Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

Använda i Vitro och i cell form att undersöka småmolekylära inducerad Pre-mRNA strukturella förändringar

Published: January 30, 2019 doi: 10.3791/59021
Automatic Translation
1, 2, 1
1Calibr, The Scripps Research Institute, 2Department of Integrative Structural and Computational Biology, The Scripps Research Institute

Summary

Detaljerade protokoll för både in vitro och i cell selektiv 2'-hydroxylgruppen acylation analyseras av primer filändelsen (form) experiment för att fastställa det sekundära strukturerar av pre-mRNA sekvenser av intresse i närvaro av en RNA-targeting liten molekyl är presenteras i denna artikel.

Abstract

I processen för läkemedelsutveckling RNA-targeting små molekyler önskas belysa de strukturella förändringarna vid deras interaktioner med målet RNA sekvenser. Vi tillhandahåller häri en detaljerad in vitro- och selektiv i cell 2'-hydroxylgruppen acylation analyseras av primer filändelsen (form) protokoll för att studera den RNA strukturförändringen i närvaro av en drog för spinal muskelatrofi (SMA), överlevnad motorneuronen (SMN)-C2, och i exon 7 av pre-mRNA av SMN2-genen. I in vitro-form, är en RNA-sekvens av 140 nukleotider som innehåller SMN2 exon 7 transkriberas av T7 RNA-polymeras, vikta i närvaro av SMN-C2 och därefter ändras av en mild 2'-OH acylation reagens, 2-methylnicotinic acid imidazolide (NAI). Detta 2'-OH-NAI addukt är ytterligare trotsat av 32P-märkt primer filändelsen och lösas av polyakrylamid gelelektrofores (sidan). Omvänt, 2'-OH acylation i cell formen sker på plats med SMN-C2 bunden cellulära RNA i levande celler. Den pre-mRNA-sekvensen av exon 7 i SMN2 genen, tillsammans med form-inducerade mutationer i tillägget primer, förstärktes sedan av PCR och omfattas av nästa generations sekvensering. Jämföra de två metoderna, in vitro-form är en mer kostnadseffektiv metod och kräver inte datorkraft att visualisera resultat. In vitro-form-derived RNA modellen avviker dock ibland från det sekundära strukturerar i cellulära sammanhang, sannolikt på grund av förlusten av alla interaktioner med RNA-bindande proteiner. I cell form behöver inte ett radioaktivt material arbetsplatsen och ger en mer exakt RNA sekundära struktur inom ramen för cellulära. Dessutom i cell formen är vanligtvis tillämplig för ett större utbud av RNA-sekvenser (~ 1000 nukleotider) genom att använda nästa generations sekvensering, jämfört med in vitro-forma (~ 200 nukleotider) som vanligtvis bygger på analys. I fall av exon 7 i SMN2 pre-mRNA, in vitro och i cell form härrör är RNA modellerna lika varandra.

Introduction

Selektiv 2'-hydroxylgruppen acylation analyseras av primer filändelsen (form) är en metod för mätning av kinetik av varje nukleotid i en RNA-sekvens av intresse och klarlägga det sekundära strukturerar på single-nucleotide upplösning1. FORM metoder, både i in vitro-villkor2,3,4 (renat RNA i en definierad buffertsystem) och levande däggdjursceller5,6, har utvecklats för att undersöka sekundärt struktur av medium längd RNA sekvenser (vanligtvis < 1 000 nukleotider för i cell form och < 200 nukleotider för in vitro-form). Det är särskilt användbart att utvärdera strukturella förändringar i receptorn RNA vid bindning till RNA-interagera småmolekylära metaboliter2,4,7,8 och studera mekanistiska åtgärder av målobjekt RNA molekyler under drog utveckling9,10.

RNA-targeting läkemedelsutveckling har nyligen dragit uppmärksamhet i akademiska laboratorier och läkemedelsindustrin11,12 via olika metoder och strategier13,14,15 ,16. Aktuella exempel på RNA-targeting små molekyler för klinisk användning är två strukturellt distinkta experimentella läkemedel, LMI-07017 och RG-791618,19, för spinal muskelatrofi (SMA), som visade lovande resultat i fas II kliniska prövningar20. Båda molekylerna var visat att målet överlevnad motorneuronen (SMN) 2 pre-mRNA och reglera processen skarvning av SMN2 genen6,17,21. Vi visat tidigare tillämpning av in vitro- och i cell form i en undersökning av de strukturella förändringarna som mål RNA i närvaro av en analog till RG-7916 kallas SMN-C26.

I princip mäter form 2'-OH acylation andelen varje nukleotid av en RNA-sekvens i närvaro av överskjutande belopp av själv släcka acylation reagens på ett opartiskt sätt. Acylation reagens är inte stabila i vatten, med en kort halveringstid på (t.ex., T1/2 = 17 s för 1-metyl-7-nitroisatoic bauxit; eller 1 M 7, ~ 20 min för 2-methylnicotinic acid imidazolide eller NAI)22 och okänslighet för identitet baser23. Detta resulterar i en mer gynnsam acylation av 2'-OH grupper av flexibla baser, som kan omvandlas till en korrekt bedömning av dynamiken i varje nukleotid. Specifikt, är en nukleotid i en base-par oftast mindre reaktiva än en oparade till 2'-OH modifiera reagens, såsom NAI och 1 M 7.

Tittar på källan till mallen RNA och där 2'-OH acylation sker, kan formen generellt delas in i in vitro och i cell form. I vitro form använder renat T7 transkriberade RNA och saknar en cellulär sammanhang i experimentell design. I cell form inträffa både RNA mall transkription och 2'-OH acylation inom levande celler; resultaten kan därför sammanfatta RNA strukturella modellen i cellulära sammanhang. I cell form har hänvisats till som i vivo form för formen i levande celler i den litteratur24. Eftersom detta experiment inte utförs i ett djur, kallas vi detta experiment i cell form för noggrannhet.

Strategierna för primer filändelsen scenen av in vitro och i cell form är också olika. I in vitro-form slutar omvänd Transkription vid 2'-OH acylation position i närvaro av Mg2 +. En 32P-märkt primer filändelsen förefaller därför som ett band i polyakrylamid gelelektrofores (sidan) och intensiteten i bandet är proportionell till acylation kurs1. I cell form, omvänd Transkription genererar slumpmässiga mutationer på 2'-OH addukt position i närvaro av Mn2 +. Mutationsanalys andelen varje nukleotid kan fångas av i djup nästa generations sekvensering, och formen reaktiviteten på single-nucleotide upplösning kan sedan beräknas.

Ett potentiellt problem för i cell form är låg signal-brus-förhållandet (dvs. en majoritet av de 2'-OH-grupperna är oförändrad, medan de omodifierade sekvenserna upptar mest av Läs i nästa generations sekvensering). Nyligen, en metod för att berika 2'-OH modifierade RNA, som avses i vivo Klicka formen (icSHAPE), utvecklades av Chang laboratorium25. Denna berikning metod kan vara förmånligt studera svaga små molekyler som RNA interaktioner, särskilt i en transkriptom-wide förhör.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. in Vitro form

Obs: Protokollet är modifierad från publicerade protokoll1.

  1. Förbereda mallen RNA
    Obs: Mallen för T7 transkription beställdes som en syntetisk dubbelsträngat DNA (dsDNA) och förstärks av antingen införande i en E. coli -vektor som bär ett unikt par av mina/BamHI begränsning Amiiiiin platser, såsom pET28a, eller med PCR. Protokollet för PCR-amplifiering illustreras nedan.
    1. Blanda följande material: 50 μl av PCR-master mix (se Tabell för material), 2 μL för varje primer i 10 μM (se tabell 1 för sekvenser), 200 ng för dsDNA template i 2 μL och 3 μL av dimetyl sulfoxid (DMSO) och 41 μL av H2O. alikvot in två PCR rör (varje tub innehåller 50 μL av reaktionsblandningen).
    2. Ställ termocykel enligt följande: steg 1) 95 ° C i 30 s; etapp 2) 95 ° C under 20 s; etapp 3) 56 ° C i 20 s; etapp 4) 72 ° C under 20 s; etapp 5) loop tillbaka till steg 2 för 30 cykler; etapp 6) 72 ° C under 3 minuter; och steg 7) oändlig hålla vid 4 ° C tills följande steg.
    3. Rena de PCR-Amplikonen genom utvinning av gel skivor (se Tabell för material och använda tillverkarens protokollet). Eluera produkten DNA med 35 μl av Tris-EDTA (TE) bufferten, som innehåller 10 mM Tris (pH 8,0) och 1 mM EDTA, ge en 0,1 – 0,5 μg/μL mall. Normalisera den rena DNA-mallen till 0,10 μg/μL.
      Obs: Kvaliteten på mallen kan alternativt analyseras på en 1,8% agaros gel-elektrofores med 0,10 μg DNA. Ett enda band med önskad mall DNA förväntas på gelen.
    4. Ställa in T7 transkription reaktionen (total volym 40 μl) genom att lägga till följande material i en PCR-röret: 4 μL 10 x reaktion buffert, 4 μL av ATP, 4 μL av CTP, 4 μL av GTP, 4 μL av UTP, 4 μL av T7 enzym (se Tabellen för material) , 4 μL av renat PCR-amplikon från steg 1.1.3 (0,4 μg) och 12 μL av dietyleter pyrocarbonate (DEPC)-behandlat vatten. Blanda genom pipettering upp och ner 4 x. Inkubera vid 37 ° C i 4 – 16 h i en termocykel eller i en 37 ° C inkubator.
      Obs: Börja med att ställa in steg 1.1.6 medan reaktionen i steg 1.1.4 pågår.
    5. Tillsätt 2 μL av DNAS, blanda genom pipettering upp och ner 4 x och inkubera vid 37 ° C i 15 min. Blanda med lika volym 2 x Tris-Borat-EDTA (TBE)-urea prov buffert (se Tabell för material). Värme vid 70 ° C för 3 min att inaktivera.
    6. I ett RNase-fri flaska, blanda 75 mL 40% akrylamid/bisacrylamide lösning (29: 1, se Tabell för material), 180.2 g urea, och 50 mL 10 x TBE buffert (RNase-fri, se Tabell för material). Placera flaskan i orbitalskak (250 rpm) tills alla kristaller av urea är upplöst (kan ta upp till 2 h). Justera volymen med DEPC-behandlad vatten till 500 mL. Filtrera lösningen med 0,2 μm membran (se Tabell för material).
      Obs: I denna process, undvika att använda speglande och uppståndelse-bar för att förhindra RNase kontaminering. Lösningen kan förvaras vid 4 ° C i upp till 1 år.
    7. Rengör två elektrofores exponeringsglas pläterar av lämplig storlek (16,5 cm x 24 cm) med avjoniserat vatten och 70% EtOH använder en bit av torka papper. Justera plattorna med ett par av 2,0 mm distanser (plattan med en silikoniserad ytan är vänd inåt) och försegla kanten av plattorna med tejp. Dubbel-tejp i hörnet av plattan att förhindra läckage.
    8. I en bägare, blanda 200 mL akrylamid lösning från steg 1.1.6, 2,0 mL 10% ammonium persulfatoxidation lösning och 100 μL av tetramethylethylenediamine (TEMED) med ett RNase-fri pipettspetsen genom omrörning snabbt för 30 s. Tilt plattorna på en bit bänkmonterade täcka och häll lösningen från mellanrummet av plattorna. Knacka plattan för att lyfta alla bubblor och Lägg plattan platt på bänkmonterade omslaget. Omedelbart infoga kammen och låt gelen polymerisera för minst 1 h.
      Obs: Om gelen ska användas inom nästa dag, täcka toppen av gelen med en bit våt pappershandduk och wrap upp med en större bit plastfolie. Placera den liggande platt vid 4 ° C.
    9. Ta bort tejpen och klämma plattan i en elektrofores monter. Ta bort kammen och lägga till lämpliga 1 x TBE buffert på toppen och botten av reservoaren. Förväg Kör gelen i 30 min på 20 W.
      Obs: Alternativt, om innehållet i önskad RNA är ~ 90% eller mer, kan en mini gel användas i substitution av en förberedande gel.
    10. Tvätta varje lastning brunnarna genom pipettering upp och ner två gånger med vätskan i behållaren. Lägga till rå RNA från steg 1.1.5 i brunnar. Kör gelen vid 20 W tills xylen cyanol FF färgämnet (ljusblå) passerar ungefär två tredjedelar av Gelens längd (~ 60 min).
      Obs: Se till att läsa in mer än en tredjedel av höjden av brunnen (Använd flera brunnar vid behov).
    11. Sänk ner gelen i 1 x TBE buffert med 1:10,000 utspädning av säkra färga (se Tabell för material) i en behållare som är tillräckligt stor för gelen. Placera behållaren i orbitalskak för 5 min på 80 rpm.
    12. Under UV-ljus, identifiera önskat RNA band och snabbt skär ett tunt band av gel med en ren rakblad. Placera 1 – 2 gel skivor på 1,7 mL tub.
    13. Återställa RNA från gel segmentet genom passiv eluering. Lägga till lämpliga eluering/nederbörd mix (~0.3 mL per skiva) i varje rör: 0.3 M NaOAc (pH 5.2), 2,5 M LiCl, 1 mM EDTA, 0,1% sodium dodecyl sulfate (SDS) i DEPC-behandlad vatten. Vrid röret som innehåller den gel splice(s) vid 4 ° C för 16 h.
      Obs: En typisk återvinningsgrad är ~ 75% i det här steget. För att öka avkastningen, ta bort och samla eluenten och tillsätt samma mängd eluering buffert, sedan upprepa detta steg.
    14. Kombinera eluenten i en ny 1,7 mL tub. Lägga till 2,5 x iskall EtOH vänd rören sex gånger för att blanda vätskan och placera rören vid-80 ° C i minst 1 h.
    15. Centrifugera i 10 min på 10.000 x g och 4 ° C. Ta försiktigt bort supernatanten genom pipettering. Tvätta pelleten RNA genom att lägga till 80% EtOH (1 mL per rör), virvel för 15 s, och Centrifugera i 10 min på 10.000 x g och 4 ° C.
    16. Avlägsna supernatanten och lufttorka pelleten RNA för 5 min. Tillsätt 50 μL av RNase-gratis vatten och blanda genom pipettering upp och ner 10 gånger. Normalisera den RNA-koncentrationen till 0,10 μg/μL. Lagra den renade RNA vid-80 ° C.
      Obs: Torka inte alltför RNA pelleten.
    17. Alternativt, för att analysera kvaliteten på RNA, späd 1 μL (100 ng) av RNA från steg 1.1.16 i 5 μL av vatten och blanda med 5 μL av 2 x TBE-urea prov buffert. Sedan värme vid 70 ° C i 3 min och belastningen på en 6% TBE-urea mini gel.
      1. Kör gelen vid 180 V för 1 h. utför färgningen som gjort steg 1.1.11. Visualisera gelen med UV i ett bildsystem. Ett enda band förväntas vid önskad längd.
  2. Förbereda den 32P-märkt primer
    1. Ställa in reaktionen genom att blanda följande material: 10 μL av γ -32P-ATP (~1.5 mCi, ~ 25 μM, se Tabell för material), 2 μL av omvänd Transkription (RT) primer (100 μM, för sekvens se tabell 1), 2 μL 10 x T4 polynucleotide kinase (PNK) reaktion buffert, 1 μL av T4 PNK (se Tabell för material), och 5 μL RNase-gratis vatten. Inkubera vid 37 ° C i 1 h.
      Varning: Lämpligt skydd behövs steg 1.2-1.5 i en auktoriserad arbetsplats för radioaktivt material.
    2. Värme-inaktivera i 20 min vid 65 ° C. Lägga till proverna på en avsaltning kolumn och centrifugera vid 1 000 x g för 1 min. Blanda eluenten med 25 μL av 2 x TBE-urea prov buffert. .
      Obs: Lagra den märkta rå produkten vid-20 ° C om det inte renas omedelbart.
    3. Kör en 10% akrylamid gel på 20 W för 1 h.
      Varning: Ladda den 32P-märkt primer från steg 1.2.1 på gelen och undvika blödning radioaktiviteten i övre behållaren. Fyll inte på mer än en tredjedel av höjden av brunnen för att säkerställa ett tunt band på gel (Använd flera brunnar vid behov). Vätskan i reservoaren botten kan vara starkt radioaktiva.
    4. Ta bort glasplattorna av gel kassetten och låg gelen på en bit plastfolie. Vik den plastfolie för att täcka toppen av gel för att gör en lufttät smörgås. Placera gelsandwichen på en kalcium volframhaltigt fosfor skärm och exponera ett imaging instrument. Bild gelen igen med regelbunden lätt att veta var kanterna på gelen är.
    5. Använda ett bildbehandlingsprogram för att överlagra de två bilderna. Rikta in gelen på den utskrivna bilden. Använd ett fräscha rakblad för att skära önskat band av gelen. Plats 1 till 2 gel skivor på 1,7 mL tub.
      Obs: Kontrollera den utskrivna bilden har samma storlek som riktiga gelen. Dubbel kolla justeringen av imaging överblivna gelen igen efter styckning sig på gel-segmentet.
    6. Återställa 32P-märkt primern genom att följa steg 1.1.13 till 1.1.16. Ta 1,0 μL av lösningen till en 0,4 mL rör och späd primern med 1 x TE buffert att erhålla radioaktiviteten i 1,0 μL på ~ 100.000 cpm. Lagra den rena 32P-märkt primer vid-80 ° C tills RNA 2'-OH modifiering reaktion men längre än 4 veckor.
  3. Liten molekyl bindande och RNA 2'-OH modifiering
    1. För att förbereda fyra prover, lägga till 8 pmol RNA i 32 μL av 0,5 x TE buffert en 1,7 mL tub, värme vid 80 ° C i 2 min och snapin-cool på is för minst 1 min.
      Obs: Använd följande ekvation för att beräkna RNA ungefärlig molekylvikt: MW = (# av baser) x 340 Da.
    2. Tillsätt 8 μl av 5 x fällbara mix som innehåller 500 mM HEPES (pH 8,0), 20 mM MgCl2och 500 mM NaCl. Alikvotens 9 μL av RNA blandningen i var och en av fyra PCR-rör och märka dem #1-#4. Tillsätt 1 μL 10% DMSO i #1 röret, 1 μL av koncentrerad liten molekyl lösning (10% DMSO) till #2, 1 μL utspätt småmolekylära lösning (10% DMSO) in #3 och 1 μL av vattnet till #4.
    3. Inkubera PCR-rören vid 37 ° C i en termocykel i 30 min.
    4. Precis innan 2'-OH modifiering reaktionen, späd 1 μL av NAI stamlösning (2 M) med 3 μL DEPC-behandlad vatten för att ge en 0,5 M fungerande lösning. Utan dröjsmål lägga 1 μL av NAI arbetar lösning in rören #1, #2 och #3, och 1 μL av 25% DMSO till #4. Inkubera vid 37 ° C i en termocykel för 15 min.
    5. Tillsätt 100 μL av eluering/nederbörd blanda (se steg 1.1.13 för recept), 2 μL av glykogen (15 mg/mL), och överför all vätska i varje PCR-röret till en 1,7 mL tub. Tillsätt 0,34 mL iskallt 200-bevis EtOH (3 x volym) i varje rör. Mix av vortexa för 5 s och placera rören i-80 ° C frys för minst 1 h.
      Obs: Under den här perioden börja ställa upp sekvensering gelen ska användas i steg 1.5.1.
    6. Centrifugera i 15 min på 14 000 x g och 4 ° C. Ta bort supernatanten utan att störa pelleten RNA. Tvätta pelleten RNA genom att lägga till 80% EtOH (0,5 mL per rör), virvel för 15 s, och Centrifugera under 15 minuter vid 20 000 x g och 4 ° C. Ta bort supernatanten igen.
      Obs: Använd eventuellt en geigermätare för att säkerställa den radioaktiva pellets kvar i röret.
    7. Lufttorka pelleten RNA för 5 min. Tillsätt 9 μL RNase-gratis vatten och blanda genom pipettering upp och ner 10 gånger.
      Obs: Torka inte alltför RNA pelleten. Alla nederbörd förväntas upplösas i slutet av detta steg.
  4. Markör förberedelse och primer filändelsen
    1. Överföra den modifierade RNA in 4 nya PCR-rören och märka dem #1-#4 som tidigare. Lägga till 2 pmol kontroll RNA i 7 μL DEPC-behandlad vatten 4 ytterligare PCR-rören och märka dem #5 – nr 8. Tillsätt 2 μL av radiomärkt primer (steg 1.2.6) i alla åtta rör. Värme för att glödga vid 65 ° C i 5 min, sedan omedelbart cool ned till 4 ° C i termocykel.
    2. Tillsätt 4 μL av 5 x RT buffert (se Tabell för material), 1 μL av Ditiotreitol (DTT, 0,1 M) och 1 μL av dNTP mix (10 mM varje) till var och en av de åtta PCR-rören.
    3. Tillsätt 2 μL DEPC-behandlad H2O rör #1-#4. Tillsätt 4 μL av ddATP (5 mM), 4 μL av ddTTP (5 mM) och 4 μL av ddCTP (5 mM) i rören #5 – #7, respektive. Tillsätt 1 μL av ddGTP (5 mM) och 3 μL DEPC-behandlad vatten till röret #8. Pipettera fyra gånger för att blanda.
    4. Värme vid 52 ° C i 1 min i termocykel. Tillsätt 1 μL av omvänt transkriptas (se Tabell för material), sedan blanda genom pipettering upp och ner fyra gånger. Inkubera reaktionen vid 52 ° C i 20 min.
    5. Tillsätt 1 μL av 5 M NaOH i vart och ett av rören till hydrolyserar RNA. Värm rören vid 95 ° C i 5 min.
    6. Tillsätt 5 μl av 1 M HCl och upprepa etanol nederbörden (steg 1.3.5 och 1.3.6), förutom utelämnar det glykogen och flytande överföring.
      Obs: Utelämna steg 1.4.6 resultat i en oskärpa region mitt i gelen kallas ”salt framsidan”.
    7. Lufttorka DNA pelleten för 5 min. Tillsätt 10 μL av H2O och 10 μL av 2 x TBE-urea prova lastning buffert och pipett upp och ner 10 gånger till lös. Värme vid 70 ° C för 5 min. Placera rören på is innan lastning på gelen.
  5. Sidanalys
    1. För att förbereda en 8% Polyakrylamidgelen sekvensering, Följ steg 1.1.6 till 1.1.10 med följande ändringar: Använd 100 mL 40% akrylamid/bisacrylamide lösning (29: 1) för att förbereda en 8% akrylamid lösning, och sekvensering gel Glasplattor (t.ex., 46 x 57 cm) med en 0,4 mm spacer.
    2. Ladda 10 μL av provet från steg 1.4.7. Kör gelen vid 65 W för 2 h eller tills botten färgämnet når 3/4 av gelen.
      Obs: Förvara resten av proverna vid-80 ° C för att upprepa om det behövs.
    3. Ta bort översta silikoniserat glasplattan genom att ta bort mellanlägget och försiktigt infoga en spatel. Placera en bit stora filtrerpapper att täcka gelen och tryck försiktigt så att gelen att följa pappersfiltret. Start från nederdelen, lyft pappersfiltret och ta bort gelen från glasskivan tillsammans.
    4. Placera gelen tillsammans med filterpappret på en bit plastfolie som är tillräckligt stor för att täcka hela gelen (filterpapper uppåt). Överföra filterpapper/gel/plast wrap smörgåsen till en gel som är torrare med filterpapper vänd.
      Varning: För att undvika materiella radioaktivitet, använda 3 till 4 fler bitar av stora filterpapper mellan gel smörgås och gel torrare.
    5. Torka gelen vid 70 ° C för 1 h med vakuum. Överföra gel smörgås på en foto-blekt fosfor lagring skärmen kassett. Exponera radioaktiviteten i gelen till skärmen för 4 – 16 h.
    6. Placera skärmen fosfor lagring på en tänkbar enhet och skanna med medelhög upplösning (~ 30 min).
      Obs: Om en leende-liknande artefakt är närvarande på gel bilden, använda korrigerande programvara (t.ex., SAFA) för att bearbeta bilden till en publicerbar kvalitet. Tänk på att den standard markör lanen är 1 nukleotid längre än de 2'-OH modifiering köer.

2. i cell form

  1. Primer design
    Obs: Till skillnad från in vitro-form behöver i cell form inte designa ett uttryck-kassett. Dock en optimal primer uppsättning bör användas och måste utvärderas innan formen experimentera.
    1. Generera minst tre unika primer par genom ett BLAST-baserad primer designverktyg (t.ex., Primer-BLAST). För att studera pre-mRNA i mänskliga celler, markerar du det mänskliga genomet (inte transkriptom) som en referensdatabas i Primer par specificitet Kontrollera parametrarna. Välj storleken på amplikon i intervallet 200 – 1.000 base-par (bp).
    2. Extrahera den genomiskt DNA från ~ 106 celler av intresse med en spin kolumn-baserade metod med behandling av RNase A och proteas K (se Tabell för material och använda tillverkarens protokollet). Normalisera den renade genomiskt DNA i 0,1 μg/μL TE buffert.
    3. PCR-test med protokollet utförs i steg 1.1.1 och 1.1.2.
      Obs: Önskad primer uppsättningen bör ge ett enda band på en 1,8% agarosgel.
  2. Cell förberedelse och 2'-OH modifiering
    Obs: För att öka överflödet av pre-mRNA av intresse, är en minigene med rätt sekvens under cytomegalovirus (CMV) arrangören för konstitutiva uttryck transfekterade in i värdceller.
    1. Pre värma odlingssubstratet som innehåller 10% fetalt bovint serum (FBS) och 1 x antibiotika blandning i Dulbeccos modifierade Eagle Medium (DMEM) vid 37 ° C. Frö 293T celler på 50% konfluens 24 h innan transfection i odlingsmedium. Ändra på medellång till 2% FBS i DMEM utan antibiotika ~ 1 h innan transfection.
    2. Tillsätt 10 μg av minigene plasmid i 100 μL av minskade serum media (se Tabell för material) i 1 väl i en plattan med 96 brunnar. Pipettera upp och ner fyra gånger för att blanda lösningen.
    3. Tillsätt 40 μl transfection reagens (se Tabell för material) till 100 μL av minskade serum medier i en annan väl av plattan. Pipettera upp och ner fyra gånger för att blanda. Odla i rumstemperatur i 5 min.
    4. Lägga till hela plasmid lösningen transfection reagens suspensionen. Pipettera upp och ner fyra gånger för att blanda. Odla i rumstemperatur i 30 min.
    5. Lägg hela DNA / transfection reagens blandning droppvis på ytan av mediet i hela skålen. Inkubera vid 37 ° C i 6 – 12 h.
    6. Aspirera på medellång och försiktigt tvätta en gång med 5 mL fosfatbuffrad koksaltlösning (PBS, pH 7,4, utan CaCl2 och MgCl2, se Tabell för material). Trypsinize cellerna med 3 mL trypsin lösning. Odla i rumstemperatur i 5 min.
    7. Slå skålen försiktigt för att separera celler från botten av skålen. Neutralisera trypsin med 6 mL odlingsmedium. Centrifugera vid 300 x g i 4 min och ta bort medlet.
    8. Att resuspendera cellerna ~ 106 för varje prov i 199 μL av reaktion medium (1% FBS i DMEM) och överför cellsuspensionen till en plattan med 96 brunnar. Inkubera cellerna med 1 μL av sammansatta fungerande lösning eller 1 μL av DMSO i alla tre kontroller under 30 minuter vid 37 ° C.
      Obs: Tre kontrollprover bör ingå: DMSO kontroll med NAI, denaturerad RNA med NAI och NAI negativ kontroll.
    9. Tillsätt 10 μL av 2 M NAI till varje prov, med undantag för denatureringen kontroll (DC) RNA och NAI negativa kontroller. Pipettera upp och ner fyra gånger för att blanda. Inkubera vid 37 ° C för 15 min. skaka försiktigt plattorna att Slamma upp cellerna var 5 minut.
    10. Över cellerna till 1,7 mL rör och centrifugera vid 400 x g under 2 minuter utan dröjsmål. Ta bort supernatanten utan att störa cellpelleten.
    11. Tillsätt 0,4 mL guanidinium kaliumtiocyanat (se Tabell för material). Virvel för 15 s för att homogenisera. Inkubera proverna i rumstemperatur i 5 min.
      Obs: Proverna kan förvaras vid-20 ° C tills du fortsätter till nästa steg.
  3. RNA-extraktion
    1. Tillsätt 0,2 mL kloroform till varje guanidinium kaliumtiocyanat homogeniseras proven. Virvel för 15 s. Inkubera i rumstemperatur i 2 min.
    2. Centrifugera under 5 minuter vid 12 000 x g och 4 ° C. Det översta färglösa vattenlösning lagret innehåller RNA. Över ~ 380 μL av vattenlösning till en ny 1,7 mL tub.
      Varning: Stör inte interphasen för att undvika kontaminering.
    3. Tillsätt 1,5 x mängd EtOH (~ 570 μL). Virvel för 15 s att blanda.
    4. Överför 600 μL av RNA blandning till en RNA isolering spin-kolumn (se Tabell för material). Centrifugera vid 12 000 x g i 15 s. kasta eluenten. Upprepa detta steg att passera all vätska i kolumnen samma spin.
    5. Tvätta kolonnen med 0,35 mL RW1 buffert (se Tabell för material) genom att snurra för 15 s. lägga till 80 μl RNase-fri DNAS jag i RDD buffert (se Tabell för material). Odla i rumstemperatur i 20 min.
      Obs: Det är viktigt att ta bort alla DNA-kontaminering.
    6. Därefter Tvätta kolonnen med 0,35 mL RW1 buffert och 0.6 mL 2 x RPE buffert (se Tabell för material) av spinning för 15 s vid varje steg. Torka kolumnen genom centrifugering kolumnen spinn med en tom samling röret vid 12 000 x g i 1 min.
    7. Lägg till 32 μL RNase-fritt vatten till mitten av kolumnen. Inkubera i 1 min. Centrifugera vid 12 000 x g i 30 s att få ~ 30 μL av renat RNA lösning. Sätta proverna vid-20 ° C medan bearbetning denaturerade provet.
  4. Denaturerat RNA kontroll förberedelse
    1. Plats 30 µL RNA-prov för DC i ett 1,7 mL plaströr på is. Tillsätt 50 μL av formamid och 15 μL av DC buffert innehållande 300 mM HEPES (pH 8,0) och 25 mM EDTA i röret.
    2. Värme att denaturera RNA vid 95 ° C i 1 min. snabbt Tillsätt 5 μl av NAI stamlösning (2 M), då flick två gånger för att blanda och Lägg röret in värmeblocket igen. Inkubera vid 95 ° C för en ytterligare 1 min sedan omedelbart lägga röret på is.
    3. Tillsätt 0,4 mL guanidinium kaliumtiocyanat. Upprepa steg 2.3.1–2.3.4.
    4. Tvätta kolonnen med 0,6 mL 2 x RPE buffert (se Tabell för material) av spinning för 15 s vid varje steg. Torka kolumnen genom centrifugering kolumnen spinn med en tom samling röret vid 12 000 x g i 1 min.
    5. Lägg till 32 μL RNase-fritt vatten till mitten av kolumnen. Inkubera i 1 min. Centrifugera vid 12 000 x g i 30 s att få ~ 30 μL av återvunna DC RNA lösning.
  5. Primer filändelsen
    1. Normalisera RNA lösningen från 2.3.7 och 2.4.5 till 0,5 μg/μL med RNase-gratis vatten. Nymalen förbereda 30 mM MnCl2 lösning från MnCl2∙4H2O pulver.
    2. Överföra 9 μL av RNA lösning för varje prov till en PCR-remsa. Lägga till 1 μL 10 mM dNTP och 1 μL av 2 μM gen-specifik primer (GSP) i varje rör. Pipettera upp och ner fyra gånger för att blanda. Inkubera vid 65 ° C i 5 min i en termocykel och sätta på is för > 1 min.
      Obs: Alternativt kan 1 μL av en slumpmässig nonamer användas i substitution av GSP.
    3. I varje PCR-röret, tillsätt en blandning av 2 μL 10 x RT buffert (se Tabell för material), 4 μL av 30 mM MnCl2och 2 μL av 100 mM DTT. Pipettera upp och ner 4 x att blanda. Inkubera vid 42 ° C i 2 min.
    4. Tillsätt 1 μL av omvänt transkriptas (se Tabell för material). Pipettera upp och ner 4 x att blanda. Inkubera vid 42 ° C i en termocykel för 3 h.
  6. Bibliotek förberedelse och nästa generations sekvensering
    1. Ställa in en PCR-reaktion genom att lägga till 1 μL av DNA-polymeras, 5 μL 10 x DNA-polymeras buffert (se Tabell för material), 2 μL av DMSO, 1,5 μL för varje primers (10 μM), 34 μL av H2O och 5 μL cDNA från steg 2.5.4.
    2. Ställ termocykel enligt följande: steg 1) 95 ° C under 2 min; etapp 2) 95 ° C i 30 s; etapp 3) 60 ° C under 30 s; etapp 4) 68 ° C för 30 s; etapp 5) loop tillbaka till steg 2 för 30 cykler; etapp 6) 68 ° C för 3 min; och steg 7) oändlig hålla vid 4 ° C tills följande steg.
    3. Rena ospädd med 1,8% agarosgel.
      Obs: PCR-bandet ska visas som ett enda band på gelen.
    4. Konstruera biblioteket med hjälp av standard fragmentering och ligatur metoder som fastställs i den litteratur6,26.
    5. Sekvensen på en nästa generations sekvensering utrustning använder 1 x 75 single-end läsningar för att generera omkring 10 miljoner läser per prov.
    6. Analysera resultatet med hjälp av ShapeMapper och SuperFold programvara paket som utvecklats av veckorna koncernen26.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Vi tidigare visat att en RNA skarvning modulator, SMN-C2, interagerar med AGGAAG motiv på exon 7 SMN2 genens pre-mRNA och används formen för att bedöma de RNA strukturförändringarna i närvaro av SMN-C26. Bindningsstället för SMN-C2 är skild från den FDA-godkända antisense oligonukleotiden (ASO) för SMA, nusinersen, som binder och blockerar intronic skarvning ljuddämparen (ISS) på intron 727,28 (figur 1A). Mest kända skarvning regulatorer av SMN2 exon 7 är inom ~ 100 nukleotid spänna av exon 7 i pre-mRNA29; Därför, en 140 och 276 nukleotid-långa RNA sekvenser användes för in vitro och i cell form, olikt, som omfattar exon 7 och intilliggande intron regionen (figur 1A).

I denna representativa in vitro-form analys, är den RNA-sekvensen av intresse inbäddad i en optimerad kassett som utvecklats av laboratorium, som är kompatibel för de flesta RNA sekvenser1i veckor. Ibland kan sekvensen av intresse samverkar eller stör denna kassett. I dessa fall en modifierad kassett kan användas med följande tre egenskaper: i) en 3'-änden specifika primer bindningsställe med en effektivare hybridisering affinitet för primer än någon del av RNA-sekvensen, ii) ett mycket strukturerade hårnål loop Beläget direkt uppströms primer bindningsstället som visar specifika reproducerbara form signal (detta kommer att fungera som både intern kontroll för experiment och metod för att justera signalen från experiment till experiment) och iii) en 5'-änden hårnål struktur element, som anger slutet på formen signalen. FORM kassetten flankeras ytterligare med egen klyva ribozym sekvenser på båda 5'- och 3'-avslutar för att generera en homogen RNA30. Vi fann att hammerhead och hepatit delta virus ribozymerna är kompatibla i form kassetten och brukar ge hög avkastning av önskad RNA. Den resulterande mallen RNA har en 3'-ände 2', 3'-cykliska fosfat och en 5'-ände hydroxylgrupp, som inte stör primer filändelsen. En 140-nukleosid lång sekvens som täcker exon 7 SMN2 och angränsande region i pre-mRNA syntetiserades inom form och ribozym kassett som illustreras i ordningen 1.

I allmänhet, bör sekvensen av intresse sammanskrivna i uttrycket kassett vara tillräckligt lång för att täcka potentiella sekundära eller högre ordning på struktur. När det gäller SMN2 exon 7 innehåller en 140-nukleotid region två stem-loop strukturer6,31. Strukturen i regionen av intresse varierar av fall och bör utvärderas av trial-and-error.

Polyakrylamidgelen sekvensering med 32P-märkt primer filändelsen produkter valdes att visualisera i vitro form profilen i detta representativa experiment. En alternativ visualisering metod är att använda kapillärelektrofores med fluorescently märkta DNA primer32. I sekvensering polyakrylamidgeler, ~ 20 nukleosider nära 5'-slutet och ~ 10 nukleotider nära 3'-ände den RNA-sekvensen av intresse kommer inte visualiseras kvantitativt, tack vare ibland stannar vid de inledande stegen av omvänd Transkription och intensiv band på sidan geler för fullängds avskrifter1.

Ett alternativt sätt för preparativ gel återvinning av en RNA-mall (steg 1.1.6 till 1.1.12) är att överbelasta en mini gel om utbytet av önskad RNA mall är > 90%. Det är klokt att ta bort överflödig NTP från RNA produkten genom avsaltning kolumnen och eluering RNA i 50 µL TE buffert. Mätning av koncentrationen av RNA och ladda 5.0 µg i varje brunn. Under reningen transkriberas steg i T7 RNA mall, stoppa sidan när xylen cyanol FF färgämnet (ljusblå) passerade två tredjedelar 6% denaturerad TBE-karbamid gel. Den själv-klyvning RNA fragmenten (< 80 nukleosider) passerade genom gelen, som lämnade den önskade RNA som enda stora bandet i gel vid färgning (figur 1B).

SMN-C2 (figur 1 c) var syntetiseras enligt de offentliggjorda förfarande33 och upplöst i 10 mM DMSO stamlösning. Stamlösning späds ytterligare till 500 och 50 µM i 10% DMSO lösning att uppnå slutliga koncentrationer av 50 och 5 µM, respektive. Snapin-cooled RNA refolded till dess jämvikt etapp i närvaro av DMSO eller SMN-C2 inom 30 minuter vid 37 ° C. En längre inkubationstid förändrades inte resultatet av experimentet. Två experimentprover (50 och 5 µM SMN-C2), två kontroller (DMSO och NAI-kontroller) och fyra markörer (A, T, G, C) behandlades för primer filändelsen. Efter utsätta gelen till fosfor lagring skärmen, ett framgångsrikt form experiment visar: i) ett enda och mest intensiva band överst i gel och ii) band hela gelen på single-nucleotide upplösning utan smear (figur 1 d). Ett vanligt problem i analys är att en smeta region känd som ”salt beklär” kan visas i mitten av gelen (figur 1E). Detta är förmodligen på grund av hög koncentration av salt, DMSO, eller andra oönskade ämne i lastning provet som kan tas bort av etanol nederbörd.

I in vitro-formen, en ren RNA-mall är nyckeln till ett lyckat experiment. En oren RNA-mall är oftast orsaken till oönskade resultat. Om analys visar tydligt ett mönster av 2 uppsättningar av markörer, visar att RNA mallen inte är homogen och att måste att vara repurified av förberedande TBE-karbamid gel.

För i cell form är nyckeln till ett lyckat experiment att designa en optimerad primer set för förstärkning. Med 0.10 µg av genomisk DNA-fria cDNA mall, bör ett enda band observeras inom 25 PCR cykler i agaros gel analys. De repetitiva intron sekvenserna bör därför undvikas. För att studera strukturella effekterna av SMN-C2 på SMN2 pre-mRNA, tre primer uppsättningar (tabell 2) testades, och alla var tillfredsställande (figur 2A).

En låg kopia på en target RNA-sekvens är generellt ett problem för i cell form. För att berika RNA av intresse, var en minigene som innehåller sekvensen RNA sevärdheter under en stark CMV-promotorn transfekterade i 293T celler. Eftersom mönstret skarvning av den SMN2 minigene recapitulates som av endogena SMN2 med eller utan SMN-C219,34, föreställer vi att strukturera av SMN-C2 samverkande RNA i överuttryckt SMN2 pre-mRNA sannolikt var densamma som den endogena genprodukten. Medan de EG50 SMN-C3 i splitsning analysen var ~0.1 µM6,19, användes en koncentration på den högre änden (20 µM) att säkerställa det bindande tillståndet av liten molekyl och målet RNA-sekvens.

Vid isolering av RNA, kan både gene-specifika och slumpmässiga primers användas för förlängning. När det gäller exon 7 av SMN2 hittade vi att SMN2E7-338-RV (tabell 2) ger en högre kopia av önskad cDNA än en random nonamer, framgår av en mer intensiv band i den PCR-amplifieringen med SMN2E7-276 primer (tabell 2) efter 25 cykler. I steg 2'-OH i ändring användes 91 µM NAI koncentration för en inkubationstid på 15 min. Om en annan celltyp eller medium används, vara inkubationstiden åter optimerad. Om inkubationstiden är för lång, inte agaros gel analys av ospädd ibland visa ett band.

Ett python-baserade program, ShapeMapper, utvecklat av de veckorna laboratorium35 användes för att analysera de data som genereras av nästa generations sekvensering [för rådata SMN-C2 behandlas i cell form av SMN2 exon 7 pre-mRNA, se till sekvens Läs arkiv (SRA) databas]. Hela ospädd, formen reaktiviteten inte signifikant förändring (> 1), vilket indikerar att det sekundära strukturerar förblir i närvaro av SMN-C2 (figur 2B). Detta bekräftas också av arc tomterna genereras av SuperFold35. De anslutning linjerna anger möjliga bas ihopkopplingen baserat på formen aktivitet av varje nukleotid. SMN-C2 - och DMSO-behandlade RNA modellering är väsentligen den samma (figur 2 c). Differentiell i cell form reaktivitet beräknades för varje nukleotid (figur 2B), och de flesta reaktivitet förändringen inträffade vid TSL-1 (5'-ände exon 7) men inte TSL-2 (3'-ände exon 7). Detta resultat överensstämmer med de in vitro-form; även om basen ihopkopplingen skiftade från in vitro-analyser form RNA modellering i formen i cell (figur 2D).

Ett vanligt problem i cell form är den låga mutationshastighet hela ospädd. Detta beror oftast på genomisk DNA kontaminering. DNA innehåller inte 2'-OH-gruppen; Därför bildas ingen acylation produkt med NAI. PCR-amplifiering således avspeglar endast den låga mutationshastighet för DNA-polymerasen. Isolering av RNA av guanidinium kaliumtiocyanat följt av den kolumn DNAS matsmältningen är tillräckliga för att undanröja alla DNA i de flesta fall. Om DNA förorening kvarstår, upprepa steg 2.3 för RNA isolering.

Scheme 1
System 1: DNA-sekvensen för mallen RNA transkriptionen. Sekvensen 12 bp inom Hammerhead virus ribozym sekvensen i rött är det omvända komplementet av första 12 bp av 5'-kassetten. Den RNA-sekvensen av intresse som presenteras häri är en 140 bp pre-mRNA-sekvens innehåller exon 7 av mänskliga SMN2-genen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 1
Figur 1: Experimentell design och resultatet av in vitro-form för SMN2 exon 7 pre-mRNA i närvaro av SMN-C2. (A) översikt av sekvensen av intresse för in vitro och i cell form studier av SMN2-genen. SMN-C2 binder till AGGAAG motivet på exon 7, en specifik plats från nusinersen bindningsstället. (B) rening av T7 transkription produkten. Var och en av tre köer innehåller 5,0 µg rå RNA. TBE-urea gelen var fläckade SYBR-Safe (1:10 000) för 5 min i 1 x TBE buffert. Röd streckad ruta anger kanten av excision för RNA återhämtning. (C) strukturera av SMN-C2. (D), In vitro form experiment med NAI och en 140 nukleotid-långa RNA mall som innehåller exon 7. 1 = DMSO; 2 = SMN-C2 (50 ΜM); 3 = SMN-C2 (5 ΜM); 4 = saknande av NAI; 5-8 = stegar som genereras genom tillsats av ddATP, ddTTP, ddCTP och ddGTP under primer filändelsen. Sidan bars ut på en TBE-urea sekvensering gel på 60 W för 3 h. röda asterisker indikera ökad band intensitet med 50 µM SMN-C26. (E) ett exempel på en ”salt front” region i rutan streckad röd från en separat experiment. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: I cell form härrör RNA modellering för SMN2 exon 7 pre-mRNA. (A), PCR förstärkning med alla tre primer uppsättningar (tabell 2) gav ett enda band i agaros gel analys. 1 = SMN2E7-338, 2 = SMNE7-276, 3 = SMN2E7-251, 4 = DNA stege. (B) Differential i cell form reaktivitet i SMN2 minigene-transfekterade 293T celler för 10 µM SMN-C2 och DMSO i TSL1. FORM reaktivitet med single-nucleotide upplösning. Dess standardavvikelse beräknades genom ShapeMapper programvara35. Gröna asterisker visar betydande formförändringen reaktivitet induceras av 10 µM SMN-C2. Numreringen av nukleotiderna i 276 bp ospädd visas på x-axeln. Felstaplar uppskattades av form-Mapper programvara26. (C) Arc tomt genereras av SuperFold35 för den mest sannolika RNA sekundärt strukturera modellering av i cell formdata. (D) In vitro och i cell form-regisserad modellering av exon 7 och angränsande regioner. För in vitro-RNA modell visas formen stabilisera kassett (orange) och nukleotider 1-19 (blå) i skiss. För i cell RNA modell, är nukleotid numrering justerad med in vitro-form template. Nukleotider 1-18 och 120-140 utelämnades. Betydande reaktivitet ändringar anges i röda och gröna asterisker för in vitro och i cell form, respektive. De sekundära strukturer som hette tidigare TSL1 och TSL231 omsluts med Blå rutor. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Primer namn 5' - 3'-sekvensen
Ribozym-FW TAAAACGACGGCCAGTGAAT
Ribozym-RV GCAGGTCGACTCTAGAGGAT
RT primer GAACCGGACCGAAGCCCG

Tabell 1: Sekvenserna som primer används i representanten experiment.

Namn Sekvens (5 '-> 3')
SMN2E7-338-FW AAAGACTATCAACTTAATTTCTGA
SMN2E7-338-RV TGTTTTACATTAACCTTTCAACT
SMN2E7-276-FW AATGTCTTGTGAAACAAAATGCT
SMN2E7-276-RV AACCTTTCAACTTTCTAACATCT
SMN2E7-251-FW TGAAACAAAATGCTTTTTAACATCC
SMN2E7-251-RV TCAACTTTCTAACATCTGAACTTTT

Tabell 2: primer sätter för förstärkning av den pre-mRNA-sekvensen av intresse. Alla tre primer uppsättningar ge en enda amplikon i en PCR-reaktion med genomiskt DNA-fria cDNA mall.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

I in vitro-form är det viktigt att använda högkvalitativa homogena RNA mall. T7 transkription, ger dock ofta heterogena sekvenser36. Särskilt, är sekvenser med ±1 nukleotid på 3'-terminus med försumbar avkastning36 ofta svåra att avlägsnas genom Polyakrylamidgelen rening. Heterogena RNA mall kan resultera i mer än en uppsättning av signalera i sekvensering gel profilering av primer filändelsen produkten, vilket ibland gör det svårt att tolka resultatet. Ribozym på båda 5'-3'-ände RNA mall uttryck kassett gör båda ändar homogen.

För både in vitro och i cell form är inkubationstiden 2'-OH modifiering reagenser en annan kritisk faktor. Det föreslogs av gruppen veckor att minst fem gånger halveringstiden av vatten-kylning 2'-OH acylation reagens bör används1. I våra händer, inkubation med NAI (T1/2 = ~ 20 min) för > 30 min i både in vitro och i cell form resulterar i en överreagerade resultat. Som visas i figur 1 d, en bra in vitro- form profilering bör ha > 50% totala signal ovanpå gelen som fullängds avskrift, att säkerställa att de flesta av de modifierade RNA är bara acylated en gång. Överreaktion kommer att göra dubbel-acylated produkten icke försumbar och profilering partisk berikad kort längd förlängning produkter. I cell form, ska ospädd för bibliotek byggande visas som ett enda band i agaros gel analys (steg 2.6.3). Utstryk av bandet anger en överreaktion och inkubera tiden bör minskas. I de representativa experiment var taget 15 min inkubation vid 37 ° C optimal för in vitro och i cell form. Detta bör användas som utgångspunkt för NAI ändring i liknande applikationer.

Det finns andra 2'-OH modifiering reagenser22 allmänt används för form, till exempel 1 M 7. 1M 7 jämfört med NAI, och har en bättre reaktivitet till 2'-OH grupp och kortare halveringstid i vatten22. I våra händer bildade 1M 7 massiv mängd gula nederbörd i cell kultur media i ett i cell form experiment, vilket komplicerade RNA isolering. För en jämförelse anledning används både in vitro och i cell form NAI som 2'-OH modifiering reagens för en studie av SMN-C2 och SMN2 pre-mRNA interaktioner. Om endast in vitro- form krävs, är 1 M 7 ett alternativ som framgår av olika studier i riboswitch strukturella bestämning7,8.

I cell form över in vitro-form är i allmänhet att föredra, särskilt om molekylen förmodligen agerar i kärnan av en eukaryot cell. RNA-bindande proteiner i kärnan är riklig, och det är nästan omöjligt att sammanfatta det cellulära sammanhanget in vitro-villkor.

Under det senaste decenniet blir formen standard metod för att studera det sekundära strukturerar av RNA. Jämfört med traditionella RNA fotavtryck med RNase37, är det mer lämplig att studera interaktioner med liten molekyl-RNA, som dessa interaktion kan ibland vara svag och okänslig för RNase utmaningar.

Den stora begränsningen att använda formen för att studera liten molekyl-inducerad RNA strukturella förändringar är att dess resultat inte avslöjar bindningsstället. I in vitro och i cell form för SMN-C2 bunden pre-mRNA, förändrades formen reaktiviteten inte på förmodad bindningsstället (figur 1 d, figur 2B); snarare, reaktiviteten på 2 till 3 avlägsna platser på regionen loop eller vika förändrades. SMN-C2 binder förmodligen till en RNA dubbel-helix region (figur 1 d, figur 2D), som vanligtvis har en låg form reaktivitet. Därför skulle ytterligare stabilisera strukturen för att minska form reaktivitet förmodligen inte vara observerbara. Att generera en förmodad bindningsställe, andra metoder såsom ChemCLIP38 bör användas, som är involverad i en crosslinking kemiska sond.

En vanlig alternativa metod att kartlägga RNA sekundära eller högre struktur och nukleotid dynamik är NMR spektrometri39,40. Det har visats att RNA dynamics härrör från kvantitativ NMR analys starkt korrelerar med formen verksamhet39. I samband med liten molekyl bindande, kan Kemisk förskjutning störningar avslöja de samverkande nukleotider21.

Som RNA-targeting små molekyler blir en ny modalitet av drogen utveckling11, föreställer vi att formen kommer att fastställas som en standardmetod för att värdera de strukturella effekterna av målet RNA i närvaro av små molekyler. I framtiden, önskas en transkriptom-wide förhör metod för RNA-targeting småmolekylära läkemedel.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna förklarar någon intressekonflikt.

Acknowledgments

Detta arbete har gjorts möjlig genom NIH R01 bidraget (NS094721, K.A.J.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DNA oligonucleotide IDT gBlock for >200 bp DNA synthesis
Phusion Green Hot Start II High-Fidelity PCR Master Mix Thermo Fisher F566S
NucleoSpin gel and PCR clean-up kit Takara 740609.50
MegaScript T7 transcription kit Thermo Fisher AM1333 Contains 10x reaction buffer, T7 enzyme, NTP and Turbo DNase
DEPC-treated water Thermo Fisher 750023
2x TBE-urea sample buffer Thermo Fisher LC6876
40% acrylamide/ bisacrylamide solution (29:1) Bio-Rad 1610146
10x TBE buffer Thermo Fisher 15581044
Nalgene Rapid-Flow™ Filter Unit Thermo Fisher 166-0045
Kimwipe Kimberly-Clark 34133
TEMED Thermo Fisher 17919
SYBR-Safe dye Thermo Fisher S33102
6% TBE-urea mini-gel Thermo Fisher EC6865BOX
ChemiDoc Bio-Rad
T4 PNK NEB M0201S
γ-32P-ATP Perkin Elmer NEG035C005MC
Hyperscreen™ Intensifying Screen GE Healthcare RPN1669 calcium tungstate phosphor screen
phosphor storage screen Molecular Dynamics BAS-IP MS 3543 E
Amersham Typhoon GE Healthcare
NAI (2M) EMD Millipore 03-310
GlycoBlue Thermo Fisher AM9515
SuperScript IV Reverse Transcriptase Thermo Fisher 18090010 Contains 5x RT buffer, SuperScript IV
dNTP mix (10 mM) Thermo Fisher R0192
ddNTP set (5 mM) Sigma GE27-2045-01
large filter paper Whatman 1001-917
Gel dryer Hoefer GD 2000
QIAamp DNA Blood Mini Kit Qiagen 51104 Also contains RNase A and protease K
SMN2 minigene34 Addgene 72287
Heat inactivated FBS Thermo Fisher 10438026
Pen-Strep Thermo Fisher 15140122
Opti-MEM I Thermo Fisher 31985062
FuGene HD Promega E2311
TrpLE Thermo Fisher 12605010
DPBS without Ca/Mg Thermo Fisher 14190250
TRIzol Thermo Fisher 15596018
RNeasy mini column Qiagen 74104 Also contains RW1, RPE buffer
RNase-Free DNase Set Qiagen 79254 Contains DNase I and RDD buffer
Deionized formamide Thermo Fisher AM9342
MnCl2•4H2O Sigma-Aldrich M3634
random nonamer Sigma-Aldrich R7647
SuperScript First-Strand Synthesis System Thermo Fisher 11904-018 Contains 10x RT buffer, SuperScript II reverse transcriptase
AccuPrime pfx DNA polymerse Thermo Fisher 12344024
NextSeq500 Illumina
NucAway column Thermo Fisher AM10070 for desalting purpose

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wilkinson, K. A., Merino, E. J., Weeks, K. M. Selective 2'-hydroxyl acylation analyzed by primer extension (SHAPE): Quantitative RNA structure analysis at single nucleotide resolution. Nature Protocols. 1, 1610-1616 (2006).
  2. Trausch, J. J., et al. Structural basis for diversity in the SAM clan of riboswitches. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111, 6624-6629 (2014).
  3. Souliere, M. F., et al. Tuning a riboswitch response through structural extension of a pseudoknot. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110, E3256-E3264. , E3256-E3264 (2013).
  4. Rice, G. M., Busan, S., Karabiber, F., Favorov, O. V., Weeks, K. M. SHAPE Analysis of Small RNAs and Riboswitches. Methods in Enzymology. , 165-187 (2014).
  5. Spitale, R. C., et al. RNA SHAPE analysis in living cells. Nature Chemical Biology. 9, 18-20 (2013).
  6. Wang, J., Schultz, P. G., Johnson, K. A. Mechanistic studies of a small-molecule modulator of SMN2 splicing. Proceedings of the National Academy of Sciences. 115, E4604-E4612 (2018).
  7. Price, I. R., Gaballa, A., Ding, F., Helmann, J. D., Ke, A. Mn 2+ -Sensing Mechanisms of yybP-ykoY Orphan Riboswitches. Molecular Cell. 57, 1110-1123 (2015).
  8. Hennelly, S. P., Sanbonmatsu, K. Y. Tertiary contacts control switching of the SAM-I riboswitch. Nucleic Acids Research. 39, 2416-2431 (2011).
  9. Abulwerdi, F. A., et al. Development of Small Molecules with a Noncanonical Binding Mode to HIV-1 Trans Activation Response (TAR) RNA. Journal of Medicinal Chemistry. 59, 11148-11160 (2016).
  10. Shortridge, M. D., et al. A Macrocyclic Peptide Ligand Binds the Oncogenic MicroRNA-21 Precursor and Suppresses Dicer Processing. ACS Chemical Biology. 12, 1611-1620 (2017).
  11. Warner, K. D., Hajdin, C. E., Weeks, K. M. Principles for targeting RNA with drug-like small molecules. Nature Reviews Drug Discovery. 17, 547-558 (2018).
  12. Mullard, A. Small molecules against RNA targets attract big backers. Nature Reviews Drug Discovery. 16, 813-815 (2017).
  13. Shortridge, M. D., Varani, G. Structure based approaches for targeting non-coding RNAs with small molecules. Current Opinion in Structural Biology. 30, 79-88 (2015).
  14. Gallego, J., Varani, G. Targeting RNA with Small-Molecule Drugs: Therapeutic Promise and Chemical Challenges. Accounts of Chemical Research. 34, 836-843 (2001).
  15. Rizvi, N. F., Smith, G. F. RNA as a small molecule druggable target. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. 27, 5083-5088 (2017).
  16. Connelly, C. M., Moon, M. H., Schneekloth, J. S. The Emerging Role of RNA as a Therapeutic Target for Small Molecules. Cell Chemical Biology. 23, 1077-1090 (2016).
  17. Palacino, J., et al. SMN2 splice modulators enhance U1-pre-mRNA association and rescue SMA mice. Nature Chemical Biology. 11, 511-517 (2015).
  18. Ratni, H., et al. Discovery of Risdiplam, a Selective Survival of Motor Neuron-2 ( SMN2 ) Gene Splicing Modifier for the Treatment of Spinal Muscular Atrophy (SMA). Journal of Medicinal Chemistry. 61, 6501-6517 (2018).
  19. Naryshkin, N., et al. SMN2 splicing modifiers improve motor function and longevity in mice with spinal muscular atrophy. Science. 345, (2014).
  20. Chiriboga, C., et al. Preliminary Evidence for Pharmacodynamics Effects of RG7916 in JEWELFISH, a Study in Patients with Spinal Muscular Atrophy who Previously Participated in a Study with Another SMN2-Splicing Targeting Therapy (S46.003). Neurology. 90, (2018).
  21. Sivaramakrishnan, M., et al. Binding to SMN2 pre-mRNA-protein complex elicits specificity for small molecule splicing modifiers. Nature Communications. 8, (2017).
  22. Lee, B., et al. Comparison of SHAPE reagents for mapping RNA structures inside living cells. RNA. 23, 169-174 (2017).
  23. Weeks, K. M., Mauger, D. M. Exploring RNA Structural Codes with SHAPE Chemistry. Accounts of Chemical Research. 44, 1280-1291 (2011).
  24. Smola, M. J., et al. SHAPE reveals transcript-wide interactions , complex structural domains , and protein interactions across the Xist lncRNA in living cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113, 10322-10327 (2016).
  25. Flynn, R. A., et al. Transcriptome-wide interrogation of RNA secondary structure in living cells with icSHAPE. Nature Protocols. 11, 273-290 (2016).
  26. Smola, M. J., Rice, G. M., Busan, S., Siegfried, N. A., Weeks, K. M. Selective 2 ′ -hydroxyl acylation analyzed by primer extension and mutational profiling (SHAPE-MaP) for direct , versatile and accurate RNA structure analysis. Nature Protocols. 10, 1643-1669 (2015).
  27. Hua, Y., et al. Antisense correction of SMN2 splicing in the CNS rescues necrosis in a type III SMA mouse model. Genes & Development. 24, 1634-1644 (2010).
  28. Hua, Y., et al. Peripheral SMN restoration is essential for long-term rescue of a severe spinal muscular atrophy mouse model. Nature. 478, 123-126 (2011).
  29. Wee, C. D., Havens, M. A., Jodelka, F. M., Hastings, M. L. Targeting SR proteins improves SMN expression in spinal muscular atrophy cells. PloS One. 9, e115205 (2014).
  30. Hammond, J. A., Rambo, R. P., Filbin, M. E., Kieft, J. S. Comparison and functional implications of the 3D architectures of viral tRNA-like structures. RNA. 15, 294-307 (2009).
  31. Singh, N. N., Singh, R. N., Androphy, E. J. Modulating role of RNA structure in alternative splicing of a critical exon in the spinal muscular atrophy genes. Nucleic Acids Research. 35, 371-389 (2007).
  32. Deigan, K. E., Li, T. W., Mathews, D. H., Weeks, K. M. Accurate SHAPE-directed RNA structure determination. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106, 97-102 (2009).
  33. Qi, H., et al. Preparation of pyridopyrimidine derivatives and related compounds for treating spinal muscular atrophy. , (2013).
  34. Lorson, C. L., Hahnen, E., Androphy, E. J., Wirth, B. A single nucleotide in the SMN gene regulates splicing and is responsible for spinal muscular atrophy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96, 6307-6311 (1999).
  35. Siegfried, N. A., Busan, S., Rice, G. M., Nelson, J. A. E., Weeks, K. M. RNA motif discovery by SHAPE and mutational profiling (SHAPE-MaP). Nature Methods. 11, 959 (2014).
  36. Milligan, J. F., Groebe, D. R., Witherell, G. W., Uhlenbeck, O. C. Oligoribonucleotide synthesis using T7 RNA polymerase and synthetic DNA templates. Nucleic Acids Research. 15, 8783-8798 (1987).
  37. Nilsen, T. W. RNase Footprinting to Map Sites of RNA-Protein Interactions. Cold Spring Harbor Protocols. , (2014).
  38. Velagapudi, S. P., et al. Design of a small molecule against an oncogenic noncoding RNA. Proceedings of the National Academy of Sciences. , 5898-5903 (2016).
  39. Barnwal, R. P., Yang, F., Varani, G. Applications of NMR to structure determination of RNAs large and small. Archives of Biochemistry and Biophysics. 628, 42-56 (2017).
  40. Scott, L. G., Hennig, M. RNA structure determination by NMR. Methods in Molecular Biology. 452, 29-61 (2008).

Tags

Denna månad i JoVE fråga 143 liten molekyl inriktning RNA RNA struktur in vitro- form form spinal muskelatrofi RG-7916 i cell
Använda i Vitro och i cell form att undersöka småmolekylära inducerad Pre-mRNA strukturella förändringar
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wang, J., Hammond, J., Johnson, K.… More

Wang, J., Hammond, J., Johnson, K. A. Using In Vitro and In-cell SHAPE to Investigate Small Molecule Induced Pre-mRNA Structural Changes. J. Vis. Exp. (143), e59021, doi:10.3791/59021 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter