Høy gjennomstrømming og omfattende narkotika overvåkning bruker Multisegment injeksjon-kapillære geleelektroforese massespektrometri

Summary

Her beskriver vi en høy gjennomstrømming metode for omfattende narkotikaovervåking som tillater for bedre oppløsning og påvisning av store paneler av misbruk og deres metabolitter, med kvalitetskontroll basert på multisegment injeksjon-kapillære geleelektroforese-massespektrometri.

Abstract

Nye analytiske metoder er sterkt behov for å aktivere høy gjennomstrømming, men likevel omfattende narkotikarelaterte screening, gitt en alarmerende opioid- og reseptbelagte stoffet krise i offentlig helse. Konvensjonelle urin narkotikatesting basert på en to-lags immunanalyse skjermen etterfulgt av en gass kromatografi-tandem massespektrometri (GC-MS/MS) eller flytende kromatografi-tandem massespektrometri (LC-MS/MS) metoden er dyre og utsatt for skjevhet samtidig begrenset til målrettet paneler av kjente narkotiske stoffer (DoA). Her, skissere vi en bedre metode for narkotikaovervåking som tillater for oppløsning og oppdagelsen av en utvidet panel av DoA og deres metabolitter ved multisegment injeksjon-kapillære geleelektroforese-massespektrometri (MSI-CE-MS). Multiplekset separasjoner av ti urinprøver med en kvalitetskontroll av CE (< 3 min/sampling) sammen med full skanning datainnsamling bruker time of flight-masse spectrometer (TOF-MS) under positivt ion mode Gjenkjenningsmerknad tillater identifikasjon og kvantifisering av DoA ovenfor anbefalte cut-off nivåer. En utmerket løsning stoffet isomerene og Isobarene, inkludert bakgrunn forstyrrelser, oppnås når du bruker MSI-CE-MULTIPLE Sclerosis med en electrokinetic mellomrom mellom eksempel segmenter, hvor nøyaktig masse/molekylære formel med comigration av en matchende deuterated interne standard og gjenkjenning av ett eller flere bio-forvandlet metabolitter lette DoA identifikasjon over et bredere oppdagelsen vinduet. I tillegg kan urinprøver analyseres direkte uten enzymet deconjugation for rask screening uten komplisert eksempel workup. MSI-CE-MULTIPLE Sclerosis aktiverer overvåking av et bredt spekter av DoA som kreves for behandling overvåking av høy-risiko pasienter, inkludert bekrefter foreskrevet narkotika etterlevelse, avslørende illegale bruk/substitusjon og vurdere optimal dosering regimer nødvendig for nye fremskritt i presisjon medisin.

Introduction

En alarmerende økning i misbruk av og avhengighet til opioider for behandling av kroniske smerter representerer en økende trussel mot folkehelsen, med over 70 000 overdosedødsfall i USA i 2017¹. Tilsvarende er ulike andre psykotrope medikamenter også mye foreskrevet til barn og unge voksne for behandling av angst, depresjon og psykiske problemer². Urin narkotikatesting metoder, mye utviklet for arbeidsplassen og rettsmedisinske toksikologi, er resultatet av avgjørende betydning for den terapeutiske overvåking av foreskrevet medisiner som er utsatt for toleranse og avhengighet^3,4. Dette er nødvendig for å sikre overholdelse, optimal terapeutiske effekten og pasientsikkerhet, mens avsløre potensielle substitusjon, inkludert ulovlig eller nonprescribed rusmiddelmisbruk. Foreløpig urin narkotikatesting for DoA stole på en to lagdelt tilnærming, bestående av et innledende konkurransedyktig immunanalyse skjermen via point-of-care enheter eller laboratorium analyserer, etterfulgt av en bekreftende test med større spesifisitet er basert på GC--MS-/ MS og stadig, LC--MS-/ MS⁵. Men er immunanalyser utsatt for bias, som antistoff reagenser binde nonspecifically til ulike narkotika klasser til å generere en presumptive skjermen-positive resultatet, som hindrer en pålitelig ID og kvantifisering av spesifikke medikamenter eller komplekse narkotika blandinger⁶. I denne sammenheng mer nøyaktig urin-narkotikatesting trengs haster gitt den ublu kostnadene ved omfattende blandingsbruk skjermbilder,⁷ inkludert syntetiske medikamenter og syntetisk urin produkter som unnvike konvensjonelle målrettet analyser.

Høy effektivitet separasjoner i forbindelse med høy oppløsning MS (HRMS) bruker TOF eller orbitrap masse analyserer foreslått som en nontargeted strategi for narkotikaovervåking i en tid med polypharmacy og utvide paneler DoA^8,9 . Men er konvensjonelle LC separasjoner treg (> 15 min) på grunn av lang elueringsrør tider for oppløsning av kjemisk ulike klasser av DoA og deres metabolitter i gradient elueringsrør-programmer, som begrenser utvalget gjennomstrømmingen for rutinemessig narkotikarelaterte screening. Alternativt, direkte analyse baseres på desorpsjon ionization (tegning)¹⁰ og laser diode termisk desorpsjon (LDTD) tillater raskere narkotikarelaterte screening uten separasjon¹¹. Men er metodene ambient ionisering utsatt for isobar/isomere forstyrrelser når analysere komplekse urin prøver, dermed krever uavhengig bekreftende testing.

Vårt laboratorium har nylig utviklet en multiplex separasjon plattform for å øke utvalg ytelse samtidig beholde oppløsning og data gjengivelsen av en høy effektivitet separasjon basert på MSI-CE-MULTIPLE Sclerosis¹². Romanen data arbeidsflyter kan være utformet på MSI-CE-MS for nontargeted metabolitten profilering (dvs.metabolomics) av volum-begrenset biospecimens, mens kvalitetskontroll (QC) tillater for satsvis korreksjon som kreves for store befolkning studier¹³. I dette tilfellet utføres separasjoner ved hjelp av en isocratic buffer med stoff ionisering oppstår under stabil løsemiddel forhold når du bruker en konvensjonell skjede flytende grensesnitt, som gir føljetong injeksjoner av 10 eller flere prøver i ett kjøre rask men selektiv screening av ulike klasser av DoA og deres metabolitter¹⁴. Fokus for denne studien er å ytterligere validere MSI-CE-MS for direkte analyse av autentisk urinprøver fra en representant kohort av klinisk deprimerte pasienter med en "fortynne-og-shoot" metode som kontorplass enzym hydrolyse¹⁵. I tillegg gjennomføringen av en electrokinetic mellomrom mellom føljetong eksempel plugger i MSI-CE-MULTIPLE Sclerosis¹⁶ ble utført ytterligere forbedre oppløsningen på forskjellige narkotika isomerene/Isobarene, bakgrunn urin forstyrrelser, og/eller Cross-forstyrrelser når screening store paneler av DoA. Den absolutte kvantifiseringen av DoA i urin prøver når bruker matchende deuterated interne standarder (d-er) er demonstrert ved MSI-CE-MULTIPLE Sclerosis. Denne tilnærmingen også forenkler narkotika identifikasjon, samt deducing riktig utvalg plasseringen av skjermen-positive tilfeller i forhold til en narkotika-panelet blanding på de anbefalte screening cut-off nivå som også fungerer som en intern referanse/QC innen samme løp.

Protocol

Blendet urinprøver fotograferingen av Dr. Zainab Samaan fra humør lidelse klinikken ved St. Joseph's Hospital (Hamilton, Storbritannia), der studie ble godkjent av Hamilton integrert forskning etikk styret.

1. reagenser og prøve løsninger forberedelse

1. Bakgrunn elektrolytt forberedelse
   1. Forberede 50 mL av bakgrunnen elektrolytt (BGE) annenhver uke, 1 M maursyre, pH 1.8, med 15% v/v acetonitrile som en organisk modifikator.
   2. Aliquot 1,9 mL konsentrert maursyre lager (26.5 M) i en 50 mL volumetriske kolbe og legge 7,5 mL av acetonitrile og 40.6 mL deionisert vann for å bringe det totale volumet til 50 ml passer. Deretter sonicate løsningen for 15 min og overføre den til en sterilisert flaske med tett forsegling.
2. Skjede flytende forberedelse
   1. Forberede 200 mL skjede flytende løsning ukentlig, bestående av 0,1% maursyre i 60: 40 (MeOH:H₂O).
   2. Aliquot 200 µL av maursyre (26.5 M stock) i en flaske som inneholder 120 mL av MeOH og 80 mL H₂O å gjøre skjede væske og degas det i 15 min.
   3. Deretter legger til 10 µL av hver av følgende referanse ioner, purine og hexakis (2,2,3,3-tetrafluoropropoxy) phosphazine (HP-921), i skjede væsken å gi konstant masse signaler på m/z 121.05087 og m/z 922.00979, henholdsvis.
      Merk: Disse referanse ioner tillater sanntid masse korreksjon og også overvåke for potensielle matrix-indusert ion undertrykkelse eller forbedring effekter under separasjon.
3. Standard forberedelse
   1. Forberede en standard løsning som inneholder en 84-stoff panelet blanding på 3 x klinisk screening cut-off nivå (L6)¹⁴ i 1 mL av metanol, bruker narkotika standarder kjøpt fra en leverandør av kjemikalier. Forbered separat en blanding av 48 matchende deuterated interne narkotika standard (d-ISs) på en 10 ganger høyere konsentrasjon enn 84-stoff blandingen i 1 mL av metanol. I tillegg klargjør en lagerløsning inneholder 200 µM 4-fluoro -L-fenylalanin (F-Phe) og 3-klor -L-tyrosin (Cl-ty) i 1 mL av deionisert H₂O.
   2. Utføre en femdoblet fortynning av ovennevnte 84-stoff blandingen (20 µL) og 48 d-ISs (20 µL), samt en tidoblet fortynning av 4-fluorophenylalanine (F-Phe, 10 µL) og 3-chlorotyrosine (Cl-Tyr, 10 µL) i en sertifisert syntetiske urin matrix (40 µL) å gjøre totalt volum på 100 µL i et 250 µL sentrifuge rør.
4. Eksterne kalibrering kurve forberedelse
   1. Forberede fem-punkts eksterne kalibrering kurver (som beskrevet nedenfor) i quadruplicate (n = 4) over en 20-fold dynamisk område med 84-stoff standard blandingen og 48 av deres tilsvarende d-ISs gjorde i trinn 1.3.1. For eksempel for å gjøre en fem-punkts eksterne kalibreringskurven, sikre fortynne 84-stoff blandingen (L6, trinn 1.3.1) til 2 - 4 - 10-, 20-, og 40-fold, mens det er nødvendig å forberede en femdoblet fortynning av d-ISs (20 µL) og en tidoblet fortynning av 4-F-Phe ( 10 µL) og Cl-Tyr (10 µL) som en ekstra er i en syntetisk urin matrix å gjøre et totalt volum på 100 µL. I tilfeller når en samsvarende d-er ikke er tilgjengelig for et bestemt legemiddel, er bruk 4-F-Phe som et surrogat for data normalisering.
      Merk: Unngå inkludering av flere d-ISs som cross-påvirke (isobar) med andre DoA panelet hvis de ikke fullt løses av CE separasjon.
5. Urin eksempel forberedelse
   1. Tine deidentified morgenen urinprøver fra en representant kohort av ti klinisk deprimerte pasienter med kjente reseptbelagte stoffet historie. Lagre urinprøver ved-80 ° C etter samling før de måtte være tint for analyse.
      Merk: Unngå flere fryse-Tin sykluser av urin eller en forsinket bagasje ved romtemperatur etter samlingen på grunn av deres virkning på den kjemiske stabiliteten av visse DoA metabolitter og deres conjugates.
   2. Vortex deidentified morgen urinen prøver for 30 s og deretter virvel dem for 1 min 14.000 x g for sedimentering. Etter at aliquot 10 µL av de ovennevnte behandlet urin, 10 µL av d-er, og 5 µL av F-Phe/Cl-Tyr og 25 µL av deionisert H₂O og vortex for 1 min (Gjenta disse trinnene i tre eksemplarer å vurdere tekniske presisjon). Overføre en 20 µL aliquot av ovenfor beskrevet blandingen til polypropylen ampuller for analyse.

2. oppsett av CE-TOF-MULTIPLE Sclerosis systemet

1. Ubestrøket smeltet silica kapillær condition parametere
   1. Kontroller at alle standarder, eksterne kalibrering kurver og urinprøver i inndelinger 1,3 til 1,5 atskilles med en ubestrøket åpen-rørformede smeltet silica polyimid (pi)-belagt kapillær med en indre diameter på 50 μm, en ytre diameter på 360 µm, og kapillær totallengde 135 cm
      Merk: En diamond cutter verktøyet brukes til å sikre konsekvent kapillærene som undersøkes ytterligere for å sikre en flush og glatt kutt.
   2. Fjern ca 7 mm Beleggets polyimid (pi) fra både distale kapillær ender, med en kapillær vinduet maker å redusere eksempel bære-over og forhindre potensielle polyimid (pi) hevelse når i kontakt med organiske løsemidler.
   3. Kontroller at stikker ca 2 mm av kapillær utløpet av CE sprøyta nålen og installere kapillær innløp i CE kassetten av looping to 360-graders svinger. Deretter forsiktig installere CE kassetten i CE og plasser sprøyta CE av ion kilden når condition av kapillær.
      Merk: Klipp kapillær uttaket konsekvent som det er avgjørende for å sikre en stabil electrospray gjeldende kombinert til MS. To forskjellige sprøyter ble brukt i dette arbeidet: en CE sprayer ble brukt for eksempel analyse og en LC sprøyta ble brukt for masse kalibreringen.
   4. Pass på å utføre av kapillær condition med CE sprøyta ikke plassert i ion kilden. LC sprøyta innlegge ion kilden.
      Merk: Dette gir masse kalibrering og unngå enhver kontaminering av koaksial skjede flytende grensesnittet som er deretter koblet til TOF-MS.
   5. Tilstand nye kapillærene ved å velge flush-funksjonen (940 mbar) på leverandørens programvare brukes til å kontrollere apparatet og Still inn varigheten for flush 30 minutter hver for fire forskjellige løsemidler i følgende rekkefølge: metanol, 1 M NaOH, vaskebuffer vann og BGE. Pass på å sette isocratic pumpen i ventemodus i kapillær condition perioden.
   6. Tørk CE-MS sprøyta med en vev tørke dynket i MeOH/T₂O å fjerne eventuelle gjenværende saltavleiringer.
   7. Utføre daglig forebyggende vedlikehold av CE-MS systemet før analysere prøvene. Bruk metanol tørk av CE elektroden (på innløpet) men bruke en isopropanol og vann (50/50) blandingen å rengjøre CE-MS grensesnittet, som er viktig å unngå salt oppbygging og begrense potensielle eksempel bære-over.
   8. Fjerne LC sprøyta av ion kilden og plasser renset sprøyta med en nylig betinget kapillær i koaksial skjede flytende grensesnittet i CE-MS.
   9. Slå på isocratic pumpen og bruke en spenning på 30 kV i 15 min slik at en stabil CE gjeldende profil er oppnådd før urin analysen.
2. Injeksjon og separasjon vilkår bruker CE
   1. Åpne leverandør programvaren brukes for å styre maskinen sette CE parameterne og velg den preconditioning trinn. Angi flush funksjonen til 600 s og angi en BGE medisinglass posisjon.
      Merk: En ekstern vann chiller må være koblet til CE systemer som mangler eksempel skuffen kjøling funksjoner, som dette er nødvendig for å hindre eksempel fordampning når analysere store grupper av volum-begrenset prøver.
   2. Angi injeksjon funksjonen å injisere hydrodynamically prøvene på 100 mbar for 5 s og electrokinetically injisere BGE avstandsstykker 30 kV for 75 s.
      Merk: Denne prosessen gjentas med hvert eksempel injeksjon (fra en annen medisinglass posisjon) etterfulgt av en BGE for avstand (fra samme flaske plasseringen) som utføres automatisk et metoden program på programvare for totalt 11 diskret prøver analysert i den samme kjøre når du bruker et MSI-format. Analysere 10 urinprøver i tilfeldig rekkefølge etter en 84-panel narkotika blanding på screening cut-off injiseres nivå som første eksempel plassering for hver MSI-CE-MULTIPLE Sclerosis kjøre.
   3. Angi den anvendt spenning å være 30 kV, patron temperatur 25 ° C, og total kjøretid skal 40 min. med tidsplanen gjelder en trykkgradient av 2 mbar/min fra 0 min 40 min under separasjon.
      Merk: En gradient trykket brukes under separasjon å tillate tilsettes langsom-migrering narkotika, som inkluderer noen svakt, grunnleggende benzodiazepiner og nøytral/syreholdig stoffer (f.eks, Paracetamol, barbiturater). Men overføre mest grunnleggende DoA og deres metabolitter som kasjoner innen 25 min, inkludert amfetamin, opioider og andre klasser av alkaloider.
   4. Når prøven oppkjøp er fullført, må du skylle av kapillær ved lave trykk (50 mbar) med BGE før neste dag. Ellers, skyll av kapillær for 600 s ved høyt trykk (900 mbar) med vann og deretter 600 s med luft, og lagre den i en sprøyta holder fram til neste bruk.
3. Isocratic pumpe og skjede væske
   1. Bruke en uendelig Isocratic pumpe og en uendelig Degasser for å levere skjede væske (60: 40 MeOH:H₂O med 0,1% v/v maursyre) med en hastighet på 10 µL/min til CE-MS sprøyta.
4. TOF-MS innstillinger
   1. Kontroller at en TOF-MS, koaksial skjede-flytende electrospray ion kilde og oppvarmet nitrogen gass, er utstyrt med en CE-enheten.
   2. Operere TOF-MS under positivt ion oppdagelsen som varte en masse m/z 50-1700, med en datahastighet for kjøp av 500 ms/spektrum. Kontroller at både profilen og centroid data er lagret i et filformat med ".d".
   3. Angi electrospray ionization forhold skal: Vcap og munnstykke spenningsnivået 2000 V forstøveren gassen på 10 psi og tørking gass levert på 8 L/min ved 300 ° C, med en skjede gasstrømmen på 3,5 L/min på 195 ° C. I tillegg angi MS spenning innstillinger av fragmentor, skimmer og Oct1 RF 120, 65 og 750 V, henholdsvis.
      Merk: Vcap og munnstykke spenning, samt forstøveren gass ble slått av under føljetong eksempel injeksjon sekvensen i MSI-CE-MULTIPLE Sclerosis, men electrospray var programmert til å være slått tilbake på 1 min etter initiering av electrophoretic separasjon å hindre gjeldende feil på grunn av utsuging effekter.
   4. Utføre instrument kontroll og datafangst med leverandørens programvare (Tabell for materiale).
5. Dataanalyse
   1. Analysere MSI-CE-MULTIPLE Sclerosis dataene med leverandørens programvare, inkludert behandling, data utjevning, og integrering av utdraget ion electropherograms (EIEs) for representant DoA og deres metabolitter.
   2. Åpne programvaren og følgende parametere.
      1. Under chromatograms, velg utvinning dataformatog chromatogram og masse spektraldata format til profil -modus.
      2. Velg Kvadratiske/Cubic Savitzky Golay under utjevning funksjonen og funksjonen bredde 15 poeng.
      3. Klikk deretter Integrere (MS), angi integrator skal Agileog velg maksimalt antall topper grensen til de største 11 under topp filtrene.
      4. Klikk Vis, klikk integrering topp-listen, og velg toppen antall, tiden (RT), peak området, topp høydeog signal-til-støy-forhold (SNR).
      5. Lagre disse parameterne under en unik metodenavn. Bruk denne metoden til prosessen og tolke hvert datasett.
         Merk: En tabell med toppen antall, RT, peak området og høyde og SNR vises på høyre side. Utføre data normalisering for målte RT og integrert peak området for hver DoA til enten en tilsvarende d-er eller (hvis ikke tilgjengelig) til F-Phe å forbedre analytisk presisjon.

3. analyse av urinprøver og eksterne kalibrering kurver

1. Annen seriell injeksjon konfigurasjoner brukes i MSI-CE-MS
   1. Den første serielle eksempel injeksjon konfigurasjonen, brukes til å vise narkotika isomer/isobar oppløsning (figur 1A), sikre at fem gjentatt injeksjoner utføres på en blanding av 84 narkotika standarder med d-er og 4-F-Phe/Cl-Tyr, etterfulgt av en sjette injeksjon, som er et tomt utvalg i syntetisk urin, og fem ekstra injeksjoner av standard dopingtest blandingen.
   2. For andre serielle eksempel injeksjon konfigurasjonen, brukes til å vise påvisning av DoA i individuelle urinprøver fra pasienter med kjente resept (figur 2A), påse at første eksempel pluggen er en blanding av 84-stoff standard blanding på en 1 x cut-off screening nivå (positiv kontroll) etterfulgt av en randomisert injeksjon av 10 utvannet urinprøver fra pasienter: #293, #88, #309, #43, #281, #64, #221, #208, #183 og #50.
   3. For tredje føljetong eksempel injeksjon konfigurasjonen, brukes for å illustrere oppkjøpet av eksterne kalibrering kurver i en enkelt kjøre, sikre at calibrant løsninger for DoA tilberedes over en 20-fold lineær dynamiske område tilsvarer 0,25 x, 0.5 x, 1 x 2.5 x og 5 x cut-off konsentrasjon nivåer, sammen med matchende d-er og F-Phe/Cl-Tyr flere er i en syntetisk urin matrise (n = 4).

Representative Results

MSI-CE-MULTIPLE Sclerosis gjør føljetong injeksjon av ti eller flere separate prøver i et enkelt løp, som forbedrer gjennomstrømning (< 3 min/sampling) uten kompliserte instrumental modifikasjoner, kolonnen-svitsjing programmer eller kostbare infrastruktur investeringer (figur 1A). En vekslende rekke etter injeksjoner av prøven og electrokinetic distansestykke BGE utføres innenfor en uendret smeltet silica kapillær, der sonal electrophoretic separasjoner ioner oppstå under sterkt surt elektrolytt forhold (pH 1.8). stoff ionisering oppstår også under steady-state-betingelser. I dette tilfellet brukes en koaksial skjede væske, med en masse calibrant, som et grensesnitt for CE-MS under positivt ion modus gjenkjenning med minimal ion undertrykkelse eller forbedring effekter som overvåkes av masse calibrant ioner signalet. TOF representerer en robust men kostnadseffektive HRMS med en rask datainnsamling ideell for nontargeted screening/stoffet overvåking programmer når du bruker MSI-CE-MULTIPLE Sclerosis. Imponerende oppløsning oppnås for eksempel for ulike isobar/isomere DoA og deres metabolitter, inkludert strukturelle en tre opioider strukturelle isomerene, nemlig norhydrocodone, hydromorphone og morfin (figur 1B). I dette tilfellet løst 30 peaks 10 uavhengig prøver av en narkotika-blanding oppdages uten eksempel bære-over. En syntetisk urin tom/negative urin kontroll er også inkludert i seriell injeksjon serien (prøve posisjon #6). Også er to andre isobar opioider, nemlig 6-acetylmorphine (en inaktiv heroin metabolitten) og naloxon (en opioid reseptor antagonist brukes for akutt behandling av opioidoverdoser) fullt løst som 20 forskjellige topper med full skanning data oppkjøp ( Figur 1 c). Tilsvarende løses to amfetamin posisjonelle isomerene fullt i MSI-CE-MS for å skille illegale metamfetamin misbruk fra potensielle misbruk av phentermine, en foreskrevet stimulerende som brukes som en appetitt suppressant for vekttap.

Figur 1: en rekke utdraget ion electropherograms (EIE) for representant DoA isomerene/Isobarene som løses av MSI-CE-MULTIPLE Sclerosis ved å analysere ti eksempler og en tom i et enkelt løp. (A) skjematisk av MSI-CE-MULTIPLE Sclerosis som viser føljetong injeksjon konfigurasjonen brukes for en 84-DoA panel i syntetisk urin. Denne multiplex separasjon metoden bruker en vekslende rekke etter injeksjoner av 11 diskret prøver og tom med en electrokinetic injeksjon av en buffer til å starte sonal electrophoretic separasjon av ioner, etterfulgt av en full skanning data oppkjøpet av TOF-MS med positivt ion modus gjenkjenning. (B) tre isobar funksjonsgruppe opioider isomerene (m/z 286.1438), adskilt av CE, bestående av 30 løst peaks 10 diskret eksempel injeksjoner, inkludert norhydrocodone, hydromorphone og morfin. (C) to isobar opioider og deres metabolitter (m/z 328.1543), adskilt av CE, bestående av 20 løst peaks 10 diskret eksempel injeksjoner, inkludert 6-acetylmorphine (heroin metabolitten) og naloxon. (D) to isobar funksjonsgruppe amfetamin isomerene, atskilt av CE, bestående av 20 løst peaks 10 diskret eksempel injeksjoner, inkludert metamfetamin og phentermine. I alle tilfeller hadde negative urin kontroller/mellomrom introdusert på den sjette prøveposisjon i MSI-CE-MULTIPLE Sclerosis ubetydelig bevis for eksempel bære-over. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Til skjermen DoA, en seriell injeksjon konfigurasjon i MSI-CE-MULTIPLE Sclerosis brukte en 84-stoff panelet blanding på de anbefalte screening cut-off konsentrasjon nivåer (som første injeksjon plasseringen for alle tekster) etterfulgt av en randomisert analyse av 10 representant urin prøver fra klinisk deprimerte pasienter med en kjent resept historie. For eksempel, en positiv screening testresultatet for metadon (m/z 310.2165) fra pasient #208 (figur 2A) er utledet av gjenkjenning av en stor signal topp (som stammer fra injeksjon #9) som comigrates med metadon-d3 med lav masse feil (< 5 ppm). Ingen andre signaler oppdages i noen andre urinprøver innen samme kjøre. Metadon konsentrasjon overskrider 13 x anbefalte cut-off grensen når sammenlignende målt ion svar forholdet i prøven (injeksjon #9) med referanse stoff blanding/QC (injeksjon #1) og rettes opp ved en firedobbelt fortynningsfaktoren for urin. Dermed bekrefter dette resultatet pasientens tilslutning til metadon vedlikehold terapi. Bevis av nonprescribed amfetamin (figur 2B) vises etter forhøyet amfetamin (m/z 136.1121) som ble bare oppdaget i en pasient (pasient #50, i injeksjon #11) innen MSI-CE-MULTIPLE Sclerosis kjøre. Målt konsentrasjonen litt overskredet anbefalte cut-off nivåer (1,3 x). Dette comigrates med amfetamin-d5 hadde en lav masse feil med en topprangerte molekylære formel kamp. Et positivt testresultat for antidepressant venlafaxine (m/z 278.2115), en selektive serotonin-noradrenalin reopptakshemmere, er også vist i pasient #281 (injeksjon #6). I dette tilfellet konsentrasjonen overskrider anbefalte cut-off nivåer (15 x), dette er identifisert av sin nøyaktig masse - eller molekylære formel-match, sammen med comigrating venlafaxine-d6 (figur 2C). Sistnevnte vilkåret ikke er oppfylt for en ukjent isobar som også oppdaget i EIE spor, som fremhever behovet for forsiktig når stole utelukkende på sin nøyaktig masse. Også definitive gjenkjenning av foreskrevet pregabalin, som er foreskrevet for behandling av nevropatisk smerte, samt generalisert angst, er også demonstrert for pasienten #309, basert på grovt opphøyet konsentrasjonen (64 x) over de anbefalte Cut-off nivåer (figur 2D). Det er imidlertid ikke oppdaget i de ni andre pasienten urinprøver analysert i samme kjøre. I likhet med andre skjermen-positive tilfeller, injeksjon #4, comigrates med pregabalin-d6, som er inkludert i alle urinprøver analysert av MSI-CE-MULTIPLE Sclerosis.

Figur 2: en rekke utdraget ion electropherograms (EIE) for representant skjermen-positive urin dopingtest resultater fra en kohort av 10 klinisk deprimerte pasienter som bekreftet når bruker MSI-CE-MS, som inkluderer en 84-stoff panel på anbefalt Cut-off nivå, injisert som første eksempel injeksjon posisjon som intern referanse/QC. (A) EIE overlegg tilsvarer metadon-d3, som comigrates med metadon, utheving at bare en urinprøve (injeksjon posisjon #9) forhøyede metadon konsentrasjoner langt overskrider cut-off nivået. (B) EIE overlegg tilsvarer amfetamin-d3, som comigrates med amfetamin, utheving at bare en urinprøve (injeksjon posisjon #11) forhøyede konsentrasjoner over cut-off nivåer. (C) EIE overlegg tilsvarer venlafaxine-d6, som comigrates med venlafaxine, utheving at bare en urinprøve (injeksjon posisjon #6) forhøyede konsentrasjoner over cut-off nivåer. (D) EIE overlegg tilsvarer pregabalin-d6, som comigrates med pregabalin, utheving at bare en urinprøve (injeksjon posisjon #4) forhøyede grovt konsentrasjoner overstiger cut-off nivåer. Alle urinprøver ble analysert rett etter en femdoblet fortynning i deionisert vann sammen med tillegg av en tilsvarende d-(når tilgjengelig). En skjerm-positive resultatet i MSI-CE-MULTIPLE Sclerosis tilsvarer et stoff som comigrates med d-ISs med en lav masse feil (< 5 ppm) og den riktige molekylære formelen, som konsentrasjon overskrider cut-off som analysert i samme løp som intern referanse/QC. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Absolutt kvantifiseringen DoA og deres metabolitter oppnås også ved MSI-CE-MULTIPLE Sclerosis basert på eksterne kalibrering kurver, bruker referanse calibrant standarder for DoA som følger raskt i et enkelt løp. For eksempel den serielle fortynning av en 84-stoff calibrant blanding med en matchende d-er på en fast konsentrasjon gir en pålitelig kvantitativ analyse i komplekse urinprøver. Dette kompenserer for potensielle matrix-indusert ion undertrykkelse eller ekstrautstyr, men også for variasjoner i injeksjon volumet i kapillær mellom utvalgene. I tilfeller når en samsvarende d-er er kommersielt tilgjengelig eller kostnadseffektive uoverkommelige for visse DoA, et surrogat er brukes for data normalisering, som en d-er fra samme stoffet klasse eller en syntetisk sammensatte ikke funnet i urin (F-Phe), som vist tidligere ¹⁴. representant EIEs og eksterne kalibrering kurver for Oksykodon vises i figur 3A, B. og for citalopram i Figur 3 c, D. Dette er vidt foreskrevet smertestillende og Antidepressiva, henholdsvis med mulig. Relativ ion svar forhold til deres matchende d-er måles. I dette tilfellet en seriell injeksjon konfigurasjon i MSI-CE-MS, som består av fem ulike calibrants, analyseres i duplikat i et enkelt løp sammen med en syntetisk urin tomt. Samlet, god linearitet (R² > 0.990) over en 20-fold konsentrasjon området ble oppnådd med tilstrekkelig sensitivitet for påvisning av DoA og deres metabolitter (dvs., kationisk alkaloider) 84-stoff panelet ¹⁴. i alle tilfeller narkotika metabolitter oppdages som deres protonerte molekylær ion [MH⁺] over deres screening cut-off begrenser (> 50 ng/mL), med unntak av visse Sure/nøytral legemidler som har en dårlig ionisering effektivitet under den positivt ion-modus, som cannabinoider (f.eksTHC-COOH), barbiturater (f.ekssecobarbital) og carbamates (f.ekscarisoprodol).

Figur 3: en rekke utdraget ion electropherograms (EIE) for kvantifisering av representant DoA. Dette gjøres ved å generere eksterne kalibrering kurver basert på deres relative ion svar forhold med en matchende d-er over en 20-fold lineær dynamiske område. (A) kopiere injeksjon av en fem-punkts kalibrering kurve for Oksykodon calibrants Oksykodon-d3 og en tom. (B) eksterne kalibreringskurven for Oksykodon, følge lineær regresjon å utlede følsomhet (stigningstallet) og linearitet (R²), med feilfelt som representerer ±1σ (n = 4). (C) kopiere injeksjon av en fem-punkts kalibrering kurve for citalopram calibrants, citalopram-d6 og en tom. (D) eksterne kalibreringskurven for citalopram, følge lineær regresjon å utlede følsomhet (stigningstallet) og linearitet (R²), feil barer representerer ±1 SD (n = 4). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Discussion

Vanlig brukt kromatografiske separasjoner er vanligvis avhengige av en enkelt prøve injeksjon per kjørt, som etterfølges av en gradient tilsettes for å løse komplekse narkotika blandinger og justering av kolonnen. Disse kravene fundamentalt begrense utvalg ytelse og plikt syklus selv når du bruker optimal kolonnen bytte programmer. I denne sammenheng, høyt volum urin drug analyse for arbeidsplassen, toksikologi eller terapeutiske overvåking programmer av GC--MS-/ MS og stadig, LC--MS-/ MS er dermed utføres parallelt, men brukes fortrinnsvis som et andre lag eller bekreftende teste når nødvendig (dvs., juridiske eller medisinske sammenheng). Dette er på grunn av mye høyere investeringer og driftskostnader, samt komplikasjoner med dataanalyse når sammenligne analyserte på flere instrumental plattformer innen akkreditert laboratorium prøver. Resultatet fortsatt immunanalyser Hovedmetode for rutinemessig narkotikarelaterte screening tross utsatt for falske positiver og USANN-negativer blant mange narkotika klasser, med begrenset tilgang til antistoff reagenser for nye syntetiske medikamenter. Tidligere studier har vist at multiplex separasjoner basert på MSI-CE-MULTIPLE Sclerosis tilbyr en enkel løsning for å forbedre utvalget gjennomstrømningen til en størrelsesorden. I tillegg gir denne tilnærmingen for design av romanen data arbeidsflyter for biomarkør oppdagelsen med høy kvalitet basert på gjennomførelsen effektiv satsvis og kvalitetskontroll^12,13,14. Men forkorter innføringen av 10 eller flere serielle etter injeksjoner i MSI-CE-MULTIPLE Sclerosis den effektive kapillære lengden forpliktet til høy effektivitet separasjoner, noe som kan kompromittere selektivitet når du analyserer DoA og deres metabolitter i menneskelige urin.

Her, innført vi en electrokinetic injeksjon av BGE etter hver etter eksempel injeksjon, slik at avstanden utnytter full kapillær lengden (120 cm), dermed forbedre oppløsningen på stoffet Isobarene/isomerene ved full-scan datainnsamling av TOF-MS (figur 1A). I forhold til en siste rapport¹⁴oppnås bedre oppløsning for flere viktige isobar/isomere DoA og deres metabolitter, som er kritisk når screening for store narkotika paneler. For eksempel ble oppløsningen for flere viktige strukturelle/funksjonelle gruppen isomerene realisert, inkludert tre analoge opioider narkotika/metabolitter (figur 1B), to urelaterte opioider Isobarene (figur 1 c) og to metamfetamin posisjonelle isomerene (figur 1 d). I alle tilfeller er eksempel carry-over fra føljetong injeksjon av ulike calibrant løsninger innen samme kjøre ikke betydelig som bekreftes av en negativ urin kontroll/tom. I tillegg forbedret oppløsning er også innsett for flere kryss-forstyrrelser med visse d-ISs med isobar narkotika panelet, som cotinine-d3 og 3,4-methylenedioxyamphetamine (MDA), EDDP-d3 og imipramin, norfentanyl-d5 og Ketamin, kodein-d6 og sertraline, og kokain-d3 og zolpidem. Dette resultatet er utvidet til andre isobar forstyrrelser narkotika panelet som var bedre løst i denne studien (f.eksnoroxycodone/oxymorphone, normeperidine/metylfenidat), samt store bakgrunn urin forstyrrelser (f.eks , i kildekode fragmentere ioner av creatinine med amfetamin)¹⁴. Tilgang til to ortogonale parametere å tilfredsstille antatte identifisering av en bestemt DoA er faktisk avgjørende for å redusere false-positiv på grunn av isobar forstyrrelser, nemlig nøyaktig masse kombinert med comigration med d-ISs. Også gjenkjenning av ett eller flere biotransformed metabolitter av overordnede innenfor samme prøven, som hydroxylated, demethylated eller intakt glucuronide narkotika conjugate(s), legger ytterligere tillit mot narkotika identifikasjon mens utvide vinduet for gjenkjenning.

Anbefalte cut-off nivåene for urin narkotikarelaterte screening varierer for ulike klasser av DoA (alt fra 50 til 1000 ng/mL) avhengig av farmakokinetikken, toksisitet, og bakgrunnen forstyrrelser, for å redusere metoden bias basert på retningslinjer fra Rusmiddelmisbruk og psykiske tjenester administrasjon (SAMHSA)¹⁴. Potensialet for MSI-CE-MS å oppdage og identifisere ulike klasser av DoA direkte i urin med minimal eksempel forbehandling ble brukt til en gruppe klinisk deprimerte pasienter med kjente resept posten. Definitive identifikasjon av metadon (reseptbelagte), amfetamin (nonprescribed/ulovlig), venlafaxine (reseptbelagte) og pregabalin (reseptbelagte) i utvannet, men nonhydrolyzed, urinprøver ble demonstrert ved MSI-CE-MULTIPLE Sclerosis. Den var basert på en direkte sammenligning av et medikament oppdaget i en bestemt injeksjon posisjon i forhold til 84-stoff blandingen i første eksempel stilling ved de anbefalte screening cut-off nivå som fungerer som en intern referanse/QC og positiv kontroll (Figur 2). Også absolutt medikamentfri kvantifisering er mulig ved hjelp av eksterne kalibrering kurver (Figur 3) basert på ion svar forholdet målt for et stoff i forhold til sin d-er. I motsetning til mest brukt kromatografiske separasjoner, det er ingen deuterium effekt påvirker overføring tid forskjellene mellom en d-er og dens nondeuterated narkotika siden de har tilsvarende electrophoretic mobilities i gratisløsning CE. Migrasjon virkemåten til DoA er faktisk nøyaktig modellert i CE, basert på deres grunnleggende mekanisk-egenskaper/kjemisk struktur, nemlig molekylær volum og effektiv kostnad (pK_en)¹⁴. Siden mange legemidler gjennomgår også betydelige sekundære metabolisme før utskillelse i urin (f.eksmorfin glucuronide), screening cut-off nivåer krever justering som deres konsentrasjonene er lavere enn forventet sammenlignet metoder som bruker enzym hydrolyse for totale gjenkjenning. En stor fordel av "fortynne-og-shoot" urin narkotikatesting, i tillegg til å redusere kostnader/tid, prøve-håndtering, og en potensielle skjevhet eller satsvis variasjoner på grunn av ufullstendige enzym hydrolyse, er at presumptive skjermen-positive tilfeller blir ytterligere bekreftet av den gjenkjenning av ett eller flere relaterte narkotika metabolitter i samme utvalget. Dette gir også dypere innsikt i stoffet farmakokinetikken og optimal dosering krav for individuelle pasienter samtidig forbedre gjenkjenning for "rask" metabolizers eller foreskrevet/illegale rusmidler med korte halv-liv. I tillegg comigration med tilsvarende d-spiller to viktige funksjoner for pålitelig narkotikarelaterte screening når bruker MSI-CE-MULTIPLE Sclerosis, nemlig den identifiserer nøyaktig utvalg injeksjon posisjon (dvs., pasient #) mens også korrigerer for forskjeller i ion svar/injeksjon volumer for forbedret presisjon og nøyaktighet.

Fremtiden fungere som mål å utvikle tilpasset programvareverktøy å Letter automatisert databehandling av multiplex separasjoner koplet til HRMS som kreves for høyt volum urin-narkotikatesting med QC/QA. Strenge validering av MSI-CE-MS for bredspektret screening av DoA vil også bli undersøkt en større kohort av høy-risiko pasienter for å objektivt vurdere foreskrevet narkotika etterlevelse og potensielle misbruk/substitusjon som kan kompromittere behandling effekt, pasientens sikkerhet eller psykiatrisk evaluering/diagnose. En supplerende analyse av Sure/anionic klasser av DoA og deres metabolitter vil også bli fremført av MSI-CE-MULTIPLE Sclerosis under alkaliske forhold med negative ion modus gjenkjenning som kreves for omfattende screening av naturlige/syntetisk cannabinoider. Dette er viktig gitt truende folkehelsen implikasjonene av legalisering av marihuana rekreasjons over Canada og flere amerikanske stater. En stor fordel av full skanning datainnsamling av TOF-MS er at retrospektiv av prøver kan utføres selv når urin prøver er ikke lenger tilgjengelig for oppfølging testing, mens andre livsstil eller kosthold eksponeringer kan bli vurdert bedre forstå differensial Svar å bedøve terapi. I sammendraget tilbyr rask men presis narkotika overvåking metode av MSI-CE-MULTIPLE Sclerosis betydelige fordeler til konvensjonelle målrettet immunanalyser, samt direkte infusjon/ambient ionisering--MS-/ MS metoder som er utsatt for forstyrrelser/bias ved løsing utvidet paneler DoA og deres metabolitter i komplekse biologiske prøver inkrementelle kostnader.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
7100 Capillary Electrophoresis System	Agilent Technologies Inc.	G7100A	CE instrument used for separation of drug mixtures, desalting and anotation
6230 Series Time-of-Flight Mass Spectrometer	Agilent Technologies Inc.	G6230B	HRMS mass analyzer used for drug detection and anotation
CE-ESI-MS Sprayer Kit	Agilent Technologies Inc.	G1603A	CE/MS coaxial sheath liquid interface and capillary casette
1260 Infinity Isocratic Pump and Degasser	Agilent Technologies Inc.	G1310B	Isocratic pump to deliver sheath liquid/mass calibrant
MassHunter Workstation Data Acquisition Software (B.06.01)	Agilent Technologies Inc.	--	Software used for control of CE-MS system
MassHunter Qualitative Analysis Software (B.06.01)	Agilent Technologies Inc.	--	Software used for processing of CE-MS data
Shortix Capillary Cutter	Agilent Technologies Inc.	5813-4620	Cutting tool with diamond blade used to cut capillaries
Capillary Window Maker	Microsolv Inc.	07200-S	Burner with 7 mm window size to remove polyimide coating from CE capillary
Flexible Fused-silica Capillary Tubing	Polymicro Technologies Inc.	TSP05375	Standard polyimide coated fused-silica capillary for CE separation (50 micron ID; 360 micron OD)
Drug standards, deuterated internal standards, synthetic urine matrix (SURINE)	Cerilliant Inc.	Miscellaneous	Certified drugs of abuse reference standards (86 drug panel) with 48 deuterated internal standards and negative urine control (Surine)