Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

שימוש בחוץ גופית וצורה בתא לחקור מולקולה קטנה המושרה שינויים מבניים Pre-mRNA

Published: January 30, 2019 doi: 10.3791/59021
Automatic Translation
1, 2, 1
1Calibr, The Scripps Research Institute, 2Department of Integrative Structural and Computational Biology, The Scripps Research Institute

Summary

פרוטוקולים מפורט עבור שני acylation במבחנה, בתא סלקטיבי 2'-הידרוקסיל נותחו על ידי פריימר ניסויים סיומת (צורה) כדי לקבוע את מבנה שניוני של רצפי ה-pre-mRNA עניין בנוכחות מולקולה קטנה פילוח RNA הם הציג במאמר זה.

Abstract

בתהליך של פיתוח תרופות של פילוח RNA מולקולות קטנות, שחקרתי את השינויים המבניים על האינטראקציות שלהם עם רצפי RNA יעד רצוי. בזאת אנו מספקים של נתונים היסטוריים במבחנה , בתא סלקטיבי 2'-הידרוקסיל acylation נותחו על ידי הארכת תחל (צורה) פרוטוקול ללמוד השינוי המבני RNA בנוכחות תרופה ניסיונית עבור ניוון שרירי עמוד השדרה (SMA), הישרדות מוטור נוירון (SMN)-C2, ו ב אקסון 7 של pre-mRNA של הגן SMN2. בצורת גופית, רצף הרנ א של נוקלאוטידים 140 המכיל SMN2 אקסון 7 עיבד על ידי T7 RNA פולימראז, מקופל בנוכחותו של SMN-C2, שונה לאחר מכן על ידי תגובה כימית acylation מתון-2' הו, 2-methylnicotinic imidazolide חומצה (NAI). זה adduct 2'-הו-נאי נוסף שנבדק על-ידי בגודל 32הארכת תחל התווית על-ידי P, נפתרת על-ידי אלקטרופורזה בג'ל לזיהוי (עמוד). לעומת זאת, 2'-הו acylation במצב בתא מתקיים באתרו עם RNA הסלולר SMN-C2 מאוגד בתאים חיים. רצף ה-pre-mRNA של אקסון 7 בגן SMN2 יחד עם צורה-induced מוטציות בהרחבה פריימר, היה אז מוגבר על-ידי ה-PCR ובכפוף הדור הבא רצפי. משווים את שתי מתודולוגיות, צורה במבחנה היא שיטה חסכונית יותר, לא דורשת כוח חישובית לדמיין תוצאות. עם זאת, הדגם RNA נגזר צורה במבחנה לפעמים סוטה מן המבנה משני בהקשר הסלולר, ככל הנראה בשל האובדן של כל האינטראקציות עם RNA מחייב חלבונים. הצורה בתאים אינו צריך מקום העבודה חומרים רדיואקטיביים ותשואות מבנה שניוני מדויקת יותר של RNA בהקשר הסלולר. יתר על כן, בתא בצורה ישימה כלל עבור רצפי טווח של RNA גדול יותר (~ 1,000 נוקלאוטידים) על-ידי ניצול רצפי הדור הבא, לעומת הפריה צורה (~ 200 נוקלאוטידים) כי בדרך כלל מסתמך על דף ניתוח. במקרה של אקסון 7 ב- SMN2 pre-mRNA, נגזר הצורה במבחנה, בתא RNA מודלים דומים אחד לשני.

Introduction

Acylation סלקטיבית-2' הידרוקסיל נותחו על ידי הארכת תחל (צורה) היא שיטת מדידה של קינטיקה של כל נוקלאוטיד ברצף RNA עניין ולאחר שחקרתי את מבנה שניוני-נוקלאוטיד יחיד החלטה1. הצורה מתודולוגיות, שניהם תנאים במבחנה2,3,4 (מטוהרים RNA במערכת מאגר מוגדר), ב-5,בתרבית של תאים חיים6, פותחו כדי לחקור המשני מבנה של רצפי אורך בינוני RNA (בדרך כלל < 1,000 נוקלאוטידים עבור צורה בתוך תא, < נוקלאוטידים 200 עבור צורה במבחנה). זה שימושי במיוחד כדי להעריך את ביצוע שינויים מבניים קולטן ה-RNA על איגוד אינטראקציה-RNA מולקולה קטנה מטבוליטים2,4,7,8 , ללמוד פעולות מכניסטית של מולקולות RNA פילוח במהלך סמים פיתוח9,10.

פילוח RNA גילוי תרופות לאחרונה מושך תשומת לב במעבדות אקדמי ו11,בתעשייה הפרמצבטית12 באמצעות גישות שונות ואסטרטגיות13,14,15 ,16. דוגמאות פילוח RNA מולקולות קטנות לשימוש קליני האחרונות כוללות שתי תרופות ניסיוניות מבנית ברורים, LMI-07017 ו RG-791618,19, עבור ניוון שרירי עמוד השדרה (SMA), אשר הראו מבטיח תוצאות בשלב II ניסויים קליניים20. היו שתי מולקולות הפגינו להישרדות היעד של נוירון מוטורי (SMN) 2 pre-mRNA ולווסת את התהליך splicing של17,216,ג'ין SMN2. אנחנו הפגינו בעבר היישום של במבחנה ואת הצורה בתא במבחן של השינויים המבניים היעד RNA בנוכחות אנלוגי של RG-7916 המכונה SMN-C26.

בעקרון, צורה מודד את שיעור acylation 2'-הו כל נוקלאוטיד של רצף הרנ א בנוכחות כמויות עודפות של ריאגנט acylation עצמית quenching בצורה בלתי לא משוחדת. הכימית acylation אינה יציבה במים, עם מחצית חיים קצר של (למשל, T1/2 = 17 s עבור 1-מתיל-7-nitroisatoic אנהידריד; או 1 מ' 7, ~ 20 דקות עבור 2-methylnicotinic imidazolide חומצה, או נאי)22 ו חוסר רגישות לגבי זהותו של בסיסים23. התוצאה acylation יותר של קבוצות 2'-הו הבסיסים גמיש, אשר יכולה להיהפך הערכה מדויקת של כל נוקלאוטיד הדינמיקות. באופן ספציפי, נוקלאוטיד בזוג הבסיס הוא בדרך כלל מגיב פחות מזו אינטראקצית ל ריאגנט שינוי 2'-הו, נאי ו 1 מ' 7.

מסתכל על המקור של התבנית RNA שם מתקיים acylation 2'-הו, צורה ניתן בדרך כלל לסווג במבחנה וצורה בתא. שימושים חוץ גופית צורה T7 מטוהרים עיבד RNA, חסר הקשר הסלולר בעיצובים ניסיוני. בצורת בתא, שעתוק RNA תבנית והן 2'-הו acylation מתרחשות בתוך תאים חיים; לכן, התוצאות ניתן לסכם המודל המבני RNA בהקשר הסלולר. הצורה בתא שהופנתה כמו vivo צורה עבור הצורה נשא בתאים חיים ספרות24. מאז הניסוי הזה לא מתבצע בחיה, אנחנו כינה את הניסוי הזה בתא הצורה על דיוק.

האסטרטגיות עבור השלב סיומת פריימר של הפריה וצורה בתא הם גם שונים. בצורת גופית, שעתוק במהופך עוצר המיקום acylation 2'-או בנוכחות Mg2 +. סיומת פריימר 32P-בעל התווית ולכן מופיע עם הלהקה ב לזיהוי בג'ל (עמוד), האינטנסיביות של הלהקה הוא יחסי קצב acylation1. בצורת בתא, שעתוק במהופך יוצר מוטציות אקראיות ב- 2'-. הו-adduct עמדה בנוכחות Mn2 +. קצב mutational של כל נוקלאוטיד ניתן ללכוד מאת עומק הדור הבא רצפי ולאחר מכן ניתן לחשב את תגובתיות צורה ברזולוציה נוקלאוטיד יחיד.

בעיה פוטנציאלית עבור צורה בתא הוא יחס אות לרעש נמוך (קרי, רוב הקבוצות 2'-הו הוא שלא שונתה, ואילו רצפי יאומתו לכבוש את רוב קרא ב הדור הבא רצפי). לאחרונה, שיטה להעשיר 2'-. הו-שינוי RNA, המכונה כמו vivo לחץ על צורה (icSHAPE), פותחה על ידי מעבדה צ'אנג25. שיטה זו העשרה עשוי להיות יתרון בלימוד חלש מולקולות קטנות כגון אינטראקציות RNA, בפרט חקירה transcriptome ברוחב.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. במבחנה צורה

הערה: הפרוטוקול זה ששינה את פרוטוקול שפורסמו1.

  1. הכנת תבנית הרנ א
    הערה: התבנית עבור שעתוק T7 פקדו סינתטי זוגית גדילי הדנ א (dsDNA), מוגבר על ידי גם הכניסה לתוך וקטור e. coli שיישא זוג ייחודי של אתרי endonuclease ההגבלה EcoRI/BamHI, כגון pET28a, או על-ידי ה-PCR. הפרוטוקול עבור הגברה PCR מודגם להלן.
    1. מערבבים את החומר הבא: מערבבים 50 μL של ה-PCR מאסטר (ראה טבלה של חומרים), μL 2 עבור כל תחל ב- 10 μM (ראה טבלה 1 עבור רצפי), 200 ng של תבנית dsDNA 2 μL μL 3 של דימתיל סולפוקסיד (דימתיל סולפוקסיד), ואת μL 41 של H2O. Aliquot לתוך שני PCR צינורות (כל שפופרת מכיל 50 μL תערובת התגובה).
    2. להגדיר הצנטרפוגה תרמי כדלקמן: שלב 1) 95 ° C ל 30 s; שלב 2) 95 ° C עבור 20 s; שלב 3) 56 ° C עבור 20 s; שלב 4) 72 ° C עבור 20 s; שלב 5) לולאה לחזור שלב 2 מחזורים 30; שלב 6) 72 מעלות צלזיוס למשך 3 דקות; ושלב 7) אינסופי מחזיק ב 4 ° C עד השלב הבא.
    3. לטהר את אמפליקון PCR על ידי מיצוי של ג'ל פרוסות (ראה טבלה של חומרים ושימוש הפרוטוקול של היצרן). Elute את המוצר DNA עם 35 μL מאגר טריס-EDTA (TE), המכיל 10 מ מ טריס (pH 8.0) ו- 1 מ מ EDTA, להניב תשואה של 0.1-0.5 μg/μL תבנית. לנרמל את תבנית ה-DNA מטוהרים לתוך 0.10 μg/μL.
      הערה: באופן אופציונלי, האיכות של התבנית עשוי להיות מנותח כ- 1.8% agarose בג'ל עם μg 0.10 של ה-DNA. להקה אחת של DNA התבנית הרצויה צפוי על הג'ל.
    4. להגדיר את התגובה שעתוק T7 (הנפח הכולל 40 μL) על-ידי הוספת החומרים הבאים לתוך צינור ה-PCR: 4 μL של 10 x תגובת מאגר, μL 4 של ATP, μL 4 של CTP, μL 4 של GTP, 4 μL של זוג שזור, μL 4 של האנזים T7 (ראה טבלה של חומרים) , ΜL 4 של מטוהרים אמפליקון PCR מ שלב 1.1.3 (0.4 μg) ולאחר 12 μL של diethyl pyrocarbonate (DEPC)-מים מטופלים. מערבבים על-ידי pipetting למעלה ולמטה 4 x. דגירה ב 37 ° C עבור h 4-16 הצנטרפוגה תרמי או חממה של 37 ° C.
      הערה: להתחיל להגדיר שלב 1.1.6 בזמן התגובה בשלב 1.1.4 היא מתמשכת.
    5. להוסיף 2 μL של DNase לערבב על ידי pipetting למעלה ולמטה 4 x, דגירה ב 37 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות מערבבים עם נפח שווה של 2 x טריס-בוראט-EDTA (TBE)-מאגר דוגמאות אוריאה (ראה טבלה של חומרים). חום-70 מעלות צלזיוס למשך 3 דקות להשבית.
    6. בבקבוק נטולת RNase, לערבב 75 מ של 40% פתרון אקרילאמיד/bisacrylamide (29:1, ראה טבלה של חומרים), g 180.2 של אוריאה, ו- 50 מ של מאגר x TBE 10 (ללא RNase, ראה טבלה של חומרים). לשים את הבקבוק שייקר מסלולית (250 סל"ד) עד כל הגבישים של שתנן הם התפרקה (עשוי לקחת עד 2 שעות). לכוון את עוצמת הקול עד 500 מ"ל מים שטופלו DEPC. לסנן את הפתרון עם קרום 0.2 μm (ראה טבלה של חומרים).
      הערה: בתהליך זה, להימנע באמצעות סימונים ובר stir-למניעת זיהום RNase. ניתן לאחסן את הפתרון ב 4 ° C עד 1 שנה.
    7. לנקות שתי צלחות זכוכית אלקטרופורזה בגודל תקין (16.5 ס"מ x 24 ס מ) עם מים יונים ו- 70% EtOH באמצעות פיסת נייר ניגוב. יישר את הצלחות עם זוג של מפרידי 2.0 מ מ (לצלחת עם משטח siliconized פונה כלפי פנים), לאטום את הקצה של הצלחות עם הקלטת. זוגיות-הקלטת לפינה של צלחת למניעת דליפה.
    8. בגביע, לערבב 200 מ של אקרילאמיד פתרון של שלב 1.1.6, 2.0 מ של 10% אמוניום persulfate פתרון 100 μL של tetramethylethylenediamine (TEMED) עם הטיפ פיפטה נטולת RNase על ידי ערבוב במהירות על הטיה ס' 30 הלוחות על חתיכה של benchtop המכסה ויוצקים הפתרון מן הפער של הלוחות. הקש על הלוח כדי להרים את כל בועות ולהניח את הצלחת שטוח על השער benchtop. מיד להוסיף את המסרק ולתת את הג'ל פולימריזציה במשך לפחות שעה.
      הערה: אם הג'ל לשימוש בתוך למחרת, לכסות העליון של הג'ל עם פיסת מגבת נייר רטובה, לעטוף עם חתיכה גדולה של ניילון נצמד. למקם אותו שוכב שטוח ב 4 º C.
    9. הוצא את הקלטת, מהדק את הצלחת בדוכן אלקטרופורזה. להסיר את המסרק ולהוסיף נאותה מאגר x TBE 1 בחלק העליון והתחתון של המאגר. מראש להפעיל את הג'ל במשך 30 דקות בגיל 20 W.
      הערה: לחלופין, אם התוכן של RNA הרצוי ~ 90% או יותר, ניתן להשתמש ג'ל מיני בהתמרה של ג'ל מפוח.
    10. לשטוף כל הבארות טעינה על-ידי pipetting למעלה ולמטה פעמיים עם הנוזל בתוך המאגר. הוסף RNA גולמי הצעד 1.1.5 הבארות. הפעל את הג'ל בגיל 20 W עד קסילן cyanol FF לצבוע (תכלת) יעבור כשני שלישים של הג'ל אורך (~ 60 דקות).
      הערה: להבטיח לטעון לא יותר מאשר שליש הגובה של הבאר (השתמש במספר בארות במידת הצורך).
    11. לטבול את הג'ל במאגר x TBE 1 עם 1:10,000 דילול של הכספת לצבוע (ראה טבלה של חומרים) במיכל גדול מספיק עבור הג'ל. לשים את הגורם המכיל תפקודי לב / נשימה במשך 5 דקות במהירות של 80 סל ד.
    12. תחת אור UV, לזהות את הלהקה RNA הרצוי וחותכים במהירות פס דק של הג'ל באמצעות סכין גילוח נקי. מקום 1 – 2 פרוסות ג'ל צינור 1.7 מ.
    13. לשחזר את הרנ א הפרוסה ג'ל מאת • תנאי פסיבי. להוסיף תערובת • תנאי נאותה/משקעים (~0.3 מ לכל פרוסה) כל שפופרת: 0.3 M NaOAc (pH 5.2), 2.5 מטר LiCl, 1 מ מ EDTA, 0.1% dodecyl סולפט נתרן (מרחביות) במים שטופלו DEPC. לסובב את הצינור המכיל את splice(s) ג'ל ב 4 ° C עבור 16 h.
      הערה: קצב ההחלמה טיפוסי הוא ~ 75% בשלב זה. כדי להגדיל את התשואה, להסיר, לאסוף את eluent, להוסיף באותו אמצעי אחסון • תנאי המאגר ולאחר מכן חזור על שלב זה.
    14. לשלב את eluent בשפופרת 1.7 mL החדש. להוסיף 2.5 x EtOH קר כקרח, להפוך את הצינורות שש פעמים לערבב הנוזל, ולמקם הצינורות ב-80 מעלות צלזיוס במשך לפחות שעה.
    15. צנטריפוגה 10 דקות ב 10,000 x g ו- 4 מעלות צלזיוס. הסר בזהירות את תגובת שיקוע על-ידי pipetting. לשטוף בגדר RNA על-ידי הוספת 80% EtOH (1 מ"ל למחזור), מערבולת 15 s ו צנטריפוגה 10 דקות ב 10,000 x g ו- 4 מעלות צלזיוס.
    16. הסר את תגובת שיקוע, מילה נהדרת בגדר RNA עבור 5 דק להוסיף 50 μL של מים נטולי RNase מיקס על ידי pipetting למעלה ולמטה 10 פעמים. לנרמל את ריכוז ה-RNA 0.10 μg/μL. לאחסן את הרנ א מטוהרים ב-80 מעלות צלזיוס.
      הערה: יתר יבש בגדר RNA.
    17. לחלופין, כדי לנתח את איכות הרנ א, לדלל 1 μL (100 ng) של RNA של μL 1.1.16 ב 5 שלב של מים, לערבב עם 5 μL 2 x TBE-שתנן דוגמת המאגר. לאחר מכן, חום ב- 70 מעלות צלזיוס במשך 3 דקות, העומס על 6% ג'ל מיני TBE-אוריאה.
      1. הפעל הג'ל ב 180 V עבור ה 1 בצע ההכתמה כפי שנעשה צעד 1.1.11. דמיינו את הג'ל עם UV בכל מערכת הדמיה. להקה אחת צפויה לאורך הרצוי.
  2. הכנת את 32פריימר התווית על-ידי P
    1. להגדיר את התגובה על ידי ערבוב החומרים הבאים: μL 10 של γ -32P-ATP (~1.5 mCi, μM ~ 25, ראה טבלה של חומרים), 2 μL של שעתוק במהופך (RT) פריימר (100 μM, רצף ראו טבלה 1), 2 μL של x T4 10 polynucleotide קינאז (PNK) מאגר התגובה, μL 1 של T4 PNK (ראה טבלה של חומרים), ו μL 5 RNase ללא מים. דגירה ב 37 ° C עבור 1 h.
      התראה: הגנה ראויה היא הצורך צעדים 1.2-1.5 במקום מורשה עבור חומרים רדיואקטיביים.
    2. חום-הפוך ללא פעיל למשך 20 דקות ב- 65 מעלות צלזיוס. להוסיף את הדגימות לתוך צנטריפוגה ועמודה desalting ב g x 1000 עבור מינימלית 1 מערבבים את eluent עם μL 25 2 x TBE-שתנן דוגמת המאגר. .
      הערה: לאחסן את המוצר הגולמי שכותרתו ב-20 ° C, אם זה לא כדי להיטהר מיד.
    3. הפעל ג'ל אקרילאמיד 10% בגיל 20 W עבור 1 h.
      התראה: לטעון את 32פריימר התווית על-ידי P מ שלב 1.2.1 על גבי הג'ל ולהימנע דימום הרדיואקטיביות לתוך המאגר העליון. אל תטען יותר שליש הגובה של הבאר כדי להבטיח פס דק על הג'ל (השתמש במספר בארות במידת הצורך). הנוזל בתוך המאגר התחתון יכול להיות רדיואקטיבי.
    4. הסר צלחות זכוכית בקלטת ג'ל, להניח את הג'ל על חתיכה של ניילון נצמד. מקפלים בניילון נצמד כדי לכסות את החלק העליון של הג'ל לעשות סנדוויץ של אוויר חזק. מקם את הכריך ג'ל על מסך סידן פוספור tungstate ולחשוף עם כלי הדמיה. תמונה הג'ל שוב עם תאורה לדעת איפה הקצוות של הג'ל.
    5. השתמש בתוכנת עיבוד תמונה כדי כיסוי שתי תמונות. יישר את הג'ל על התמונה המודפסת. השימוש תער טריים לחתוך הלהקות הרצוי מתוך הג'ל. מניחים פרוסות ג'ל 1 עד 2 צינור 1.7 מ.
      הערה: ודא שהתמונה המודפסת יש באותו גודל כמו הג'ל בפועל. בדוק את היישור על ידי הדמיה הג'ל שאריות שוב לאחר חיתוך הפרוסה ג'ל.
    6. לשחזר את המפתח התווית על-ידי P 32על-ידי ביצוע שלבים 1.1.13 כדי 1.1.16. קח μL 1.0 של פתרון לתוך צינור 0.4 mL, לדלל את תחל עם מאגר טה 1 x כדי לקבל הרדיואקטיביות של μL 1.0-cpm ~ 100,000. חנות מטוהרים 32התווית על-ידי P תחל ב- 80 ° C עד ה-RNA 2'-או שינוי התגובה אך לא יותר מ- 4 שבועות.
  3. מולקולה קטנה איגוד והסבת 2'-הו RNA
    1. כדי להכין הארבעה, להוסיף 8 pmol RNA μL 32 0.5 x טה מאגר לרכבת התחתית 1.7 mL, חום ב 80 מעלות צלזיוס במשך 2 דקות, snap-cool על קרח לפחות 1 דקות.
      הערה: להשתמש במשוואה הבאה כדי לחשב את המשקל המולקולרי משוער של רנ א: MW = (# של בסיסים) x 340 Da.
    2. הוסף 8 μL של 5 x מתקפל תערובת המכילה 500 מ מ HEPES (pH 8.0), 20 מ מ MgCl2, 500 מ מ NaCl. Aliquot μL 9 של תערובת RNA לתוך כל אחד ה-PCR ארבעה צינורות, לתת להם תוויות #1-#4. להוסיף 1 μL של 10% דימתיל סולפוקסיד לתוך הצינורית #1, 1 μL של מולקולה קטנה מרוכז פתרון (10% דימתיל סולפוקסיד) לתוך #2, μL 1 של מולקולה קטנה מדולל פתרון (10% דימתיל סולפוקסיד) לתוך #3, 1 μL של מים לתוך #4.
    3. דגירה את המבחנות-37 מעלות צלזיוס הצנטרפוגה תרמי למשך 30 דקות.
    4. ממש לפני התגובה שינוי 2'-הו, לדלל 1 μL של פתרון מניות נאי (ז 2) עם 3 μL של מים שטופלו DEPC להניב הפתרון עובד 0.5 M. ללא דיחוי, הוסף 1 μL של NAI עובד פתרון לתוך צינורות #1, #2 ו- #3 1 μL של 25% דימתיל סולפוקסיד לתוך #4. דגירה-37 מעלות צלזיוס הצנטרפוגה תרמי למשך 15 דקות.
    5. הוסף μL 100 המשקעים / • תנאי לערבב (ראה שלב 1.1.13 למתכון) 2 μL של גליקוגן (15 מ"ג/מ"ל), ולהעביר וכל נוזלי כל שפופרת PCR לתוך צינור 1.7 מ. להוסיף מ 0.34 ל EtOH 200-הוכחה כקרח (3 x נפח) לתוך כל שפופרת. מיקס על ידי vortexing על 5 s ומקום הצינורות במקפיא-80 מעלות צלזיוס במשך לפחות שעה.
      הערה: במהלך תקופה זו, להתחיל לארגן הג'ל רצף כדי לשמש בשלב 1.5.1.
    6. צנטריפוגה למשך 15 דקות-14,000- g ו- 4 מעלות צלזיוס. הסר את תגובת שיקוע מבלי להפריע בגדר RNA. לשטוף בגדר RNA על-ידי הוספת 80% EtOH (0.5 mL למחזור), מערבולת 15 s ו צנטריפוגה למשך 15 דקות ב20, 000- g ו- 4 מעלות צלזיוס. הסר את תגובת שיקוע שוב.
      הערה: לחלופין, השתמש מונה גייגר כדי להבטיח בגדר רדיואקטיבי תמך בצינור.
    7. מילה נהדרת בגדר RNA עבור 5 דק μL 9 להוסיף מים נטולי RNase ומערבבים על ידי pipetting למעלה ולמטה 10 פעמים.
      הערה: יתר יבש בגדר RNA. כל המשקעים צפויה להיות מומס בסופו של שלב זה.
  4. הארכת תחל והכנה סמן
    1. להעביר את הרנ א ששונתה לתוך המבחנות 4 חדשים, לתת להם תוויות #1-#4 כמו בעבר. הוספת pmol 2 שליטה RNA μL 7 מים שטופלו DEPC אל 4 המבחנות נוספים, לתת להם תוויות #5 – #8. להוסיף 2 μL של פריימר radiolabeled (שלב 1.2.6) לכל הצינורות שמונה. מחממים anneal ב 65 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות, ואז מיד מגניב עד 4 ° C ב הצנטרפוגה תרמי.
    2. להוסיף 4 μL של 5 x מאגר RT (ראה טבלה של חומרים), 1 μL של dithiothreitol (DTT, 0.1 M), μL 1 של dNTP מיקס (10 מ מ כל אחד) לכל אחד המבחנות שמונה.
    3. להוסיף 2 μL שטופלו DEPC H2O צינורות #1-#4. להוסיף 4 μL של ddATP (5 מ מ), 4 μL של ddTTP (5 מ מ) ו- 4 μL של ddCTP (5 מ מ) לתוך צינורות #5 – 7, בהתאמה. להוסיף 1 μL של ddGTP (5 מ מ) ו- 3 μL של מים שטופלו DEPC צינור #8. פיפטה ארבע פעמים כדי לערבב.
    4. חום ב 52 ° C עבור 1 דקות בהצנטרפוגה תרמי. להוסיף 1 μL של רוורס טרנסקריפטאז (ראה טבלה של חומרים), ואז מערבבים על-ידי pipetting למעלה ולמטה ארבע פעמים. דגירה התגובה ב 52 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות.
    5. להוסיף 1 μL של 5 M NaOH לתוך כל הצינורות כדי hydrolyze את הרנ א. מחממים את הצינורות ב 95 מעלות צלזיוס במשך 5 דקות.
    6. להוסיף 5 μL של 1 M HCl וחזור על משקעים אתנול (שלבים 1.3.5 ו 1.3.6), אלא להשמיט את הגליקוגן ואת להעברת נוזלים.
      הערה: השמטת תוצאות שלב 1.4.6 באזור blurring באמצע הג'ל הידוע בשם "החזית מלח".
    7. מילה נהדרת בגדר DNA עבור 5 דק להוסיף 10 μL של H2O וטעמו μL 10 של 2 x TBE-שתנן טעינת מאגר, פיפטה לאורך 10 פעמים כדי redissolve. חום-70 מעלות צלזיוס במשך 5 דק במקום הצינורות על הקרח לפני כשהעמיסו על הג'ל.
  5. דף ניתוח
    1. כדי להכין ג'ל רצף של 8% לזיהוי, בצע שלבים 1.1.6 כדי 1.1.10 עם השינויים הבאים: 100 מ של 40% פתרון אקרילאמיד/bisacrylamide (29:1) כדי להכין פתרון אקרילאמיד 8%, וגם, צלחות זכוכית ג'ל רצף (למשל, 46 x 57 ס"מ) עם כרווח 0.4 מ מ.
    2. לטעון μL 10 של הדוגמה מהצעד 1.4.7. להפעיל את הג'ל על 65 W 2 h או עד לצבוע התחתון מגיע ל- 3/4 של הג'ל.
      הערה: אחסן את שאר הדגימות ב-80 מעלות צלזיוס חוזרות במידת הצורך.
    3. הסר את לוחית הזכוכית siliconized העליון על ידי הסרת את מרווח והכנסת בעדינות במרית. מניחים חתיכת נייר סינון גדול כדי לכסות את הג'ל והקש בעדינות כדי לאפשר את הג'ל לדבוק נייר הסינון. החל מן הקצה התחתון, נייר הסינון הרם, להסיר את הג'ל של לוח הזכוכית ביחד.
    4. מניחים את הג'ל עם נייר הסינון על חתיכת ניילון נצמד גדול מספיק כדי לכסות את כל הג'ל (נייר סינון פונה כלפי מעלה). להעביר את הכריך גלישת נייר סינון/ג'ל/פלסטיק ג'ל הברגה עם הצד נייר סינון פונה כלפי מטה.
      התראה: כדי למנוע זיהום רדיואקטיבי גשמי, להשתמש פיסות נייר סינון גדול בין הכריך ג'ל עוד 3-4 וג'ל הברגה.
    5. יבש את הג'ל ב 70 ° C עבור h 1 עם שואב אבק. להעביר את הכריך ג'ל על גבי קסטה פוספור מולבן-צילום מסך אחסון. לחשוף את הרדיואקטיביות של הג'ל על המסך עבור h 4-16.
    6. במקום את המסך אחסון זרחן על התקן הדמיה וסריקה עם רזולוציה בינונית (~ 30 דקות).
      הערה: אם חפץ דמוי חיוך על התמונה ג'ל, להשתמש בתוכנה ותיקון (למשל, צפא) לעבד את התמונה איכות לפרסום. זכור כי השביל הסמן הרגיל הוא ארוך יותר המסלולים שינוי 2'-הו 1 נוקלאוטיד.

2. בתא צורה

  1. העיצוב תחל
    הערה: בניגוד במבחנה צורה, צורה בתא אינו צריך לעצב קלטת של הביטוי. עם זאת, ערכה פריימר אופטימלית אמור לשמש, הערכת לפני הצורה הניסוי.
    1. צור לפחות שלושה ייחודי פריימר זוגות על ידי כלי עיצוב מבוסס הפיצוץ פריימר (למשל, פריימר-הפיצוץ). ללמוד pre-mRNA בתאים אנושיים, בחר הגנום האנושי (לא transcriptome) הפניה מסד נתונים בפריימר זוג ירידה לפרטים בדיקת פרמטרים. לבחור את גודל אמפליקון בטווח של 200-1000 base-זוג (bp).
    2. לחלץ את ה-DNA גנומי ~ 106 תאים עניין עם שיטה המבוססת על עמודה ספין עם הטיפול של RNase A, פרוטאז K (ראה טבלה של חומרים ושימוש הפרוטוקול של היצרן). לנרמל את הדנ א הגנומי מטוהרים במאגר טה 0.1 μg/μL.
    3. בדיקת PCR עם הפרוטוקול מתבצע בשלבים 1.1.1 ו 1.1.2.
      הערה: ערכת פריימר הרצוי אמור להניב להקה אחת על ג'ל agarose כ- 1.8%.
  2. תא הכנה והסבת 2'-הו
    הערה: כדי להגביר את השפע pre-mRNA של עניין, minigene עם הרצף הנכון תחת cytomegalovirus (CMV) יזם לביטוי מכוננת היא transfected לתוך התאים מארח.
    1. לחמם המדיום תרבות המכיל 10% סרום שור עוברית (FBS) ו x 1 לאנטיביוטיקה תערובת של Dulbecco ששינה נשר בינוני (DMEM) ב 37 º C. זרעי 293T תאים ב- 50% confluency 24 שעןת לפני תרביות תאים במדיום תרבות. לשנות את המדיום לתוך 2% FBS ב DMEM ללא אנטיביוטיקה ~ 1 h לפני תרביות תאים.
    2. להוסיף 10 μg של פלסמיד minigene 100 μL של התקשורת מופחת סרום (ראה טבלה של חומרים) 1 טוב של צלחת 96-ובכן. Pipette הפתרון למעלה ולמטה ארבע פעמים כדי לערבב.
    3. להוסיף 40 μL של תרביות תאים ריאגנט (ראה טבלה של חומרים) לתוך 100 μL של התקשורת מופחת סרום טוב אחר של הצלחת. פיפטה למעלה ולמטה ארבע פעמים כדי לערבב. דגירה בטמפרטורת החדר במשך 5 דקות.
    4. להוסיף את הפתרון פלסמיד כולו המתלה ריאגנט תרביות תאים. פיפטה למעלה ולמטה ארבע פעמים כדי לערבב. דגירה בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות.
    5. להוסיף את כל ה-DNA / תקנים ריאגנט תערובת dropwise על פני השטח של המדיום לאורך כל המנה. דגירה ב 37 מעלות צלזיוס במשך 6-12 שעות.
    6. האחות המדיום ולשטוף בעדינות פעם 5 מ של תמיסת מלח באגירה פוספט (PBS, pH 7.4, בלי CaCl2 ו- MgCl2, ראה טבלה של חומרים). Trypsinize התאים עם 3 מ"ל של טריפסין פתרון. דגירה בטמפרטורת החדר במשך 5 דקות.
    7. לדפוק את המנה בעדינות לנתק את התאים מהחלק התחתון של המנה. לנטרל טריפסין עם 6 מ של תרבות בינוני. צנטריפוגה ב x 300 גרם במשך 4 דקות ולהסיר את המדיום.
    8. Resuspend את התאים6 ~ 10 עבור כל דגימה ב 199 μL של התגובה בינוני (1% FBS ב DMEM) ולהעביר את המתלים תא לתוך צלחת 96-ובכן. דגירה התאים עם μL 1 של תרכובת הפתרון עובד או μL 1 של דימתיל סולפוקסיד כל שלושה פקדים למשך 30 דקות ב- 37 מעלות צלזיוס.
      הערה: 3 דגימות הבקרה יש לכלול: דימתיל סולפוקסיד שליטה עם נאי, שפגע בסימני RNA עם נאי, נאי שלילי שליטה.
    9. להוסיף 10 μL של 2 מ' נאי כל דגימה, למעט השליטה denaturing (DC) RNA ופקדים נאי שלילי. פיפטה למעלה ולמטה ארבע פעמים כדי לערבב. דגירה ב 37 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות לנער בעדינות את הצלחות להשעות מחדש את התאים בכל 5 דקות.
    10. העבר את התאים לתוך צינורות 1.7 mL, צנטריפוגה ב 400 x g למשך 2 דקות ללא דיחוי. הסר את תגובת שיקוע מבלי להפריע בגדר התא.
    11. להוסיף 0.4 מ של guanidinium thiocyanate (ראה טבלה של חומרים). מערבולת 15 s כדי homogenize. דגירה בדגימות בטמפרטורת החדר במשך 5 דקות.
      הערה: ניתן לאחסן את הדגימות ב-20 ° C עד שתמשיך לשלב הבא.
  3. החילוץ-RNA
    1. להוסיף כל הדגימות thiocyanate הומוגני guanidinium 0.2 מ של כלורופורם. מערבולת עבור Incubate ס' 15 בטמפרטורת החדר למשך 2 דקות.
    2. צנטריפוגה למשך 5 דקות ב- 12,000- g ו- 4 מעלות צלזיוס. השכבה העליונה מימית השקופה מכילה RNA. העברת μL ~ 380 של תמיסה מימית לתוך צינור 1.7 mL החדש.
      התראה: נא לא להפריע את לאטמוספרה כדי למנוע זיהום.
    3. להוסיף 1.5 x נפח של EtOH (μL ~ 570). מערבולת 15 s לערבב.
    4. להעביר 600 μL של RNA תערובת לתוך ספין-עמודה בעלת בידוד ה-RNA (ראה טבלה של חומרים). Centrifuge ב 12,000 x g עבור ביטול ס' 15 את eluent. חזור על שלב זה כדי לעבור דרך כל נוזל לתוך ספין באותה העמודה.
    5. לשטוף את העמודה עם 0.35 מ של מאגר RW1 (ראה טבלה של חומרים) על ידי סחרור עבור 15-ס' 80 להוסיף μL של נטול RNase DNase אני במאגר הדויוות (ראה טבלה של חומרים). דגירה בטמפרטורת החדר במשך 20 דקות.
      הערה: זה חיוני כדי להסיר את כל ה-DNA זיהום.
    6. לאחר מכן לשטוף את העמודה 0.35 מ ל מאגר RW1 ו- 0.6 מ"ל של מאגר x RPE 2 (ראה טבלה של חומרים) על ידי ספינינג 15 s בכל שלב. יבש את העמודה על-ידי צריך שתוציאו את העמודה ספין עם שפופרת ריק אוסף ב 12,000 x g עבור 1 דקות.
    7. הוסף μL 32 של מים נטולי RNase למרכז של העמודה. תקופת דגירה של 1 מינימלית צנטריפוגה ב x 12,000 g ב-30 s כדי להשיג ~ 30 μL של פתרון ה-RNA מטוהרים. לשים את הדגימות ב-20 ° C בעת עיבוד הדגימה denatured.
  4. . שפגע בסימני RNA שליטה הכנה
    1. מקום 30 µL דוגמת רנ א עבור DC 1.7 mL צינור פלסטיק על קרח. להוסיף 50 μL של formamide ו μL 15 DC מאגר המכיל 300 מ"מ HEPES (pH 8.0) ו- 25 מ מ EDTA לתוך הצינור.
    2. חום כדי denature את הרנ א ב 95 ° C עבור מינימלית 1 במהירות להוסיף 5 μL של פתרון מניות נאי (2 מ'), ואז סרט פעמיים כדי לערבב ולשים את הצינורית אל הרחוב חימום. דגירה ב 95 ° C עבור 1 דקות נוספות ואז מיד לשים את הצינורית על קרח.
    3. מוסיפים 0.4 מ של guanidinium thiocyanate. חזור על שלבים 2.3.1–2.3.4.
    4. לשטוף את העמודה עם 0.6 מ"ל של מאגר x RPE 2 (ראה טבלה של חומרים) על ידי ספינינג 15 s בכל שלב. יבש את העמודה על-ידי צריך שתוציאו את העמודה ספין עם שפופרת ריק אוסף ב 12,000 x g עבור 1 דקות.
    5. הוסף μL 32 של מים נטולי RNase למרכז של העמודה. תקופת דגירה של 1 מינימלית צנטריפוגה ב x 12,000 g ב-30 s כדי להשיג ~ 30 μL של פתרון ה-RNA DC התאושש.
  5. הארכת תחל
    1. לנרמל את פתרון ה-RNA 2.3.7 ו 2.4.5 לתוך 0.5 μg/μL עם מים ללא RNase. להכין טרי 30 מ מ MnCl פתרון2 מ- MnCl2∙4H2O אבקה.
    2. העברת μL 9 של RNA פתרון עבור כל דגימה לתוך רצועת ה-PCR. להוסיף 1 μL של 10 מ מ dNTP וμl 1 של μM 2 גנים ספציפיים פריימר (GSP) כל שפופרת. פיפטה למעלה ולמטה ארבע פעמים כדי לערבב. דגירה-65 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות ב הצנטרפוגה תרמי ולשים קרח על > 1 דקות.
      הערה: לחלופין, ניתן להשתמש μL 1 של nonamer אקראית בהתמרה של GSP.
    3. ב כל שפופרת PCR, להוסיף תערובת של 2 μL של 10 x מאגר RT (ראה טבלה של חומרים), 4 μL MnCl 30 מ מ2' וכן μL 2 מ"מ DTT. פיפטה לאורך 4 x לערבב. דגירה ב 42 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות.
    4. להוסיף 1 μL של רוורס טרנסקריפטאז (ראה טבלה של חומרים). פיפטה לאורך 4 x לערבב. דגירה-42 מעלות צלזיוס הצנטרפוגה תרמי במשך 3 שעות.
  6. ספריית הכנה ורצף הדור הבא
    1. להגדיר את תגובת ה-PCR על-ידי הוספת 1 μL של ה-DNA פולימראז, 5 μL של 10 x מאגר ה-DNA פולימראז (ראה טבלה של חומרים), 2 μL של דימתיל סולפוקסיד, 1.5 μL עבור כל אחד תחל (10 μM), 34 μL של H2O, ו- 5 μL של cDNA מהשלב 2.5.4.
    2. להגדיר הצנטרפוגה תרמי כדלקמן: שלב 1) 95 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות; שלב 2) 95 ° C ל 30 s; שלב 3) 60 ° C ל 30 s; שלב 4) 68 מעלות צלזיוס ל 30 s; שלב 5) לולאה לחזור שלב 2 מחזורים 30; שלב 6) 68 מעלות צלזיוס למשך 3 דקות; ושלב 7) אינסופי מחזיק ב 4 ° C עד השלב הבא.
    3. לטהר את אמפליקון באמצעות ג'ל agarose כ- 1.8%.
      הערה: הלהקה PCR אמור להופיע כלהקה יחיד על הג'ל.
    4. לבנות את הספרייה באמצעות פיצול סטנדרטיים ושיטות מצדו נוסדה בשנת ספרות6,26.
    5. רצף ציוד הדור הבא רצפי באמצעות 1 x 75 יחיד-end קריאות לייצר כ-10 מיליון קורא לכל דגימה.
    6. לנתח את התוצאות באמצעות ShapeMapper ו- SuperFold תוכנה חבילות שפותחה על ידי השבועות קבוצה26.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

אנחנו הפגינו בעבר כי RNA שחבור אפנן, SMN-C2, אינטראקציה עם מוטיב AGGAAG על אקסון 7 של pre-mRNA הגן SMN2, המשמש צורה כדי להעריך את השינויים המבניים של RNA בנוכחותו של SMN-C26. אתר איגוד של SMN-C2 היא נבדלת שאושרו על-ידי ה-FDA antisense oligonucleotide (אסו) עבור SMA, nusinersen, אשר נקשר וחוסם intronic splicing משתיק הקול (ISS) על אינטרון 727,28 (איור 1 א'). הכי ידוע splicing הרגולטורים SMN2 אקסון 7 נמצאים בטווח ~ 100 נוקלאוטיד של אקסון 7 ב- pre-mRNA29; לכן 140, 276 נוקלאוטיד באורך RNA רצפים שימשו צורה במבחנה, בתוך תא, representatively, אשר מכסה אקסון 7 ובאזור אינטרון סמוכים (איור 1 א').

בניתוח הזה נציג במבחנה צורה רצף הרנ א עניין מוטבע לתוך קלטת אופטימיזציה שפיתחה המעבדה שבועות, אשר תואם ל- RNA רוב רצפי1. לעיתים, הרצף של עניין אינטראקציה או משבש את הקלטת הזאת. במקרים אלה, ניתן להשתמש קלטת שהשתנתה עם שלושת המאפיינים הבאים: i) 3'-סוף פריימר ספציפי איגוד אתר עם משיכה הכלאה יעיל יותר עבור ומהצמיגים מאשר כל חלק רצף ה-RNA, ii) לולאה סיכת ראש מאוד מובנית ממוקם ישירות נגד הזרם של האתר מחייב פריימר אשר יציג ספציפי לשחזור צורת האות (זה will מעשה as שני פקד פנימי כדי להפוך את ניסוי השיטה כדי ליישר את האות ניסוי כדי ניסוי), ואת השלישי) מבנה סיכת ראש 5'-סיום רכיב, המציין את סוף האות צורה. בקלטת צורה נוספת צדי עם עצמי ביקוע ריבוזים רצפים-שני 5'- ומסתיים 3'-על מנת ליצור RNA הומוגנית30. מצאנו כי ראש פטיש, הפטיטיס דלתא וירוסים ribozymes תואמים בקלטת צורה, בדרך-כלל נותן תשואה גבוהה של RNA הרצוי. תבנית הנוצרת RNA יש 3'-קצה 2', פוספט 3'-מחזורית, 5'-סופו של קבוצת הידרוקסיל, אשר לא יפריעו הארכת תחל. רצף ארוך 140-nucleoside כיסוי אקסון 7 של SMN2 ואיזור סמוכים ב- pre-mRNA סונתז בתוך קלטות הצורה ואת ריבוזים כמופיע באיור 1 ערכת.

באופן כללי, הרצף של עניין מאתרים במגרה הביטוי צריך להיות מספיק זמן. לכסות את סדר משניים או יותר פוטנציאל של המבנה. במקרה של SMN2 אקסון 7, אזור 140-נוקלאוטיד מכיל שני גזע לופ מבנים6,31. המבנה של האזור של ריבית משתנה-מקרה, צריך להיות מוערך על ידי משפט--שגיאה.

לזיהוי רצפי ג'ל עם מוצרים להרחבת פריימר התווית על-ידי P 32נבחר כדי להמחיש את הפרופיל במבחנה צורה בניסוי זה נציג. שיטה חלופית ויזואליזציה היא להשתמש אלקטרופורזה נימי עם פריימר דנ א שכותרתו fluorescently32. לזיהוי רצפי ג'ל, נוקלאוזידים ~ 20 ליד 5'-הסוף, ~ 10 נוקלאוטידים ליד 3'-סוף הרצף RNA עניין לא ניתן לאבחן באופן כמותי, בשל עוצר מדי פעם השלבים חניכה של שעתוק במהופך. ונמרץ להקות על דף ג'לים תעתיקים באורך מלא1.

דרך חלופית עבור שחזור ג'ל מפוח של תבנית ה-RNA (שלבים 1.1.6 כדי 1.1.12) הוא עומס יתר מיני ג'ל אם התשואה של תבנית ה-RNA הרצוי > 90%. מומלץ להסיר את עודף NTP מהמוצר RNA על ידי desalting את העמודה ואת eluting את הרנ א ב 50 µL טה המאגר. למדוד את ריכוז RNA וטען µg 5.0 כל היטב. במהלך הטיהור צעד T7 עיבד תבנית ה-RNA, תפסיק את הדף קסילן cyanol FF לצבוע (תכלת) נפטר כשני שליש 6% שפגע בסימני ג'ל TBE-אוריאה. השבר RNA העצמי-המחשוף (< נוקלאוזידים 80) עברו את הג'ל, אשר עזבו את הרנ א הרצויה כמו הלהקה היחידה הג'ל על צביעת (איור 1B).

SMN-C2 (איור 1C) היה מסונתז על פי הנוהל שפורסם33 , מומסים בתמיסה מניות דימתיל סולפוקסיד 10 מ מ. הפתרון מניות נוסף מדולל 500 ו- 50 מיקרומטר ב 10% הפתרון דימתיל סולפוקסיד להשגת ריכוז סופי של 50 ו- 5 מיקרומטר, בהתאמה. RNA מקורר הצמד refolded לשלב את שיווי משקל בנוכחות דימתיל סולפוקסיד או SMN-C2 בתוך 30 דקות ב- 37 מעלות צלזיוס. זמן הדגירה ארוך לא שינתה את תוצאת הניסוי. שני מדגמים ניסיוני (50 ו- 5 מיקרומטר SMN-C2), שניים שולט (דימתיל סולפוקסיד, נאי-פקדים), ארבעה סמנים (A, T, G, C) טופלו במשך הארכת תחל. לאחר שחשף את הג'ל למסך אחסון פוספור, יראה ניסוי יירוט מוצלח צורה: i) יחיד ונמרץ ביותר להקה בחלק העליון של ג'ל ו- ii) להקות ברחבי הג'ל ברזולוציה נוקלאוטיד יחיד בלי השמצות (איור 1D). בעיה נפוצה בניתוח דף הוא אזור השמצות הידוע בשם "החזית מלח" עשויים להופיע באמצע הג'ל (איור 1E). זאת כנראה בשל ריכוז גבוה של מלח, דימתיל סולפוקסיד, או אחרים לא רצויים חומר במדגם טוען כי ניתן להסיר באמצעות אתנול משקעים.

ב במבחנה צורה, תבנית ה-RNA טהורה היא המפתח עבור ניסוי יירוט מוצלח. תבנית ה-RNA טמא הוא בדרך כלל הגורם לתוצאות לא רצויות. דף ניתוח מראה בבירור דפוס של 2 סטים של סמנים, מציין כי התבנית RNA אינה הומוגנית, צריך כדי להיות repurified על ידי מפוח ג'ל TBE-אוריאה.

עבור צורה בתוך תא, מפתח כדי ניסוי יירוט מוצלח הוא לעצב ערכה פריימר ממוטב עבור הגברה. עם µg 0.10 של תבנית cDNA ללא ה-DNA גנומי, להקה אחת להתייחס בתוך 25 מחזורי PCR בניתוח ג'ל agarose. לכן יש להימנע הרצפים אינטרון חוזרות. ללמוד את מבנה נבדקה ההשפעה של SMN-C2-SMN2 pre-mRNA, פריימר שלושה סטים (טבלה 2), ולא כל מה משביע רצון (איור 2 א).

מספר נמוך עותק של רצף יעד ה-RNA היא בדרך כלל בעיה עבור צורה בתא. כדי להעשיר את הרנ א עניין, minigene המכיל את רצף הרנ א עניין תחת מקדם CMV חזק היה transfected לתאים 293T. כי הדפוס splicing של minigene SMN2 recapitulates של אנדוגני SMN2 עם או בלי SMN-C219,34, נוכל לדמות את המבנה של SMN-C2 RNA שמעצבת ב overexpressed SMN2 pre-mRNA סביר היה זהה המוצר ג'ין אנדוגני. בעוד ה EC50 של SMN-C3 ב וזמינותו splicing היה ~0.1 מיקרומטר6,19, ריכוז בסוף גבוה יותר (20 מיקרומטר) שימש כדי להבטיח המדינה מחייב של מולקולה קטנה, רצף המטרה RNA.

על בידוד של RNA, תחל גם גנים ספציפיים וגם אקראי יכול לשמש עבור סיומת. במקרה של אקסון 7 של SMN2, מצאנו כי SMN2E7-338-RV (טבלה 2) מניב עותק cDNA המבוקש גבוה יותר מאשר nonamer אקראיים, שמעידים להקה יותר אינטנסיבי ב- PCR הגברה עם סט פריימר SMN2E7-276 (טבלה 2) לאחר 25 מחזורי. בשלב שינוי 2'-או, µM 91 ריכוז סופי נאי שימש תקופת דגירה של 15 דקות. אם נעשה שימוש של סוג התא שונים או בינוני, זמן הדגירה חייב להיות מחדש ממוטבת. אם זמן הדגירה ארוך מדי, agarose ג'ל ניתוח אמפליקון ייכשל לפעמים להראות להקה.

פיתון תוכנית מבוססת, ShapeMapper, שפותחה על ידי השבועות מעבדה35 שימש כדי לנתח את הנתונים שנוצרו על-ידי הדור הבא רצף [עבור הנתונים הגולמיים של SMN-C2 מטופלים בתא צורה של SMN2 אקסון 7 pre-mRNA, מתייחסים אל ארכיון קריאה ברצף (ההזמנות) מאגר מידע]. ברחבי אמפליקון, תגובתיות צורה ולא באופן משמעותי שינו (> 1), מה שמעיד כי המבנה משני נשאר בנוכחותו של SMN-C2 (איור 2B). זה גם אושר על ידי החלקות קשת הנוצר על ידי SuperFold35. הקווים חיבור מציינים אפשרי הבסיס הזיווג בהתבסס על צורת הפעילות של כל נוקלאוטיד. SMN-C2 ו דימתיל סולפוקסיד-שטופלו דוגמנות RNA הוא בעצם אותו (איור 2C). תגובתיות דיפרנציאלית בתא צורה מחושב עבור כל נוקלאוטיד (איור 2B) ולאחר השינוי תגובתיות לרוב אירעה ב TSL-1 (5'-סוף אקסון 7) אבל לא חיים רותם-2 (3'-סוף אקסון 7). תוצאה זו מסכים עם צורה במבחנה; למרות הבסיס הזיווג זז מן במבחנה דוגמנות RNA צורה בדמות בתא מנתח (איור דו-ממדי).

בעיה נפוצה של צורה בתא הוא קצב מוטציה נמוכים ברחבי אמפליקון. זה בדרך כלל בגלל זיהום הדנ א הגנומי. ה-DNA אינו מכיל קבוצת 2'-הו; לכן, אף מוצר acylation נוצר עם נאי. PCR-הגברה ובכך רק משקף את קצב מוטציה נמוכים של ה-DNA פולימראז. בידוד של RNA מאת thiocyanate guanidinium, ואחריו-עמודות DNase עיכול מספיקה להסיר את כל ה-DNA ברוב המקרים. אם ה-DNA זיהום נמשכת, חזור על שלב 2.3 לבידוד RNA.

Scheme 1
ערכת 1: רצף ה-DNA עבור התבנית של שעתוק RNA. הרצף bp 12 בתוך הרצף ריבוזים וירוס האמרהאד באדום הוא המשלים הפוכה של ה-12 הראשון bp של 5'-בקלטת. רצף הרנ א עניין שהוצגו במסמך זה הוא 140 רצף ה-pre-mRNA bp מכיל אקסון 7 לייעו SMN2 אנושי. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 1
איור 1: עיצוב ניסיוני, תוצאה של צורה במבחנה SMN2 אקסון 7 pre-mRNA בנוכחותו של SMN-C2. (א) סקירה של הרצף של עניין ללימודי צורה במבחנה, בתא של הגן SMN2. SMN-C2 מאגד את מוטיב AGGAAG על אקסון 7, במיקום ייחודי מתוך אתר איגוד nusinersen. (B) טיהור של המוצר שעתוק T7. כל אחד שלושה מסלולים מכיל µg 5.0 של RNA גולמי. הג'ל TBE-שתנן הוכתם SYBR חסיני (1:10, 000) עבור 5 דקות במאגר x TBE 1. תיבת מקווקו אדום מציין הקצה של כריתה להתאוששות RNA. (ג) המבנה של SMN-C2. (ד) צורה במבחנה ניסוי עם נאי ו 140 נוקלאוטיד באורך RNA תבנית המכילה אקסון 7. 1 = דימתיל סולפוקסיד; 2 = SMN-C2 (50 מיקרומטר); 3 = SMN-C2 (5 מיקרומטר); 4 = חסר של NAI; 5-8 = סולמות שנוצר על ידי תוספת של ddATP, ddTTP, ddCTP ו- ddGTP במהלך הארכת תחל. דף בוצעה בחוץ על ג'ל רצף TBE-אוריאה ב-60 W עבור ה 3 אדום כוכביות לציין בעוצמה מוגברת הלהקה עם 50 מיקרומטר SMN-C26. הניסוי (E), זו דוגמה של אזור "מלח הראשית" בתיבת אדום מקווקו נפרדת. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 2
איור 2: הצורה בתא נגזר RNA המידול עבור SMN2 אקסון 7 pre-mRNA. הגברה (A) PCR עם פריימר שלוש כל ערכות (טבלה 2) הניבה להקה אחת בניתוח ג'ל agarose. 1 = SMN2E7-338, 2 = SMNE7-276, 3 = SMN2E7-251, 4 = סולם הדנ א. (B) בתא דיפרנציאלית צורה תגובתיות בתאים 293T minigene transfected SMN2 עבור 10 מיקרומטר SMN-C2 ו דימתיל סולפוקסיד ב- TSL1. תגובתיות צורה ברזולוציה נוקלאוטיד יחיד. סטיית התקן שלה היה מחושב על ידי תוכנה ShapeMapper35. כוכביות ירוק עולה משמעותית שינוי תגובתיות של צורה, המושרה על ידי 10 מיקרומטר SMN-C2. גם מספור נוקלאוטידים ב אמפליקון bp 276 שמוצג ב- x-ציר. קווי שגיאה הוערך על ידי הצורה-ממפה תוכנה26. (ג) מגרש קשת הנוצר על ידי SuperFold35 עבור הסביר ביותר מבנה הרנ א משני מידול על-ידי נתוני צורה בתא. (ד) במבחנה, בתא מכוון צורה מידול של אקסון 7 ואזורים סמוכים. לדגם ה-RNA במבחנה, צורה ייצוב קלטת (כתום) ואת נוקלאוטידים 1-19 (כחול) מוצגים סקיצה. לדגם ה-RNA בתא, נוקלאוטיד מספור מיושר עם תבנית צורה במבחנה. נוקלאוטידים 1-18 ו- 120-140 הושמטו. שינויים משמעותיים תגובתיות נקובים באדום וירוק כוכביות עבור הצורה במבחנה, בתאים, בהתאמה. המבנים משני כי היו שם קודם לכן TSL1 ו- TSL231 מוקפים בתיבות כחולות. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

פריימר שם 5 - 3' רצף
ריבוזים-FW TAAAACGACGGCCAGTGAAT
ריבוזים-RV GCAGGTCGACTCTAGAGGAT
RT פריימר GAACCGGACCGAAGCCCG

טבלה 1: רצפי פריימר בשימוש הנציג של הניסוי.

שם רצף (5 '-> 3')
SMN2E7-338-FW AAAGACTATCAACTTAATTTCTGA
SMN2E7-338-RV TGTTTTACATTAACCTTTCAACT
SMN2E7-276-FW AATGTCTTGTGAAACAAAATGCT
SMN2E7-276-RV AACCTTTCAACTTTCTAACATCT
SMN2E7-251-FW TGAAACAAAATGCTTTTTAACATCC
SMN2E7-251-RV TCAACTTTCTAACATCTGAACTTTT

בטבלה 2: תחל מגדירה עבור הגברה של רצף ה-pre-mRNA עניין. כל ערכות פריימר שלוש תשואות של אמפליקון יחיד בתגובה PCR עם תבנית cDNA ללא ה-DNA גנומי.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

בצורת גופית, חיוני להשתמש בתבנית ה-RNA הומוגנית באיכות גבוהה. T7 שעתוק, עם זאת, לעיתים קרובות התשואות רצפים הטרוגנית36. במיוחד, רצפי עם נוקלאוטיד ±1 בקצהו 3'-עם תשואות שעצירת36 קשים בדרך כלל שיוסרו על-ידי לזיהוי ג'ל לטיהור. תבנית ה-RNA הטרוגניות עלולים לגרום קבוצה אחד או יותר של האות בבניית פרופילים ג'ל רצף של המוצר פריימר הרחבה, אשר לפעמים מקשה לפרש את התוצאה. ריבוזים-שני 5'-3'-סוף בקלטת ביטוי תבנית הרנ א יעשה בשני הקצוות הומוגנית.

עבור צורה במבחנה וגם בתא, זמן הדגירה של ריאגנטים שינוי 2'-הו הוא גורם קריטי נוסף. הוצע על ידי קבוצת שבועות לפחות חמש פעמים מחצית החיים של ריאגנט acylation 2'-הו מים להרוות צריכה להיות בשימוש1. בידיים שלנו, המקננת עם נאי (T1/2 = ~ 20 דקות) עבור > 30 דקות במצב במבחנה וגם בתא מתבטא תוצאה overreacted. כפי שמוצג באיור 1D, טוב במבחנה צורה פרופיל צריך > אות סה כ 50% על גבי הג'ל בתור תעתיק באורך מלא, המבטיח כי רוב שונה רנ א היא acylated רק פעם אחת. תגובת יתר יעבד את המוצר כפול-acylated שעצירת, פרופיל בשאלונים המוצרים הארכת אורך קצר מועשר. בצורת בתא, אמפליקון להקמת ספריה אמור להופיע כלהקה יחיד בניתוח ג'ל agarose (שלב 2.6.3). השמצות של הלהקה מציין מוגזמת, הפעם incubate צריך להיות מופחת. בניסויים נציג, זמן הדגירה 15 דקות ב 37 ° C היה אופטימלי במבחנה וצורה בתא. זה אמור לשמש כנקודת התחלה נאי שינוי ביישומים דומים.

. יש אחרים 2'-או שינוי ריאגנטים22 בשימוש נרחב עבור צורה, כגון 1 מ' 7 בהשוואה לנאי, 1 מ' 7 יש תגובתיות טובה יותר של קבוצה 2'-הו, מחצית חיים קצר יותר מים22. בידיים שלנו, 1 מ' 7 הקים כמות עצומה של משקעים צהובים בתקשורת התרבות התא בניסוי צורה בתאים, אשר מורכב הבידוד RNA. מסיבה השוואה, צורה במבחנה וגם בתא משמש נאי הכימית שינוי 2'-הו למחקר של SMN-C2 ואינטראקציות pre-mRNA SMN2. אם רק במבחנה צורה נדרשת, 1 מ' 7 הוא אפשרות חלופית כפי שמתואר על ידי מחקרים שונים ב- riboswitch-נחישות מבנית-7,-8.

באופן כללי, בתא צורה צורה במבחנה הוא המועדף, במיוחד אם המולקולה ככל הנראה מתנהג בגרעין התא האיקריוטים. RNA-מחייב חלבונים בגרעין בשפע, זה כמעט בלתי אפשרי לסכם את ההקשר הסלולר בתנאים במבחנה.

בעשור האחרון, הצורה הופך השיטה הרגילה ללמוד את מבנה שניוני של RNA. בהשוואה footprinting RNA מסורתי עם RNase37, זה מתאים יותר ללמוד אינטראקציות מולקולה קטנה-RNA, כמו אלה אינטראקציה לפעמים יכול להיות חלש וחסר רגישות RNase אתגרים.

המגבלה העיקרית של שימוש צורה ללמוד קטנות הנוצרות על-ידי מולקולת RNA שינויים מבניים היא כי התוצאות שלה אינם מגלים באתר האיגוד. במצב במבחנה, בתא של SMN-C2 מאוגד pre-mRNA, תגובתיות צורה לא השתנה באתר איגוד בשם (1D איור, איור 2B); במקום זאת, תגובתיות באתרים מרוחקים 2-3-האזור לולאה או זז שונה. SMN-C2 יש להניח נקשר לאזור RNA סליל כפול (1D איור, איור דו-ממדי), אשר בדרך כלל יש תגובתיות נמוכה של הצורה. לכן, נוסף לייצב את המבנה כדי להקטין את הצורה תגובתיות כנראה לא יהיה נצפות. כדי ליצור אתר איגוד בשם, שיטות אחרות כגון ChemCLIP38 אמור לשמש, שבו בדיקה כימית crosslinking מעורב.

גישה חלופית משותפת כדי למפות RNA משניים או יותר המבנה של נוקלאוטיד dynamics הוא NMR ספקטרומטר39,40. זה הוכח, כי הדינמיקה RNA נגזר ניתוח NMR כמותית correlate חריפה עם צורת פעילות39. בהקשר של מולקולה קטנה מחייב, shift כימי לפליטת יכול לחשוף נוקלאוטידים שמעצבת את21.

ככל פילוח RNA מולקולות קטנות מודאליות חדשה של פיתוח תרופות11, נוכל לדמות כי הצורה יוקם כמו מתודולוגיה סטנדרטי כדי להעריך את ההשפעות מבנית של RNA היעד בנוכחות מולקולות קטנות. בעתיד, שיטת החקירה כולו transcriptome לסמים מולקולה קטנה פילוח RNA היא הרצויה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים מצהירים ללא ניגוד אינטרסים.

Acknowledgments

עבודה זו התאפשרה על ידי המענק NIH R01 (NS094721, K.A.J.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DNA oligonucleotide IDT gBlock for >200 bp DNA synthesis
Phusion Green Hot Start II High-Fidelity PCR Master Mix Thermo Fisher F566S
NucleoSpin gel and PCR clean-up kit Takara 740609.50
MegaScript T7 transcription kit Thermo Fisher AM1333 Contains 10x reaction buffer, T7 enzyme, NTP and Turbo DNase
DEPC-treated water Thermo Fisher 750023
2x TBE-urea sample buffer Thermo Fisher LC6876
40% acrylamide/ bisacrylamide solution (29:1) Bio-Rad 1610146
10x TBE buffer Thermo Fisher 15581044
Nalgene Rapid-Flow™ Filter Unit Thermo Fisher 166-0045
Kimwipe Kimberly-Clark 34133
TEMED Thermo Fisher 17919
SYBR-Safe dye Thermo Fisher S33102
6% TBE-urea mini-gel Thermo Fisher EC6865BOX
ChemiDoc Bio-Rad
T4 PNK NEB M0201S
γ-32P-ATP Perkin Elmer NEG035C005MC
Hyperscreen™ Intensifying Screen GE Healthcare RPN1669 calcium tungstate phosphor screen
phosphor storage screen Molecular Dynamics BAS-IP MS 3543 E
Amersham Typhoon GE Healthcare
NAI (2M) EMD Millipore 03-310
GlycoBlue Thermo Fisher AM9515
SuperScript IV Reverse Transcriptase Thermo Fisher 18090010 Contains 5x RT buffer, SuperScript IV
dNTP mix (10 mM) Thermo Fisher R0192
ddNTP set (5 mM) Sigma GE27-2045-01
large filter paper Whatman 1001-917
Gel dryer Hoefer GD 2000
QIAamp DNA Blood Mini Kit Qiagen 51104 Also contains RNase A and protease K
SMN2 minigene34 Addgene 72287
Heat inactivated FBS Thermo Fisher 10438026
Pen-Strep Thermo Fisher 15140122
Opti-MEM I Thermo Fisher 31985062
FuGene HD Promega E2311
TrpLE Thermo Fisher 12605010
DPBS without Ca/Mg Thermo Fisher 14190250
TRIzol Thermo Fisher 15596018
RNeasy mini column Qiagen 74104 Also contains RW1, RPE buffer
RNase-Free DNase Set Qiagen 79254 Contains DNase I and RDD buffer
Deionized formamide Thermo Fisher AM9342
MnCl2•4H2O Sigma-Aldrich M3634
random nonamer Sigma-Aldrich R7647
SuperScript First-Strand Synthesis System Thermo Fisher 11904-018 Contains 10x RT buffer, SuperScript II reverse transcriptase
AccuPrime pfx DNA polymerse Thermo Fisher 12344024
NextSeq500 Illumina
NucAway column Thermo Fisher AM10070 for desalting purpose

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wilkinson, K. A., Merino, E. J., Weeks, K. M. Selective 2'-hydroxyl acylation analyzed by primer extension (SHAPE): Quantitative RNA structure analysis at single nucleotide resolution. Nature Protocols. 1, 1610-1616 (2006).
  2. Trausch, J. J., et al. Structural basis for diversity in the SAM clan of riboswitches. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111, 6624-6629 (2014).
  3. Souliere, M. F., et al. Tuning a riboswitch response through structural extension of a pseudoknot. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110, E3256-E3264. , E3256-E3264 (2013).
  4. Rice, G. M., Busan, S., Karabiber, F., Favorov, O. V., Weeks, K. M. SHAPE Analysis of Small RNAs and Riboswitches. Methods in Enzymology. , 165-187 (2014).
  5. Spitale, R. C., et al. RNA SHAPE analysis in living cells. Nature Chemical Biology. 9, 18-20 (2013).
  6. Wang, J., Schultz, P. G., Johnson, K. A. Mechanistic studies of a small-molecule modulator of SMN2 splicing. Proceedings of the National Academy of Sciences. 115, E4604-E4612 (2018).
  7. Price, I. R., Gaballa, A., Ding, F., Helmann, J. D., Ke, A. Mn 2+ -Sensing Mechanisms of yybP-ykoY Orphan Riboswitches. Molecular Cell. 57, 1110-1123 (2015).
  8. Hennelly, S. P., Sanbonmatsu, K. Y. Tertiary contacts control switching of the SAM-I riboswitch. Nucleic Acids Research. 39, 2416-2431 (2011).
  9. Abulwerdi, F. A., et al. Development of Small Molecules with a Noncanonical Binding Mode to HIV-1 Trans Activation Response (TAR) RNA. Journal of Medicinal Chemistry. 59, 11148-11160 (2016).
  10. Shortridge, M. D., et al. A Macrocyclic Peptide Ligand Binds the Oncogenic MicroRNA-21 Precursor and Suppresses Dicer Processing. ACS Chemical Biology. 12, 1611-1620 (2017).
  11. Warner, K. D., Hajdin, C. E., Weeks, K. M. Principles for targeting RNA with drug-like small molecules. Nature Reviews Drug Discovery. 17, 547-558 (2018).
  12. Mullard, A. Small molecules against RNA targets attract big backers. Nature Reviews Drug Discovery. 16, 813-815 (2017).
  13. Shortridge, M. D., Varani, G. Structure based approaches for targeting non-coding RNAs with small molecules. Current Opinion in Structural Biology. 30, 79-88 (2015).
  14. Gallego, J., Varani, G. Targeting RNA with Small-Molecule Drugs: Therapeutic Promise and Chemical Challenges. Accounts of Chemical Research. 34, 836-843 (2001).
  15. Rizvi, N. F., Smith, G. F. RNA as a small molecule druggable target. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. 27, 5083-5088 (2017).
  16. Connelly, C. M., Moon, M. H., Schneekloth, J. S. The Emerging Role of RNA as a Therapeutic Target for Small Molecules. Cell Chemical Biology. 23, 1077-1090 (2016).
  17. Palacino, J., et al. SMN2 splice modulators enhance U1-pre-mRNA association and rescue SMA mice. Nature Chemical Biology. 11, 511-517 (2015).
  18. Ratni, H., et al. Discovery of Risdiplam, a Selective Survival of Motor Neuron-2 ( SMN2 ) Gene Splicing Modifier for the Treatment of Spinal Muscular Atrophy (SMA). Journal of Medicinal Chemistry. 61, 6501-6517 (2018).
  19. Naryshkin, N., et al. SMN2 splicing modifiers improve motor function and longevity in mice with spinal muscular atrophy. Science. 345, (2014).
  20. Chiriboga, C., et al. Preliminary Evidence for Pharmacodynamics Effects of RG7916 in JEWELFISH, a Study in Patients with Spinal Muscular Atrophy who Previously Participated in a Study with Another SMN2-Splicing Targeting Therapy (S46.003). Neurology. 90, (2018).
  21. Sivaramakrishnan, M., et al. Binding to SMN2 pre-mRNA-protein complex elicits specificity for small molecule splicing modifiers. Nature Communications. 8, (2017).
  22. Lee, B., et al. Comparison of SHAPE reagents for mapping RNA structures inside living cells. RNA. 23, 169-174 (2017).
  23. Weeks, K. M., Mauger, D. M. Exploring RNA Structural Codes with SHAPE Chemistry. Accounts of Chemical Research. 44, 1280-1291 (2011).
  24. Smola, M. J., et al. SHAPE reveals transcript-wide interactions , complex structural domains , and protein interactions across the Xist lncRNA in living cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113, 10322-10327 (2016).
  25. Flynn, R. A., et al. Transcriptome-wide interrogation of RNA secondary structure in living cells with icSHAPE. Nature Protocols. 11, 273-290 (2016).
  26. Smola, M. J., Rice, G. M., Busan, S., Siegfried, N. A., Weeks, K. M. Selective 2 ′ -hydroxyl acylation analyzed by primer extension and mutational profiling (SHAPE-MaP) for direct , versatile and accurate RNA structure analysis. Nature Protocols. 10, 1643-1669 (2015).
  27. Hua, Y., et al. Antisense correction of SMN2 splicing in the CNS rescues necrosis in a type III SMA mouse model. Genes & Development. 24, 1634-1644 (2010).
  28. Hua, Y., et al. Peripheral SMN restoration is essential for long-term rescue of a severe spinal muscular atrophy mouse model. Nature. 478, 123-126 (2011).
  29. Wee, C. D., Havens, M. A., Jodelka, F. M., Hastings, M. L. Targeting SR proteins improves SMN expression in spinal muscular atrophy cells. PloS One. 9, e115205 (2014).
  30. Hammond, J. A., Rambo, R. P., Filbin, M. E., Kieft, J. S. Comparison and functional implications of the 3D architectures of viral tRNA-like structures. RNA. 15, 294-307 (2009).
  31. Singh, N. N., Singh, R. N., Androphy, E. J. Modulating role of RNA structure in alternative splicing of a critical exon in the spinal muscular atrophy genes. Nucleic Acids Research. 35, 371-389 (2007).
  32. Deigan, K. E., Li, T. W., Mathews, D. H., Weeks, K. M. Accurate SHAPE-directed RNA structure determination. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106, 97-102 (2009).
  33. Qi, H., et al. Preparation of pyridopyrimidine derivatives and related compounds for treating spinal muscular atrophy. , (2013).
  34. Lorson, C. L., Hahnen, E., Androphy, E. J., Wirth, B. A single nucleotide in the SMN gene regulates splicing and is responsible for spinal muscular atrophy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96, 6307-6311 (1999).
  35. Siegfried, N. A., Busan, S., Rice, G. M., Nelson, J. A. E., Weeks, K. M. RNA motif discovery by SHAPE and mutational profiling (SHAPE-MaP). Nature Methods. 11, 959 (2014).
  36. Milligan, J. F., Groebe, D. R., Witherell, G. W., Uhlenbeck, O. C. Oligoribonucleotide synthesis using T7 RNA polymerase and synthetic DNA templates. Nucleic Acids Research. 15, 8783-8798 (1987).
  37. Nilsen, T. W. RNase Footprinting to Map Sites of RNA-Protein Interactions. Cold Spring Harbor Protocols. , (2014).
  38. Velagapudi, S. P., et al. Design of a small molecule against an oncogenic noncoding RNA. Proceedings of the National Academy of Sciences. , 5898-5903 (2016).
  39. Barnwal, R. P., Yang, F., Varani, G. Applications of NMR to structure determination of RNAs large and small. Archives of Biochemistry and Biophysics. 628, 42-56 (2017).
  40. Scott, L. G., Hennig, M. RNA structure determination by NMR. Methods in Molecular Biology. 452, 29-61 (2008).

Tags

החודש יופיטר גיליון 143 מולקולה קטנה פילוח RNA RNA מבנה במבחנה צורה צורה ניוון שרירי עמוד השדרה RG-7916 בתוך תא
שימוש בחוץ גופית וצורה בתא לחקור מולקולה קטנה המושרה שינויים מבניים Pre-mRNA
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wang, J., Hammond, J., Johnson, K.… More

Wang, J., Hammond, J., Johnson, K. A. Using In Vitro and In-cell SHAPE to Investigate Small Molecule Induced Pre-mRNA Structural Changes. J. Vis. Exp. (143), e59021, doi:10.3791/59021 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter