Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

تستخدم في المختبر وفي خلايا الشكل للتحقيق في جزيء الصغيرة التي يسببها مرناً قبل إجراء تغييرات هيكلية

Published: January 30, 2019 doi: 10.3791/59021
Automatic Translation
1, 2, 1
1Calibr, The Scripps Research Institute, 2Department of Integrative Structural and Computational Biology, The Scripps Research Institute

Summary

بروتوكولات مفصلة لكلا أسيليشن في المختبر وفي خلايا انتقائية 2-هيدروكسيل تحليلها بواسطة التمهيدي ملحق (الشكل) تجارب لتحديد هيكل تسلسل قبل مرناً لمصلحة حضور جزيء صغير استهداف الجيش الملكي النيبالي الثانوية المعروضة في هذه المقالة.

Abstract

عملية تطوير العقاقير للجزيئات الصغيرة التي تستهدف الجيش الملكي النيبالي، توضيح التغييرات الهيكلية على تفاعلها مع تسلسل الحمض النووي الريبي الهدف هو المطلوب. نحن نقدم هذه الوثيقة التفصيل في المختبر وانتقائية في الخلية 2-هيدروكسيل أسيلاتيون تحليلها من قبل تمديد التمهيدي البروتوكول (الشكل) لدراسة التغير الهيكلي حضور دواء تجريبي لضمور العضلات الشوكي (SMA)، البقاء على قيد الحياة من الجيش الملكي النيبالي الخلايا العصبية الحركية (العليا)-C2, وفي إكسون 7 من قبل-مرناً الجينات SMN2. في الشكل في المختبر، وهو تسلسل الحمض النووي الريبي من 140 النيوكليوتيدات التي تحتوي على SMN2 إكسون 7 نسخها من قبل بوليميريز الحمض النووي الريبي T7 ومطوية بحضور الجالي-C2 وتعديله فيما بعد بكاشف أسيليشن خفيف 2 '--أوه، إيميدازوليدي حمض 2-ميثيلنيكوتينيك (ناي). هذا adduct 2 '--يا ناي هو كذلك سبر طريق 32تمديد التمهيدي المسمى ف وحلها بالتفريد جل polyacrylamide (صفحة). على العكس من ذلك، أسيليشن 2 '-OH في الشكل في الخلية يأخذ مكان في الموقع مع الجالي-C2 ملزمة الخلوية الحمض النووي الريبي في الخلايا الحية. ثم اتسع نطاق تسلسل مرناً قبل إكسون 7 في الجينات SMN2، جنبا إلى جنب مع الطفرات المستحثة بالشكل في تمديد التمهيدي، بكر ويخضع لتسلسل الجيل القادم. المقارنة بين المنهجيتين، الشكل في المختبر هو وسيلة أكثر فعالية من حيث تكلفة ولا تتطلب الطاقة الحسابية لتصور النتائج. ومع ذلك، الطراز المستمدة من شكل الجيش الملكي النيبالي في المختبر أحياناً ينحرف عن هيكل الثانوي في سياق خلوية، يرجح أن سبب فقدان جميع التفاعلات مع الحمض النووي الريبي ملزم البروتينات. الشكل في الخلية لا تحتاج إلى مكان مواد مشعة وغلة بنية الحمض النووي الريبي ثانوي أكثر دقة في سياق الخلوية. وعلاوة على ذلك، الشكل في الخلية المطبقة عادة لتسلسل مجموعة من الجيش الملكي النيبالي أكبر (~ 1,000 النيوكليوتيدات) باستخدام تسلسل الجيل القادم، مقارنة في المختبر الشكل (~ 200 النيوكليوتيدات) التي عادة ما تعتمد على تحليل صفحة. في حالة المستمدة من إكسون 7 في SMN2 قبل-مرناً، الشكل في المختبر وفي خلايا الحمض النووي الريبي النماذج مشابهة لبعضها البعض.

Introduction

أسيليشن انتقائية 2-هيدروكسيل تحليلها بواسطة الملحق التمهيدي (الشكل) أسلوب لقياس الحركية من كل النوكليوتيدات في تسلسل الحمض النووي الريبي للفائدة وتوضيح هيكل الثانوية في قرار واحد-النوكليوتيدات1. المنهجيات الشكل، سواء في الظروف المختبرية2،3،4 (تنقية الحمض النووي الريبي في نظام المخزن مؤقت معرفة) وفي خلايا الثدييات الحية5،6، وقد وضعت للتحقيق الثانوي هيكل تسلسل متوسط طول الحمض النووي الريبي (عادة < النيوكليوتيدات 1,000 للشكل في الخلية و < النيوكليوتيدات 200 للشكل الأنبوبي). أنها مفيدة بشكل خاص لتقييم التغيرات الهيكلية في مستقبلات الحمض النووي الريبي عليها ملزمة للتفاعل الحمض النووي الريبي جزيء صغير والايضات2،4،،من78 ودراسة الإجراءات آليا من جزيئات الحمض النووي الريبي استهداف خلال المخدرات التنمية9،10.

اكتشاف المخدرات تستهدف الجيش الملكي النيبالي مؤخرا لفت الانتباه في المختبرات الأكاديمية و الصناعة الصيدلانية11،12 عبر مختلف النهج والاستراتيجيات13،،من1415 ،16. وتشمل الأمثلة الأخيرة الجزيئات الصغيرة التي تستهدف الجيش الملكي النيبالي للاستخدام السريري العقاقير التجريبية هيكلياً متميزة LMI-07017 و RG-791618،19، لضمور العضلات الشوكي (SMA)، الذي أظهر واعدة النتائج في مرحلة التجارب السريرية الثاني20. كل الجزيئات وقد أثبت لبقاء الهدف من الخلايا العصبية الحركية (الجالي) قبل 2-مرناً وتنظيم عملية الربط SMN2 الجينات6،،من1721. أظهرنا سابقا التطبيق في المختبر والشكل في الخلية في دراسة التغيرات الهيكلية المستهدفة الحمض النووي الريبي حضور تمثيلي للنمو الحقيقي-7916 المعروفة باسم C2 الجالي6.

من حيث المبدأ، التدابير شكل معدل أسيليشن 2 '--يا كل نوكليوتيد تسلسل الحمض النووي الريبي حضور المبالغ الزائدة من كاشف أسيليشن التبريد الذاتي بطريقة غير متحيزة. الكاشف أسيلاتيون ليست مستقرة في الماء، وله فترة قصيرة (مثل، T1/2 = 17 s 1-الميثيل-7-نيترويساتويك الخل؛ أو 1 م 7، ~ 20 دقيقة إيميدازوليدي حمض 2-ميثيلنيكوتينيك، أو ناي)22 وعدم الاكتراث بالهوية قواعد23. هذه النتائج في أسيليشن مواتية أكثر المجموعات 2 '--أوه القواعد المرنة، التي يمكن أن تتحول إلى تقييم دقيق لديناميات كل النوكليوتيدات. على وجه التحديد، النوكليوتيدات في قاعدة زوج عادة أقل رد الفعل من أحد مزاوج إلى كاشف تعديل 2 '--أوه، مثل ناي و 1 م 7.

النظر في مصدر القالب الجيش الملكي النيبالي، والتي يجري فيها أسيليشن 2 '--يا، ويمكن عموما تصنيف الشكل في الشكل في المختبر وفي الخلية. في استخدامات الأنابيب الشكل T7 المنقي نسخها الجيش الملكي النيبالي ويفتقر إلى سياق خلوية في تصاميم تجريبية. في الشكل في الخلية، وتحدث كل من الجيش الملكي النيبالي قالب النسخ وأسيليشن 2 '--يا داخل الخلايا الحية؛ ولذلك، يمكن أن الخص النتائج النموذج الهيكلي الجيش الملكي النيبالي في سياق خلوية. قد أحيلت إلى الشكل في الخلية كما هو الحال في فيفو الشكل للشكل في الخلايا الحية في الأدب24. حيث لم يتم تنفيذ هذه التجربة في حيوان، نحن وصف هذه التجربة على الشكل في الخلية للتأكد من دقتها.

كما تختلف أيضا استراتيجيات لمرحلة التمديد التمهيدي للشكل في المختبر وفي الخلية. في الشكل في المختبر، وتوقف النسخ العكسي في موقف أسيليشن 2 '--يا حضور Mg2 +. ولذلك يظهر ملحق التمهيدي 32فالمسمي كعصابة في جل polyacrylamide التفريد (صفحة) وكثافة الفرقة يكون متناسباً مع معدل أسيليشن1. في الشكل في الخلية، وينشئ النسخ العكسي الطفرات العشوائية في 2 '--أوه adduct موقف حضور Mn2 +. معدل كل النوكليوتيدات حيث يمكن التقاطها بواسطة في عمق الجيل التالي التسلسل، ويمكن ثم حساب مفاعليه الشكل في قرار واحد-النوكليوتيدات.

مشكلة محتملة للشكل في الخلية هو نسبة الإشارة إلى الضوضاء منخفضة (أي أغلبية المجموعات 2 '--يا معدلة، بينما تسلسل غير معدلة تحتل أكثر من القراءة في تسلسل الجيل القادم). في الآونة الأخيرة، طريقة لإثراء 2 '--أوه تعديل الحمض النووي الريبي، المشار إليها كما هو الحال في فيفو انقر فوق الشكل (إيكشابي)، وضعه مختبر تشانغ25. قد يكون هذا الأسلوب الإثراء مفيدة في دراسة الجزيئات الصغيرة ضعيفة مثل التفاعلات الحمض النووي الريبي، خاصة في استجواب على نطاق الترنسكربيتوم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1-في المختبر الشكل

ملاحظة: يتم تعديل البروتوكول من البروتوكول المنشورة1.

  1. إعداد قالب الحمض النووي الريبي
    ملاحظة: وأمرت القالب للنسخ T7 اصطناعية مزدوج-الذين تقطعت بهم السبل الحمض النووي (dsDNA) وتضخيمه بالإدراج أما إلى متجه كولاي التي يحمل زوج فريدة من مواقع endonuclease تقييد اكوري/بامهي، مثل pET28a، أو بواسطة PCR. ويتضح في البروتوكول للتضخيم PCR أدناه.
    1. خلط المواد التالية: 50 ميكروليتر من سيد بكر مزيج (انظر الجدول للمواد)، 2 ميكروليتر لكل التمهيدي في 10 ميكرومترات (انظر الجدول 1 لتسلسل)، 200 نانوغرام قالب دسدنا في ميكروليتر 2 و 3 ميكروليتر من ثنائي ميثيل سلفوكسيد ([دمس])، وميكروليتر 41 ح2قاسمة سين إلى بكر اثنين أنابيب (كل أنبوبة تحتوي على 50 ميكروليتر من خليط رد الفعل).
    2. إعداد cycler الحرارية كما يلي: المرحلة 1) 95 درجة مئوية لمدة 30 ثانية؛ المرحلة 2) 95 ° ج ل 20 ق؛ المرحلة 3) 56 درجة مئوية 20 s; المرحلة 4) 72 درجة مئوية 20 s; حلقة المرحلة 5) العودة إلى المرحلة 2 لدورات 30؛ المرحلة 6) 72 درجة مئوية لمدة 3 دقائق؛ والمرحلة 7) لا حصر لها عقد في 4 درجات مئوية حتى الخطوة التالية.
    3. تنقية أمبليكون بكر باستخراج الشرائح هلام (انظر الجدول للمواد واستخدام البروتوكول الخاص بالشركة المصنعة). الوت المنتج الحمض النووي مع 35 ميكروليتر من المخزن المؤقت تريس يدتا (TE)، التي تحتوي على 10 ملم تريس (pH 8.0) و 1 مم يدتا، تؤتي من 0.1 – 0.5 ميكروغرام/ميكروليتر القالب. تطبيع القالب الحمض النووي المنقي إلى 0.10 ميكروغرام/ميكروليتر.
      ملاحظة: بشكل اختياري، قد حلل نوعية القالب على 1.8% [اغروس] هلام التفريد مع 0.10 ميكروغرام من الحمض النووي. ومن المتوقع عصابة واحدة من الحمض النووي القالب المطلوب في الهلام.
    4. إعداد النسخ T7 رد فعل (الحجم الإجمالي 40 ميكروليتر) بإضافة المواد التالية في أنبوب PCR: ميكروليتر 4 من 10 س رد فعل المخزن المؤقت، 4 ميكروليتر من ATP، 4 ميكروليتر من الأداء النظري المركب، 4 ميكروليتر من غتب، ميكروليتر 4 من UTP، ميكروليتر 4 إنزيم T7 (انظر الجدول للمواد) ، 4 ميكروليتر من amplicon بكر المنقي من الخطوة 1.1.3 (0.4 ميكروغرام)، و 12 ميكروليتر من ثنائي إثيل بيروكاربوناتي (ديبك)-المياه المعالجة. مزيج من بيبيتينج صعودا وهبوطاً 4 x. احتضان في 37 درجة مئوية ح 4 – 16 في cycler حرارية أو حاضنة 37 درجة مئوية.
      ملاحظة: ابدأ في إعداد الخطوة 1.1.6 بينما رد الفعل في خطوة 1.1.4 الجارية.
    5. إضافة 2 ميكروليتر من الدناز، ومزيج من بيبيتينج صعودا وهبوطاً 4 x، واحتضان في 37 درجة مئوية ل 15 دقيقة المزيج بتساوي حجم 2 × تريس-بورات-يدتا (TBE)-اليوريا عينة المخزن المؤقت (انظر الجدول للمواد). الحرارة عند 70 درجة مئوية لمدة 3 دقائق لإلغاء تنشيط.
    6. يختلط زجاجة خالية رناسي، 75 مل محلول الاكريلاميد/بيساكريلاميدي 40% (فيها، انظر الجدول للمواد)، 180.2 ز يوريا، و 50 مل من 10 x TBE العازلة (رناسي خالية، انظر الجدول للمواد). وضع الزجاجة على شاكر مداري (250 لفة في الدقيقة) حتى يتم حل جميع بلورات اليوريا (قد يستغرق مدة تصل إلى 2 حاء). ضبط حجم الصوت إلى 500 مل مع المياه المعالجة ديبك. تصفية الحل مع غشاء 0.2 ميكرومتر (انظر الجدول للمواد).
      ملاحظة: في هذه العملية، وتجنب استخدام براق وآثاره-بار للحيلولة دون تلوث رناسي. ويمكن تخزين الحل عند 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى سنة واحدة.
    7. تنظيف ألواح الزجاج التفريد اثنين بحجم مناسب (16.5 سم x 24 سم) مع المياه و 70% EtOH استخدام قطعة من مسح ورقة. محاذاة اللوحات مع زوج من الفواصل 2.0 مم (اللوحة مع سطح siliconized تواجه إلى الداخل) وختم على حافة اللوحات مع الشريط. زاوية اللوحة لمنع تسرب الشريط مزدوجة.
    8. في كوب، مزيج 200 مل من محلول اكريلاميد من الخطوة 1.1.6 و 2.0 مل من محلول فوق كبريتات الأمونيوم 10% 100 ميكروليتر من تيتراميثيليثيلينيدياميني (تيميد) مع تلميح ماصة رناسي خالية بالتحريك السريع للميل س. 30 لوحات على قطعة من غطاء benchtop وصب الحل من فجوة اللوحات. اضغط على اللوحة رفع أي فقاعات وإرساء اللوحة مسطحة على الغطاء benchtop. فورا إدراج المشط والسماح للهلام بلمرة ح 1 على الأقل.
      ملاحظة: إذا كان الجل لاستخدامها في اليوم التالي، تغطي الجزء العلوي من الجل مع قطعة من منشفة ورقية رطبة والتفاف مع أكبر قطعة من البلاستيك. ضع الكذب شقة في 4 درجات مئوية.
    9. قم بإزالة الشريط والمشبك اللوحة في موقف التفريد. إزالة المشط وإضافة كافية من المخزن المؤقت x TBE 1 في أعلى وأسفل الخزان. قبل تشغيل للهلام لمدة 30 دقيقة في 20 دبليو
      ملاحظة: اختيارياً، إذا كان المحتوى من الجيش الملكي النيبالي المطلوب ~ 90 في المائة أو أكثر، يمكن استخدام هلام المصغر في الاستعاضة عن جل محضرة.
    10. يغسل كل من الآبار التحميل من بيبيتينج صعودا وهبوطاً مرتين مع السائل في الخزان. إضافة الحمض النووي الريبي الخام من الخطوة 1.1.5 إلى الآبار. تشغيل الهلام في 20 ث حتى الصبغ زايلين FF زيلين نفط (أزرق فاتح) يمر حوالي ثلثي طول للهلام (~ 60 دقيقة).
      ملاحظة: التأكد من تحميل أي أكثر من ثلث ارتفاع البئر (استخدام الآبار متعددة إذا لزم الأمر).
    11. تزج الهلام في المخزن المؤقت x TBE 1 مع المضيفين تمييع الآمنة صبغ (انظر الجدول للمواد) في حاوية كبيرة بما يكفي للجل. وضع الحاوية على شاكر مدارية لمدة 5 دقائق في 80 لفة في الدقيقة.
    12. تحت الأشعة فوق البنفسجية، تحديد الفرقة الجيش الملكي النيبالي المطلوب وخفض سرعة عصابة رقيقة من الجل باستخدام شفرة حلاقة نظيفة. وضع شرائح جل 1 – 2 في أنبوب 1.7 مل.
    13. استرداد الجيش الملكي النيبالي من شريحة هلام شطف السلبي. إضافة المزيج الملائم شطف/هطول الأمطار (مل ~0.3 كل شريحة) لكل أنبوبة: 0.3 متر نواك (pH 5.2)، 2.5 م ليكل، يدتا 1 مم، 0.1% دوديسيل كبريتات الصوديوم (الحزب الديمقراطي الصربي) في المياه المعالجة ديبك. قم بتدوير الأنبوب الذي يحتوي على splice(s) هلام في 4 درجات مئوية عن ح 16.
      ملاحظة: هو معدل استرداد نموذجية ~ 75% في هذه الخطوة. لزيادة الغلة، وجمع في الوينت إزالة وإضافة نفس حجم المخزن المؤقت شطف، ثم كرر هذه الخطوة.
    14. الجمع بين الوينت في أنبوب 1.7 مل جديدة. إضافة 2.5 × EtOH المثلج وعكس الأنابيب ست مرات لخلط السائل، ووضع الأنابيب في-80 درجة مئوية على الأقل 1 ح.
    15. أجهزة الطرد المركزي لمدة 10 دقيقة 10 آلاف س ز و 4 درجة مئوية. بعناية إزالة المادة طافية بيبيتينج. أغسل بيليه الجيش الملكي النيبالي بإضافة 80% EtOH (1 مل كل أنبوب)، دوامة 15 ثانية، وأجهزة الطرد المركزي لمدة 10 دقيقة 10 آلاف س ز و 4 درجة مئوية.
    16. إزالة المادة طافية وأيردري بيليه الحمض النووي الريبي للحد الأدنى 5 إضافة 50 ميكروليتر من المياه خالية من رناسي ومزيج من بيبيتينج صعودا وهبوطاً 10 مرات. تطبيع تركيز الحمض النووي الريبي إلى 0.10 ميكروغرام/ميكروليتر. مخزن تنقية الجيش الملكي النيبالي في-80 درجة مئوية.
      ملاحظة: عدم الإفراط الجاف بيليه الجيش الملكي النيبالي.
    17. بشكل اختياري، لتحليل النوعية من الجيش الملكي النيبالي، تمييع 1 ميكروليتر (100 نانوغرام) من الحمض النووي الريبي من الخطوة 1.1.16 في 5 ميكروليتر من الماء وتخلط مع 5 ميكروليتر من اليوريا TBE x 2 عينة المخزن المؤقت. ثم، من الحرارة عند 70 درجة مئوية 3 دقيقة والتحميل على 6% يوريا TBE هلام المصغر.
      1. تشغيل الهلام 180 الخامس حاء 1 إجراء في تلطيخ كما فعلت في الخطوة 1.1.11. تصور الهلام مع الأشعة فوق البنفسجية في نظام تصوير. ومن المتوقع عصابة واحدة في الطول المطلوب.
  2. إعداد ال 32التمهيدي المسمى ف
    1. قم بإعداد رد فعل بخلط المواد التالية: 10 ميكروليتر من γ-32ف-ATP (وزارة التجارة والصناعة ~1.5، ~ 25 ميكرومتر، انظر الجدول للمواد)، 2 ميكروليتر من النسخ العكسي (RT) التمهيدي (100 ميكرومتر، لتسلسل، انظر الجدول 1)، 2 ميكروليتر من 10 x T4 بولينوكليوتيدي كيناز (بنك) رد فعل المخزن المؤقت، 1 ميكروليتر من بنك T4 (انظر الجدول للمواد)، و 5 ميكروليتر من المياه خالية من رناسي. احتضان في 37 درجة مئوية ح 1.
      تنبيه: الحماية المناسبة هو الحاجة إلى اتخاذ خطوات 1.2-1.5 في أماكن العمل المأذون به للمواد المشعة.
    2. إلغاء تنشيط الحرارة لمدة 20 دقيقة عند 65 درجة مئوية. إضافة العينات على عمود الملحي، وأجهزة الطرد المركزي في غ س 1,000 لمزيج 1 كحد أدنى في الوينت مع 25 ميكروليتر من 2 x اليوريا TBE العازلة عينة. .
      ملاحظة: تخزين النفط الخام المنتج المسمى في-20 درجة مئوية إذا كان ليس أن تكون تنقية فورا.
    3. تشغيل هلام اكريلاميد 10% في 20 ث عن ح 1.
      تنبيه: تحميل ال 32التمهيدي المسمى ف من الخطوة 1.2.1 على الجل وتجنب نزيف النشاط الإشعاعي في الخزان العلوي. لا تقم بتحميل أكثر من ثلث ارتفاع البئر لضمان عصابة رقيقة على الهلام (استخدام الآبار متعددة إذا لزم الأمر). يمكن أن يكون السائل في الخزان السفلي عالية الإشعاع.
    4. إزالة ألواح الزجاج للكاسيت جل ووضع الجل على قطعة من البلاستيك. طي الأغطية البلاستيكية لتغطية الجزء العلوي من جل جعل ساندويتش الغلق. ضع ساندويتش جل على شاشة فوسفور تنغستات كالسيوم وفضح مع أداة تصوير. صورة الجل مرة أخرى مع الضوء العادية لمعرفة أين حواف الهلام.
    5. استخدم برامج معالجة صور لتراكب الصورتين. قم بمحاذاة الجل إلى الصورة المطبوعة. استخدام شفرة حلاقة جديدة لقص الأشرطة المطلوب من الجل. وضع شرائح جل 1 إلى 2 في أنبوب 1.7 مل.
      ملاحظة: تأكد من أن الصورة المطبوعة بنفس حجم هلام الفعلية. مضاعفة التحقق من المحاذاة بالتصوير الجل بقايا مرة أخرى بعد الاستغناء عن الشريحة جل.
    6. استرداد التمهيدي 32ف المسمى باتباع الخطوات 1-1-13 إلى 1.1.16. تأخذ ميكروليتر 1.0 للحل في أنبوب 0.4 مل وتمييع التمهيدي مع المخزن المؤقت للشركة المصرية للاتصالات 1 x للحصول على النشاط الإشعاعي ميكروليتر 1.0 في ظهور ~ 100,000. تخزين المنقي 32التمهيدي المسمى ف في-80 درجة مئوية وحتى الجيش الملكي النيبالي 2 '--أوه تعديل رد فعل ولكن لمدة لا تزيد على 4 أسابيع.
  3. ربط جزيء صغير والتعديل 2 '--يا رنا
    1. لإعداد العينات الأربع، إضافة 8 pmol الجيش الملكي النيبالي في ميكروليتر 32 x 0.5 TE المخزن المؤقت إلى أنبوب 1.7 مل، الحرارة عند 80 درجة مئوية 2 دقيقة، وبارد الأداة الإضافية على الجليد لمدة 1 دقيقة على الأقل.
      ملاحظة: تستخدم المعادلة التالية لحساب تقريبي الوزن الجزيئي للحمض النووي الريبي: MW = (# القواعد) x 340 دا.
    2. إضافة 8 ميكروليتر من 5 × طي مزيج يحتوي على 500 مم حبيس (pH 8.0)، 20 مجكل2، و 500 ملم كلوريد الصوديوم. الكوة ميكروليتر 9 من خليط الحمض النووي الريبي في كل من بكر أربعة أنابيب وتسميتها #1--#4. أضف 1 ميكروليتر من 10% [دمس] في الأنبوب #1، 1 ميكروليتر من جزيء صغير يتركز الحل (10% [دمس]) في #2، 1 ميكروليتر من حل جزيء صغير المخفف (10% [دمس]) إلى #3، وميكروليتر 1 من المياه إلى #4.
    3. احتضان أنابيب PCR عند 37 درجة مئوية في cycler حرارية لمدة 30 دقيقة.
    4. الحق قبل رد فعل التعديل 2 '--أوه، تمييع 1 ميكروليتر من حل الأسهم ناي (2 م) مع 3 ميكروليتر من المياه المعالجة ديبك أن تسفر عن حل عامل 0.5 متر. دون تأخير، إضافة ميكروليتر 1 ناي يعمل الحل في أنابيب #1 و #2 و #3، و 1 ميكروليتر من 25% [دمس] في #4. احتضان عند 37 درجة مئوية في cycler حرارية لمدة 15 دقيقة.
    5. إضافة 100 ميكروليتر من شطف/هطول الأمطار مزيج (راجع الخطوة 1-1-13 للوصفة)، 2 ميكروليتر من الجليكوجين (15 ملغ/مل)، ونقل جميع السائل في كل أنبوبة PCR في أنبوب 1.7 مل. إضافة مل 0.34 من المثلج واقية من 200 EtOH (المجلد 3 x) في كل أنبوب. مزيج من فورتيكسينج 5 ق ومكان هذه الأنابيب في ثلاجة-80 درجة مئوية على الأقل ح 1.
      ملاحظة: وخلال هذه الفترة، البدء في إقامة جل التسلسل لاستخدامها في الخطوة 1.5.1.
    6. أجهزة الطرد المركزي لمدة 15 دقيقة في 14,000 س ز و 4 درجة مئوية. إزالة المادة طافية دون إزعاج بيليه الجيش الملكي النيبالي. أغسل بيليه الجيش الملكي النيبالي بإضافة 80% EtOH (0.5 مل في الأنبوب)، دوامة 15 ثانية، وأجهزة الطرد المركزي لمدة 15 دقيقة 000 20 شخص × ز و 4 درجة مئوية. إزالة المادة طافية مرة أخرى.
      ملاحظة: يمكنك بشكل اختياري استخدام عداد غايغر لضمان بيليه المشعة الاحتفاظ في الأنبوب.
    7. أيردري بيليه الحمض النووي الريبي ميكروليتر 9 إضافة 5 كحد أدنى من المياه خالية من رناسي ومزيج من بيبيتينج صعودا وهبوطاً 10 مرات.
      ملاحظة: عدم الإفراط الجاف بيليه الجيش الملكي النيبالي. ومن المتوقع هطول الأمطار جميع تحل في نهاية هذه الخطوة.
  4. علامة التمديد إعداد والتمهيدي
    1. نقل الجيش الملكي النيبالي معدلة إلى 4 أنابيب PCR جديدة وتسميتها #1--#4 كالسابق. إضافة 2 pmol تحكم الجيش الملكي النيبالي في ميكروليتر 7 من المياه المعالجة ديبك إلى 4 أنابيب PCR إضافية وتسميتها #5-#8. إضافة 2 ميكروليتر من التمهيدي راديولابيليد (الخطوة 1.2.6) في جميع الأنابيب ثمانية. الحرارة يصلب عند 65 درجة مئوية لمدة 5 دقائق، ثم تبرد مباشرة وصولاً إلى 4 درجات مئوية في cycler الحرارية.
    2. إضافة ميكروليتر 4 من 5 × RT المخزن المؤقت (انظر الجدول للمواد)، 1 ميكروليتر من ديثيوثريتول (DTT، 0.1 M)، و 1 ميكروليتر من مزيج دنتب (10 ملم في كل) لكل واحد من ثمانية أنابيب PCR.
    3. إضافة 2 ميكروليتر من تعامل ديبك ح2س إلى أنابيب #1--#4. إضافة 4 ميكروليتر من داتب (5 مم) وميكروليتر 4 من دتتب (5 ملم) 4 ميكروليتر من دكتب (5 مم) في أنابيب #5-#7، على التوالي. إضافة 1 ميكروليتر من دجتب (5 مم) وميكروليتر 3 من المياه المعالجة ديبك إلى أنبوب #8. ماصة أربع مرات لخلط.
    4. الحرارة في 52 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة في cycler الحرارية. أضف 1 ميكروليتر من المنتسخة العكسية (انظر الجدول للمواد)، ثم مزيج من بيبيتينج صعودا وهبوطاً أربع مرات. تبني رد فعل على 52 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة.
    5. إضافة 1 ميكروليتر من 5 م هيدروكسيد الصوديوم في كل من هذه الأنابيب يتحلل الجيش الملكي النيبالي. حرارة الأنابيب عند 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
    6. إضافة 5 ميكروليتر من 1 M HCl وتكرار هطول الأمطار الإيثانول (الخطوات 1.3.5 و 1.3.6)، باستثناء حذف الجليكوجين ونقل السوائل.
      ملاحظة: إهمال نتائج الخطوة 1.4.6 في منطقة التشويه الناتج عن عنصر في منتصف هلام المعروفة باسم "الجبهة ملح".
    7. أيردري بيليه الحمض النووي للحد الأدنى 5 إضافة 10 ميكروليتر من ح2س و 10 ميكروليتر من 2 x عينة من اليوريا TBE تحميل المخزن المؤقت وماصة صعودا وهبوطاً 10 مرات ريديسولفي. الحرارة عند 70 درجة مئوية للحد الأدنى 5 وضع الأنابيب على الجليد قبل تحميلها على الهلام.
  5. تحليل صفحة
    1. لإعداد جل تسلسل polyacrylamide 8%، اتبع الخطوات 1.1.6 ل 1.1.10 مع إدخال التعديلات التالية: استخدام 100 مل محلول الاكريلاميد/بيساكريلاميدي 40% (فيها) لتحضير حلاً اكريلاميد 8%، واستخدام التسلسل هلام (مثلاً، 46 ألواح الزجاج × 57 سم) مع فاصل 0.4 مم.
    2. تحميل 10 ميكروليتر من العينة من الخطوة 1.4.7. تشغيل الهلام على 65 ث لح 2 أو حتى صبغ أسفل يصل إلى 3/4 الجل.
      ملاحظة: تخزين بقية العينات في-80 درجة مئوية لتكرار إذا لزم الأمر.
    3. إزالة لوحة زجاج سيليكونيزيد العلوي بإزالة فاصل وإدراج بلطف ملعقة. ضع قطعة من الورق تصفية كبيرة لتغطية الهلام، واضغط برفق للسماح هلام التمسك بالورقة عامل التصفية. ابتداء من نهاية الجزء السفلي، رفع الورقة عامل التصفية وإزالة الجل من لوحة زجاج معا.
    4. ضع الجل جنبا إلى جنب مع أوراق الترشيح على قطعة من البلاستيك التي كبيرة بما يكفي لتغطية جل كله (ورق الترشيح مواجهة). نقل ساندويتش التفاف أوراق الترشيح/جل/البلاستيك إلى هلام أكثر جفافاً مع الجانب ورق الترشيح إلى الأسفل.
      تنبيه: لتجنب التلوث بالمواد المشعة، استخدام 3 إلى 4 أكثر من قطعة من ورق تصفية كبيرة بين ساندويتش جل وهلام أكثر جفافاً.
    5. الجاف للجل عند 70 درجة مئوية ح 1 مع وجود فراغ. نقل ساندويتش جل على كاسيت شاشة تخزين فوسفور أبيض صور. الكشف عن النشاط إشعاعي الجل للشاشة من أجل ح 4 – 16.
    6. مكان تخزين الفوسفور الشاشة على جهاز التصوير والمسح الضوئي مع القرار المتوسطة (~ 30 دقيقة).
      ملاحظة: إذا قطعة أثرية شبيهة بابتسامة غير موجود في صورة هلام، استخدام برامج تصحيح (مثلاً، الصفا) لمعالجة الصورة إلى نوعية النشر. ضع في اعتبارك أن لين علامة قياسية 1 نوكليوتيد أطول من الممرات التعديل 2 '--يا.

2-الشكل في الخلية

  1. التصميم التمهيدي
    ملاحظة: على عكس الشكل الأنبوبي، والشكل في الخلية لا تحتاج إلى تصميم كاسيت تعبير. ومع ذلك، ينبغي أن تستخدم مجموعة التمهيدي أمثل ويجب تقييمها قبل الشكل التجربة.
    1. إنشاء مالا يقل عن ثلاثة أزواج التمهيدي فريدة من نوعها بأداة تصميم التمهيدي المستندة إلى الانفجار (مثلاً، انفجار التمهيدي). لدراسة ما قبل-مرناً في الخلايا البشرية، حدد الجينوم البشري (لا الترنسكربيتوم) كقاعدة بيانات مرجعية في "التمهيدي زوج خصوصية التحقق من المعلمات". اختيار حجم أمبليكون في المجموعة من 200 – 1,000 زوج قاعدي (bp).
    2. استخراج الحمض النووي الجينومي من ~ 106 خلايا للاهتمام بأسلوب يستند إلى عمود دوران مع معاملة رناسي A وحوزتي ك (انظر الجدول للمواد واستخدام البروتوكول الخاص بالشركة المصنعة). تطبيع تنقية الحمض النووي في 0.1 ميكروغرام/ميكروليتر TE العازلة.
    3. إجراء اختبار PCR مع البروتوكول في الخطوات 1.1.1 و 1.1.2.
      ملاحظة: مجموعة التمهيدي المرجوة ينبغي أن تسفر عن عصابة واحدة على 1.8% [اغروس] هلام.
  2. خلية إعداد وتعديل 2 '--أوه
    ملاحظة: زيادة الوفرة من قبل-مرناً للفائدة، هو ترانسفيكتيد مينيجيني مع التسلسل الصحيح تحت المروج الفيروس المضخم للخلايا (CMV) للتعبير التأسيسي في الخلايا المضيفة.
    1. قبل الحارة المتوسطة الثقافة التي تحتوي على 10% مصل بقرى الجنين (FBS) والمضادات الحيوية 1 x المخلوط في تعديل النسر المتوسطة (دميم دولبيكو) عند 37 درجة مئوية. خلايا 293T البذور في 50% كونفلوينسي 24 ساعة قبل تعداء في الثقافة المتوسطة. تغيير في المتوسط إلى 2% FBS في دميم دون ح ~ 1 قبل تعداء المضادات الحيوية.
    2. إضافة 10 ميكروغرام من بلازميد مينيجيني إلى 100 ميكروليتر المصل انخفاض وسائط الإعلام (انظر الجدول للمواد) في 1 جيدا من صفيحة 96-جيدا. "الماصة؛" الحل صعودا وهبوطاً أربع مرات لخلط.
    3. إضافة 40 ميكروليتر من تعداء كاشف (انظر الجدول للمواد) إلى 100 ميكروليتر من المصل انخفاض وسائل الإعلام بشكل جيد آخر اللوحة. "الماصة؛" أعلى وأسفل أربع مرات لخلط. احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق.
    4. إضافة حل بلازميد كامل إلى تعليق الكاشف تعداء. "الماصة؛" أعلى وأسفل أربع مرات لخلط. احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة.
    5. إضافة الحمض النووي الكامل/خليط كاشف تعداء dropwise على سطح المتوسطة في جميع أنحاء الطبق. احتضان في 37 درجة مئوية ح 6 – 12.
    6. نضح المتوسطة وتغسل بلطف مرة واحدة مع 5 مل من المحلول الملحي مخزنة الفوسفات (برنامج تلفزيوني، درجة الحموضة 7.4، دون كاكل2 ومجكل2، انظر الجدول للمواد). تريبسينيزي الخلايا مع 3 مل من محلول التربسين. احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق.
    7. ضرب الطبق برفق فصل الخلايا من الجزء السفلي من الطبق. تحييد التربسين مع 6 مل من الثقافة المتوسطة. الطرد المركزي في 300 x ز لمدة 4 دقائق وإزالة المتوسطة.
    8. ريسوسبيند الخلايا6 ~ 10 لكل عينة في ميكروليتر 199 من رد فعل المتوسطة (1% FBS في دميم) ونقل تعليق خلية في لوحة 96-جيدا. احتضان الخلايا مع 1 ميكروليتر من حل العامل مركب أو ميكروليتر 1 من [دمس] في كافة عناصر التحكم الثلاثة لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
      ملاحظة: ثلاث عينات المراقبة ينبغي أن تشمل: [دمس] التحكم بناي، والجيش الملكي النيبالي التشويه والتحريف مع ناي، وناي السلبية السيطرة.
    9. إضافة 10 ميكروليتر 2 م ناي لكل عينة، باستثناء يشوه التحكم (DC) الجيش الملكي النيبالي وناي السلبية. "الماصة؛" أعلى وأسفل أربع مرات لخلط. احتضان في 37 درجة مئوية لاهتزاز 15 دقيقة بلطف اللوحات تعليق إعادة الخلايا كل 5 دقائق.
    10. نقل الخلايا في أنابيب 1.7 مل وأجهزة الطرد المركزي في 400 x ز لمدة 2 دقيقة دون تأخير. إزالة المادة طافية دون إزعاج بيليه الخلية.
    11. إضافة مل 0.4 من ثيوسيانات جوانيدينيوم (انظر الجدول للمواد). دوامة لمدة 15 ثانية مجانسة. احتضان هذه العينات في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق.
      ملاحظة: ويمكن تخزين العينات في-20 درجة مئوية حتى الانتقال إلى الخطوة التالية.
  3. استخراج الحمض النووي الريبي
    1. إضافة 0.2 مل كلوروفورم إلى كل من العينات ثيوسيانات تجانس جوانيدينيوم. دوامة إينكوباتي س. 15 في درجة حرارة الغرفة لمدة 2 دقيقة.
    2. أجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 12,000 س ز و 4 درجة مئوية. الطبقة العليا مائي عديم اللون يحتوي على الحمض النووي الريبي. نقل ~ 380 ميكروليتر من محلول مائي في أنبوب 1.7 مل جديدة.
      تنبيه: عدم الإزعاج في الطور البيني لتجنب التلوث.
    3. إضافة 1.5 x حجم EtOH (ميكروليتر ~ 570). دوامة لمدة 15 ثانية لمزيج.
    4. نقل 600 ميكروليتر من خليط الحمض النووي الريبي في الجيش الملكي النيبالي عزلة تدور-عمود (انظر الجدول للمواد). الطرد المركزي في 12,000 س ز لتجاهل س. 15 في الوينت. كرر هذه الخطوة تمر عبر جميع السائل في نفس عمود الدوران.
    5. أغسل العمود مع 0.35 مل من RW1 المخزن المؤقت (انظر الجدول للمواد) من الغزل ل 15 ميكروليتر إضافة 80 س. من الحر رناسي الدناز أنا في المخزن المؤقت هي (انظر الجدول للمواد). احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة.
      ملاحظة: من الضروري إزالة جميع الحمض النووي التلوث.
    6. تغسل فيما بعد العمود مع 0.35 مل من المخزن المؤقت RW1 و 0.6 مل من المخزن المؤقت x RPE 2 (انظر الجدول للمواد) بالغزل لمدة 15 ثانية في كل خطوة. الجاف للعمود قبل سينتريفوجينج عمود الدوران مع أنبوب مجموعة فارغة في س 12,000 ز لمدة 1 دقيقة.
    7. إضافة ميكروليتر 32 من المياه خالية من رناسي إلى مركز العمود. احتضانها للحد الأدنى 1 أجهزة الطرد المركزي في س 12,000 ز لمدة 30 ثانية للحصول على ميكروليتر ~ 30 لتنقية الحمض النووي الريبي الحل. وضع العينات في-20 درجة مئوية أثناء معالجة العينة التشويه والتحريف.
  4. التشويه والتحريف إعداد التحكم في الجيش الملكي النيبالي
    1. مكان 30 ميليلتر الحمض النووي الريبي عينة ل DC في أنبوب بلاستيكي 1.7 مل على الجليد. إضافة 50 ميكروليتر من ميثلامين و 15 ميكروليتر من المخزن المؤقت DC التي تحتوي على 300 ملم حبيس (pH 8.0) و 25 مم أدتا إلى الأنبوب.
    2. الحرارة تجريدها من الجيش الملكي النيبالي في 95 درجة مئوية للحد الأدنى 1 بسرعة إضافة 5 ميكروليتر ناي حل الأسهم (م 2)، ثم نقر مرتين لخلط ووضع الأنبوب مرة أخرى إلى كتلة التدفئة. احتضان عند 95 درجة مئوية 1 دقيقة إضافية ثم فورا وضع الأنبوب على الجليد.
    3. إضافة مل 0.4 من ثيوسيانات جوانيدينيوم. كرر الخطوات 2.3.1–2.3.4.
    4. أغسل العمود مع 0.6 مل من المخزن المؤقت x RPE 2 (انظر الجدول للمواد) بالغزل لمدة 15 ثانية في كل خطوة. الجاف للعمود قبل سينتريفوجينج عمود الدوران مع أنبوب مجموعة فارغة في س 12,000 ز لمدة 1 دقيقة.
    5. إضافة ميكروليتر 32 من المياه خالية من رناسي إلى مركز العمود. احتضانها للحد الأدنى 1 أجهزة الطرد المركزي في س 12,000 ز لمدة 30 ثانية للحصول على ميكروليتر ~ 30 المستردة إلى حل "الجيش الملكي النيبالي في العاصمة".
  5. تمديد التمهيدي
    1. تطبيع حل الجيش الملكي النيبالي من 2.3.7 و 2.4.5 إلى 0.5 ميكروغرام/ميكروليتر مع المياه خالية من رناسي. إعداد 30 ملم الحل2 الحركة من الحركة2∙4H2O مسحوق طازجة.
    2. نقل 9 ميكروليتر من حل الجيش الملكي النيبالي لكل عينة قطاع بكر. إضافة 1 ميكروليتر من دنتب 10 ملم وميكروليتر 1 من 2 ميكرومتر الخاصة بالجينات التمهيدي (نظام اﻷفضليات المعمم) في كل أنبوبة. "الماصة؛" أعلى وأسفل أربع مرات لخلط. احتضان عند 65 درجة مئوية لمدة 5 دقائق في cycler حرارية ووضع على الجليد > 1 دقيقة.
      ملاحظة: وبدلاً من ذلك، يمكن استخدام 1 ميكروليتر من نونامير عشوائية في الاستعاضة عن نظام اﻷفضليات المعمم.
    3. في كل أنبوبة PCR، إضافة خليط من 2 ميكروليتر من 10 × RT المخزن المؤقت (انظر الجدول للمواد)، 4 ميكروليتر من الحركة 30 مم2، و 2 ميكروليتر من 100 مم DTT. "الماصة؛" صعودا وهبوطاً x 4 للمزيج. احتضان في 42 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة.
    4. أضف 1 ميكروليتر من المنتسخة العكسية (انظر الجدول للمواد). "الماصة؛" صعودا وهبوطاً x 4 للمزيج. احتضان في 42 درجة مئوية في cycler حرارية ح 3.
  6. إعداد مكتبة وتسلسل الجيل المقبل
    1. إعداد رد فعل PCR بإضافة 1 ميكروليتر من بوليميريز الحمض النووي، 5 ميكروليتر من 10 × بوليميراز الدنا المخزن المؤقت (انظر الجدول للمواد)، 2 ميكروليتر من [دمس]، ميكروليتر 1.5 لكل من الإشعال (10 ميكرومترات)، ميكروليتر 34 س ح2، و 5 ميكروليتر من كدنا من الخطوة 2.5.4.
    2. إعداد cycler الحرارية كما يلي: المرحلة 1) 95 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة؛ المرحلة 2) 95 درجة مئوية لمدة 30 ثانية؛ المرحلة 3) 60 درجة مئوية لمدة 30 ثانية؛ المرحلة 4) 68 درجة مئوية لمدة 30 ثانية؛ حلقة المرحلة 5) العودة إلى المرحلة 2 لدورات 30؛ المرحلة 6) 68 درجة مئوية لمدة 3 دقائق؛ والمرحلة 7) لا حصر لها عقد في 4 درجات مئوية حتى الخطوة التالية.
    3. نق أمبليكون باستخدام 1.8% [اغروس] هلام.
      ملاحظة: يجب أن تظهر الفرقة بكر عصابة واحدة في الهلام.
    4. بناء المكتبة باستخدام تجزئة القياسية وأساليب ربط المنشأة في6،الأدب26.
    5. تسلسل على معدات الجيل التالي تسلسل استخدام 1 × 75 واحد في نهاية ما يلي لإنشاء حوالي 10 مليون يقرأ كل عينة.
    6. تحليل النتائج باستخدام شابيمابير وبرامج سوبيرفولد مجموعة حزم وضعتها في الأسابيع26.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

أظهرنا سابقا أن الجيش الملكي النيبالي الربط المغير، الجالي-C2، يتفاعل مع فكرة أجاج على إكسون 7 من قبل-مرناً مورث SMN2، ويستخدم الشكل لتقييم التغيرات الهيكلية الحمض النووي الريبي حضور C2 الجالي6. موقع الربط الجالي-C2 يختلف عن وافقت عليها إدارة الأغذية والعقاقير العقاقير اليغنوكليوتيد (ASO) للإدارة البحرية السويدية، نوسينيرسين، الذي يربط وكتل كاتم الصوت الربط إينترونيك (ISS) إنترون 727،28 (الشكل 1A). الأكثر المعروفة المنظمين الربط من SMN2 إكسون 7 داخل نطاق ~ 100 النوكليوتيدات إكسون 7 في مرناً قبل29؛ ولذلك، 140 و 276 النوكليوتيدات طوله رنا متواليات واستخدمت للشكل في المختبر وفي الخلية، بالإسم، الذي يغطي إكسون 7 والمنطقة المتاخمة إنترون (الشكل 1A).

في تحليل الشكل هذا الممثل في المختبر، هو تسلسل الحمض النووي الريبي لمصلحة مدمجة كاسيت أمثل الذي وضعه مختبر أسبوعا، ومتوافق ل تسلسل الحمض النووي الريبي معظم1. في بعض الأحيان، تسلسل الفائدة يتفاعل أو يتداخل مع هذا الكاسيت. وفي هذه الحالات، يمكن استخدام كاسيت تعديل بالخصائص الثلاث التالية: ط) 3 ' في نهاية التمهيدي محددة ملزمة موقع مع تقارب تهجين أكثر كفاءة للتمهيدي من أي جزء من تسلسل الحمض النووي الريبي، ثانيا) حلقة دبوس التنظيم يقع المنبع مباشرة موقع الربط التمهيدي الذي سوف تظهر إشارة الشكل (وهذا سيكون بمثابة كل رقابة داخلية للتجربة وأسلوب لمحاذاة الإشارة من التجربة للتجربة) محددة واستنساخه، وثالثاً) بنية دبوس 5 '-نهاية العنصر الذي يشير إلى نهاية الإشارة الشكل. كذلك يحيط كاسيت الشكل مع ناهضة متواليات رايبوزيم ذاتيا في كل 5 '--و 3'-ينتهي من أجل توليد الحمض النووي الريبي متجانسة30. وجدنا أن المطرقة والتهاب الكبد ريبوزيميس فيروس دلتا متوافقة للكاسيت الشكل، وعادة ما تعطي عالية الغلة من الجيش الملكي النيبالي المرجوة. قالب الحمض النووي الريبي قد 3 '-نهاية 2'، 3 'دوري الفوسفات و 5'-نهاية مجموعة الهيدروكسيل، التي لا تتداخل مع تمديد التمهيدي. 140-نوكليوزيد تسلسل طويلة تغطي إكسون 7 SMN2 والمنطقة المجاورة لها في مرحلة ما قبل-مرناً تم تصنيعه داخل كاسيت الشكل ورايبوزيم كما هو موضح في مخطط 1.

وبصفة عامة، تسلسل الفائدة متصلة في كاسيت التعبير ينبغي أن تكون طويلة بما يكفي لتغطية النظام الثانوي أو العالي المحتملة للهيكل. وفي حالة SMN2 إكسون 7، يتضمن منطقة 140-النوكليوتيدات اثنين6،هياكل الجذعية-حلقة31. يختلف حسب حالة هيكل منطقة الاهتمام وينبغي تقييمها عن طريق التجربة والخطأ.

اختير polyacrylamide هلام التسلسل مع 32التمهيدي المسمى ف ملحق المنتجات لتصور الشخصية في المختبر الشكل في هذه التجربة التمثيلية. أسلوب تصور بديل استخدام التفريد الشعرية مع الحمض النووي مسمى فلوريسسينتلي التمهيدي32. في polyacrylamide تسلسل المواد الهلامية، ~ 20 نوكليوسدس بالقرب من 5 '-النهاية وسوف لا يمكن تصور كمي النيوكليوتيدات ~ 10 بالقرب من 3'-نهاية تسلسل الحمض النووي الريبي للفائدة، نظراً لتوقف أحياناً في خطوات بدء النسخ العكسي ومكثفة الفرق في المواد الهلامية الصفحة للنصوص كاملة الطول1.

طريقة بديلة لاسترداد محضرة جل قالب الحمض النووي الريبي (الخطوات 1.1.6 ل 1.1.12) هو الزائد هلام المصغر إذا كان عائد القالب المطلوب من الحمض النووي الريبي > 90%. ينصح بإزالة NTP الزائدة من الحمض النووي الريبي للمنتج بواسطة الملحي العمود والتينج الجيش الملكي النيبالي في 50 ميليلتر من المخزن المؤقت للشركة المصرية للاتصالات. قياس تركيز الجيش الملكي النيبالي، وتحميل 5.0 ميكروغرام في كل بئر. أثناء التنقية نسخها خطوة T7 قالب الجيش الملكي النيبالي، ووقف الصفحة عند تمرير صبغ زايلين FF زيلين نفط (أزرق فاتح) جل اليوريا TBE التشويه والتحريف ثلثي نسبة 6 في المائة. جزء الجيش الملكي النيبالي على الانقسام الذاتي (< نوكليوسدس 80) مرت الجل، الذي ترك الجيش الملكي النيبالي المطلوب كالفرقة الرئيسية فقط في الجل على تلطيخ (الشكل 1B).

كان تصنيعه طبقاً للإجراء المنشورة33 الجالي-C2 (الشكل 1) والمذاب في حل الأسهم [دمس] 10 ملم. كذلك هو تمييع الحل الأسهم إلى 500 و 50 ميكرومتر في حل [دمس] 10% لبلوغ النهائي تركيزات ميكرومتر 50 و 5، على التوالي. الجيش الملكي النيبالي تبرد المفاجئة ريفولديد إلى مرحلة التوازن بحضور [دمس] أو الجالي-C2 ضمن 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية. فترة حضانة أطول ولم تتغير نتائج هذه التجربة. عينتين تجريبية (50 و 5 ميكرومتر الجالي-C2)، اثنان عناصر التحكم ([دمس] وناي-الضوابط)، وتم علاج أربعة علامات (أ، ر، ز، ج) تمديد التمهيدي. بعد فضح الجل إلى الفوسفور تخزين الشاشة، سوف تظهر تجربة ناجحة لشكل: ط) عصابة واحدة وأكثر كثافة في الجزء العلوي من جل والثاني) الفرق في جميع أنحاء الهلام في قرار واحد-النوكليوتيدات دون تشويه (الشكل 1). مشكلة شائعة في صفحة التحليل أن تشويه منطقة المعروفة باسم "الجبهة الملح" قد تظهر في منتصف الهلام (الشكل 1E). وربما هذا سبب التركيز العالي للملح، [دمس]، أو الأخرى غير المرغوب فيها مضمون في تحميل العينة التي يمكن إزالتها بالترسيب الإيثانول.

في في المختبر الشكل، قالب الحمض النووي الريبي نقي هو المفتاح لتجربة ناجحة. قالب الحمض النووي الريبي نجسة السبب عادة لنتائج غير مرغوب فيها. إذا صفحة التحليل يبين بوضوح نمط من 2 مجموعات من علامات، تشير إلى أن الجيش الملكي النيبالي القالب غير متجانسة ويحتاج إلى أن يكون ريبوريفيد بإعداد اليوريا TBE هلام.

للشكل في الخلية، ومفتاح لتجربة ناجحة لتصميم مجموعة التمهيدي أمثل للتضخيم. مع 0.10 ميكروغرام للجينوم قالب كدنا خالية من الحمض النووي، ينبغي أن تراعي عصابة واحدة ضمن دورات [بكر] 25 [اغروس] هلام التحليل. ولذلك ينبغي تجنب تسلسل إنترون المتكررة. ولدراسة الهيكلية تم اختبار تأثير الجالي-C2 على SMN2 قبل-مرناً، ثلاث مجموعات التمهيدي (الجدول 2)، وكلها كانت مرضية (الشكل 2A).

عدد نسخة منخفضة من تسلسل هدف الجيش الملكي النيبالي عموما مشكلة بالنسبة للشكل في الخلية. لإثراء الجيش الملكي النيبالي للفائدة، كان ترانسفيكتيد مينيجيني يحتوي على تسلسل الحمض النووي الريبي الفائدة بموجب أحد المروجين CMV قوية داخل الخلايا 293T. لأن نمط الربط مينيجيني SMN2 يجمل من SMN2 الذاتية مع أو بدون الجالي-C219،34، ونحن نتصور أن هيكل الجالي-C2 رنا المتفاعلة في overexpressed SMN2 قبل-مرناً المحتمل هو نفس المنتج الجيني الذاتية. بينما كانت المفوضية الأوروبية50 من الجالي-C3 في مقايسة الربط ~0.1 مكم6،19، استخدمت تركيز في نهاية أعلى (20 ميكرومتر) لضمان الدولة ملزمة جزيء صغير وتسلسل هدف الجيش الملكي النيبالي.

عند عزلة من الجيش الملكي النيبالي، يمكن استخدام كبسولة تفجير الجينات وعشوائي للتمديد. وفي حالة إكسون 7 من SMN2، وجدنا أن SMN2E7-338-RV (الجدول 2) تعطي نسخة أعلى من كدنا المرجوة من نونامير عشوائية، يتضح من عصابة أكثر كثافة في [بكر] تضخيم مع مجموعة التمهيدي SMN2E7-276 (الجدول 2) بعد 25 دورات. في خطوة التعديل 2 '--أوه، استخدمت تركيز ميكرومتر نهائي ناي 91 لفترة حضانة مدتها 15 دقيقة. إذا تم استخدام نوع خلية مختلفة أو المتوسطة، يجب أن تكون فترة الحضانة إعادة الأمثل. إذا كانت فترة الحضانة طويلة جداً، ستفشل [اغروس] هلام التحليل أمبليكون في بعض الأحيان لإظهار فرقة.

بيثون برنامج المستندة، شابيمابير، وضعت قبل أسابيع المختبر35 استخدمت لتحليل البيانات الناتجة عن الجيل التالي تسلسل [للبيانات الخام من الجالي-C2 تعامل في الخلية قبل إكسون 7 الشكل SMN2-مرناً، أرجع إلى أرشيف قراءة التسلسل (SRA) قاعدة البيانات]. في جميع أنحاء أمبليكون، مفاعليه الشكل لم كثيرا تغير (> 1)، مما يدل على أن هيكل الثانوي لا يزال حضور الجالي-C2 (الشكل 2). هذا ما يؤكده أيضا قوس المؤامرات التي تم إنشاؤها بواسطة سوبيرفولد35. خطوط الاتصال تشير إلى الاقتران قاعدة ممكن استناداً إلى شكل النشاط لكل النوكليوتيدات. تعامل الجالي-C2 و [دمس] النمذجة الجيش الملكي النيبالي هو أساسا نفسه (الشكل 2). مفاعليه التفاضلية في الخلية الشكل تم حسابها لكل النوكليوتيدات (الشكل 2)، ووقع معظم التغيير مفاعليه في TSL-1 (5-نهاية إكسون 7) لكن لا TSL-2 (3 '-نهاية إكسون 7). وتتفق هذه النتيجة مع الشكل في المختبر؛ على الرغم من أن قاعدة الاقتران وتحول من المختبر يحلل "الحمض النووي الريبي الشكل" النمذجة في الشكل في الخلية (الشكل 2D).

مشكلة شائعة للشكل في الخلية هو معدل الطفرات منخفضة طوال أمبليكون. وهذا يحدث عادة بسبب المجينية الحمض النووي التلوث. لا تحتوي على الحمض النووي 2 '--أوه المجموعة؛ ولذلك، يتم تشكيل أي منتج أسيليشن مع ناي. وهكذا يعكس [بكر] تضخيم مجرد طفرة انخفاض معدل بوليميريز الحمض النووي. عزل من الجيش الملكي النيبالي بواسطة ثيوسيانات جوانيدينيوم تليها على عمود الدناز الهضم كافية لإزالة جميع الحمض النووي في معظم الحالات. إذا استمر التلوث بالحمض النووي، كرر الخطوة 2، 3 لعزل الحمض النووي الريبي.

Scheme 1
مخطط 1: تسلسل الحمض النووي للقالب من الحمض النووي الريبي النسخ- التسلسل bp 12 ضمن تسلسل رايبوزيم الفيروس المطرقة باللون الأحمر هو تكملة عكس من ال 12 الأولى بي بي من 5 '-الكاسيت. تسلسل الحمض النووي الريبي للفائدة المقدمة في هذه الوثيقة هو 140 يحتوي على تسلسل مرناً قبل bp إكسون 7 جينات البشرية SMN2. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 1
رقم 1: التصميم التجريبي ونتيجة للشكل في المختبر ل SMN2 إكسون 7 قبل مرناً حضور الجالي-C2. (أ) نظرة عامة على تسلسل اهتمام الدراسات الشكل في المختبر وفي الخلية للجين SMN2. بربط الجالي-C2 الحافز عجاج في إكسون 7، موقعا متميزاً من موقع الربط نوسينيرسين. (ب) تنقية المنتج النسخ T7. يتضمن كل من الممرات الثلاثة 5.0 ميكروغرام من النفط الخام الجيش الملكي النيبالي. وكان ملطخة هلام اليوريا TBE سيبر الآمنة (01:10، 000) لمدة 5 دقائق في المخزن المؤقت x TBE 1. مربع أحمر منقط يشير إلى حافة الختان لاستعادة الجيش الملكي النيبالي. (ج) هيكل الجالي-C2. (د) تجربة الشكل في المختبر مع ناي و 140 من النوكليوتيدات طوله الحمض النووي الريبي قالب يحتوي على إكسون 7. 1 = [دمس]؛ 2 = الجالي-C2 (50 ميكرومتر)؛ 3 = الجالي-C2 (5 ميكرون)؛ 4 = تفتقر إلى ناي؛ 5-8 = سلالم إنشاؤها بواسطة إضافة داتب، دتتب، دكتب ودجتب أثناء تمديد التمهيدي. صفحة تم الخروج على هلام تسلسل TBE-يوريا في 60 ث حاء 3 الأحمر تبين العلامات النجمية الفرقة زيادة كثافة مع 50 ميكرومتر C2 الجالي6. (ﻫ) مثال لمنطقة "الجبهة الملح" في مربع أحمر متقطع من منفصلة التجربة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 2
رقم 2: الشكل في الخلية المشتقة النمذجة الحمض النووي الريبي ل SMN2 قبل إكسون 7-مرناً. (أ) بكر التضخيم مع كافة التمهيدي ثلاث مجموعات (الجدول 2) أسفرت عن عصابة واحدة في التحليل [اغروس] هلام. 1 = SMN2E7-338، 2 = SMNE7-276، 3 = SMN2E7-251، 4 = سلم الحمض النووي. (ب) التفاضلية مفاعليه الشكل في الخلية في الخلايا 293T ترانسفيكتيد مينيجيني SMN2 عن 10 ميكرون الجالي-C2 و [دمس] في TSL1. الشكل مفاعليه في قرار واحد-النوكليوتيدات. تم حساب الانحراف المعياري لها ب البرمجيات شابيمابير35. النجمة الخضراء تشير إلى تغير كبير مفاعليه الشكل الناجم عن 10 ميكرون الجالي-C2. الترقيم من النيوكليوتيدات في amplicon bp 276 على x-المحور. أشرطة الخطأ قدرت بشكل مخطط البرنامج26. (ج) ارسم القوس التي تم إنشاؤها بواسطة سوبيرفولد35 لهيكل الثانوية الأكثر قبولا في الجيش الملكي النيبالي النمذجة ببيانات الشكل في الخلية. (د) في المختبر وفي الخلية النمذجة الموجه بشكل إكسون 7 والمناطق المتاخمة لها. لنموذج الجيش الملكي النيبالي في المختبر، ويبين رسم الشكل استقرار كاسيت (برتقالي) والنيوكليوتيدات 1-19 (أزرق). لنموذج الجيش الملكي النيبالي في الخلية، ترقيم النوكليوتيدات تتماشى مع قالب الشكل في المختبر. وقد أغفل النيوكليوتيدات 1-18 و 120-140. تبين التغييرات الهامة مفاعليه في النجمة الحمراء والخضراء للشكل في المختبر وفي الخلية، على التوالي. الهياكل الثانوية التي كانت سابقا باسم TSL1 و TSL231 المحاطة بمربعات زرقاء. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

اسم الدليل 5 '-3' تسلسل
رايبوزيم-مهاجم تاااكجاكجككاجتجات
رايبوزيم-رف جكاجتكجاكتكتاجاجات
RT التمهيدي جاككجاككجاجكككج

الجدول 1: تسلسل التمهيدي استخدمت في التجربة التمثيلية.

الاسم تسلسل (5 '--> 3')
SMN2E7-338-مهاجم آآجاكتاتكاكتاتتكتجا
SMN2E7-338-رف تجتتتاكاتاككتتكاكت
SMN2E7--276-مهاجم آتجتكتجتجااكاااتجكت
SMN2E7-276-رف آككتتتكاكتتكتاكاتكت
SMN2E7-251-مهاجم تجااكاااتجكتتتتاكاتكك
SMN2E7-251-رف تكاكتتكتاكاتكتجاكتتت

الجدول 2: يعين التمهيدي للتضخيم في التسلسل قبل مرناً للفائدة- جميع التمهيدي ثلاث مجموعات العائد أمبليكون واحدة في رد فعل PCR مع قالب كدنا خالية من الحمض النووي الجينوم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

في الشكل في المختبر، من الضروري استخدام قالب الحمض النووي الريبي متجانسة ذات جودة عالية. ومع ذلك، غلة T7 النسخ، غالباً ما تسلسل غير متجانسة36. وبخاصة، تسلسل مع النوكليوتيدات ± 1 في 3 '-المحطة مع عائدات لا يستهان بها36 عادة من الصعب إزالتها بتنقية جل polyacrylamide. قالب الحمض النووي الريبي غير المتجانسة يمكن أن ينتج أكثر من مجموعة واحدة من الإشارات في جل تسلسل تحديد سمات المنتج تمديد التمهيدي، مما يجعل من الصعب تفسير النتيجة في بعض الأحيان. رايبوزيم في كلا 5 '--وسوف تجعل 3'-ينتهي كاسيت التعبير قالب الحمض النووي الريبي طرفي متجانسة.

للشكل في المختبر وفي الخلية، وقت حضانة 2 '--يا الكاشفات التعديل عامل حاسم آخر. اقترح الفريق أسابيع أن خمس مرات على الأقل نصف عمر الكاشف أسيليشن 2 '--أوه تبريد المياه المستعملة1. في أيدينا، حضانة مع ناي (T1/2 = ~ 20 دقيقة) > 30 دقيقة في الشكل في المختبر وفي الخلية يؤدي إلى نتيجة أوفيرياكتيد. كما هو مبين في الشكل 1، ينبغي أن يكون جيد في المختبر الشكل التنميط > إشارة مجموع 50% على رأس الهلام كنسخة كاملة الطول، ضمان أن معظم من تم التعديل الجيش الملكي النيبالي أسيلاتيد إلا مرة واحدة. افرزا سوف تجعل المنتج مزدوجة-أسيلاتيد لا يستهان بها والتنميط متحيزة للمنتجات تمديد مدة قصيرة المخصب. في الشكل في الخلية، ويجب أن تظهر أمبليكون لبناء مكتبة عصابة واحدة في [اغروس] هلام التحليل (الخطوة 2.6.3). يشير إلى تشويه للفرقة ردود، وينبغي خفض وقت إينكوباتي. في هذه التجارب التمثيلية، فترة حضانة 15 دقيقة عند 37 درجة مئوية كان الأمثل للشكل في المختبر وفي الخلية. وينبغي استخدام هذا كنقطة انطلاق لتعديل ناي في تطبيقات مماثلة.

وهناك أخرى 2-أوه تعديل الكواشف22 يستخدم على نطاق واسع للشكل، مثل 1 م 7. بالمقارنة مع ناي، له م 1 7 من مفاعليه أفضل للمجموعة 2 ' أوه وأقصر فترة نصف العمر في المياه22. في أيدينا، شكلت م 1 7 كمية هائلة من هطول الأمطار الصفراء في خلية ثقافة الإعلام في تجربة شكل في خلية، مما عزل الحمض النووي الريبي من تعقيد. لسبب مقارنة، الشكل في المختبر وفي الخلية كناي كاشف التعديل 2 '--يا لدراسة الجالي-C2 والتفاعلات مرناً قبل SMN2. إذا كان فقط في المختبر الشكل المطلوب، م 1 7 خيار بديل كما يتبين من الدراسات المختلفة في ريبوسويتش التصميم الهيكلي7،8.

وبصفة عامة، الشكل في الخلية على الشكل في المختبر المفضل، لا سيما إذا كان الجزيء يفترض أن يتصرف في نواة خلية حقيقية النواة. الجيش الملكي النيبالي ملزم البروتينات في النواة وفيرة، ويكاد يكون من المستحيل أن الخص سياق الخلوية تحت الظروف المختبرية.

في العقد الماضي، يصبح الشكل الأسلوب القياسي لدراسة هيكل الثانوية للجيش الملكي النيبالي. مقارنة التقليدية الجيش الملكي النيبالي footprinting مع رناسي37، أكثر ملاءمة لدراسة التفاعلات بين الجزيئات الصغيرة-الجيش الملكي النيبالي، في بعض الأحيان يمكن أن تكون هذه التفاعل ضعيفة وغير مبال بالتحديات رناسي.

الرئيسية الحد من استخدام الشكل لدراسة الصغيرة التي يسببها جزيء الحمض النووي الريبي التغييرات الهيكلية أن نتائجه لا تكشف عن الموقع ملزم. في الشكل في المختبر وفي الخلية الجالي-C2 ملزمة قبل-مرناً، مفاعليه الشكل لم يتغير في موقع الربط المفترضة (الشكل 1و الشكل 2)؛ بدلاً من ذلك، تم تغيير مفاعليه في 2 إلى 3 مواقع نائية في منطقة حلقة أو تتزحزح. يفترض أن يربط الجالي-C2 إلى منطقة الحلزون مزدوج الحمض النووي الريبي (الشكل 1و الشكل 2D)، الذي عادة ما يكون مفاعليه شكل منخفضة. ولذلك، قد لا يكون كذلك استقرار الهيكل إنقاص مفاعليه الشكل يمكن ملاحظتها. لإنشاء موقع ربط المفترضة، وأساليب أخرى مثل ينبغي أن تستخدم تشيمكليب38 ، التي تشارك فيها تحقيق crosslinking كيميائية.

نهج بديل موحد لخريطة بنية الحمض النووي الريبي الثانوي أو العالي، وديناميات النوكليوتيدات هو الرنين المغناطيسي قياس الطيف الكتلي39،40. وقد ثبت أن ديناميات الحمض النووي الريبي المستمدة من التحليل الكمي للرنين المغناطيسي النووي كورليت بشدة مع شكل النشاط39. في سياق ربط جزيء صغيرة، يمكن أن تكشف عن التحول الكيميائي اضطرابات النيوكليوتيدات المتفاعلة21.

استهداف الجيش الملكي النيبالي الجزيئات الصغيرة أصبحت أسلوباً جديداً ل التنمية المخدرات11، ونحن نتصور أنه سيتم إنشاء الشكل كمنهجية موحدة تقييم الآثار الهيكلية للحمض النووي الريبي الهدف حضور الجزيئات الصغيرة. وفي المستقبل، هو المطلوب أسلوب استجواب على نطاق الترنسكربيتوم لاستهداف الجيش الملكي النيبالي المخدرات جزيء صغير.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب يعلن لا تضارب في المصالح.

Acknowledgments

تسنى هذا العمل بالمنحة R01 المعاهد الوطنية للصحة (NS094721، K.A.J.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DNA oligonucleotide IDT gBlock for >200 bp DNA synthesis
Phusion Green Hot Start II High-Fidelity PCR Master Mix Thermo Fisher F566S
NucleoSpin gel and PCR clean-up kit Takara 740609.50
MegaScript T7 transcription kit Thermo Fisher AM1333 Contains 10x reaction buffer, T7 enzyme, NTP and Turbo DNase
DEPC-treated water Thermo Fisher 750023
2x TBE-urea sample buffer Thermo Fisher LC6876
40% acrylamide/ bisacrylamide solution (29:1) Bio-Rad 1610146
10x TBE buffer Thermo Fisher 15581044
Nalgene Rapid-Flow™ Filter Unit Thermo Fisher 166-0045
Kimwipe Kimberly-Clark 34133
TEMED Thermo Fisher 17919
SYBR-Safe dye Thermo Fisher S33102
6% TBE-urea mini-gel Thermo Fisher EC6865BOX
ChemiDoc Bio-Rad
T4 PNK NEB M0201S
γ-32P-ATP Perkin Elmer NEG035C005MC
Hyperscreen™ Intensifying Screen GE Healthcare RPN1669 calcium tungstate phosphor screen
phosphor storage screen Molecular Dynamics BAS-IP MS 3543 E
Amersham Typhoon GE Healthcare
NAI (2M) EMD Millipore 03-310
GlycoBlue Thermo Fisher AM9515
SuperScript IV Reverse Transcriptase Thermo Fisher 18090010 Contains 5x RT buffer, SuperScript IV
dNTP mix (10 mM) Thermo Fisher R0192
ddNTP set (5 mM) Sigma GE27-2045-01
large filter paper Whatman 1001-917
Gel dryer Hoefer GD 2000
QIAamp DNA Blood Mini Kit Qiagen 51104 Also contains RNase A and protease K
SMN2 minigene34 Addgene 72287
Heat inactivated FBS Thermo Fisher 10438026
Pen-Strep Thermo Fisher 15140122
Opti-MEM I Thermo Fisher 31985062
FuGene HD Promega E2311
TrpLE Thermo Fisher 12605010
DPBS without Ca/Mg Thermo Fisher 14190250
TRIzol Thermo Fisher 15596018
RNeasy mini column Qiagen 74104 Also contains RW1, RPE buffer
RNase-Free DNase Set Qiagen 79254 Contains DNase I and RDD buffer
Deionized formamide Thermo Fisher AM9342
MnCl2•4H2O Sigma-Aldrich M3634
random nonamer Sigma-Aldrich R7647
SuperScript First-Strand Synthesis System Thermo Fisher 11904-018 Contains 10x RT buffer, SuperScript II reverse transcriptase
AccuPrime pfx DNA polymerse Thermo Fisher 12344024
NextSeq500 Illumina
NucAway column Thermo Fisher AM10070 for desalting purpose

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wilkinson, K. A., Merino, E. J., Weeks, K. M. Selective 2'-hydroxyl acylation analyzed by primer extension (SHAPE): Quantitative RNA structure analysis at single nucleotide resolution. Nature Protocols. 1, 1610-1616 (2006).
  2. Trausch, J. J., et al. Structural basis for diversity in the SAM clan of riboswitches. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111, 6624-6629 (2014).
  3. Souliere, M. F., et al. Tuning a riboswitch response through structural extension of a pseudoknot. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110, E3256-E3264. , E3256-E3264 (2013).
  4. Rice, G. M., Busan, S., Karabiber, F., Favorov, O. V., Weeks, K. M. SHAPE Analysis of Small RNAs and Riboswitches. Methods in Enzymology. , 165-187 (2014).
  5. Spitale, R. C., et al. RNA SHAPE analysis in living cells. Nature Chemical Biology. 9, 18-20 (2013).
  6. Wang, J., Schultz, P. G., Johnson, K. A. Mechanistic studies of a small-molecule modulator of SMN2 splicing. Proceedings of the National Academy of Sciences. 115, E4604-E4612 (2018).
  7. Price, I. R., Gaballa, A., Ding, F., Helmann, J. D., Ke, A. Mn 2+ -Sensing Mechanisms of yybP-ykoY Orphan Riboswitches. Molecular Cell. 57, 1110-1123 (2015).
  8. Hennelly, S. P., Sanbonmatsu, K. Y. Tertiary contacts control switching of the SAM-I riboswitch. Nucleic Acids Research. 39, 2416-2431 (2011).
  9. Abulwerdi, F. A., et al. Development of Small Molecules with a Noncanonical Binding Mode to HIV-1 Trans Activation Response (TAR) RNA. Journal of Medicinal Chemistry. 59, 11148-11160 (2016).
  10. Shortridge, M. D., et al. A Macrocyclic Peptide Ligand Binds the Oncogenic MicroRNA-21 Precursor and Suppresses Dicer Processing. ACS Chemical Biology. 12, 1611-1620 (2017).
  11. Warner, K. D., Hajdin, C. E., Weeks, K. M. Principles for targeting RNA with drug-like small molecules. Nature Reviews Drug Discovery. 17, 547-558 (2018).
  12. Mullard, A. Small molecules against RNA targets attract big backers. Nature Reviews Drug Discovery. 16, 813-815 (2017).
  13. Shortridge, M. D., Varani, G. Structure based approaches for targeting non-coding RNAs with small molecules. Current Opinion in Structural Biology. 30, 79-88 (2015).
  14. Gallego, J., Varani, G. Targeting RNA with Small-Molecule Drugs: Therapeutic Promise and Chemical Challenges. Accounts of Chemical Research. 34, 836-843 (2001).
  15. Rizvi, N. F., Smith, G. F. RNA as a small molecule druggable target. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. 27, 5083-5088 (2017).
  16. Connelly, C. M., Moon, M. H., Schneekloth, J. S. The Emerging Role of RNA as a Therapeutic Target for Small Molecules. Cell Chemical Biology. 23, 1077-1090 (2016).
  17. Palacino, J., et al. SMN2 splice modulators enhance U1-pre-mRNA association and rescue SMA mice. Nature Chemical Biology. 11, 511-517 (2015).
  18. Ratni, H., et al. Discovery of Risdiplam, a Selective Survival of Motor Neuron-2 ( SMN2 ) Gene Splicing Modifier for the Treatment of Spinal Muscular Atrophy (SMA). Journal of Medicinal Chemistry. 61, 6501-6517 (2018).
  19. Naryshkin, N., et al. SMN2 splicing modifiers improve motor function and longevity in mice with spinal muscular atrophy. Science. 345, (2014).
  20. Chiriboga, C., et al. Preliminary Evidence for Pharmacodynamics Effects of RG7916 in JEWELFISH, a Study in Patients with Spinal Muscular Atrophy who Previously Participated in a Study with Another SMN2-Splicing Targeting Therapy (S46.003). Neurology. 90, (2018).
  21. Sivaramakrishnan, M., et al. Binding to SMN2 pre-mRNA-protein complex elicits specificity for small molecule splicing modifiers. Nature Communications. 8, (2017).
  22. Lee, B., et al. Comparison of SHAPE reagents for mapping RNA structures inside living cells. RNA. 23, 169-174 (2017).
  23. Weeks, K. M., Mauger, D. M. Exploring RNA Structural Codes with SHAPE Chemistry. Accounts of Chemical Research. 44, 1280-1291 (2011).
  24. Smola, M. J., et al. SHAPE reveals transcript-wide interactions , complex structural domains , and protein interactions across the Xist lncRNA in living cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113, 10322-10327 (2016).
  25. Flynn, R. A., et al. Transcriptome-wide interrogation of RNA secondary structure in living cells with icSHAPE. Nature Protocols. 11, 273-290 (2016).
  26. Smola, M. J., Rice, G. M., Busan, S., Siegfried, N. A., Weeks, K. M. Selective 2 ′ -hydroxyl acylation analyzed by primer extension and mutational profiling (SHAPE-MaP) for direct , versatile and accurate RNA structure analysis. Nature Protocols. 10, 1643-1669 (2015).
  27. Hua, Y., et al. Antisense correction of SMN2 splicing in the CNS rescues necrosis in a type III SMA mouse model. Genes & Development. 24, 1634-1644 (2010).
  28. Hua, Y., et al. Peripheral SMN restoration is essential for long-term rescue of a severe spinal muscular atrophy mouse model. Nature. 478, 123-126 (2011).
  29. Wee, C. D., Havens, M. A., Jodelka, F. M., Hastings, M. L. Targeting SR proteins improves SMN expression in spinal muscular atrophy cells. PloS One. 9, e115205 (2014).
  30. Hammond, J. A., Rambo, R. P., Filbin, M. E., Kieft, J. S. Comparison and functional implications of the 3D architectures of viral tRNA-like structures. RNA. 15, 294-307 (2009).
  31. Singh, N. N., Singh, R. N., Androphy, E. J. Modulating role of RNA structure in alternative splicing of a critical exon in the spinal muscular atrophy genes. Nucleic Acids Research. 35, 371-389 (2007).
  32. Deigan, K. E., Li, T. W., Mathews, D. H., Weeks, K. M. Accurate SHAPE-directed RNA structure determination. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106, 97-102 (2009).
  33. Qi, H., et al. Preparation of pyridopyrimidine derivatives and related compounds for treating spinal muscular atrophy. , (2013).
  34. Lorson, C. L., Hahnen, E., Androphy, E. J., Wirth, B. A single nucleotide in the SMN gene regulates splicing and is responsible for spinal muscular atrophy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96, 6307-6311 (1999).
  35. Siegfried, N. A., Busan, S., Rice, G. M., Nelson, J. A. E., Weeks, K. M. RNA motif discovery by SHAPE and mutational profiling (SHAPE-MaP). Nature Methods. 11, 959 (2014).
  36. Milligan, J. F., Groebe, D. R., Witherell, G. W., Uhlenbeck, O. C. Oligoribonucleotide synthesis using T7 RNA polymerase and synthetic DNA templates. Nucleic Acids Research. 15, 8783-8798 (1987).
  37. Nilsen, T. W. RNase Footprinting to Map Sites of RNA-Protein Interactions. Cold Spring Harbor Protocols. , (2014).
  38. Velagapudi, S. P., et al. Design of a small molecule against an oncogenic noncoding RNA. Proceedings of the National Academy of Sciences. , 5898-5903 (2016).
  39. Barnwal, R. P., Yang, F., Varani, G. Applications of NMR to structure determination of RNAs large and small. Archives of Biochemistry and Biophysics. 628, 42-56 (2017).
  40. Scott, L. G., Hennig, M. RNA structure determination by NMR. Methods in Molecular Biology. 452, 29-61 (2008).

Tags

هذا الشهر في جوف، العدد 143، جزيء صغير، استهداف الجيش الملكي النيبالي، والجيش الملكي النيبالي الهيكل و في المختبر الشكل، الشكل، ضمور العضلات الشوكي، RG-7916 في الخلية
تستخدم في المختبر وفي خلايا الشكل للتحقيق في جزيء الصغيرة التي يسببها مرناً قبل إجراء تغييرات هيكلية
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wang, J., Hammond, J., Johnson, K.… More

Wang, J., Hammond, J., Johnson, K. A. Using In Vitro and In-cell SHAPE to Investigate Small Molecule Induced Pre-mRNA Structural Changes. J. Vis. Exp. (143), e59021, doi:10.3791/59021 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter