशंसित स्क्रीनिंग कट-बंद एकाग्रता के स्तर पर दवा पैनल के मिश्रण का इस्तेमाल किया (सभी रन के लिए पहले इंजेक्शन की स्थिति के रूप में) के एक यादृच्छिक विश्लेषण के बाद 10 प्रतिनिधि मूत्र एक ज्ञात पर्चे इतिहास के साथ चिकित्सकीय अवसादग्रस्त रोगियों से नमूने । उदाहरण के लिए, रोगी #208 से मेथीटोन (m/z ३१०.२१६५) के लिए एक सकारात्मक स्क्रीनिंग परीक्षा परिणाम (चित्रा 2a) एक बड़े सिग्नल पीक (इंजेक्शन #9 से उत्पन्न) का पता लगाने के द्वारा deduced किया जाता है जो मेथीदाए-डी3 के साथ कम के साथ comigrates मास त्रुटि (< 5 पीपीएम) । एक ही भाग के भीतर किसी अन्य मूत्र के नमूनों में कोई अन्य संकेतों का पता चला रहे हैं. Methadone एकाग्रता 13x से अधिक की सिफारिश की कट-ऑफ सीमा जब नमूने में मापा आयन प्रतिक्रिया अनुपात की तुलना (इंजेक्शन #9) संदर्भ दवा मिश्रण/QC (इंजेक्शन #1) के साथ और एक गुणा मूत्र तनुता कारक द्वारा सही. इस प्रकार, इस परिणाम मेथाडोन रखरखाव चिकित्सा के लिए रोगी के पालन की पुष्टि करता है । Nonprescribed एम्फैसिस के सेवन के साक्ष्य (चित्र 2b) ऊंचा एम्फैटेमिन स्तर (एम/जेड १३६.११२१) जो केवल एक रोगी में पाया गया था द्वारा दिखाया गया है (रोगी #50, इंजेक्शन #11 में) MSI-CE-MS चलाने के भीतर. मापा एकाग्रता थोड़ा अनुशंसित कट-ऑफ स्तर से अधिक (1.3 x). यह amphetamine-d5 के साथ comigrates और एक शीर्ष रैंक आणविक फार्मूला मैच के साथ एक कम जन त्रुटि थी । एंटीडिप्रेसेंट venlafaxine (m/z २७८.२११५), एक चयनात्मक सेरोटोनिन-norepinephrine reuptake अवरोध करनेवाला के लिए एक सकारात्मक परीक्षा परिणाम भी रोगी #281 (इंजेक्शन #6) में प्रदर्शन किया है । इस मामले में, एकाग्रता अनुशंसित कट-ऑफ स्तर (15x) से अधिक है, यह comiझंझरी venlafaxine-डी-6 (चित्रा 2c) के साथ एक साथ अपने सटीक द्रव्यमान या आणविक फार्मूला मैच, द्वारा पहचाना जाता है । उत्तरार्द्ध कसौटी एक अज्ञात समदाब रेखा कि eie ट्रेस के भीतर भी पता चला है के लिए पूरा नहीं है, जो सावधानी की जरूरत है जब पूरी तरह से अपने सटीक द्रव्यमान पर भरोसा पर प्रकाश डाला गया है । इसके अलावा, निर्धारित pregabalin की एक निश्चित पता लगाने, जो neuropathic दर्द के उपचार के लिए निर्धारित है, साथ ही सामान्यीकृत चिंता की, भी रोगी #309 के लिए सिफारिश की, इसके बाद के संस्करण की निहायत ऊंचा एकाग्रता (64x) के आधार पर प्रदर्शन किया है कट-ऑफ स्तर (चित्रा 2d) । यह है, तथापि, नौ अंय रोगी मूत्र नमूनों में पता नहीं एक ही रन के भीतर विश्लेषण किया । अंय स्क्रीन सकारात्मक मामलों, इंजेक्शन #4, pregabalin-डी 6, जो सभी मूत्र नमूनों में शामिल है के साथ comigrates के समान MSI-CE-MS द्वारा विश्लेषण किया ।

Figure 2
चित्रा 2: निकाला आयन की एक श्रृंखला प्रतिनिधि स्क्रीन-सकारात्मक मूत्र दवा परीक्षा परिणाम के लिए एक पलटन से 10 नैदानिक अवसादग्रस्त रोगियों जब MSI-CE-MS का उपयोग करते समय की पुष्टि की, जो एक ८४-दवा पैनल में शामिल है की सिफारिश की कट-ऑफ स्तर, आंतरिक संदर्भ के रूप में सेवारत पहले नमूना इंजेक्शन स्थिति के रूप में इंजेक्शन/ (क) ईइई उपरिशाई जो मेथिटोन-डी-3 से संबंधित है, जो मेथीडॉन के साथ संपर्क करता है, इस बात पर प्रकाश डालते हुए कि केवल एक मूत्र नमूना (इंजेक्शन की स्थिति #9) ने मेथीटोन की सांद्रता को कट-ऑफ स्तर से अधिक बढ़ाया है । (ब) एम्फैटेमिन-डी-3, जो एम्फैटेमिन के साथ comigrates के लिए इसी से संबंधित ओवरले, प्रकाश डाला कि केवल एक मूत्र नमूना (इंजेक्शन की स्थिति #11) कट-ऑफ स्तर के ऊपर सांद्रता ऊपर उठाया गया है. (ग) ईआईई उपरिशाई जो वेंलाफिन-डी 6 के अनुरूप है, जो वेलाफिन से संबंधित है, यह रेखांकित करता है कि केवल एक मूत्र नमूना (इंजेक्शन की स्थिति #6) में कट-ऑफ स्तर ऊपर की सांद्रता है । (घ) प्रेगाबलिन-डी-6, जो कि प्रेगाबलिन के साथ संपर्क करता है, के अनुरूप ईईई उपरिशाई यह रेखांकित करता है कि केवल एक मूत्र नमूना (इंजेक्शन स्थिति #4) में कट-ऑफ स्तर से अधिक सांद्रता है । सभी मूत्र नमूनों सीधे विआयनीकृत पानी में एक पंचगुना कमजोर पड़ने के बाद एक मिलान डी के अलावा के साथ विश्लेषण किया गया है (जब उपलब्ध है) । MSI-CE-MS में एक स्क्रीन-सकारात्मक परिणाम एक दवा है कि एक कम जन त्रुटि (< 5 पीपीएम) और सही आणविक सूत्र, जिनकी एकाग्रता के साथ डी-ISs के साथ comigrates से मेल खाती है कट बंद है कि आंतरिक संदर्भ के रूप में एक ही चलाने के भीतर विश्लेषण किया है/ इस आंकड़े का बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।

DoA और उनके चयापचयों की पूर्ण मात्रा भी MSI द्वारा प्राप्त-CE-एमएस बाहरी अंशांकन curves के आधार पर, DoA है कि तेजी से एक ही रन के भीतर प्राप्त कर रहे हैं के लिए संदर्भ कैलिब्रेंट मानकों का उपयोग कर. उदाहरण के लिए, एक ८४-दवा अंशशोधन मिश्रण के धारावाहिक तनुकरण एक साथ एक निश्चित एकाग्रता पर एक मिलान डी है जटिल मूत्र नमूनों में एक विश्वसनीय मात्रात्मक विश्लेषण प्रदान करता है । यह संभावित मैट्रिक्स प्रेरित आयन दमन या वृद्धि के लिए क्षतिपूर्ति करता है, लेकिन यह भी नमूनों के बीच केशिका में इंजेक्शन की मात्रा में भिन्नता के लिए. मामलों में जब एक मिलान डी-है व्यावसायिक रूप से अनुपलब्ध है या कुछ DoA के लिए लागत निषेधात्मक, एक किराए की है डेटा सामान्यीकरण के लिए प्रयोग किया जाता है, जैसे एक डी-एक ही दवा वर्ग के भीतर से है या एक सिंथेटिक यौगिक मूत्र में नहीं पाया (F-Phe), के रूप में पहले प्रदर्शन 14. प्रतिनिधि eies और oxycodone के लिए बाहरी अंशांकन घटता चित्र 3a, Bमें दिखाया गया है और चित्रा 3cमें citalopram के लिए, डी। इन व्यापक रूप से निर्धारित दर्दनाशक दवाओं और अवसादरोधी दवाओं, क्रमशः, दुरुपयोग की क्षमता के साथ कर रहे हैं । सापेक्ष आयन प्रतिक्रिया अनुपात के लिए उनके मिलान डी-है मापा जाता है । इस मामले में, एक धारावाहिक में इंजेक्शन विंयास MSI-CE-MS, पांच विभिंन दवा क्षमता शामिल है, एक साथ एक ही रन के भीतर नकल में विश्लेषण कर रहे है एक सिंथेटिक मूत्र खाली के साथ । कुल मिलाकर, अच्छा रैखिकता (R2 > ०.९९०) एक 20 गुना एकाग्रता सीमा से अधिक doa और उनके चयापचयों के बहुमत का पता लगाने के लिए पर्याप्त संवेदनशीलता के साथ हासिल किया गया था (यानी, धनायनी alkaloids) ८४ के भीतर-औषध पैनल 14. सभी मामलों में, दवा चयापचयों अपनी स्क्रीनिंग कट-ऑफ सीमा (> 50 एनजी/एमएल) के ऊपर उनके प्रोटोनीकृत आणविक आयन [MH+] के रूप में पता चला रहे हैं, कुछ अम्लीय/तटस्थ दवाओं है कि एक गरीब आयनन दक्षता के अपवाद के साथ पॉजिटिव आयन मोड, जैसे कैनाबिनॉइड (उदा., thc-cooh), बारबिटयूरेट्स (उदा., secobarbital), और carbamates(जैसे, carisoprodol) ।

Figure 3
चित्र 3: प्रतिनिधि DoA की मात्रा का पता लगाने के लिए निकाली गई आयन इलेक्ट्रोफेरोग्राम (EIE) की एक श्रृंखला । यह एक मिलान डी-एक 20 गुना रैखिक गतिशील रेंज पर है के साथ उनके सापेक्ष आयन प्रतिक्रिया अनुपात के आधार पर बाहरी अंशांकन curves पैदा करके किया जाता है. (क) ऑक्सीकोडन-डी-3 और एक खाली के साथ oxycodone कैलिब्रेंट्स के लिए पांच सूत्री अंशांकन वक्र का डुप्लिकेट इंजेक्शन । (ख) oxycodone के लिए बाहरी अंशांकन वक्र, संवेदनशीलता (प्रवणता) और रैखिकता (R2) व्युत्पन्न करने के लिए रेखीय प्रतीपगमन निम्नलिखित, ± 1σ (n = 4) का प्रतिनिधित्व करने वाली त्रुटि सलाखों के साथ. (ग) citalopram कैलिब्रेंट के लिए पाँच सूत्री अंशांकन वक्र का डुप्लिकेट इंजेक्शन, एक साथ सीतलोपराम-ड6ी और एक खाली । (घ) citalopram के लिए बाहरी अंशांकन वक्र, संवेदनशीलता (ढलान) और रैखिकता (R2) व्युत्पन्न करने के लिए रेखीय प्रतीपगमन निम्नलिखित, ± 1 एसडी (n = 4) का प्रतिनिधित्व त्रुटि सलाखों के साथ । इस आंकड़े का बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।

Discussion

पारंपरिक वर्णलेखी विभाजन आम तौर पर प्रति रन एक एकल नमूना इंजेक्शन पर निर्भर करते हैं, जो जटिल दवा मिश्रण और स्तंभ के परिष्करण के लिए एक ग्रैडिएंट निक्षालन के बाद होता है । इन आवश्यकताओं को मौलिक नमूना throughput और कर्तव्य चक्र भी जब इष्टतम स्तंभ स्विचन कार्यक्रमों का उपयोग कर सीमा । इस संदर्भ में, कार्यस्थल, विष विज्ञान, या GC-MS/MS द्वारा चिकित्सकीय निगरानी अनुप्रयोगों के लिए उच्च मात्रा मूत्र दवा विश्लेषण और, तेजी से, नियंत्रण रेखा एमएस/ आवश्यक (यानी, कानूनी या चिकित्सा संदर्भ) । यह बहुत अधिक पूंजी निवेश और परिचालन लागत के कारण है, साथ ही साथ जटिलताओं के रूप में डेटा विश्लेषण जब नमूनों की तुलना एक मांयता प्राप्त प्रयोगशाला के भीतर कई वाद्य प्लेटफार्मों भर में विश्लेषण किया । नतीजतन, immunoassays हैं अभी भी नियमित दवा स्क्रीनिंग के लिए प्राथमिक विधि रहने के बावजूद झूठी सकारात्मक और कई दवा वर्गों के बीच गलत नकारात्मक करने के लिए प्रवण किया जा रहा है, उभरते डिजाइनर दवाओं के लिए एंटीबॉडी अभिकर्मकों तक सीमित पहुँच के साथ. पिछले अध्ययनों का प्रदर्शन किया है कि MSI-CE-MS पर आधारित multiplexed विभाजन का नमूना throughput बढ़ाने के लिए एक सरल समाधान की पेशकश परिमाण के एक आदेश के लिए. इसके अतिरिक्त, इस दृष्टिकोण उपंयास डेटा वर्कफ़्लोज़ के डिजाइन के लिए उच्च डेटा निष्ठा के साथ प्रभावी बैच सुधार और गुणवत्ता नियंत्रण12,13,14के कार्यांवयन के आधार पर biomarker खोज के लिए अनुमति देता है । हालांकि, का परिचय 10 या अधिक सीरियल द्रवगतिक इंजेक्शन MSI-CE-MS में प्रभावी केशिका लंबाई को बनाए रखने के लिए आवश्यक उच्च क्षमता separations, जो जब doa विश्लेषण और उनके चयापचयों में चयनशीलता समझौता कर सकते है shortens मानव मूत्र ।

इस के साथ साथ, हम bge के एक विद्युत्-गतिक इंजेक्शन प्रत्येक द्रवगतिक नमूना इंजेक्शन के बाद, इस तरह है कि जुदाई पूर्ण केशिका लंबाई (१२० सेमी) का लाभ लेता है, इस प्रकार महत्वपूर्ण दवा isobars के समाधान में सुधार शुरू/ TOF-MS द्वारा पूर्ण-स्कैन डेटा प्राप्ति (चित्र 1a) । हाल ही की एक रिपोर्ट14की तुलना में, बेहतर समाधान कई महत्वपूर्ण isobaric/isomeric doa और उनके चयापचयों, जो महत्वपूर्ण है जब बड़ी दवा पैनलों के लिए स्क्रीनिंग के लिए हासिल की है । उदाहरण के लिए, कई महत्वपूर्ण संरचनात्मक/कार्यात्मक समूह समावयवों के संकल्प, तीन अनुरूप opioid दवाओं/चयापचयों (चित्र 1 बी), दो असंबद्ध opioid isobars (चित्रा 1 सी), और दो methamphetamine सहित महसूस किया गया था स्थितीय समावयव (चित्र 1D) । सभी मामलों में, नमूना एक ही रन के भीतर विभिन्न अंशशोधन समाधान के सीरियल इंजेक्शन से अधिक ले एक नकारात्मक मूत्र नियंत्रण/खाली द्वारा पुष्टि के रूप में महत्वपूर्ण नहीं है. इसके अतिरिक्त, सुधार संकल्प भी कई पार के लिए एहसास हो रहा है-इस तरह के cotinine-d3 और 3, 4-methylenedioxyamphetamine (एमडीए), eddp-d3 और imipramine, norfentanyl-d5 के रूप में पैनल के भीतर समदाबी दवाओं के साथ कुछ डी-आईएसएस शामिल ketamine, कौडीन-d6 और sertraline, और कोकीन-डी 3 और zolpidem । इस परिणाम दवा पैनल है कि बेहतर इस अध्ययन में हल किया गया के भीतर अन्य समदाबी interferences के लिए बढ़ाया है (जैसे, noroxycodone/ऑक्सीमोरफोन, normeperidine/methylphenidate), साथ ही प्रमुख पृष्ठभूमि मूत्र interferences (उदा. , में स्रोत टुकड़ा आयनों क्रिएटिनिन के साथ एम्फैटमीन)14. वास्तव में, एक विशिष्ट doa की ख्यात पहचान को संतुष्ट करने के लिए दो लांबिक मापदंडों तक पहुंच समदाबी interferences के कारण झूठी सकारात्मक को कम करने के लिए महत्वपूर्ण है, अर्थात् सटीक द्रव्यमान डी-ISs के साथ comigration के साथ संयुक्त । इसके अलावा, इस तरह के hydroxylated, demethylated, या अक्षुण्ण glucuronide दवा (एस) के रूप में एक ही नमूने के भीतर मूल दवा के एक या अधिक biotransformed चयापचयों का पता लगाने, जबकि खिड़की का विस्तार दवा की पहचान की ओर आगे विश्वास कहते हैं पता लगाने के लिए ।

मूत्र औषध स्क्रीनिंग के लिए अनुशंसित कट-ऑफ स्तर DoA के विभिन्न वर्गों के लिए व्यापक रूप से भिन्न (५० से १,००० एनजी/एमएल) उनके फार्माकोकाइनेटिक्स, विषाक्तता, और पृष्ठभूमि interferences के आधार पर, आदेश में विधि पूर्वाग्रह को कम करने के लिए से दिशा निर्देशों के आधार पर मादक द्रव्यों के सेवन और मानसिक स्वास्थ्य सेवाओं प्रशासन (SAMHSA)14। MSI के लिए संभावित-CE-MS का पता लगाने और ंयूनतम नमूना pretreatment के साथ सीधे मूत्र में DoA के विविध वर्गों की पहचान करने के लिए एक ज्ञात नुस्खा रिकॉर्ड के साथ चिकित्सकीय उदास रोगियों के एक समूह के लिए लागू किया गया था । मेथाडोन की निश्चित पहचान (निर्धारित), एम्फैसिस (nonprescribed/अवैध), venlafaxine (निर्धारित), और pregabalin (निर्धारित) में पतला, अभी तक nonhydrolyzed, मूत्र के नमूनों का प्रदर्शन किया गया था जब MSI-CE-MS का उपयोग करते हुए. यह एक दवा की एक सीधी तुलना पर आधारित था एक विशिष्ट इंजेक्शन की स्थिति में पता चला ८४-दवा पहले नमूना स्थिति में शुरू की सिफारिश की स्क्रीनिंग कट-बंद स्तर जो एक आंतरिक संदर्भ के रूप में कार्य करता है/ (चित्र 2) । इसके अलावा, निरपेक्ष दवा प्रमात्रीकरण जब बाहरी अंशांकन घटता का उपयोग कर व्यवहार्य है (चित्रा 3) आयन प्रतिक्रिया अनुपात के आधार पर एक दवा के लिए मापा अपने डी-is. सबसे क्रोमेटोग्राफिक अलगाव के विपरीत, कोई ड्यूटीरियम प्रभाव एक डी है और उसके nondeuterated दवा के बीच प्रवास समय मतभेद को प्रभावित है क्योंकि वे CE में मुक्त समाधान में अनुरूप electrophoretic mobilities के अधिकारी । वास्तव में, doa के प्रवास व्यवहार सही रूप में उनके मौलिक भौतिक गुण/रासायनिक संरचना, अर्थात् आणविक मात्रा और प्रभावी चार्ज (पीकेए)14के आधार पर CE में मॉडलिंग की है । के बाद से कई दवाओं को भी महत्वपूर्ण माध्यमिक चयापचय से गुजरना मूत्र में उत्सर्जन से पहले (जैसे, मॉर्फिन glucuronide), स्क्रीनिंग कट-स्तर समायोजन की आवश्यकता के रूप में उनकी मापा सांद्रता से कम प्रत्याशित हैं जब की तुलना में विधि है कि कुल दवा का पता लगाने के लिए एंजाइम हाइड्रोलिसिस का उपयोग । "पतला और गोली मार" मूत्र दवा परीक्षण का एक बड़ा लाभ, लागत/समय, नमूना हैंडलिंग, और अपूर्ण एंजाइम hydrolysis के कारण एक संभावित पूर्वाग्रह या बैच भिन्नताओं को कम करने के अलावा, यह है कि प्रकल्पित स्क्रीन-पॉजिटिव मामलों की पुष्टि एक ही नमूने के भीतर एक या एक से अधिक संबंधित दवा चयापचयों का पता लगाना. यह भी दवा फार्माकोकाइनेटिक्स और व्यक्तिगत रोगियों के लिए इष्टतम खुराक आवश्यकताओं में गहरी अंतर्दृष्टि प्रदान करता है, जबकि "फास्ट" metabolizers या कम आधा जीवन के साथ निर्धारित/अवैध ड्रग्स के लिए पता लगाने में सुधार. इसके अतिरिक्त, एक मिलान डी के साथ comigration-है विश्वसनीय दवा स्क्रीनिंग के लिए दो महत्वपूर्ण कार्य निभाता है जब MSI का उपयोग-CE-MS-अर्थात्, यह सटीक नमूना इंजेक्शन की स्थिति की पहचान करता है (यानी, रोगी #) जबकि भी आयन में मतभेदों के लिए सही प्रतिक्रियाओं/सुधार परिशुद्धता और सटीकता के लिए इंजेक्शन संस्करणों ।

भविष्य के कार्य का उद्देश्य क्यूसी/क्यूए के साथ उच्च मात्रा में मूत्र दवा परीक्षण के लिए आवश्यक एचआरएमएस के साथ युग्मित बहुसंकेतन पृथक्करण के स्वचालित डेटा प्रोसेसिंग की सुविधा के लिए कस्टमाइज्ड सॉफ्टवेयर टूल्स का विकास करना है । MSI के कठोर सत्यापन-CE-DoA के व्यापक स्पेक्ट्रम स्क्रीनिंग के लिए एमएस भी उच्च जोखिम वाले रोगियों के एक बड़े पलटन के बीच की जांच के लिए निष्पक्ष निर्धारित दवा पालन और संभावित दुरुपयोग/ उपचार प्रभावकारिता, रोगी सुरक्षा, और/या मनोरोग मूल्यांकन/ DoA और उनके चयापचयों की अम्लीय/anionic कक्षाओं का एक पूरक विश्लेषण भी प्राकृतिक/सिंथेटिक कैनाइनइड्स की व्यापक स्क्रीनिंग के लिए आवश्यक के रूप में नकारात्मक आयन मोड का पता लगाने के साथ क्षारीय स्थितियों के तहत MSI-CE-MS द्वारा किया जाएगा । यह कनाडा और कई अमेरिकी राज्यों में मनोरंजन मारिजुआना के वैधीकरण के उभरते सार्वजनिक स्वास्थ्य निहितार्थ दिया महत्वपूर्ण है । TOF-MS द्वारा पूर्ण स्कैन डेटा अधिग्रहण का एक प्रमुख लाभ यह है कि नमूनों का भूतलक्षी विश्लेषण तब भी किया जा सकता है जब मूत्र नमूनों का अनुवर्ती परीक्षण के लिए अब उपलब्ध नहीं है, जबकि अन्य जीवनशैली या आहार जोखिम के लिए बेहतर मूल्यांकन किया जा सकता है ड्रग थेरेपी के लिए विभेदक प्रतिक्रियाओं को समझें । सारांश में, MSI-CE-एमएस द्वारा एक तेजी से अभी तक सटीक दवा निगरानी विधि पारंपरिक लक्षित immunoassays हैं, के रूप में अच्छी तरह के रूप में प्रत्यक्ष जलसेक के लिए महत्वपूर्ण लाभ प्रदान करता है/ वृद्धि की लागत पर जटिल जैविक नमूनों में DoA और उनके चयापचयों के पैनलों का विस्तार किया ।

Disclosures

लेखक एक अमेरिकी पेटेंट का खुलासा (PCT/CA2014/050454) MSI-CE-MS पर एक बहुसंकेतन स्क्रीनिंग मंच और डेटा कार्यप्रवाह के रूप में रासायनिक विश्लेषण के लिए ।

Acknowledgments

P.B.M. प्राकृतिक विज्ञान और कनाडा के इंजीनियरिंग अनुसंधान परिषद, नवाचार, जीनोम कनाडा और McMaster विश्वविद्यालय के लिए कनाडा फाउंडेशन से धन समर्थन स्वीकार करना चाहता है । लेखकों Seroclinix निगम में हावर्ड ली और डॉ मार्कस किम Agilent प्रौद्योगिकियों से उनके व्यावहारिक चर्चाओं के लिए धंयवाद । इसके अतिरिक्त, लेखक मनोरोग विभाग और McMaster विश्वविद्यालय में व्यवहार विज्ञान और मूड विकार क्लिनिक से डॉ Zainab समोसे स्वीकार सेंट जोसेफ अस्पताल में इस अध्ययन में इस्तेमाल किया deidentified रोगी मूत्र नमूने के लिए उपयोग करने के लिए .

Materials

Name Company Catalog Number Comments
7100 Capillary Electrophoresis System Agilent Technologies Inc. G7100A CE instrument used for separation of drug mixtures, desalting and anotation
6230 Series Time-of-Flight Mass Spectrometer Agilent Technologies Inc. G6230B HRMS mass analyzer used for drug detection and anotation
CE-ESI-MS Sprayer Kit Agilent Technologies Inc. G1603A CE/MS coaxial sheath liquid interface and capillary casette
1260 Infinity Isocratic Pump and Degasser Agilent Technologies Inc. G1310B Isocratic pump to deliver sheath liquid/mass calibrant
MassHunter Workstation Data Acquisition Software (B.06.01) Agilent Technologies Inc. -- Software used for control of CE-MS system
MassHunter Qualitative Analysis Software (B.06.01) Agilent Technologies Inc. -- Software used for processing of CE-MS data
Shortix Capillary Cutter Agilent Technologies Inc. 5813-4620 Cutting tool with diamond blade used to cut capillaries
Capillary Window Maker Microsolv Inc. 07200-S Burner with 7 mm window size to remove polyimide coating from CE capillary
Flexible Fused-silica Capillary Tubing Polymicro Technologies Inc. TSP05375 Standard polyimide coated fused-silica capillary for CE separation (50 micron ID; 360 micron OD)
Drug standards, deuterated internal standards, synthetic urine matrix (SURINE) Cerilliant Inc. Miscellaneous Certified drugs of abuse reference standards (86 drug panel) with 48 deuterated internal standards and negative urine control (Surine)

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Formal Correction: Erratum: High-throughput and Comprehensive Drug Surveillance Using Multisegment Injection-Capillary Electrophoresis-Mass Spectrometry
Posted by JoVE Editors on 05/16/2019. Citeable Link.

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High-throughput and Comprehensive Drug Surveillance Using Multisegment Injection-capillary Electrophoresis Mass Spectrometry

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High-throughput and Comprehensive Drug Surveillance Using Multisegment Injection-Capillary Electrophoresis-Mass Spectrometry

मल्टीसेगमेंट इंजेक्शन का उपयोग करके उच्च थ्रूपुट और व्यापक ड्रग निगरानी-केशिका इलेक्ट्रोफोरेसिस मास स्पेक्ट्रोमेट्री
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Shanmuganathan, M., Macklai, S.,… More

Shanmuganathan, M., Macklai, S., Barrenas Cárdenas, C., Kroezen, Z., Kim, M., Zizek, W., Lee, H., Britz-McKibbin, P. High-throughput and Comprehensive Drug Surveillance Using Multisegment Injection-Capillary Electrophoresis-Mass Spectrometry. J. Vis. Exp. (146), e58986, doi:10.3791/58986 (2019).

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