Summary
둘 다 생체 외에서 그리고 세포에서 선택적 2'-히 드 록 acylation 뇌관 연장 (모양) 실험 사전 mRNA 시퀀스는 RNA를 대상으로 작은 분자의 존재의 2 차 구조를 결정 하 여 분석에 대 한 자세한 프로토콜은 이 문서에서 제시 하는.
Abstract
RNA를 대상으로 작은 분자의 약 개발, 과정 대상 RNA 순서와 그들의 상호 작용에 구조적인 변화를 elucidating는 원한다. 우리 여기는 상세한 생체 외에서 제공 하 고 셀 선택 2'-히 드 록 acylation 뇌관 연장에 의해 척수 근육 위축 증 (SMA)의 생존에 대 한 실험 약물의 RNA 구조 변화 연구 (모양) 프로토콜 분석 모터 신경 (SMN)-c 2를 사전-SMN2 유전자의 mRNA의 exon 7에서. 생체 외에서 모양, SMN2 exon 7 포함 된 140 뉴클레오티드는 RNA 순서 T7 RNA 중 합 효소에 의해 복사할 SMN-C2, 존재 접혀 이며 가벼운 2'-OH acylation 시 약, 2-methylnicotinic 산 imidazolide (NAI)에 의해 연속적으로 수정. 이 2'-오-NAI adduct 추가 32P 표시 된 뇌관 연장에 의해 조사 되 고 polyacrylamide 젤 전기 이동 법 (페이지)에 의해 해결. 반대로, 2'-OH acylation 셀 모양에서 일어난다 SMN-C2 바인딩된 세포질 RNA와 현장에서 살아있는 세포에서. 뇌관 연장에 모양 유발 돌연변이와 SMN2 유전자에서 exon 7의 사전 mRNA 순서는 다음 차세대 시퀀싱 및 PCR에 의해 증폭 됩니다. 두 가지 방법론을 비교, 생체 외에서 모양을 더 비용 효율적인 방법 이며 결과 시각화 하는 컴퓨팅 파워를 필요로 하지 않습니다. 그러나, 생체 외에서 모양을 파생 RNA 모델은 때때로 RNA 의무적인 단백질에와 함께 모든 상호 작용의 손실로 인해 가능성이 셀룰러 맥락에서 이차 구조에서 일탈 한다. 셀 모양 방사성 소재 직장을 필요 하지 않습니다 고 세포질 문맥에서 더 정확한 RNA 이차 구조를 생성 합니다. 또한, 셀에 형태는 일반적으로 해당 페이지 분석에 의존 하는 체 외에 비해 차세대 시퀀싱을 활용 하 여 더 큰 범위의 RNA 시퀀스 (~ 1000 뉴클레오티드) 모양 (~ 200 뉴클레오티드)는 일반적으로 대 한. SMN2 사전-mRNA에 exon 7의 생체 외에서 그리고에서 셀 모양 파생 하는 경우에 RNA 모델은 서로 비슷합니다.
Introduction
선택 2'-히 드 록 acylation 뇌관 연장 (모양)에 의해 분석은 관심사의 RNA 순서에 있는 각 뉴클레오티드의 활동을 측정 하 고 단일 뉴클레오티드 해상도1에서 이차 구조를 elucidating 방법입니다. 생체 조건2,,34 (정의 된 버퍼 시스템에서 정화 RNA)에 둘 다 모양 방법론 및 보조를 조사 하기 위해 개발 되었습니다 생활 포유류 세포5,6, 중간 길이가 RNA의 구조 (일반적으로 < 셀 모양에 대 한 1000 뉴클레오티드와 < 생체 외에서 모양에 대 한 200 뉴클레오티드). 특히 유용 바인딩 상호 작용 하는 RNA 분자 대사 산물2,4,7,8 시 수용 체 RNA에에서 구조적인 변화를 평가 하 고 기계 작업을 공부 하 약 개발9,10동안 RNA를 대상으로 분자.
RNA를 대상으로 약물 발견 최근 그려 관심 학술 연구소에서 및 제약 산업11,12 다른 접근 방식 및 전략13,,1415 를 통해 16. 최근 임상 사용에 대 한 RNA를 대상으로 하는 작은 분자의 예로 두 구조적으로 독특한 실험 약물, LMI-07017 및 RG-791618,19, 척수 근육 위축 증 (SMA), 유망 보여준 단계 II 임상 시험20에서 결과. 두 분자 했다 증명 대상 생존 모터 신경 (SMN)의 2 중-mRNA 및 SMN2 유전자6,,1721의 접합 과정을 조절. 우리는 이전의 생체 외에서 셀 모양 RG-7916 SMN C26으로 알려진의 아날로그의 대상 RNA 구조 변경 검사에 응용 프로그램을 설명 했다.
원칙적으로, 모양 편견 방식에서 자체 냉각 acylation 시 약의 초과 하는 금액의 RNA 순서의 각 뉴클레오티드의 2'-OH acylation 속도 측정합니다. Acylation 시 약은 물의 짧은 반감기에에서 불안정 (예를 들어, T1/2 = 17의 1-메 틸-7-nitroisatoic 무수 물; 또는 1 M 7, 2-methylnicotinic 산 imidazolide에 대 한 ~ 20 분 또는 NAI)22 와 무감각의 정체성 기지23. 각 뉴클레오티드의 역학의 정확한 평가로 변형 될 수 있는 유연한 기초 2'-OH 그룹의 더 유리한 acylation 발생 합니다. 특히, 뉴클레오티드 기본적인 쌍에 NAI 1 M 7 등 2'-오 수정 시에는 짝이 없는 하나 보다 일반적으로 덜 반응입니다.
RNA 템플릿과 2'-OH acylation 수행의 소스를 보면, 모양 수 있다 생체 외에서 그리고에서 셀 모양으로 일반적으로 분류 될 있다. 시험관 모양 사용에서 순화 T7 RNA를 변하게 하 고 실험 설계에서 셀룰러 컨텍스트 부족. 셀 모양에 RNA 서식 파일 녹음 및 2'-OH acylation는 살아있는 세포; 내에서 발생 따라서, 결과 세포 맥락에서 RNA 구조 모델을 정리 수 있습니다. 셀에서 모양은 하 비보 모양에서 문학24에서 살아있는 세포에 운반 하는 모양에 대 한 추천 되었습니다 했다. 이후이 실험 동물에서 수행 되지 않습니다, 우리 셀 모양 정확도 대 한이 실험 되 나.
체 외에서 세포 모양의 뇌관 확장 단계에 대 한 전략 또한 다르다. 생체 외에서 모양, 반전 녹음 방송의 Mg2 +2'-OH acylation 위치에서 중지합니다. 밴드의 강도 acylation 속도1에 비례와 32P 표시 뇌관 연장 따라서 밴드 polyacrylamide 젤 전기 이동 법 (페이지)에 나타납니다. 셀 모양, 반전 녹음 방송 2'-OH에서 무작위 돌연변이 생성 adduct 미네소타2 +존재 위치. 각 뉴클레오티드의 mutational 속도 깊이 차세대 시퀀싱에서 캡처할 수 수 있습니다 그리고 단일 뉴클레오티드 해상도 모양 반응 다음 산출 될 수 있다.
셀 모양에 대 한 잠재적인 문제는 낮은 신호 대 잡음 비율 (즉, 2'-OH 그룹의 대부분은 수정, 수정 되지 않은 시퀀스 다음-세대 시퀀싱에서 읽기의 대부분을 차지 하는 동안). 최근, 2'-OH를 풍부 하 게 하는 방법 RNA, vivo에서 모양 (icSHAPE)를 클릭 하 여 참조, 수정 장 실험실25에 의해 개발 되었다. 이 농축 방법 RNA 상호 작용, 특히 전체 transcriptome 심문 등 약한 작은 분자를 공부에 유리한 수 있습니다.
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Protocol
1. 시험관 모양에서
참고: 프로토콜 게시 프로토콜1에서 수정 됩니다.
- RNA 서식 파일 준비
참고: T7 전사에 대 한 서식 파일 합성 이중 가닥 DNA (dsDNA) 고 중 삽입 대장균 벡터에 의해 증폭 된 EcoRI/BamHI 금지 endonuclease, pET28a, 또는 PCR에 의하여의 독특한 쌍으로 명령 했다. PCR 확대를 위한 프로토콜은 아래 나와 있습니다.- 다음 자료를 믹스: PCR 마스터의 50 μ 믹스 ( 재료의 표참조), 10 μ M에 각 뇌관을 위해 2 μ (시퀀스 표 1 참조), 200 2 μ 및 디 메 틸 sulfoxide (DMSO)의 3 μ H2두 개의 PCR로 약 수 오의 41 μ dsDNA 템플릿의 ng 튜브 (각 튜브 포함 반응 혼합물의 50 μ).
- 다음과 같이 열 cycler 설정: 단계 1) 95 ° C 30에 대 한 s; 2 단계) 20 95 ° C s; 3 단계) 20 56 ° C s; 4 단계) 20 72 ° C s; 단계 5) 루프 다시 단계로 2 30 사이클; 6 단계) 3 분;에 대 한 72 ° C 및 7 단계) 무한 다음 단계까지 4 ° C에서 개최.
- 젤 조각의 추출에 의해 PCR amplicon 정화 ( 테이블의 자료 를 참조 하 고 제조 업체의 프로토콜을 사용 하 여). 10 mM Tris (pH 8.0)를 포함 하는 트리 스-EDTA (테) 버퍼의 35 μ와 제품 DNA elute 1 mm EDTA 0.1-0.5 μ g/μ 서식 파일. 0.10 μ g/μ로 순화 된 DNA 템플렛을 정상화.
참고: 필요에 따라 서식 파일의 품질에는 1.8 %agarose 젤 전기 이동 법 0.10 μ g의 DNA 분석 수 있습니다. 원하는 서식 파일 DNA의 단일 밴드 젤에 예상 된다. - T7 녹음 방송 반응 (총 볼륨 40 μ) PCR 튜브에 다음 자료를 추가 하 여 설정: 반응 버퍼, ATP, CTP, GTP, UTP, T7 효소의 4 μ의 4 μ의 4 μ의 4 μ의 4 μ x 10의 4 μ ( 재료의 표참조) 단계 1.1.3 (0.4 μ g)에서 순화 된 PCR amplicon의 4 μ 그리고 diethyl pyrocarbonate (DEPC)의 12 μ-물 처리. 4 x 위아래로 pipetting으로 혼합. 4-16 h 열 cycler에서 또는 37 ° C 배양 기에서 37 ° C에서 품 어.
참고: 1.1.6 단계 단계 1.1.4에서에서 반응이 진행 하는 동안 설치를 시작 합니다. - DNase의 2 μ 추가, 4 배속, 위아래로 pipetting으로 혼합 및 동일한 볼륨 2의 15 분 믹스에 대 한 37 ° C에서 품 어 트리 스-borate-EDTA (TBE) x-요소 샘플 버퍼 ( 재료의 표참조). 비활성화를 3 분 동안 70 ° C에서 열.
- RNase 무료 병 혼합 40% 아크릴/bisacrylamide 솔루션의 75 mL (29: 1, 테이블의 자료를 참조), 요소, 180.2 g (RNase 무료 재료의 표참조) 10 x TBE 버퍼의 50 ml. 우 레 아의 모든 결정은 해산 때까지 궤도 셰이 커 (250rpm)에 병을 넣어 (2 시간까지 걸릴 수 있습니다). DEPC 처리 물 500 mL를 볼륨을 조정 합니다. 0.2 μ m의 막으로 솔루션을 필터링 ( 재료의 표참조).
참고: 이 과정에서 하지 않도록 반사를 사용 하 고 저 어 바 RNase 오염을 방지 하기 위해. 솔루션 4 ° C에서 최대 1 년 동안 저장할 수 있습니다. - 이온된 수와 70%는 적절 한 크기 (16.5 cm x 24 c m)의 2 개의 전기 이동 법 유리 접시를 청소 EtOH 닦아 종이의 조각을 사용 하 여. 2.0 m m 스페이서 (시 표면 플레이트 안쪽에서 마주보 고)의 쌍 판 하며 테이프와 플레이트의 가장자리를 밀봉 됩니다. 더블-테이프 유출 방지 하기 위해 플레이트의 모서리.
- 비 커에서 단계 1.1.6 10% 염화 persulfate 솔루션의 2.0 mL, tetramethylethylenediamine (TEMED)의 100 μ에서 아크릴 솔루션의 200 mL와 함께 혼합 RNase 무료 피 펫 팁 30 s. 기울기에 대 한 신속 하 게 감동 하 여 벤치탑 커버의 조각에 접시 부 어 격판덮개의 간격에서 솔루션입니다. 모든 거품을 해제 하 여 벤치탑 커버에 접시를 놓고 접시를 누릅니다. 즉시 빗을 삽입 하 고 적어도 1 시간에 대 한 유해 젤을 하자.
참고: 젤 다음 날 내에서 사용 될 경우 커버 젖은 종이 타월과 랩의 조각으로 젤의 상단 플라스틱 랩의 큰 조각. 4 ° c.에 평평 거짓말 배치 - 테이프를 제거 하 고 접시를 전기 스탠드에 클램프. 빗을 제거 하 고 위쪽 및 아래쪽 저수지에서 적절 한 1 x TBE 버퍼를 추가 합니다. 미리 W. 20에서 30 분 동안 젤을 실행
참고: 필요에 따라 원하는 RNA의 내용입니다 ~ 90% 이상, 미니 젤 대리점 젤의 대체에 사용할 수 있습니다. - 저수지에서 액체와 두 번 아래로 pipetting으로 각 로드 웰 스 워시. 우물에 1.1.5 단계에서 원유 RNA를 추가 합니다. 크 실 렌 cyanol FF 염료 (밝은 파란색) 전달 젤의 길이 (~ 60 분)의 대략 2/3까지 20 W에 젤을 실행 합니다.
참고: 우물의 높이의 1/3 더 이상 로드 확인 (필요한 경우 여러 개의 우물을 사용). - 담가 안전의 1:10,000 희석 1 x TBE 버퍼에 젤 젤을 위해 충분히 큰 용기에 ( 재료의 표참조)를 염색. 80 rpm에서 5 분 동안 궤도 셰이 커에 컨테이너를 넣어.
- UV 빛에서 원하는 RNA 밴드를 식별 하 고 신속 하 게 깨끗 한 면도날을 사용 하는 젤의 얇은 밴드를 잘라 합니다. 1.7 mL 튜브에 1-2 젤 분할 영역을 배치 합니다.
- 수동 차입 하 여 젤 조각에서 RNA를 복구할. 각 튜브를 적절 한 차입/강수량 믹스 (조각 당 ~0.3 mL) 추가: 0.3 M NaOAc (pH 5.2), 2.5 M LiCl, 1 mM EDTA, 0.1% 나트륨 라우릴 황산 염 (SDS) DEPC 처리 물에. 16 h 4 ° C에서 젤 splice(s) 포함 된 튜브를 회전 합니다.
참고: 일반적인 복구 속도가 ~ 75%가이 단계 에서입니다. 수확량을 증가 하 고는 eluent 수집 및 차입 버퍼의 동일한 볼륨을 추가 다음이 단계를 반복. - 새로운 1.7 mL 튜브에서 eluent 결합. 얼음 처럼 차가운 EtOH x 2.5를 추가 하 고, 액체를 혼합 하는 튜브 6 번 반전-80 ° C 1 시간 이상에서 튜브를 배치.
- 10000 x g 와 4 ° C에서 10 분 원심 분리기 조심 스럽게 pipetting으로 상쾌한 제거. 80%를 추가 하 여 RNA 펠 릿을 세척 EtOH (관 당 1 mL), 소용돌이 15 s, 및 10000 x g 와 4 ° C에서 10 분 원심 분리기
- 상쾌한을 제거 하 고 10 번 위아래로 pipetting으로 RNase 무료 물, 믹스의 5 분 추가 50 μ의 RNA 펠 렛 건조. RNA 농도 0.10 μ g/μ를 정상화. -80 ° c.에 순화 된 RNA를 저장
참고: -RNA 펠 릿을 건조 하지 마십시오. - 필요한 경우, RNA의 품질 분석, 희석 1 μ (100 ng) 2 x TBE 요소 샘플 버퍼의 5 μ와 물과 혼합의 단계 5에서 1.1.16 μ에서 RNA의. 그런 다음 3 분 및 부하 6 %TBE 요소 미니 젤에 70 ° C에서 열.
- 1.1.11 단계에서 완료 얼룩 180 V 1 h. 수행에서 젤을 실행 합니다. 이미징 시스템에서 UV 젤을 시각화. 단일 밴드는 원하는 길이 예상 된다.
- 32P 표시 된 입문서를 준비
- 다음과 같은 재료를 혼합 하 여 반응 설정: γ-32P-ATP의 10 μ (~1.5 mCi, 25 μ M, 재료의 표참조), 반전 녹음 방송 (RT) 뇌관 (100 μ M, 시퀀스 참조 하십시오 표 1)의 2 μ, 10 x T4 polynucleotide 키 니 아 제 (PNK)의 2 μ 반응 버퍼, T4 PNK의 1 μ ( 재료의 표참조), 그리고 5 μ RNase 무료 물. 1 시간 동안 37 ° C에서 품 어.
주의: 적절 한 보호 단계 1.2-1.5 방사성 물질에 대 한 권한이 있는 작업에 대 한 필요는. - 열-65 ° c.에 20 분 동안 비활성화 1 분 2 x TBE 요소 샘플 버퍼의 25 μ는 eluent 믹스에 대 한 1000 x g에 염 열 및 원심 분리기에 샘플을 추가 합니다. .
참고: 그것은 즉시 정화 하는 경우-20 ° C에 레이블이 원유 제품을 저장 합니다. - 20 W 1 h 10% 아크릴 아 미드 젤을 실행 합니다.
주의: 1.2.1 젤에 단계에서 32P 표시 된 입문서를 로드 하 고 최고의 저수지로 방사능 출혈 방지. 젤에 얇은 밴드를 되도록 잘의 높이의 1/3 이상 로드 되지 않습니다 (필요한 경우 여러 개의 우물을 사용). 아래쪽 저수지에서 액체는 높게 방사성 일 수 있다. - 젤 카세트의 유리 접시를 제거 하 고 플라스틱 랩의 조각에 젤을 하다. 빵빵한 샌드위치를 만들어 젤의 상단을 충당 하기 위해 플라스틱 포장을 접어. 칼슘 tungstate 인광 체 스크린에 젤 샌드위치를 놓고 이미징 장비를 노출 합니다. 젤의 가장자리 어디 인지를 일반 빛으로 다시 젤 이미지.
- 이미지 프로세싱 소프트웨어를 사용 하 여 두 개의 이미지를 오버레이. 인쇄 된 이미지에 젤을 맞춥니다. 신선한 면도칼 블레이드를 사용 하 여는 젤 원하는 밴드를 잘라. 1.7 mL 튜브에 1 ~ 2 젤 분할 영역을 배치 합니다.
참고: 인쇄 된 이미지는 실제 젤으로 같은 크기 다는 것을 확인 하십시오. 두 번 다시 젤 조각 절단 후 남은 젤을 이미징 하 여 맞춤을 확인 합니다. - 다음 단계로 1.1.13 1.1.16 32P 표시 된 입문서를 복구 합니다. 0.4 mL 튜브에 솔루션의 1.0 μ를 1.0 μ ~ 100000 cpm에서의 방사능을 얻기 위해 1 x 테 버퍼 뇌관을 희석. RNA 2'-오 수정 반응까지 하지만 4 주 보다는 더 이상에 대 한 정화 32-80 ° C에서 P 표시 된 입문서를 저장 합니다.
- 다음과 같은 재료를 혼합 하 여 반응 설정: γ-32P-ATP의 10 μ (~1.5 mCi, 25 μ M, 재료의 표참조), 반전 녹음 방송 (RT) 뇌관 (100 μ M, 시퀀스 참조 하십시오 표 1)의 2 μ, 10 x T4 polynucleotide 키 니 아 제 (PNK)의 2 μ 반응 버퍼, T4 PNK의 1 μ ( 재료의 표참조), 그리고 5 μ RNase 무료 물. 1 시간 동안 37 ° C에서 품 어.
- 작은 분자 바인딩 및 RNA 2'-오 수정
- 4 개의 샘플을 준비 하려면 추가할 8 pmol RNA 0.5 x 테 버퍼의 32 μ에 1.7 mL 튜브, 2 분, 그리고 스냅-멋진 적어도 1 분 동안 얼음에 80 ° C에서 열.
참고: 다음 방정식을 사용 하 여 RNA의 대략적인 분자량 계산: MW (#의) = 340 다 x. - 20 mM MgCl2, 및 500 mM NaCl 500 mM HEPES (pH 8.0)를 포함 하는 혼합을 접는 x 5의 8 μ를 추가 합니다. 각 4 개의 PCR로 RNA 혼합물의 aliquot 9 μ 튜브 하 고 그들에 레이블 #1-#4. #1 튜브, #2에 집중 된 작은 분자 솔루션 (10 %DMSO)의 1 μ로 1 μ 10 %DMSO 추가 희석된 작은 분자 솔루션 # 3 (10 %DMSO)의 1 μ 그리고 # 4에 물 1 μ.
- 30 분 동안 열 cycler에서 37 ° C에서 PCR 튜브를 품 어.
- 2'-오 수정 반응 앞 0.5 M 작업 솔루션을 DEPC 처리 물의 3 μ와 NAI 재고 솔루션 (2 M)의 1 μ를 희석. 지체 없이, NAI 솔루션 튜브 #1, # 2와 #3, 작업의 1 μ 그리고 # 4에 25 %DMSO 1 μ를 추가 합니다. 15 분에 대 한 열 cycler에 있는 37 ° C에서 품 어.
- 차입/강 수의 100 μ glycogen (15 mg/mL)의 2 μ (단계 1.1.13 레시피 참조), 혼합 1.7 mL 튜브에 각 PCR 튜브에 모든 액체를 전송 추가. 얼음 처럼 차가운 200 증거 EtOH 0.34 mL을 추가 (3 x 볼륨) 각 관으로. 5 s와 장소에 대 한 vortexing에 의해 믹스-80 ° C 냉동 적어도 1 시간에 대 한 관.
참고: 이 기간 동안 시작 시퀀싱 젤 단계 1.5.1에서에서 사용 하도록 설정 합니다. - G 와 4 ° C x 14, 000에서 15 분 동안 원심 분리기 RNA 펠 렛을 방해 하지 않고는 상쾌한을 제거 합니다. 80%를 추가 하 여 RNA 펠 릿을 세척 EtOH 튜브 당 (0.5 mL), 소용돌이 15 s, 그리고 20000 x g 와 4 ° C에서 15 분 동안 원심 분리기에 대 한 다시는 상쾌한을 제거 합니다.
참고: 필요한 경우,가 거 카운터를 사용 하 여 방사성 펠 렛 튜브에 유지 되도록. - RNase 무료 물 5 분 추가 9 μ의 RNA 펠 렛 건조 하 고 10 번 위아래로 pipetting으로 혼합.
참고: -RNA 펠 릿을 건조 하지 마십시오. 모든 강 수가이 단계 끝에 해산 될 예정 이다.
- 4 개의 샘플을 준비 하려면 추가할 8 pmol RNA 0.5 x 테 버퍼의 32 μ에 1.7 mL 튜브, 2 분, 그리고 스냅-멋진 적어도 1 분 동안 얼음에 80 ° C에서 열.
- 마커 준비 및 뇌관 연장
- 4 새로운 PCR 튜브로 수정 된 RNA를 전송 하 고 그들에 레이블 #1-#4 이전. 4 추가 PCR 관에 7 μ DEPC 처리 물에 2 pmol 제어 RNA를 추가 하 고 그들에 레이블 #5 ~ #8. 모든 8 개의 튜브에서 방사선된 뇌관 (단계 1.2.6)의 2 μ를 추가 합니다. 5 분, 65 ° C에서 anneal 다음 즉시 열 cycler에서 4 ° C까지 냉각 열.
- 추가 실시간 버퍼 x 5의 4 μ ( 재료의 표참조), dithiothreitol (DTT, 0.1 M)의 1 μ와 dNTP 믹스 (10 mM 각) 각 8 PCR 튜브의 1 μ.
- DEPC 처리 H2O 2 μ 관 #1 ~ # 4에 추가 합니다. 추가 ddATP (5 m m)의 4 μ, ddTTP (5 m m)의 4 μ 그리고 ddCTP (5 m m)의 4 μ 튜브 #5 ~ #7, 각각. 튜브 # 8를 ddGTP (5 m m)의 1 μ와 DEPC 처리 물의 3 μ를 추가 합니다. 4 피 펫 혼합 시간.
- 열 cycler에서 1 분 52 ° C에서 열. 1 μ 역전사의 추가 ( 재료의 표참조), 다음 4 번 위아래로 pipetting으로 혼합. 20 분 동안 52 ° C에서 반응을 품 어.
- 각은 RNA를 튜브 5 M NaOH의 1 μ를 추가 합니다. 5 분 동안 95 ° C에 튜브를 열.
- 1 M HCl의 5 μ를 추가 하 고 반복 에탄올 강수량 (1.3.5 단계와 단계 1.3.6), 글 리 코겐 및 액체 전송 제외 하 고.
참고: "소금 앞"로 알려진 젤 중간 흐림 지역에서 단계 1.4.6 결과 생략. - 5 분 추가 10 μ H2O의 DNA 펠 렛 건조 고 10 μ 2 x TBE 요소 로딩 버퍼와 10 번 redissolve 위아래로 피 펫. 5 분 동안 70 ° C에서 열 젤에 적재 하기 전에 얼음에 튜브를 놓습니다.
- 페이지 분석
- 8 %polyacrylamide 연속 젤 준비, 단계 1.1.6 1.1.10 다음 수정: 40% 아크릴/bisacrylamide 솔루션 (29: 1) 100 mL를 사용 하 여 8% 아크릴 솔루션을 준비 하 고 시퀀싱 젤 유리 접시 (예를 들어, 46을 사용 하 여 57 cm) x 0.4 m m의 스페이서와 함께.
- 1.4.7 단계에서 샘플의 10 μ를 로드 합니다. 65 W 2 h 또는 하단 염료는 젤의 3/4에 도달할 때까지 젤을 실행 합니다.
참고: 필요한 경우 반복-80 ° C에서 샘플의 나머지 부분을 저장 합니다. - 스페이서를 제거 하 고 부드럽게 주걱을 삽입 하 여 상위 시 유리 접시를 제거 합니다. 젤 커버 대형 필터 종이 놓고 허용 필터 종이에 젤을 살짝 누릅니다. 아래쪽 끝에서 시작, 필터 종이 리프트 하 고 함께 유리 접시에서 젤을 제거.
- 필터 종이 함께 젤 전체 젤 (지 향하도록)를 충당 하기 위해 충분히 큰 플라스틱 랩의 조각에 놓습니다. 필터 종이 면이 아래로 향하게 젤 건조 기에 필터 종이/젤/플라스틱 랩 샌드위치를 전송.
주의: 방사성 물질 오염을 방지 하려면 3 ~ 4 젤 샌드위치 사이 큰 필터 종이의 더 많은 부분을 사용 하 고 젤 건조 기. - 진공으로 1 시간에 70 ° C에서 젤을 건조. 표백 하는 사진 인 저장 화면 카세트에 젤 샌드위치를 전송 합니다. 4-16 h에 대 한 화면에 젤의 방사능 노출.
- 이미징 장치 및 중간 해상도 (~ 30 분) 스캔에 형광체 저장 화면을 놓습니다.
참고: 젤 이미지에 미소 같은 유물 경우 수정 소프트웨어 (예를 들어, 사파)를 사용 하 여 게시 품질에 이미지 처리. 표준 마커 레인 1 뉴클레오티드 2'-오 수정 차선 보다는 마음에 계속.
2. 셀 모양
- 뇌관 디자인
참고: 생체 외에서 모양을 달리 셀 모양 식 카세트 디자인 필요 하지 않습니다. 그러나, 최적의 입문서 세트 사용 해야 하며 모양 하기 전에 평가 되어야 한다 실험.- 폭발 기반 뇌관 설계 도구 (예를 들어, 뇌관 폭발)에 의해 적어도 3 개의 독특한 뇌관 쌍을 생성 합니다. 공부 하 고 사전-인간의 세포에 있는 mRNA, 인간 게놈 (하지 transcriptome) 뇌관 쌍 특이성 검사 매개 변수에서 참조 데이터베이스 선택 합니다. 200-1000 기초 쌍 (bp)의 범위에서 amplicon의 크기를 선택 합니다.
- RNase A와 protease K의 치료와 함께 회전 열 기반 방법으로 관심의 ~ 106 세포에서 게놈 DNA를 추출 ( 테이블의 자료 를 참조 하 고 제조 업체의 프로토콜을 사용 하 여). 0.1 μ g/μ 테 버퍼에 순화 된 게놈 DNA를 정상화.
- 테스트 PCR 프로토콜 1.1.1, 1.1.2 단계에서 수행합니다.
참고: 원하는 뇌관 세트 1.8 %agarose 젤에 단일 밴드를 양보 한다.
- 세포 준비 및 2'-오 수정
참고: 관심의 사전 mRNA의 풍부를 증가 구성 식 세포 (CMV) 발기인에서 올바른 시퀀스와 minigene 호스트 세포로 페는.- 미리 10% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS) 및 1 x 항생제 혼합물에 Dulbecco의 수정이 글 중간 (DMEM) 37 ° c.에 포함 된 문화 매체를 따뜻한 50 %confluency 문화 매체에 transfection 이전 24 시간에 종자 293T 세포. 2%로 매체를 변경 항생제 1 ~ h는 transfection 전에 없이 DMEM에서 FBS.
- 1 96 잘 접시의 감소 된 혈 청 미디어 ( 재료의 표참조)의 100 μ로 minigene 플라스 미드의 10 μ g을 추가 합니다. 혼합 4 번 위아래로 솔루션 플라스틱
- 40 μ transfection 시 약의 추가 ( 재료의 표참조)에 격판덮개의 다른 잘 감소 된 혈 청 미디어의 100 μ로. 최대 플라스틱 및 혼합 4 번 아래로. 5 분 동안 실 온에서 품 어.
- Transfection 시 정지에 전체 플라스 미드 솔루션을 추가 합니다. 최대 플라스틱 및 혼합 4 번 아래로. 30 분 동안 실 온에서 품 어.
- 전체 DNA를 추가 / 접시에 걸쳐 매체의 표면에 dropwise transfection 시 혼합물. 6-12 h 37 ° C에서 품 어.
- 매체를 발음 하 고 부드럽게 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS, pH 7.4, CaCl2 , MgCl2, 없이 재료의 표참조)의 5 mL로 한 번 씻어. 트립 신 솔루션의 3 mL와 함께 셀 trypsinize 5 분 동안 실 온에서 품 어.
- 접시는 접시의 아래쪽에서 세포 분열을 부드럽게 노크. 중화 문화 매체의 6 mL와 트립 신. 4 분에 대 한 300 x g 에서 centrifuge 고 매체를 제거 합니다.
- 반응 매체의 199 μ에 각 샘플에 대 한 ~ 106 셀 resuspend (1% FBS DMEM에) 및 96 잘 접시에 세포 현 탁 액을 전달. 복합 작업 솔루션의 1 μ와 모든 세 개의 컨트롤 37 ° c.에 30 분에서에서 DMSO의 1 μ 셀을 품 어
참고: 3 제어 샘플 포함 되어야 한다: NAI, NAI, 및 NAI 변성된 RNA DMSO 제어 부정적인 통제. - 변성 컨트롤 (DC) RNA 및 NAI 부정 컨트롤 제외한 각 샘플을 2m NAI의 10 μ를 추가 합니다. 최대 플라스틱 및 혼합 4 번 아래로. 15 분 부드럽게 흔들어 다시 셀 마다 5 분 중단 번호판에 대 한 37 ° C에서 품 어.
- 1.7 mL 튜브와 지체 없이 2 분에 대 한 400 x g 에서 원심 분리기로 셀을 전송 합니다. 셀 펠 렛을 방해 하지 않고는 상쾌한을 제거 합니다.
- 0.4 mL guanidinium 안산의 추가 ( 재료의 표참조). 15 소용돌이 균질에 s. 5 분 동안 실 온에서 샘플을 품 어.
참고: 샘플은 다음 단계를 진행까지-20 ° C에 저장할 수 있습니다.
- RNA 추출
- Guanidinium 안산 무 균 샘플의 각각 클로 프롬의 0.2 mL를 추가 합니다. 2 분 동안 실 온에서 15 미 품에 대 한 소용돌이.
- 12000 x g 와 4 ° C에서 5 분 동안 원심 분리기 최고 무색 수성 층 RNA를 포함합니다. 새로운 1.7 mL 튜브에 수성 해결책의 ~ 380 μ를 전송 합니다.
주의: 오염을 피하기 위하여 interphase를 방해 하지 마십시오. - EtOH의 1.5 x 볼륨을 추가 (570 ~ μ). 15 대 한 소용돌이를 섞어 s.
- 600 μ RNA의 RNA 격리 스핀-열에 전송 ( 재료의 표참조). 원심에서 12000 x g 15 미 폐기를 위해 eluent는. 동일한 회전 열에 모든 액체를 통과 하려면이 단계를 반복 합니다.
- 0.35 mL RW1 버퍼의 열 세척 ( 재료의 표참조) 나 RDD 버퍼에 RNase 무료 DNase의 15 미 추가 80 μ에 대 한 회전에 의해 ( 재료의 표참조). 20 분 동안 실 온에서 품 어.
참고: 그것은 모든 DNA 오염 제거에 중요 한입니다. - 그 후 0.35 mL 및 2 x RPE 버퍼의 0.6 mL RW1 버퍼의 열을 씻어 ( 재료의 표참조) 15 회전 하 여 각 단계에서 s. 12000 x g 1 분 동안에 빈 컬렉션 튜브와 스핀 열 centrifuging 여 열 건조.
- 열 중심에 RNase 무료 물 32 μ를 추가 합니다. 12000 x g 30에 1 분 원심 분리기에 대 한 품 어를 순화 된 RNA 솔루션의 ~ 30 μ s. 변성된 샘플을 처리 하는 동안-20 ° C에서 샘플을 넣어.
- 변성된 RNA 제어 준비
- 장소 30 µ L RNA 샘플 DC에 대 한 얼음에 1.7 mL 플라스틱 튜브에. Formamide의 50 μ와 300 mM HEPES (pH 8.0)를 포함 하는 DC 버퍼의 15 μ 추가 및 25 mM EDTA 튜브에.
- 1 분 동안 95 ° C에서 RNA를 신속 하 게 변성을 열 NAI 재고 솔루션 (2 분), 다음 두 번 혼합 하 고 다시가 열 블록에 튜브를 넣어 영화의 5 μ를 추가 합니다. 추가 1 분 동안 95 ° C에 품 어 다음 즉시 얼음에 튜브를 넣어.
- Guanidinium 안산의 0.4 mL를 추가 합니다. 2.3.1–2.3.4 단계를 반복 합니다.
- 2 x RPE 버퍼의 0.6 mL와 열 세척 ( 재료의 표참조) 15 회전 하 여 각 단계에서 s. 12000 x g 1 분 동안에 빈 컬렉션 튜브와 스핀 열 centrifuging 여 열 건조.
- 열 중심에 RNase 무료 물 32 μ를 추가 합니다. 12000 x g 30에 1 분 원심 분리기에 대 한 품 어를 복구 된 DC RNA 솔루션의 ~ 30 μ s.
- 뇌관 연장
- 2.3.7 2.4.5에서 RNA 솔루션 RNase 무료 물 0.5 μ g/μ로 정상화. 갓 30 mM MnCl2 솔루션 MnCl2∙4H2O 분말에서 준비 합니다.
- 각 샘플에 대 한 RNA 솔루션의 9 μ PCR 스트립에 전송 합니다. 각 관에서 10 mM dNTP의 1 μ와 2 μ M 유전자 특정 뇌관 (GSP)의 1 μ를 추가 합니다. 최대 플라스틱 및 혼합 4 번 아래로. 열 cycler에서 5 분 65 ° C에서 품 어와 ice에 넣어 > 1 분.
참고: 또는, 임의의 nonamer의 1 μ GSP의 대체에 사용할 수 있습니다. - 각 PCR 튜브에 추가 RT 버퍼 x 10의 2 μ의 혼합물 ( 재료의 표참조), 30 mM MnCl2, 100mm DTT의 2 μ의 4 μ. 혼합 4 x 위아래 플라스틱. 2 분 동안 42 ° C에 품 어.
- 1 μ 역전사의 추가 ( 재료의 표참조). 혼합 4 x 위아래 플라스틱. 42 ° c 3 h에 대 한 열 cycler에서 품 어.
- 라이브러리 준비 및 차세대 시퀀싱
- PCR 반응의 DNA 중 합 효소 1 μ, DNA 중 합 효소 버퍼 x 10의 5 μ를 추가 하 여 설정 ( 재료의 표참조), DMSO, 1.5 μ (10 μ M), 뇌관의 각각 34 μ H2O, 그리고 단계 2.5.4에서에서 cDNA의 5 μ의 2 μ.
- 다음과 같이 열 cycler 설정: 2 분; 1) 95 ° C 단계 2 단계) 95 ° C 30에 대 한 s; 3 단계) 30 60 ° C s; 4 단계) 30 ° C 68 s; 단계 5) 루프 다시 단계로 2 30 사이클; 6 단계) 3 분;에 대 한 68 ° C 및 7 단계) 무한 다음 단계까지 4 ° C에서 개최.
- 1.8 %agarose 젤을 사용 하 여는 amplicon 정화.
참고: PCR 악대는 젤에 단일 밴드로 표시 되어야 합니다. - 표준 조각화 및 문학6,26에 결 찰 방법을 사용 하 여 라이브러리를 생성 합니다.
- 1 x 75 일자형 읽기를 사용 하 여 약 10 백만 생성 하는 차세대 시퀀싱 장비에 시퀀스 샘플 당 읽습니다.
- ShapeMapper 및 SuperFold 소프트웨어를 사용 하 여 결과 분석 하는 주에 의해 개발 된 패키지 그룹26.
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Representative Results
우리는 이전 변조기를 접합 하는 RNA, SMN-C2, SMN2 유전자의 사전-mRNA의 exon 7에 AGGAAG 모티브로 작용을 SMN C26존재 RNA 구조 변화를 평가 하기 위해 모양 사용 설명 했다. SMN-c 2의 바인딩 사이트는 FDA 승인 센스 oligonucleotide (아소) SMA, 바인딩하고 차단 intronic 접합 소음 기 (ISS) intron 727,28 (그림 1A)에 nusinersen에 대 한 구분 이다. 가장 알려진된 접합 레 귤 레이 터 SMN2 exon 7의 범위 내에 있는 ~ 100 뉴클레오티드의 exon 7 사전 mRNA29; 따라서,는 140과 276 뉴클레오티드 긴 RNA 시퀀스 사용 되었다 생체 외에서 그리고에서 셀 모양, 대표적으로, exon 7과 인접 한 intron 지역 (그림 1A)를 커버 하.
이 대표적인 생체 외에서 모양 분석에서 관심사의 RNA 순서는 대부분 RNA 시퀀스1호환 주 연구소에 의해 개발 된 최적화 된 카세트에 포함 됩니다. 때때로, 관심사의 순서 상호 작용 하거나이 카세트를 방해 합니다. 이러한 경우에는 수정 된 카세트 사용할 수 있습니다 다음 세 가지 특성: RNA 순서, ii)는 고도로 구조화 된 머리 핀 루프의 어떤 부분 보다는 뇌관에 대 한 보다 효율적인 교 잡 선호도 i) 3'-끝 특정 뇌관 바인딩 사이트 위치한 직접 구체적이 고 재현 가능한 모양 신호 (이 두 실험 및 정렬 신호 실험에서 실험 하는 방법에 대 한 내부 통제로 작동할 것 이다), 및 iii에 표시 됩니다 뇌관 바인딩 사이트의 업스트림) 5'-끝 머리 핀 구조 요소 모양 신호의 끝을 나타냅니다. 모양 카세트 자체에서 모두 5' ribozyme 시퀀스를 고착 된 형벌 더 이다-고 3'-끝30동종 RNA 생성 하기 위하여. 우리는 귀상어과 간염 델타 바이러스 ribozymes 모양 카세트 호환 되며 일반적으로 원하는 RNA의 높은 수익률을 제공을 발견. 결과 템플릿 RNA는 3'-의 끝을 2', 3'-순환 인산 및 5'-끝을 수 산 기 그룹의 뇌관 연장 방해 하지 않습니다. SMN2와 사전 mRNA에 인접 한 지역의 exon 7 취재 140 nucleoside 긴 시퀀스 계획 1에서 볼 수 있듯이 모양과 ribozyme 카세트 내 합성 했다.
일반적으로, 식 카세트에 출혈 하는 관심사의 순서 구조의 잠재적인 보조 또는 더 높은 순서를 충당 하기 위해 충분히 오래 되어야 합니다. SMN2 exon 7 일 경우 140-뉴클레오티드 지역에는 두 줄기 루프 구조6,31포함 되어 있습니다. 관심 영역의 구조 경우에 의해 변화 하 고 재판 및 오류에 의해 평가 되어야 한다.
32P 표시 된 뇌관 확장 제품 polyacrylamide 시퀀싱 젤이 대표적인 실험에 생체 외에서 모양 프로필을 시각화 하기 위해 선정 되었다. 다른 시각화 방법 붙일 레이블 DNA 뇌관32모 세관 전기 이동 법을 사용 하는. Polyacrylamide 시퀀싱 젤, 20 ~ nucleosides 5'-끝 근처에 3'-끝의 가까이 관심사의 RNA 순서 ~ 10 뉴클레오티드 양적 시각 될 것입니다, 때문에 가끔과 강렬한 반전 녹음 방송의 개시 단계에서 중지 전체 길이 성적표1페이지 젤에 밴드.
경우 원하는 RNA 서식 파일의 수확량은 미니 젤을 오버 로드 하는 RNA 서식 파일 (단계 1.1.6 1.1.12)의 대리점 젤 복구에 대 한 대체 방법을 > 90%. 담 열을 방출 테 버퍼의 50 µ L에서 RNA RNA 제품에서 초과 NTP를 제거 하는 것이 좋습니다. RNA의 농도 측정 하 고 각 잘에서 5.0 µ g를 로드 합니다. 정화 하는 동안 단계는 t 7의 복사할 RNA 템플릿, 크 실 렌 cyanol FF 염료 (밝은 파란색) 전달 될 때 페이지를 중지-3 분의 2는 6%의 변성 TBE 요소 젤. 자기 분열 RNA 조각 (< 80 nucleosides) 얼룩 (그림 1B)에 따라 젤에 유일한 주요 악대로 원하는 RNA를 왼쪽 젤을 통과.
SMN-C2 (그림 1C)33 게시 절차 따라 합성 되었고 10 mM DMSO 재고 솔루션에 용 해. 재고 솔루션은 각각 50, 5 µ M의 최종 농도 달성 하기 위해 10 %DMSO 솔루션에서 500, 50 µ M으로 더 희석 된다. 37 ° c.에 30 분 이내 DMSO SMN C2 면 전에 서 그것의 평형 단계를 refolded 스냅 냉각 RNA 장시간 보육 실험의 결과 바꾸지 않았다. 두 실험 샘플 (50, 5 µ M SMN C2), 2 (DMSO 및 NAI-제어), 제어 및 4 개의 표식 (A, T, G, C) 뇌관 연장에 대 한 치료. 인 저장 화면에 젤, 노출 후 성공적인 모양 실험 표시 됩니다: 젤과 ii) 비방 (그림 1D) 없이 단일 뉴클레오티드 해상도 젤 내내 밴드의 상단에 i)는 단일 및 가장 강렬한 밴드. 페이지 분석에서 일반적인 문제는 "소금 앞"으로 알려진 얼룩 지역 (그림 1E) 젤의 한가운데에 나타날 수 있습니다. 이것은 아마도 때문에 고 농도의 소금, DMSO, 또는 다른 원치 않는 로드 샘플 에탄올 강 수에 의해 제거 될 수 있는 물질.
시험관 모양, 순수 RNA 서식 파일은 성공적인 실험에 대 한 키. 불순 한 RNA 서식 파일은 일반적으로 원치 않는 결과의 원인이 다. 페이지 분석은 명확 하 게 마커 2 세트의 패턴을 보여줍니다, RNA 서식 파일은 균질 성 고 TBE 요소 젤를 대리점에 의해 repurified에 필요한 것을 나타냅니다.
셀 모양에 대 한 성공적인 실험에 열쇠 확대를 위한 최적화 된 뇌관 세트 디자인 이다. 템플릿의 genomic DNA 무료 cDNA 0.10 µ g와 함께 단일 밴드 agarose 젤 분석에서 25 PCR 주기 내에서 관찰 해야. 반복적인 intron 시퀀스 그러므로 피해 야 한다. 공부는 구조를 SMN2 사전-mRNA, 3 뇌관 세트 (표 2)에서 SMN-c 2의 영향 테스트 되었습니다, 그리고 모든 만족 (그림 2A)을 했다.
대상 RNA 순서의 낮은 복사 번호는 일반적으로 셀에서 모양에 대 한 문제. 관심의 RNA를 풍부 하 게 강한 CMV 발기인에서 관심사의 RNA 순서를 포함 하는 minigene 293T 세포로 페 했다. SMN2 minigene의 접합 패턴 또는 SMN C219,34없이 생 SMN2의이, 때문에 우리는 구상 SMN-c 2는 overexpressed SMN2 사전-mRNA 가능성이 있는 상호 작용 RNA는 동일의 구조 내 생 유전자 제품입니다. 동안 접합 분석 결과에서 SMN-c 3의 EC50 ~0.1 µ M6,19, 농도 (20 µ M) 높은 끝에 작은 분자 및 대상 RNA 시퀀스의 바인딩 상태를 보장 하기 위해 사용 되었다.
RNA의 격리, 따라 유전자 특정 및 무작위 뇌관 확장을 위해 사용할 수 있습니다. SMN2의 exon 7의 경우 우리 SMN2E7-338-RV (표 2) 보다 더 강렬한 밴드 SMN2E7 276 뇌관 세트 (표 2) PCR 증폭에 의해 입증 임의의 nonamer 원하는 cDNA의 높은 복사 생성 후 발견 25 주기. 2'-오 수정 단계에서 91 µ M 마지막 NAI 농도 15 분의 인큐베이션 기간 동안 사용 되었다. 다른 셀 형식 또는 매체를 사용 하는 경우 보육 시간 다시 최적화 해야 합니다. 부 화 시간이 너무 긴 경우는 amplicon의 agarose 젤 분석 때로는 밴드 표시 못합니다.
파이썬-기반 프로그램, ShapeMapper, 실험실35 다음-세대 시퀀싱 [에 대 한 사전-mRNA, SMN-C2 치료 셀에서 모양 SMN2의 exon 7의 원시 데이터 시퀀스 읽기 아카이브 (SRA)를 참조 하 여 생성 된 데이터를 분석 하는 데 사용 되었다 주에 의해 개발 된 데이터베이스]입니다. Amplicon, 전체 모양 반응 크게 바꾸지 않았다 (> 1),이 이차 구조 SMN-C2 (그림 2B) 존재 남아 표시. 이것은 또한 SuperFold35에 의해 생성 된 아크 플롯에 의해 확인 됩니다. 연결 라인 가능한 기본 쌍 각 뉴클레오티드의 모양 활동을 기반으로 나타냅니다. SMN C2 DMSO 처리 RNA 모델링은 본질적으로는 같은 (그림 2C). 차동 셀 모양 반응 각 뉴클레오티드 (그림 2B)에 대 한 계산 그리고 대부분 반응성 변화에서 TSL-1 (5'-끝의 exon 7) 하지만 하지 TSL-2 (3'-끝의 exon 7). 이 결과 동의 시험관 모양; 비록, 체 외에서 이동 기본 페어링 셀 모양에서 모양 RNA 모델링 분석 (그림 2D).
셀 모양의 일반적인 문제는 amplicon에 걸쳐 낮은 돌연변이 비율 이다. 이것은 일반적으로 게놈 DNA 오염 때문입니다. DNA는 2'-OH 그룹;를 포함 하지 않는다 따라서, acylation 제품은 NAI 형성 된. PCR 증폭 따라서 단지 DNA 중 합 효소의 낮은 돌연변이 비율을 반영 한다. Guanidinium 안산에 열 DNase 소화 다음 RNA의 격리는 대부분의 경우에서 모든 DNA를 제거 하려면 충분 합니다. DNA 오염 지속 되 면, RNA 격리 2.3 단계를 반복 합니다.
제도 1: RNA 전사의 서식 파일에 대 한 DNA 시퀀스. 빨간색에서 귀상어 바이러스 ribozyme 시퀀스 내에서 12 bp 시퀀스는 첫 번째 12의 역 보완 5'-카세트의 혈압. 여기에 소개 하는 관심사의 RNA 순서는 140 bp 사전 mRNA 순서 포함 exon 인간 SMN2 유전자의 7. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 1: 실험 설계 및 SMN2 exon 7 pre-mRNA SMN-c 2의 존재에 대 한 생체 외에서 모양의 결과. (A) SMN2 유전자의 생체 외 및 셀 모양 연구 관심사의 순서의 개요. SMN C2 nusinersen 바인딩 사이트에서 exon 7에 AGGAAG 주제, 독특한 위치에 바인딩합니다. (B) T7 전사 제품의 정화. 각각 3 차선 원유 RNA의 5.0 µ g을 포함 되어 있습니다. TBE 요소 젤 1 x TBE 버퍼에서 5 분 SYBR-안전 (1:10, 000)으로 얼룩진 했다. 빨간 점선된 상자 RNA 복구에 대 한 절단의 가장자리를 나타냅니다. (C) SMN-c 2의 구조. (D) 시험관 모양 실험 NAI와 140 뉴클레오티드 긴 RNA 템플릿 exon 7 포함 된. 1 = DMSO; 2 = SMN-C2 (50 Μ M); 3 = SMN-C2 (5 Μ M); 4 = NAI;의 부족 5-8 = 사다리 뇌관 연장 동안 ddATP, ddTTP, ddCTP, 및 ddGTP의 추가 의해 생성 된. 페이지 실행 되었다 밖으로 60 W 3 h. 레드 TBE 요소 시퀀싱 젤에 별표 50 µ M SMN C26증가 밴드 강도 나타냅니다. (E)에서 별도 파선된 빨간색 상자에 "소금 앞" 영역의 예 실험. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: 셀 모양 SMN2 exon 7 pre-mRNA에 대 한 RNA 모델링 파생. (A) PCR 증폭을 모든 3 개의 뇌관 세트 (표 2) agarose 젤 분석에서 단일 밴드를 굴복. 1 SMN2E7-338, 2 = SMNE7-276, 3 = SMN2E7-251, 4 = = DNA 사다리. 10 µ M에 대 한 SMN2 minigene 페 293T 세포 (B) 차동 셀 모양 반응성 SMN C2 및 TSL1에서 DMSO. 단일 뉴클레오티드 해상도 모양 반응입니다. 그것의 표준 편차는 ShapeMapper 소프트웨어35에 의해 계산 되었다. 녹색 별표 나타냅니다 10 µ M에 의해 유도 된 중요 한 모양 반응성 변화 SMN C2. X표시 된 276 bp amplicon에 뉴클레오티드의 번호 매기기-축. 오차 막대 모양 매퍼 소프트웨어26에 의해 견적 되었다. (C) 가장 그럴듯한 RNA 이차 구조 셀에서 셰이프 데이터 모델링에 대 한 SuperFold35 에 의해 생성 된 아크 플롯. (D) 의 exon 7과 인접 한 지역, 생체 외에서 그리고에서 셀 모양 감독 모델링. 생체 외에서 RNA 모델에 대 한 안정화 카세트 (오렌지) 및 뉴클레오티드 1-19 (파랑) 모양 스케치에 표시 됩니다. 셀에서 RNA 모델, 뉴클레오티드 번호 매기기 시험관 모양 템플릿을 사용 하 여 정렬 됩니다. 1-18 년과 120-140 뉴클레오티드 생략 했다. 중요 한 반응성 변화 표시 된다 빨간색과 녹색 별표에 생체 외에서 그리고에서 셀 모양, 각각. TSL1 및 TSL231 라는 이전 했다 이차 구조는 파란색 상자에 동봉 되어있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
| 뇌관 이름 | 5'-3' 시퀀스 |
| Ribozyme FW | TAAAACGACGGCCAGTGAAT |
| Ribozyme RV | GCAGGTCGACTCTAGAGGAT |
| RT 뇌관 | GAACCGGACCGAAGCCCG |
표 1: 대표적인 실험에 사용 되는 뇌관 시퀀스.
| 이름 | 시퀀스 (5 '→ 3') |
| SMN2E7-338-FW | AAAGACTATCAACTTAATTTCTGA |
| SMN2E7-338-RV | TGTTTTACATTAACCTTTCAACT |
| SMN2E7-276-FW | AATGTCTTGTGAAACAAAATGCT |
| SMN2E7-276-RV | AACCTTTCAACTTTCTAACATCT |
| SMN2E7-251-FW | TGAAACAAAATGCTTTTTAACATCC |
| SMN2E7-251-RV | TCAACTTTCTAACATCTGAACTTTT |
표 2: 뇌관의 사전 mRNA 순서의 확대를 위한 설정 합니다. 모든 3 개의 뇌관 세트 genomic DNA 무료 cDNA 템플릿 사용 하 여 PCR 반응에서 단일 amplicon 항복.
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Discussion
생체 외에서 모양, 그것이 고품질 동종 RNA 서식 파일을 사용 하 여 중요 합니다. 그러나 T7 전사,, 종종 다른 유형의 시퀀스36을 생성합니다. 특히, ± 1에는 3'-무시할 수 없는 수익률36 와 뉴클레오티드와 시퀀스는 일반적으로 polyacrylamide 젤 정화에 의해 제거 될 어렵다. 유형이 다른 RNA 템플릿을 때로는 어려운 결과 해석 하는 뇌관 확장 제품의 시퀀싱 젤 프로 파일링 신호 하나 이상의 집합에 발생할 수 있습니다. Ribozyme에서 모두 5'-3'-끝 RNA 템플릿 식 카세트의 양쪽 균일 할 것입니다.
생체 외에서 그리고에서 셀 모양, 2'-오 수정 시 약의 부 화 시간은 또 다른 중요 한 요소 이다. 그것은 적어도 5 배 하프 라이프 2'-OH acylation 물 냉각 하는 시 약의 사용된1이어야 한다 주 그룹에 의해 제안 되었다. 우리의 손에, NAI와 잠복기 (T1/2 = ~ 20 분)에 대 한 > 생체 외에서 그리고에서 셀 형태로 30 분 overreacted 결과에 결과. 그림 1D같이 있어야 좋은 시험관에 모양 프로 파일링 > 전체 길이 사본으로 젤 위에 50% 총 신호 대부분의 수정 된 보장 RNA는 한 번만 acylated. 반응 더블-acylated 제품 무시할 수 없는 렌더링 하 고 풍부한 짧은 길이 확장 제품에 편향 프로 파일링. 셀 모양에서 도서관 건축을 위한 amplicon agarose 젤 분석 (2.6.3 단계)에서 단일 밴드 나타납니다. 밴드의 얼룩 나타냅니다 과잉 반응, 그리고 품 시간을 감소 한다. 대표적인 실험에서 37 ° C에서 15 분 보육 시간이 했다 생체 외에서 그리고에서 셀 모양에 대 한 최적의. 이 NAI 수정 비슷한 응용 프로그램에 대 한 시작 지점으로 사용 해야 합니다.
다른 2'-오 수정 시 약22 널리 이용 되는 모양, 1 M 7 등이 있다. 나이에 비해, 1 M 7에 짧은 반감기 2'-OH 그룹을 더 나은 반응 물22합니다. 우리의 손에서 1 M 7 RNA 격리 복잡 한 셀 모양 실험에서 세포 배양에 있는 노란 강 수의 엄청난 금액을 형성 했다. 비교 이유 생체 외에서 그리고에서 셀 모양 SMN C2 및 SMN2 이전 mRNA 상호 작용의 연구에 대 한 2'-오 수정 시 약으로 NAI 사용. 생체 외에서 모양이을 필요한 경우에 1 M 7는 대체 옵션은 riboswitch 구조 결정7,8에서 다양 한 연구에 의해 입증.
일반적으로, 생체 외에서 도형 위에 셀에서 형태는 선호, 분자는 아마도 진 핵 세포의 핵에서 행동 하는 경우에 특히. 핵에 있는 RNA 의무적인 단백질 풍부, 있으며 생체 조건 하에서 세포 컨텍스트를 정리 하기 거의 불가능 하다.
지난 10 년간에서 모양 된다 RNA의 이차 구조 공부를 위한 표준 방법. RNase37와 전통적인 RNA 프린팅에 비해, 더 적당 하다 작은 분자 RNA 상호 작용을 공부 하 약하고 RNase 과제를 구분 하지 않는 이러한 상호 작용 수 가끔.
모양 사용 하 여 작은 분자 유도 RNA 구조 변화를 연구의 주요 한계는 결과 바인딩 사이트를 공개 하지 않습니다. 생체 외에서 그리고에서 셀 형태로 SMN C2 바인딩된 사전-mRNA, 대 한 모양 반응성 변화 하지 않았다 putative 바인딩 사이트 (그림 1D, 2B 그림); 오히려, 루프 또는 버 지 지역에 2 ~ 3 원격 사이트에서 반응성 변경 했다. SMN-c 2는 RNA 이중 나선 지역 (그림 1D, 2D 그림), 일반적으로 낮은 모양 반응성이 아마도 바인딩합니다. 따라서, 더 모양 반응성 감소 구조를 안정화 아닐 것입니다 관찰. Putative 바인딩 사이트를 생성 하려면 다른 방법 ChemCLIP38 을 사용 한다, 교차 결합 시키는 화학 물질을 조사에 포함 된다.
RNA 이차 또는 더 높은 구조와 뉴클레오티드 역학 매핑할 일반적인 대체 방법은 NMR 분석39,40입니다. 그것은 RNA 역학 모양 활동39와 강하게 상관 관계가 양적 NMR 분석에서 파생 된 증명 되었습니다. 작은 분자 바인딩 컨텍스트에서 화학 변화 물결 상호 작용 뉴클레오티드21을 밝힐 수 있다.
RNA를 대상으로 작은 분자 약물 개발11의 새로운 양상으로, 우리는 모양 작은 분자의 대상 RNA의 구조적 영향을 평가 하는 표준 방법론으로 확립 될 것 이다 구상. 미래에, RNA를 대상으로 작은 분자 약물에 대 한 전체 transcriptome 심문 방법은 원한다.
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Disclosures
저자는 충돌의 관심을 선언합니다.
Acknowledgments
이 작품 NIH R01 보조금 (NS094721, K.A.J.)에 의해 가능 하 게 되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DNA oligonucleotide | IDT | gBlock for >200 bp DNA synthesis | |
| Phusion Green Hot Start II High-Fidelity PCR Master Mix | Thermo Fisher | F566S | |
| NucleoSpin gel and PCR clean-up kit | Takara | 740609.50 | |
| MegaScript T7 transcription kit | Thermo Fisher | AM1333 | Contains 10x reaction buffer, T7 enzyme, NTP and Turbo DNase |
| DEPC-treated water | Thermo Fisher | 750023 | |
| 2x TBE-urea sample buffer | Thermo Fisher | LC6876 | |
| 40% acrylamide/ bisacrylamide solution (29:1) | Bio-Rad | 1610146 | |
| 10x TBE buffer | Thermo Fisher | 15581044 | |
| Nalgene Rapid-Flow™ Filter Unit | Thermo Fisher | 166-0045 | |
| Kimwipe | Kimberly-Clark | 34133 | |
| TEMED | Thermo Fisher | 17919 | |
| SYBR-Safe dye | Thermo Fisher | S33102 | |
| 6% TBE-urea mini-gel | Thermo Fisher | EC6865BOX | |
| ChemiDoc | Bio-Rad | ||
| T4 PNK | NEB | M0201S | |
| γ-32P-ATP | Perkin Elmer | NEG035C005MC | |
| Hyperscreen™ Intensifying Screen | GE Healthcare | RPN1669 | calcium tungstate phosphor screen |
| phosphor storage screen | Molecular Dynamics | BAS-IP MS 3543 E | |
| Amersham Typhoon | GE Healthcare | ||
| NAI (2M) | EMD Millipore | 03-310 | |
| GlycoBlue | Thermo Fisher | AM9515 | |
| SuperScript IV Reverse Transcriptase | Thermo Fisher | 18090010 | Contains 5x RT buffer, SuperScript IV |
| dNTP mix (10 mM) | Thermo Fisher | R0192 | |
| ddNTP set (5 mM) | Sigma | GE27-2045-01 | |
| large filter paper | Whatman | 1001-917 | |
| Gel dryer | Hoefer | GD 2000 | |
| QIAamp DNA Blood Mini Kit | Qiagen | 51104 | Also contains RNase A and protease K |
| SMN2 minigene34 | Addgene | 72287 | |
| Heat inactivated FBS | Thermo Fisher | 10438026 | |
| Pen-Strep | Thermo Fisher | 15140122 | |
| Opti-MEM I | Thermo Fisher | 31985062 | |
| FuGene HD | Promega | E2311 | |
| TrpLE | Thermo Fisher | 12605010 | |
| DPBS without Ca/Mg | Thermo Fisher | 14190250 | |
| TRIzol | Thermo Fisher | 15596018 | |
| RNeasy mini column | Qiagen | 74104 | Also contains RW1, RPE buffer |
| RNase-Free DNase Set | Qiagen | 79254 | Contains DNase I and RDD buffer |
| Deionized formamide | Thermo Fisher | AM9342 | |
| MnCl2•4H2O | Sigma-Aldrich | M3634 | |
| random nonamer | Sigma-Aldrich | R7647 | |
| SuperScript First-Strand Synthesis System | Thermo Fisher | 11904-018 | Contains 10x RT buffer, SuperScript II reverse transcriptase |
| AccuPrime pfx DNA polymerse | Thermo Fisher | 12344024 | |
| NextSeq500 | Illumina | ||
| NucAway column | Thermo Fisher | AM10070 | for desalting purpose |
References
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