Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

Met behulp van In Vitro en In cel vorm te onderzoeken klein molecuul veroorzaakte structurele veranderingen van de Pre-mRNA

Published: January 30, 2019 doi: 10.3791/59021
Automatic Translation
1, 2, 1
1Calibr, The Scripps Research Institute, 2Department of Integrative Structural and Computational Biology, The Scripps Research Institute

Summary

Er zijn gedetailleerde protocollen voor beide in vitro en in cel selectieve 2'-hydroxyl acylering geanalyseerd door primer extensie (SHAPE) experimenten om de secundaire structuur van pre-mRNA opeenvolgingen van belang in de aanwezigheid van een kleine molecule van RNA-targeting in dit artikel wordt gepresenteerd.

Abstract

In het proces van de ontwikkeling van de drug van kleine moleculen RNA-targeting, is ophelderen van de structurele veranderingen op hun interacties met doel RNA-sequenties gewenst. Wij leveren hierin een gedetailleerde in vitro en in cel selectieve 2'-hydroxyl acylering geanalyseerd door primer extensie (SHAPE) protocol om te bestuderen van de structurele veranderingen van RNA in het bijzijn van een experimentele drug voor spinale musculaire atrofie (SMA), voortbestaan van motor neuron (SMN)-C2, inzonderheid exon 7 van de pre-mRNA van het gen SMN2. In in vitro vorm, is een RNA-volgorde van 140 nucleotiden met SMN2 exon 7 getranscribeerd door T7 RNA polymerase, gevouwen in aanwezigheid van SMN-C2 en vervolgens bewerkt door een milde 2'-OH acylering reagens, 2-methylnicotinic acid imidazolide (NAI). Deze 2'-OH-INR adduct is verder peilden door een 32P-geëtiketteerden primer extensie en opgelost door polyacrylamide gelelektroforese (pagina). Omgekeerd, 2'-OH acylering in in cel vorm plaatsvindt in situ met SMN-C2 gebonden cellulaire RNA in levende cellen. De volgorde van de pre-mRNA van exon 7 in het SMN2-gen, samen met SHAPE-geïnduceerde mutaties in de primer-extensie, werd vervolgens versterkt door PCR en onder voorbehoud van de volgende generatie sequencing. Vergelijken van de twee methoden, in vitro vorm is van een meer voordelige methode en vereist geen rekenkracht te visualiseren van de resultaten. De in vitro model van de SHAPE afkomstige RNA wijkt echter soms af van de secundaire structuur in een cellulaire context, waarschijnlijk als gevolg van het verlies van alle interacties met RNA-bindende proteïnen. In cel vorm hoeft niet een radioactief materiaal werkplek en levert een nauwkeuriger RNA secundaire structuur in de cellulaire context. Bovendien, in cel vorm meestal geldt voor een groter bereik van RNA-sequenties (~ 1000 nucleotiden) door gebruik te maken van volgende-generatie sequencing, in vergelijking met in vitro vorm (~ 200 nucleotiden) die gewoonlijk is gebaseerd op pagina-analyse. In het geval van exon 7 in SMN2 pre-mRNA, de vorm van in vitro en in cel afgeleid zijn RNA modellen op elkaar lijken.

Introduction

Selectieve 2'-hydroxyl acylering geanalyseerd door primer extensie (SHAPE) is een methode voor het meten van de kinetiek van elk nucleotide in een opeenvolging van RNA van belang en het ophelderen van de secundaire structuur op single-nucleotide oplossing1. SHAPE methodologieën, zowel in in vitro voorwaarden2,3,4 (gezuiverde RNA in een gedefinieerde buffersysteem) en in levende cellen van zoogdieren5,6, hebben ontwikkeld om te onderzoeken van de secundaire structuur van halflang RNA-sequenties (meestal < 1000 nucleotiden in cel vorm en < 200 nucleotiden voor in vitro vorm). Het is met name handig om structurele veranderingen in de receptor RNA bij binding met RNA-interactie klein molecuul metabolieten2,4,7,8 en te bestuderen of mechanistische acties van RNA-targeting moleculen tijdens9,10van de ontwikkeling van de drug.

RNA-targeting drugontdekking heeft onlangs aandacht in academische laboratoria en de farmaceutische industrie11,12 getrokken via verschillende benaderingen en strategieën13,14,15 ,16. Recente voorbeelden van kleine moleculen RNA-targeting voor klinisch gebruik twee structureel verschillende experimentele drugs, LMI-07017 en RG-791618,19, voor spinale musculaire atrofie (SMA), waaruit veelbelovend blijkt resultaten in fase II klinische proeven20. Beide moleculen werden aangetoond voor doel voortbestaan van motor neuron (SMN) 2 pre-mRNA en reguleren de splicing proces van de SMN2 gen6,17,21. Wij eerder blijk gegeven van de toepassing van in vitro en in cel vorm in een onderzoek naar de structurele veranderingen van de target RNA in het bijzijn van een analoge van RG-7916 SMN-C26genoemd.

In principe meet vorm de 2'-OH acylering snelheid van elk nucleotide van een opeenvolging van RNA in aanwezigheid van overtollige hoeveelheden een zelf blussen acylering reagens op onpartijdige wijze. Het reagens acylering is niet stabiel in water, met een korte halfwaardetijd van (bv T1/2 = 17 s voor 1-methyl-7-nitroisatoic zwavelzuuranhydride; of 1 M 7, ~ 20 min. voor het 2-methylnicotinic zuur imidazolide, of INR)22 en ongevoeligheid voor de identiteit van de honken kwamen23. Dit resulteert in een gunstiger acylering van de 2'-OH-groepen van flexibele grondslagen, die kunnen worden omgezet in een nauwkeurige beoordeling van de dynamiek van elk nucleotide. Specifiek, is een nucleotide in een base-paar meestal minder reactief dan een ongepaard die een 2'-OH wijzigen reagens, zoals NAI en 1 M 7.

Als we kijken naar de bron van de RNA-sjabloon en waar 2'-OH acylering plaatsvindt, kan vorm over het algemeen worden onderverdeeld in in vitro en in cel vorm. In vitro vorm gebruik gezuiverde T7 Getranscribeerd RNA en mist een cellulaire context in experimentele designs. In cel vorm plaatsvinden zowel het RNA sjabloon transcriptie en 2'-OH acylering in levende cellen; de resultaten kunnen daarom het structurele model van RNA in een cellulaire context recapituleren. In cel vorm heeft voorgelegd aan zoals in vivo vorm voor de vorm in levende cellen in de literatuur24vervoerd. Aangezien dit experiment wordt niet uitgevoerd in een dier, wij dit experiment genoemd als in cel vorm voor nauwkeurigheid.

De strategieën voor de fase van de uitbreiding primer van in vitro en in cel vorm zijn ook verschillend. In de vorm van het in vitro stopt omgekeerde transcriptie op de 2'-OH acylering positie in aanwezigheid van Mg2 +. Extensie primer 32P-labelled daarom verschijnt als een band in polyacrylamide gelelektroforese (pagina), en de intensiteit van de band is evenredig aan de acylering tarief1. In cel vorm, omgekeerde transcriptie genereert willekeurige mutaties op de 2'-OH adduct positie in aanwezigheid van Mn2 +. Het vogelgriepvirus tarief van elk nucleotide kan worden onderschept door in het rangschikken van de volgende generatie van diepte en de reactiviteit van de SHAPE op single-nucleotide resolutie kan vervolgens worden berekend.

Een potentieel probleem voor in cel vorm is de lage signal-to-noise verhouding (dat wil zeggen, een meerderheid van de fracties 2'-OH is ongewijzigd, terwijl de ongewijzigde sequenties allermeest naar de lezen in de volgende-generatie sequencing bezetten). Onlangs, een methode om te verrijken de 2'-OH gemodificeerde RNA, bedoelde zoals in vivo klikt u op SHAPE (icSHAPE), werd ontwikkeld door de Chang laboratorium25. Deze verrijking methode kan nuttig zijn bij het bestuderen van zwakke kleine molecules zoals RNA interacties, vooral in een transcriptome bestrijkende ondervraging.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. in Vitro vorm

Opmerking: Het protocol is uit de gepubliceerde protocol1gewijzigd.

  1. Voorbereiding van de RNA-sjabloon
    Opmerking: De sjabloon voor de Transcriptie T7 verstaat als een synthetische double-stranded DNA (dsDNA) en versterkt door beide opneming in een vector van E. coli die een uniek paar EcoRI/BamHI beperking endonuclease sites, zoals pET28a, of door PCR draagt. Het protocol voor PCR versterking is hieronder geïllustreerd.
    1. Meng het volgende materiaal: 50 μl van PCR meester mix (Zie Tabel van materialen), 2 μL voor elke primer in 10 μM (Zie tabel 1 voor sequenties), 200 ng voor dsDNA template in 2 μL en 3 μL van dimethylsulfoxide (DMSO) en 41 μL van H2O. Aliquot in twee PCR buizen (elke buis bevat 50 μl van reactiemengsel).
    2. De thermische cycler als volgt instellen: etappe 1) 95 ° C gedurende 30 s; fase 2) 95 ° C gedurende 20 s; etappe 3) 56 ° C gedurende 20 s; 4e etappe) 72 ° C gedurende 20 s; fase 5) lus terug naar fase 2 voor 30 cycli; fase 6) 72 ° C gedurende 3 minuten; en 7e etappe) oneindige houden bij 4 ° C tot en met de volgende stap.
    3. De PCR-amplicon zuiveren door extractie van de segmenten van de gel (Zie Tabel van materialen en gebruik van de fabrikant-protocol). Elueer het product DNA met 35 μL van Tris-EDTA (TE) buffer, met 10 mM Tris (pH 8.0) en 1 mM EDTA, aan opbrengst een 0,1-0,5 μg/μL sjabloon. Normaliseren de gezuiverde DNA-sjabloon in 0.10 μg/μL.
      Opmerking: De kwaliteit van de sjabloon kan eventueel worden geanalyseerd op een 1,8% agarose gelelektroforese met 0,10 μg van DNA. Een enkele band van gewenste sjabloon DNA wordt verwacht op de gel.
    4. De reactie Transcriptie T7 (totale volume 40 μL) instellen door de volgende materialen toe te voegen in een PCR-buis: 4 μL van 10 x reactie buffer, 4 μL van ATP, 4 μL van CTP, 4 μL van GTP, 4 μL van UTP, 4 μL van T7 enzym (Zie Tabel van materialen) , 4 μL van gezuiverde PCR amplicon uit stap 1.1.3 (0,4 μg) en 12 μL van diethyl-pyrocarbonate (DEPC)-behandeld water. Meng door pipetteren op en neer 4 x. Incubeer bij 37 ° C gedurende 4 – 16 h in een thermische cycler of in een 37 ° C incubator.
      Opmerking: Start stap 1.1.6 instellen, terwijl de reactie in stap 1.1.4 gewerkt wordt.
    5. Voeg 2 l DNase, Meng door pipetteren op en neer 4 x en Incubeer bij 37 ° C gedurende 15 min. Mix met gelijke volume van 2 x Tris-boraat-EDTA (FSME)-ureum monster buffer (Zie Tabel van materialen). Bij 70 ° C gedurende 3 minuten naar de inactivering van warmte.
    6. Meng in een RNase-vrije fles, 75 mL van 40% acrylamide/bisacrylamide-oplossing (29:1, Zie Tabel of Materials), 180.2 g ureum, en 50 mL 10 x TBE buffer (RNase-vrij, Zie Tabel van materialen). Zet de fles op een roteerschudapparaat (250 rpm) totdat alle kristallen van ureum worden opgelost (maximaal 2 uur kan duren). Regel het volume met DEPC behandelde water tot 500 mL. Filtreer de oplossing met een membraan van 0,2 micrometer (Zie Tabel van materialen).
      Opmerking: In dit proces te voorkomen met behulp van spiegelende en roer-bar RNase verontreiniging te voorkomen. De oplossing kan worden achtergelaten bij 4 ° C voor maximaal 1 jaar.
    7. Twee glasplaten van de Elektroforese van een juiste grootte (16,5 x 24 cm) met gedeïoniseerd water en 70% reinigen EtOH met behulp van een stukje papier afvegen. Uitlijnen van de platen met een paar 2.0 mm afstandhouders (de plaat met een gesiliconiseerd oppervlak kampt naar binnen) en verzegel de rand van de platen met tape. De hoek van de plaat om te voorkomen dat lekkende dubbel-band.
    8. In een bekerglas, meng 200 mL van acrylamide oplossing uit stap 1.1.6, 2,0 mL 10% ammoniumnitraat persulfate oplossing en 100 μl van tetramethylethylenediamine (TEMED) met een pipet RNase-vrije uiteinde door roeren snel 30 s. Tilt de platen op een stuk van benchtop dekking en giet de oplossing van de kloof van de platen. Tik op de plaat om te heffen bubbels en leg de plaat plat op de benchtop-cover. Onmiddellijk plaats van de kam en laat de gel gedurende ten minste 1 uur te polymeriseren.
      Opmerking: Als de gel is binnen de volgende dag moet worden gebruikt, bedekken de bovenkant van de gel met een stuk van natte papieren handdoek en wrap met een groter stuk plasticfolie. Plaats deze liggen vlak bij 4 ° C.
    9. Verwijder de tape en de Klemplaat in een stand van elektroforese. Verwijder de kam en voldoende 1 x TBE buffer toevoegen aan de boven- en onderin het reservoir. Stel vooraf de gel gedurende 30 minuten op 20 W.
      Opmerking: Optioneel, als de inhoud van de gewenste RNA ~ 90% of meer is, een mini gel kan gebruikt worden ter vervanging van een voorbereidende gel.
    10. Was de putjes laden door op en neer pipetteren tweemaal met de vloeistof in het reservoir. Voeg ruwe RNA van stap 1.1.5 in de putjes. De gel op 20 W uitvoeren tot de kleurstof cyanol FF xyleen (lichtblauw) ongeveer tweederde van de lengte van de gel (~ 60 min gaat).
      Opmerking: Zorgen voor het laden van niet meer dan eenderde van de hoogte van de put (gebruik meerdere wells indien nodig).
    11. Dompel de gel in 1 x TBE buffer met 1:10,000 verdunning van de kluis kleurstof (Zie Tabel van materialen) in een container groot genoeg voor de gel. Zet de container op een roteerschudapparaat gedurende 5 minuten bij 80 omwentelingen per minuut.
    12. Onder UV-licht, de gewenste RNA band identificeren en snel een dunne band van de gel met behulp van een schone scheermesje te snijden. 1 – 2 gel segmenten in een 1,7 mL-buis te plaatsen.
    13. Herstelt de RNA van het gel-segment door passieve elutie. Voldoende elutie/neerslag mix (~0.3 mL per segment) toevoegen aan elke buis: 0.3 M NaOAc (pH 5.2), 2,5 M LiCl, 1 mM EDTA, 0,1% natrium dodecyl sulfaat (SDS) in DEPC-behandeld water. Draai de buis van Eustachius de gel splice(s) bij 4 ° C voor 16 h bevat.
      Opmerking: ~ 75% in deze stap werd een typische terugbezorgd. Het vergroten van de opbrengst, verwijderen en het eluent verzamelen en toevoegen van dezelfde hoeveelheid elutie buffer, dan Herhaal deze stap.
    14. Combineer het eluent in een nieuwe 1,7 mL-buis. 2.5 x ijskoude EtOH toevoegen, omkeren van de buizen zesmaal te mengen van de vloeistof en de buizen te plaatsen bij-80 ° C gedurende ten minste 1 uur.
    15. Centrifugeer gedurende 10 min op 10.000 x g - en 4 ° C. Verwijder voorzichtig het supernatant door pipetteren. Wassen van de RNA-pellet door toevoeging van 80% EtOH (1 mL per buis), vortex voor 15 s, en Centrifugeer gedurende 10 min op 10.000 x g - en 4 ° C.
    16. Verwijder het supernatant en drogen van de RNA-pellet voor 5 min. Voeg 50 μL van RNase-gratis water en meng door pipetteren op en neer 10 keer. Normaliseren van de RNA-concentratie tot 0,10 μg/μL. Winkel de gezuiverde RNA bij-80 ° C.
      Opmerking: Niet overdreven drogen de RNA-pellet.
    17. Optioneel, voor het analyseren van de kwaliteit van het RNA, verdund 1 μL (100 ng) van RNA van stap 1.1.16 in 5 μL van water toe en meng met 5 μL van 2 x TBE-ureum monster buffer. Vervolgens warmte bij 70 ° C gedurende 3 min en belasting op een 6% TBE-ureum mini gel.
      1. Stel de gel bij 180 V voor 1 h. uitvoeren de kleuring zoals gedaan in stap 1.1.11. Visualiseer de gel met UV in een imaging systeem. Een enkele band wordt verwacht op de gewenste lengte.
  2. Voorbereiding van de 32P-geëtiketteerden primer
    1. De reactie instellen door het mengen van de volgende materialen: 10 μL van de γ -32P-ATP (~1.5 mCi, ~ 25 μM, Zie Tabel van materialen), 2 μL van omgekeerde transcriptie (RT) primer (100 μm, bestemd voor volgorde Zie tabel 1), 2 μL van 10 x T4 polynucleotide kinase (PNK) reactie buffer, 1 μL van T4 PNK (Zie Tabel of Materials), en 5 μL van RNase-gratis water. Incubeer bij 37 ° C gedurende 1 uur.
      Let op: Goede bescherming is stappen 1,2-1,5 in een erkende werkplaats voor radioactieve materialen nodig.
    2. Warmte-inactivering gedurende 20 minuten bij 65 ° C. De monsters op een demineralisatie kolom en centrifuge op 1.000 x g toevoegen voor 1 min. Mix de elutievloeistof met 25 μL van 2 x TBE-ureum monster buffer. .
      Opmerking: De gelabelde ruwe product bij-20 ° C worden opgeslagen als het niet onmiddellijk worden gezuiverd.
    3. Een 10% acrylamide gel op 20 W voor 1 h uitvoeren.
      Let op: De 32P-geëtiketteerden primer uit stap 1.2.1 op het gel laadt en voorkomen bloeden van de radioactiviteit in het bovenste reservoir. Laad niet meer dan eenderde van de hoogte van de put om een dunne band op de gel (gebruik meerdere wells indien nodig). De vloeistof in het reservoir onder kunnen hoogradioactief.
    4. Verwijder de glasplaten van de gel cassette en leg de gel op een stuk plasticfolie. Vouw het plastic wrap ter dekking van de bovenkant van de gel Maak een luchtdichte sandwich. Plaats de gel sandwich op een calcium-wolframaat fosfor-scherm en bloot met een imaging instrument. Het imago van de gel weer met regelmatige licht om te weten waar de randen van de gel.
    5. Gebruik een beeld processing software om overlay de twee afbeeldingen. Hiermee lijnt u de gel op de afgedrukte afbeelding. Gebruik een verse scheermesje te snijden van de gewenste bands uit de gel. Plaats 1 tot 2 gel segmenten in een tube van 1,7 mL.
      Opmerking: Zorg ervoor dat de afgedrukte afbeelding hetzelfde formaat als de werkelijke gel. Controleer de uitlijning door de overgebleven gel imaging weer na uitsnijden van het gel-segment.
    6. De 32P-geëtiketteerden primer herstellen door stap 1.1.13 te 1.1.16. 1.0 μL van oplossing rekening een tube 0.4 mL en Verdun de primer met 1 x TE buffer te verkrijgen van de radioactiviteit van 1,0 μl op ~ 100.000 cpm. Bewaar de gezuiverde 32P-geëtiketteerden primer op-80 ° C tot RNA 2'-OH wijziging reactie, maar niet langer dan 4 weken.
  3. Klein molecuul bindende en RNA 2'-OH wijziging
    1. Toevoegen om te bereiden vier monsters, 8 pmol RNA in 32 μL van 0,5 x TE buffer tot een 1,7 mL koker, warmte bij 80 ° C gedurende 2 min en module-cool in de ijskast voor minstens 1 min.
      Opmerking: De volgende vergelijking gebruiken voor het berekenen van de geschatte molecuulgewicht van RNA: MW = (# van bases) x 340 Da.
    2. Voeg 8 l 5 x vouwen mix met 500 mM HEPES (pH 8,0), 20 mM MgCl2en 500 mM NaCl. Aliquot 9 μl van het mengsel van RNA in elk van de vier PCR buizen en label ze #1-#4. Voeg 1 μl van 10% DMSO in de #1 buis, 1 μL van geconcentreerde klein molecuul oplossing (10% DMSO) in #2, 1 μL van verdunde klein molecuul oplossing (10% DMSO) in #3, en 1 μL van water in #4.
    3. Incubeer de PCR-buizen bij 37 ° C in een thermische cycler gedurende 30 minuten.
    4. Vlak voor de 2'-OH wijziging reactie, verdund 1 μL van NAI stockoplossing (2 M) met 3 μL van DEPC-behandeld water een 0.5 M werkende oplossing opleveren. Onverwijld, 1 μL van NAI werkoplossing in buizen #3, #1 en #2 en 1 μL van 25% DMSO in #4 toevoegen. Incubeer bij 37 ° C in een thermische cycler gedurende 15 minuten.
    5. Voeg 100 μl van elutie/neerslag mix (zie stap 1.1.13 voor recept), 2 μL van glycogeen (15 mg/mL) en Pipetteer al vloeistof in elke PCR buis in een tube van 1,7 mL. Voeg 0,34 mL ijskoud 200-proof EtOH (3 x volume) in elke buis. Meng door de vortexing voor 5 s en plaats de buizen in een vriezer-80 ° C gedurende ten minste 1 uur.
      Opmerking: Tijdens deze periode, start instellen de sequencing-gel te gebruiken in stap 1.5.1.
    6. Centrifugeer gedurende 15 min op 14.000 x g - en 4 ° C. Verwijder de bovendrijvende vloeistof zonder verstoring van de RNA-pellet. Wassen van de RNA-pellet door toevoeging van 80% EtOH (0,5 mL per buis), vortex voor 15 s, en Centrifugeer gedurende 15 min op 20.000 x g - en 4 ° C. Verwijder het supernatant opnieuw.
      Opmerking: Gebruik eventueel een geigerteller om ervoor te zorgen de radioactieve pellet behoud in de buis.
    7. Drogen van de RNA-pellet voor 5 min. Voeg 9 μL van RNase-gratis water en meng door pipetteren op en neer 10 keer.
      Opmerking: Niet overdreven drogen de RNA-pellet. Alle neerslag wordt verwacht aan het eind van deze stap worden ontbonden.
  4. Marker voorbereiding en primer extensie
    1. Breng de gemodificeerde RNA in 4 nieuwe PCR-buizen en label ze #1-#4 zoals voorheen. 2 pmol besturingselement RNA in 7 μL van DEPC-behandeld water toevoegen 4 extra PCR buizen en labelen hen #5 – #8. Voeg 2 μL van radiolabeled primer (stap 1.2.6) in alle acht buizen. Warmte om te gloeien bij 65 ° C gedurende 5 minuten, dan onmiddellijk afkoelen tot 4 ° C in de thermische cycler.
    2. Voeg 4 l 5 x RT buffer (Zie Tabel of Materials), 1 μL van dithiothreitol (DTT, 0,1 M), en 1 μL van dNTP mix (elke 10 mM) aan elk van de acht PCR-buizen.
    3. Voeg 2 l DEPC-behandelde H2O buizen #1 – #4. Voeg 4 μL van ddATP (5 mM), 4 μL van ddTTP (5 mM) en 4 μL van ddCTP (5 mM) in buizen #5 – #7, respectievelijk. 1 μL van ddGTP (5 mM) en 3 μL van DEPC-behandeld water toevoegen aan buis #8. Pipetteer viermaal te mengen.
    4. Verwarm op 52 ° C gedurende 1 min. in de thermische cycler. Voeg 1 μl van reverse-transcriptase (Zie Tabel of Materials), Meng door pipetteren op en neer viermaal. Incubeer de reactie bij 52 ° C gedurende 20 min.
    5. Voeg 1 μL van 5 M NaOH in elk van de buizen te hydrolyseren van RNA. Verwarm de buizen bij 95 ° C gedurende 5 min.
    6. 5 μL van 1 M HCl toevoegen en herhaalt u de ethanol neerslag (stappen 1.3.5 en 1.3.6), behalve de glycogeen en vloeibare overdracht weglaat.
      Opmerking: Weglaten van stap 1.4.6 resultaten in een vervagende regio in het midden van de gel bekend als het "zout front".
    7. Drogen van de DNA-pellet voor 5 min. Voeg 10 μL van H2O en 10 μL van 2 x TBE-ureum proef laden buffer en Pipetteer op en neer 10 keer naar Los opnieuw op. Warmte bij 70 ° C gedurende 5 min. plaats de buizen op ijs vóór het laden op de gel.
  5. PAGINA analyse
    1. Ter voorbereiding van een 8% polyacrylamidegel sequencing, stappen 1.1.6 tot 1.1.10 met de volgende wijzigingen: gebruik 100 mL van 40% acrylamide/bisacrylamide-oplossing (29:1) om te bereiden van een oplossing van 8% acrylamide, en sequencing gel glasplaten (bijvoorbeeld46 x 57 cm) met een 0,4 mm spacer.
    2. Laden 10 μL van het monster uit stap 1.4.7. Stel de gel op 65 W gedurende 2 uur of totdat de onderkant kleurstof 3/4 van de gel bereikt.
      Opmerking: Bewaar de rest van de monsters bij-80 ° C voor het herhalen indien nodig.
    3. Verwijder de bovenste gesiliconiseerd glasplaat door verwijderen van de spacer en een spatel voorzichtig te voegen. Plaats een stuk grote filtreerpapier ter dekking van de gel en druk zachtjes op dat de gel zich te houden aan het koffiefilter. Vanaf de onderkant, til het koffiefilter en verwijderen van de gel uit de glasplaat samen.
    4. Plaats de gel samen met het filtreerpapier op een stuk plasticfolie die groot genoeg is voor de hele gel (filtreerpapier naar boven). Het filtreerpapier/gel/plastic wrap broodje overbrengen in een drogere gel met het filtreerpapier kant naar beneden.
      Let op: Radioactief materiaal om besmetting te voorkomen, gebruik van 3 tot en met 4 meer stukken van grote filtreerpapier tussen de gel sandwich en drogere gel.
    5. Droog de gel bij 70 ° C gedurende 1 uur met een vacuüm. Breng de gel sandwich op een foto-gebleekt fosfor opslag scherm cassette. Bloot de radioactiviteit van de gel op het scherm voor 4-16 h.
    6. Plaats het fosfor opslag scherm op een imaging-apparaat en scannen met medium resolutie (~ 30 min).
      Opmerking: Als een glimlach-achtige artefact aanwezig op de afbeelding van de gel is, corrigeren software (b.v., SAFA) gebruiken voor het verwerken van het beeld tot een publiceerbare kwaliteit. Houd er rekening mee dat de standaard marker lane 1 nucleotide langer dan de 2'-OH wijziging rijstroken is.

2. in-cel vorm

  1. Primer ontwerp
    Opmerking: In tegenstelling tot de vorm van het in vitro hoeft in cel vorm niet te ontwerpen een expressie cassette. Echter een optimale primer set moet worden gebruikt en moeten worden geëvalueerd vóór vorm experimenteren.
    1. Het genereren van ten minste drie unieke primerparen door een BLAST gebaseerde primer design tool (bijvoorbeeldPrimer-BLAST). Studeren pre-mRNA in menselijke cellen, selecteert u het menselijk genoom (niet transcriptome) als een referentiedatabank in Primer paar specificiteit controle Parameters. Kies de grootte van de amplicon in de range van 200-1000-basenpaar (bp).
    2. Extract van de genomic DNA van ~ 106 cellen van belang met een spin kolom gebaseerde methode met de behandeling van RNase A en protease K (Zie Tabel van materialen en gebruik van de fabrikant-protocol). Normaliseren van het gezuiverde genomic DNA in 0.1 μg/μL TE buffer.
    3. Test PCR met het protocol uitgevoerd in stappen 1.1.1 en 1.1.2.
      Opmerking: De gewenste primer set moet een enkele band op een 1,8% agarose gel opleveren.
  2. Cel opstelling en wijziging van de 2'-OH
    Opmerking: Het vergroten van de overvloed van de pre-mRNA van belang, is een minigene met de juiste volgorde onder cytomegalovirus (CMV) promotor voor constitutieve expressie transfected in de cellen van de gastheer.
    1. Vooraf warm het kweekmedium dat 10% foetale runderserum (FBS) en 1 x antibiotica mengsel in de Dulbecco bewerkt Eagle Medium (DMEM) bij 37 ° C. Zaad 293T cellen op 50% confluentie 24 h vóór de transfectie kweekmedium. Veranderen van het medium in 2% FBS in DMEM zonder antibiotica ~ 1 h vóór de transfectie.
    2. Voeg 10 μg minigene plasmide in 100 μl van verminderde serum media (Zie Tabel van materialen) in 1 goed van een 96-wells-plaat. Pipetteer de oplossing op en neer viermaal te mengen.
    3. Voeg 40 l transfectiereagens (Zie Tabel van materialen) in 100 μl van verminderde serum media in een ander putje van de plaat. Pipetteer omhoog en omlaag viermaal te mengen. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten.
    4. Voeg de volledige plasmide-oplossing tot de transfectie reagens schorsing. Pipetteer omhoog en omlaag viermaal te mengen. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten.
    5. Toevoegen van het hele DNA / transfectie reagens mengsel dropwise op het oppervlak van het medium in de schotel. Incubeer bij 37 ° C gedurende 6 – 12 uur.
    6. Het medium gecombineerd en zachtjes eens wassen met 5 mL-fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS, pH 7.4, zonder CaCl2 en MgCl2, Zie Tabel van materialen). Trypsinize van de cellen met 3 mL trypsine oplossing. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten.
    7. Klop de schotel voorzichtig te distantiëren van de cellen vanaf de onderkant van de schotel. Neutraliseer trypsine met 6 mL gestolde voedingsbodem. Centrifugeer bij 300 x g gedurende 4 minuten en verwijder het medium.
    8. Resuspendeer de cellen6 ~ 10 voor elk monster in 199 μL van reactie medium (1% FBS in DMEM) en breng de celsuspensie in een 96-wells-plaat. Incubeer de cellen met 1 μL van samengestelde werkoplossing of 1 μL van DMSO in alle drie besturingselementen gedurende 30 minuten bij 37 ° C.
      Opmerking: Drie controlemonsters moeten worden opgenomen: DMSO controle met NAI, gedenatureerde RNA met NAI en NAI negatieve controle.
    9. 10 μL van 2 M NAI toevoegen aan elk monster, behalve het denatureren controle (DC) RNA en NAI negatieve controles. Pipetteer omhoog en omlaag viermaal te mengen. Incubeer bij 37 ° C voor 15 min. zachtjes schudden de platen aan resuspendeer de cellen om 5 min.
    10. Breng de cellen in de 1.7 mL tubes en centrifugeer bij 400 x g gedurende 2 min zonder vertraging. Verwijder de bovendrijvende vloeistof zonder verstoring van de cel-pellet.
    11. Voeg 0.4 mL guanidinium kaliumthiocyanaatoplossing (Zie Tabel van materialen). Vortex voor 15 s te homogeniseren. Incubeer de monsters bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten.
      Opmerking: De monsters kunnen worden opgeslagen bij-20 ° C tot u verdergaat met de volgende stap.
  3. RNA extractie
    1. 0,2 mL chloroform toevoegen aan elk van de monsters guanidinium kaliumthiocyanaat gehomogeniseerd. Vortex voor 15 s. Incubate bij kamertemperatuur gedurende 2 minuten.
    2. Centrifugeer gedurende 5 min van 12.000 x g - en 4 ° C. De bovenste kleurloze waterige laag bevat RNA. Pipetteer ~ 380 μL van waterige oplossing in een nieuwe 1,7 mL-buis.
      Let op: Niet storen de interfase om besmetting te voorkomen.
    3. Voeg 1,5 x hoeveelheid EtOH toe (~ 570 μL). Vortex voor 15 s te mengen.
    4. Breng 600 μL van RNA mengsel in een RNA isolatie spin-kolom (Zie Tabel van materialen). Centrifugeer bij 12.000 x g gedurende 15 s. negeren de elutievloeistof. Herhaal deze stap passeren alle vloeistof in dezelfde kolom spin.
    5. Was de kolom met 0.35 mL RW1 buffer (Zie Tabel van materialen) door spinnen voor 15 s. toevoegen 80 μL van RNase-vrije DNase ik in RDD buffer (Zie Tabel van materialen). Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 20 minuten.
      Opmerking: Het is cruciaal voor het verwijderen van alle DNA-besmetting.
    6. Vervolgens was de kolom met 0.35 mL RW1 buffer en 0,6 mL 2 x RPE buffer (Zie Tabel van materialen) door spinnen voor 15 s bij elke stap. Droog de kolom door het centrifugeren van de spin-kolom met een lege collectie buis bij 12.000 x g gedurende 1 minuut.
    7. Voeg 32 l RNase-gratis water naar het midden van de kolom. Incubeer gedurende 1 min. Centrifuge bij 12.000 x g gedurende 30 s ~ 30 μL van gezuiverde RNA oplossing te verkrijgen. Zet de monsters bij-20 ° C tijdens het verwerken van het gedenatureerde monster.
  4. Gedenatureerde RNA controle voorbereiding
    1. Plaats 30 µL RNA monster voor DC in een 1,7 mL plastic buis op ijs. Voeg 50 μl van formamide en 15 μL van DC buffer met 300 mM HEPES (pH 8.0) en 25 mM EDTA in de buis.
    2. Warmte te denatureren RNA bij 95 ° C gedurende 1 min. snel toevoegen 5 μL van NAI stockoplossing (2 M), dan flick tweemaal te mengen en zetten de buis terug op het blok van de verwarming. Incubeer bij 95 ° C gedurende een extra 1 min en vervolgens onmiddellijk de buis op ijs te zetten.
    3. Voeg 0.4 mL kaliumthiocyanaat guanidinium. Herhaal stappen 2.3.1–2.3.4.
    4. Was de kolom met 2 x RPE buffer 0,6 mL (Zie Tabel van materialen) door spinnen voor 15 s bij elke stap. Droog de kolom door het centrifugeren van de spin-kolom met een lege collectie buis bij 12.000 x g gedurende 1 minuut.
    5. Voeg 32 l RNase-gratis water naar het midden van de kolom. Incubeer gedurende 1 min. Centrifuge bij 12.000 x g gedurende 30 s ~ 30 μL van herstelde DC RNA oplossing te verkrijgen.
  5. Primer extensie
    1. Normaliseren de RNA-oplossing van 2.3.7 en 2.4.5 in 0.5 μg/μL met RNase-gratis water. Vers bereiden 30 mM MnCl2 oplossing van MnCl2∙4H2O poeder.
    2. Pipetteer 9 μL van RNA oplossing voor elk monster in een PCR-strip. Voeg 1 μl van 10 mM dNTP en 1 μL van 2 μM gen-specifieke primer (SAP) in elke buis. Pipetteer omhoog en omlaag viermaal te mengen. Incubeer bij 65 ° C gedurende 5 minuten in een thermische cycler en zetten ijs voor > 1 min.
      Opmerking: U kunt ook kan 1 μL van een willekeurige nonamer worden gebruikt ter vervanging van SAP.
    3. In elke buis van PCR, voeg een mengsel van 2 μL van 10 x RT buffer (Zie Tabel of Materials), 4 μL van 30 mM MnCl2en 2 μL van 100 mM DTT. Pipetteer op en neer 4 x te mengen. Incubeer bij 42 ° C gedurende 2 minuten.
    4. Voeg 1 μl van reverse-transcriptase (Zie Tabel van materialen). Pipetteer op en neer 4 x te mengen. Incubeer bij 42 ° C in een thermische cycler gedurende 3 uur.
  6. Voorbereiding van de bibliotheek en de volgende generatie sequencing
    1. Instellen van een PCR reactie door toevoeging van 1 μL van de polymerase van DNA, 5 μl van 10 x de polymerase van DNA buffer (Zie Tabel van materialen), 2 μL van DMSO, 1.5 μL voor elk van de inleidingen (10 μM), 34 μL van H2O en 5 μL van cDNA uit stap 2.5.4.
    2. De thermische cycler als volgt instellen: etappe 1) 95 ° C gedurende 2 min; fase 2) 95 ° C gedurende 30 s; etappe 3) 60 ° C gedurende 30 s; 4e etappe) 68 ° C gedurende 30 s; fase 5) lus terug naar fase 2 voor 30 cycli; fase 6) 68 ° C gedurende 3 minuten; en 7e etappe) oneindige houden bij 4 ° C tot en met de volgende stap.
    3. De amplicon zuiveren met behulp van 1,8% agarose gel.
      Opmerking: De PCR-band moet worden weergegeven als een enkele band op de gel.
    4. Construeer de bibliotheek met behulp van standaard fragmentatie en Afbinding methoden vastgesteld in de literatuur6,26.
    5. Volgorde op een volgende-generatie sequencing-apparatuur met behulp van 1 x 75 single-end leest voor het genereren van ongeveer 10 miljoen leest per monster.
    6. Analyseren van de resultaten met behulp van ShapeMapper en SuperFold software pakketten ontwikkeld door de weken groep26.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Wij eerder bewezen dat een RNA splicing modulator, SMN-C2, samenwerkt met AGGAAG motief op exon 7 van het SMN2 gen van pre-mRNA en SHAPE gebruikt ter beoordeling van de structurele veranderingen van RNA in het bijzijn van SMN-C26. De bindende site van SMN-C2 is verschillend van de FDA-goedgekeurde antisense oligonucleotide (ASO) voor SMA, nusinersen, die bindt en blokkeert de intronic splicing silencer (ISS) op intron 727,28 (figuur 1A). Meest bekende splicing regulatoren van SMN2 exon 7 zijn binnen het bereik van ~ 100 nucleotide van exon 7 in de pre-mRNA-29; daarom een 140 en 276 nucleotide-lang RNA opeenvolgingen werden gebruikt voor in vitro en in cel vorm, representatief, die betrekking heeft op exon 7 en de aangrenzende intron regio (figuur 1A).

In deze vertegenwoordiger in vitro analyse van de vorm, is de opeenvolging van RNA van belang ingebed in een geoptimaliseerde cassette, ontwikkeld door het laboratorium van weken, die compatibel is voor de meeste RNA-sequenties1. Af en toe, de opeenvolging van belang samenwerkt of interfereert met deze cassette. In deze gevallen een gemodificeerde cassette kan worden gebruikt met de volgende drie kenmerken: i) een 3'-eind specifieke primer bindende site met een efficiënter hybridisatie affiniteit voor de primer dan enig onderdeel van de sequentie van het RNA, ii) een zeer gestructureerde haarspeld lus gelegen direct voorafgaand aan de primer bindende site laten zien dat zal specifieke en reproduceerbare SHAPE signaal (dit zal fungeren als zowel een interne controle voor het experiment en de methode voor het uitlijnen van het signaal van experiment aan experiment), en iii) een 5'-eind haarspeld structuur element, dat het einde van het signaal van de vorm aangeeft. De SHAPE cassette is verder geflankeerd door zelf het splijten van sequenties van de Ribozym op beide 5'- en de 3'-uiteinden om het genereren van een homogene RNA-30. We vonden dat hamerhoofd en hepatitis delta virus ribozymes compatibel met de SHAPE cassette zijn en meestal hoog rendement van de gewenste RNA geven. De resulterende sjabloon RNA heeft een 3'-eind van 2', 3'-cyclische fosfaat en een 5'-eind van hydroxylgroep, die niet met primer extensie interfereren. Een lange reeks van 140-nucleoside die betrekking hebben op exon 7 van SMN2 en aangrenzende regio in de pre-mRNA werd gesynthetiseerd in vorm en Ribozym cassette zoals geïllustreerd in schema 1.

In het algemeen, moet de opeenvolging van belang in de expressie cassette afgebonden lang genoeg ter dekking van de potentiële middelbaar of hoger volgorde van structuur. In het geval van SMN2 exon 7 bevat een 140-nucleotide regio twee stam-lus-structuren-6,31. De structuur van de regio van belang case-by-case varieert en moet worden beoordeeld door trial-and-error.

Sequencing polyacrylamidegel met 32P-geëtiketteerden primer extensie producten werd gekozen om te visualiseren van het profiel in vitro vorm in dit representatieve experiment. Een alternatieve visualisatie-methode is het gebruik van capillaire elektroforese met een fluorescently geëtiketteerde DNA primer32. In polyacrylamide sequencing gels, ~ 20 nucleosiden in de buurt van het 5'-eind en ~ 10 nucleotiden in de buurt van de 3'-eind van de opeenvolging van RNA van belang zal niet kwantitatief worden gevisualiseerd, moet af en toe stopt bij de stappen van de initiatie van omgekeerde transcriptie en intense bands op pagina gelen voor full-length afschriften1.

Is een alternatieve manier voor voorbereidende gel herstel van een RNA-sjabloon (stappen 1.1.6 tot 1.1.12) overbelasting van een mini gel als de opbrengst van de gewenste RNA sjabloon is > 90%. Het wordt geadviseerd uit te verwijderen het overtollige NTP de RNA-product door ontzouten van de kolom en het RNA in 50 µL van TE buffer eluerende. Meten van de concentratie van het RNA en laden van 5,0 µg in elk putje. Tijdens de zuivering stap van de T7 Getranscribeerd RNA sjabloon, stoppen de pagina wanneer de kleurstof cyanol FF xyleen (lichtblauw) doorgegeven tweederde van de 6% gedenatureerd TBE-ureum gel. Het zelf-decollete RNA fragment (< 80 nucleosiden) doorgegeven via de gel, die links van de gewenste RNA als de enige grote band in de gel op de vlekken (figuur 1B).

SMN-C2 (Figuur 1 c) werd gesynthetiseerd volgens de gepubliceerde procedure33 en ontbonden in 10 mM DMSO stamoplossing. De stockoplossing wordt verder verdund tot 500 en 50 µM in 10% DMSO-oplossing om de eindconcentraties van 50 en 5 µM, respectievelijk. Module-gekoelde RNA refolded naar het werkgebied van het evenwicht in het bijzijn van DMSO of SMN-C2 binnen 30 minuten bij 37 ° C. Een langere incubatietijd veranderde niet de uitkomst van het experiment. Twee experimentele monsters (50 en 5 µM SMN-C2), twee besturingselementen (DMSO en NAI-besturingselementen) en vier markeringen (A, T, G, C) werden behandeld voor uitbreiding van de primer. Na de gel naar fosfor opslag scherm bloot, een succesvolle vorm experiment zal tonen: i) een interne en meeste-intense band aan de bovenkant van de gel en ii) bands in de gel op single-nucleotide resolutie zonder uitstrijkje (Figuur 1 d). Een veelvoorkomend probleem in pagina-analyse is dat een uitstrijkje regio bekend als het "zout front" in het midden van de gel (1E cijfer verschijnen kan). Dit is waarschijnlijk te wijten aan de hoge concentratie van zout, DMSO, of andere ongewenste stof in het laden monster die kan worden verwijderd door ethanol neerslag.

In in vitro vorm, een zuivere RNA-sjabloon is de sleutel voor een succesvolle experiment. Een onzuiver RNA-sjabloon is meestal de oorzaak van de ongewenste resultaten. PAGINA analyse toont duidelijk aan een patroon van 2 sets van markeringen, geeft aan dat de RNA-sjabloon niet homogeen is en dient te worden repurified door preparative TBE-ureum-gel.

In cel vorm is een sleutel tot een succesvolle experiment het ontwerpen van een geoptimaliseerde primer set voor versterking. Met 0,10 µg genomic DNA-vrije cDNA sjabloon, moet een enkele band binnen 25 cycli van PCR in agarose gel analyse worden opgemerkt. De repetitieve intron sequenties moeten daarom worden vermeden. Om te bestuderen van de structurele gevolgen van SMN-C2 SMN2 pre-mRNA, drie sets van de primer (tabel 2) werd getest, en allen waren bevredigend (figuur 2A).

Een lage exemplaaraantal van een reeks doel RNA is over het algemeen een probleem voor in cel vorm. Om te verrijken het RNA van belang, was een minigene waarin de opeenvolging van RNA van belang onder een sterke CMV promotor in 293T cellen transfected. Omdat de splicing patroon van de SMN2 minigene die van endogene SMN2 met of zonder SMN-C219,34 recapituleert, wij voorzien dat de structuur van het SMN-C2 interagerende RNA in de overexpressie SMN2 pre-mRNA waarschijnlijk hetzelfde als was het endogene gene product. Terwijl de EG50 voor SMN-C3 in de splicing bepaling ~0.1 µM6,19 was, werd een concentratie aan het hogere einde (20 µM) gebruikt om de bindende status van het kleine molecuul en doel RNA volgorde.

Bij isolatie van RNA, kunnen gen-specifieke zowel willekeurige inleidingen worden gebruikt voor uitbreiding. In het geval van exon 7 van SMN2 vonden we dat SMN2E7-338-RV (tabel 2) een hogere kopie van gewenste cDNA dan een willekeurige nonamer levert, blijkt uit een meer intense band in de PCR versterking met SMN2E7-276 primer set (tabel 2) na 25 cycli. In de stap 2'-OH wijziging werd een 91 µM NAI eindconcentratie gebruikt voor een incubatietijd van 15 min. Als een andere celtype of het medium wordt gebruikt, is de incubatietijd moet opnieuw geoptimaliseerd. Als de incubatietijd lang is, mislukt agarose gel analyse van de amplicon soms om te laten zien van een band.

Een python gebaseerde programma, ShapeMapper, ontwikkeld door de weken laboratorium35 werd gebruikt voor het analyseren van de gegevens die zijn gegenereerd door de volgende-generatie sequencing [voor onbewerkte gegevens van SMN-C2 behandeld in cel vorm van SMN2 exon 7 pre-mRNA, verwijzen naar de volgorde lezen archief (SRA) database]. Gedurende de amplicon, de SHAPE reactiviteit aanzienlijk veranderde niet (> 1), die aangegeven dat de secundaire structuur in het bijzijn van SMN-C2 (figuur 2B blijft). Dit wordt ook bevestigd door de boog percelen gegenereerd door SuperFold35. De verbindingslijnen geven de mogelijke basis koppeling gebaseerd op SHAPE activiteit van elk nucleotide. SMN-C2 - en DMSO-testgroep RNA model is in wezen de dezelfde (figuur 2C). Differentiële in cel vorm reactiviteit werd berekend voor elk nucleotide (figuur 2B), en de meeste reactiviteit merkbaar resultaat op TSL-1 (5'-eind exon 7) maar niet TSL-2 (3'-eind exon 7). Dit resultaat stemt in met de in vitro vorm; Hoewel, verschoof de basis koppeling van in vitro analyseert vorm RNA modelleren in de vorm van in-cell (figuur 2D).

Een gemeenschappelijk probleem van in cel vorm is de lage mutaties gedurende de amplicon. Dit is meestal te wijten aan de genomic DNA besmetting. DNA bevat geen 2'-OH groep; Daarom wordt geen acylering product gevormd met NAI. PCR versterking weerspiegelt dus alleen de lage mutaties van de polymerase van DNA. Isolatie van RNA door guanidinium kaliumthiocyanaat gevolgd door aan-kolom DNase spijsvertering is voldoende om alle DNA in de meeste gevallen verwijderen. Als DNA besmetting blijft bestaan, herhaalt u stap 2.3 voor RNA isolatie.

Scheme 1
Regeling 1: DNA-sequentie voor het sjabloon van RNA transcriptie. De volgorde van de 12 bp in de Hammerhead virus Ribozym volgorde in het rood is het omgekeerde complement van de eerste 12 bp van de 5'-cassette. De RNA-opeenvolging van belang hier vermelde is een 140 bp pre-mRNA reeks bevat exon 7 van menselijk SMN2 gen. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 1
Figuur 1: Proefopzet en resultaat van in vitro vorm voor SMN2 exon 7 pre-mRNA in aanwezigheid van SMN-C2. (A) overzicht van de opeenvolging van belang voor in vitro en in cel vorm studies van de SMN2-gen. SMN-C2 bindt aan de AGGAAG motif op exon 7, een aparte locatie van de site van de bindende nusinersen. (B) reiniging van het product van de Transcriptie T7. Elk van de drie rijstroken bevat 5,0 µg voor ruwe RNA. De TBE-ureum gel was gekleurd met SYBR-Safe (1:10, 000) gedurende 5 minuten in 1 x TBE buffer. Rode onderbroken vak geeft aan de rand van excisie voor RNA herstel. (C) de structuur van het SMN-C2. (D) In vitro vorm experimenteren met NAI en een 140 nucleotide-lang RNA sjabloon met exon 7. 1 = DMSO; 2 = SMN-C2 (50 ΜM); 3 = SMN-C2 (5 ΜM); 4 = ontbreken van NAI; 5-8 = ladders gegenereerd door toevoeging van ddATP, ddTTP, ddCTP en ddGTP tijdens primer uitbreiding. PAGINA werd uitgevoerd die op een TBE-ureum sequencing gel op 60 W voor 3 h. rode sterretjes geven verhoogde band met 50 µM SMN-C26intensiteit. (E) een voorbeeld van een "zout front" regio in het onderbroken rode vak van een afzonderlijk experiment. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 2
Figuur 2: In cel vorm afgeleid RNA modellering voor SMN2 exon 7 pre-mRNA. (A) PCR versterking met alle drie primer sets (tabel 2) leverde een enkele band in agarose gel analyse. 1 = SMN2E7-338, 2 = SMNE7-276, 3 = SMN2E7-251, 4 = DNA-ladder. (B) differentiële in cel vorm reactiviteit in SMN2 293T minigene-transfected cellen voor 10 µM SMN-C2 en DMSO in TSL1. SHAPE reactiviteit op single-nucleotide resolutie. De standaarddeviatie werd berekend door ShapeMapper software35. Groene sterretjes geven belangrijke vormverandering reactiviteit geïnduceerd door 10 µM SMN-C2. De nummering van de nucleotiden in de 276 bp amplicon weergegeven op x-as. Foutbalken werden geraamd door Shape-Mapper software26. (C) Arc perceel gegenereerd door SuperFold35 voor de meest plausibele RNA secundaire structuur modelleren door in cel shapegegevens. (D) In vitro en in-cel op SHAPE-gerichte modellering van exon 7 en aangrenzende regio's. Voor in-vitrodiagnostiek RNA model, worden SHAPE stabiliseren cassette (oranje) en nucleotiden 1-19 (blauw) weergegeven in de schets. In cel RNA model wordt nucleotide nummering uitgelijnd met in vitro vorm sjabloon. Nucleotiden 1-18 en 120-140 werden weggelaten. Belangrijke reactiviteit veranderingen zijn aangegeven in rood en groen sterretjes voor in vitro en in cel vorm, respectievelijk. De secondaire structuren die werden TSL1 en TSL231 eerder genoemd zijn ingesloten in blauwe dozen. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

De naam van de primer 5' - 3' reeks
Ribozym-FW TAAAACGACGGCCAGTGAAT
Ribozym-RV GCAGGTCGACTCTAGAGGAT
RT primer GAACCGGACCGAAGCCCG

Tabel 1: De primer sequenties gebruikt in het representatieve experiment.

Naam Volgorde (5 '-> 3')
SMN2E7-338-FW AAAGACTATCAACTTAATTTCTGA
SMN2E7-338-RV TGTTTTACATTAACCTTTCAACT
SMN2E7-276-FW AATGTCTTGTGAAACAAAATGCT
SMN2E7-276-RV AACCTTTCAACTTTCTAACATCT
SMN2E7-251-FW TGAAACAAAATGCTTTTTAACATCC
SMN2E7-251-RV TCAACTTTCTAACATCTGAACTTTT

Tabel 2: de primer ingesteld voor versterking van de pre-mRNA opeenvolging van belang. Alle drie primer sets opbrengst een één amplicon in een PCR reactie met genomic DNA-vrije cDNA sjabloon.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

In in vitro vorm is het cruciaal voor hoge kwaliteit homogene RNA sjabloon gebruiken. Transcriptie T7, levert echter vaak heterogene sequenties36. Vooral zijn sequenties met ±1 nucleotide in de 3'-terminus met niet te verwaarlozen opbrengsten36 meestal moeilijk te worden verwijderd door polyacrylamidegel zuivering. Heterogene RNA sjabloon kan resulteren in meer dan één set van het signaal in de sequencing gel profilering van de primer extensie product, waardoor het soms moeilijk te interpreteren van het resultaat. De Ribozym op beide 5'- en 3'-einden van het RNA sjabloon expressie cassette zal beide uiteinden homogene.

Voor zowel in vitro en in cel vorm is de incubatietijd van 2'-OH wijziging reagentia een andere kritische factor. Door het weken groep werd gesuggereerd dat minstens vijf keer de halfwaardetijd van het water-blussen 2'-OH acylering reagens gebruikt1 worden moet. In onze handen, aan het broeden met NAI (T-1/2 = ~ 20 min) voor > 30 min in zowel in vitro en in cel vorm resulteert in een overreacted resultaat. Zoals blijkt uit Figuur 1 d, een goede in vitro vorm profiling moet > 50% totale signaal op de top van de gel als full-length transcript, ervoor te zorgen dat de meeste van de gewijzigde RNA is slechts GEACYLEERDE eens. Overreactie zal maken van de dubbel-GEACYLEERDE product niet te verwaarlozen en de profilering bevooroordeeld op de producten van de uitbreiding verrijkt korte lengte. In in cel vorm, moet de amplicon voor de bouw van de bibliotheek worden weergegeven als een enkele band in agarose gel analyse (stap 2.6.3). Uitstrijkje van de band geeft een overdreven reactie, en de incubate tijd moet worden teruggebracht. In de representatieve experimenten was een tijd van 15 minuten incubatie bij 37 ° C optimaal voor in vitro en in cel vorm. Dit dient als uitgangspunt voor NAI wijziging in soortgelijke toepassingen.

Er zijn andere 2'-OH wijziging reagentia22 op grote schaal gebruikt voor SHAPE, bijvoorbeeld 1 M 7. Vergeleken bij NAI, heeft 1M 7 een betere reactiviteit aan kortere halfwaardetijd en 2'-OH groep in water22. 1M 7 gevormd in onze handen, enorme hoeveelheid geel neerslag in cel voedingsbodems in een experiment in cel vorm, wat ingewikkelder de RNA-isolatie. Voor een vergelijking reden, zowel in vitro en in cel vorm gebruikt NAI als de 2'-OH wijziging reagens voor een studie van SMN-C2 en SMN2 pre-mRNA interacties. Als alleen in vitro vorm vereist is, is 1 M 7 een alternatieve optie, zoals blijkt uit verschillende onderzoeken in riboswitch structurele bepaling7,8.

In cel vorm over de SHAPE van de in vitro heeft in het algemeen de voorkeur, vooral als het molecuul zich vermoedelijk in de kern van een eukaryote cel. RNA-bindende proteïnen in de kern zijn overvloedig, en het is bijna onmogelijk om te recapituleren de cellulaire context in vitro omstandigheden.

In de afgelopen tien jaar wordt de SHAPE de standaardmethode voor het bestuderen van de secundaire structuur van RNA. In vergelijking met traditionele RNA footprinting met RNase37, is meer geschikt voor de studie van klein molecuul-RNA interacties, zoals deze interactie soms zwak en ongevoelig voor RNase uitdagingen kunnen.

De grote beperking van het gebruik van de SHAPE te bestuderen van kleine molecuul-geïnduceerde RNA structurele veranderingen is dat de resultaten niet de bindende site onthullen. In in vitro en in cel vorm voor SMN-C2 pre-mRNA gebonden, veranderde de reactiviteit van vorm niet op de website putatief bindende (Figuur 1 d, figuur 2B); Integendeel, de reactiviteit op 2 tot en met 3 externe sites op de lus of budge regio werden gewijzigd. SMN-C2 vermoedelijk bindt aan een RNA dubbele-helix regio (Figuur 1 d, figuur 2D), die meestal een lage vorm reactiviteit heeft. Daarom zou verder stabiliseren de structuur om te verminderen van de reactiviteit van de SHAPE waarschijnlijk niet waarneembaar. Een vermeende bindende om site te genereren, andere methoden zoals ChemCLIP38 moet worden gebruikt, waarbij een crosslinking chemische sonde is betrokken.

Een gemeenschappelijke aanpak van alternatieve kaart RNA middelbaar of hoger structuur en dynamiek van de nucleotide is NMR spectrometrie39,40. Het is aangetoond dat RNA dynamics afgeleid van kwantitatieve NMR analyse sterk correlate met SHAPE activiteit39. In het kader van klein molecuul bindende, kunnen chemische verschuiving verstoringen onthullen de interactie nucleotiden21.

Kleine moleculen RNA-targeting naarmate een nieuwe modaliteit van drug ontwikkeling11, voorzien wij dat vorm zal worden opgericht als een standaard methodologie voor de evaluatie van de structurele effecten van doel RNA in het bijzijn van kleine molecules. In de toekomst is een transcriptome bestrijkende ondervraging methode voor RNA-targeting klein molecuul drugs gewenst.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs verklaren geen belangenconflict.

Acknowledgments

Dit werk werd mogelijk gemaakt door de NIH R01 grant (NS094721, K.A.J.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DNA oligonucleotide IDT gBlock for >200 bp DNA synthesis
Phusion Green Hot Start II High-Fidelity PCR Master Mix Thermo Fisher F566S
NucleoSpin gel and PCR clean-up kit Takara 740609.50
MegaScript T7 transcription kit Thermo Fisher AM1333 Contains 10x reaction buffer, T7 enzyme, NTP and Turbo DNase
DEPC-treated water Thermo Fisher 750023
2x TBE-urea sample buffer Thermo Fisher LC6876
40% acrylamide/ bisacrylamide solution (29:1) Bio-Rad 1610146
10x TBE buffer Thermo Fisher 15581044
Nalgene Rapid-Flow™ Filter Unit Thermo Fisher 166-0045
Kimwipe Kimberly-Clark 34133
TEMED Thermo Fisher 17919
SYBR-Safe dye Thermo Fisher S33102
6% TBE-urea mini-gel Thermo Fisher EC6865BOX
ChemiDoc Bio-Rad
T4 PNK NEB M0201S
γ-32P-ATP Perkin Elmer NEG035C005MC
Hyperscreen™ Intensifying Screen GE Healthcare RPN1669 calcium tungstate phosphor screen
phosphor storage screen Molecular Dynamics BAS-IP MS 3543 E
Amersham Typhoon GE Healthcare
NAI (2M) EMD Millipore 03-310
GlycoBlue Thermo Fisher AM9515
SuperScript IV Reverse Transcriptase Thermo Fisher 18090010 Contains 5x RT buffer, SuperScript IV
dNTP mix (10 mM) Thermo Fisher R0192
ddNTP set (5 mM) Sigma GE27-2045-01
large filter paper Whatman 1001-917
Gel dryer Hoefer GD 2000
QIAamp DNA Blood Mini Kit Qiagen 51104 Also contains RNase A and protease K
SMN2 minigene34 Addgene 72287
Heat inactivated FBS Thermo Fisher 10438026
Pen-Strep Thermo Fisher 15140122
Opti-MEM I Thermo Fisher 31985062
FuGene HD Promega E2311
TrpLE Thermo Fisher 12605010
DPBS without Ca/Mg Thermo Fisher 14190250
TRIzol Thermo Fisher 15596018
RNeasy mini column Qiagen 74104 Also contains RW1, RPE buffer
RNase-Free DNase Set Qiagen 79254 Contains DNase I and RDD buffer
Deionized formamide Thermo Fisher AM9342
MnCl2•4H2O Sigma-Aldrich M3634
random nonamer Sigma-Aldrich R7647
SuperScript First-Strand Synthesis System Thermo Fisher 11904-018 Contains 10x RT buffer, SuperScript II reverse transcriptase
AccuPrime pfx DNA polymerse Thermo Fisher 12344024
NextSeq500 Illumina
NucAway column Thermo Fisher AM10070 for desalting purpose

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wilkinson, K. A., Merino, E. J., Weeks, K. M. Selective 2'-hydroxyl acylation analyzed by primer extension (SHAPE): Quantitative RNA structure analysis at single nucleotide resolution. Nature Protocols. 1, 1610-1616 (2006).
  2. Trausch, J. J., et al. Structural basis for diversity in the SAM clan of riboswitches. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111, 6624-6629 (2014).
  3. Souliere, M. F., et al. Tuning a riboswitch response through structural extension of a pseudoknot. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110, E3256-E3264. , E3256-E3264 (2013).
  4. Rice, G. M., Busan, S., Karabiber, F., Favorov, O. V., Weeks, K. M. SHAPE Analysis of Small RNAs and Riboswitches. Methods in Enzymology. , 165-187 (2014).
  5. Spitale, R. C., et al. RNA SHAPE analysis in living cells. Nature Chemical Biology. 9, 18-20 (2013).
  6. Wang, J., Schultz, P. G., Johnson, K. A. Mechanistic studies of a small-molecule modulator of SMN2 splicing. Proceedings of the National Academy of Sciences. 115, E4604-E4612 (2018).
  7. Price, I. R., Gaballa, A., Ding, F., Helmann, J. D., Ke, A. Mn 2+ -Sensing Mechanisms of yybP-ykoY Orphan Riboswitches. Molecular Cell. 57, 1110-1123 (2015).
  8. Hennelly, S. P., Sanbonmatsu, K. Y. Tertiary contacts control switching of the SAM-I riboswitch. Nucleic Acids Research. 39, 2416-2431 (2011).
  9. Abulwerdi, F. A., et al. Development of Small Molecules with a Noncanonical Binding Mode to HIV-1 Trans Activation Response (TAR) RNA. Journal of Medicinal Chemistry. 59, 11148-11160 (2016).
  10. Shortridge, M. D., et al. A Macrocyclic Peptide Ligand Binds the Oncogenic MicroRNA-21 Precursor and Suppresses Dicer Processing. ACS Chemical Biology. 12, 1611-1620 (2017).
  11. Warner, K. D., Hajdin, C. E., Weeks, K. M. Principles for targeting RNA with drug-like small molecules. Nature Reviews Drug Discovery. 17, 547-558 (2018).
  12. Mullard, A. Small molecules against RNA targets attract big backers. Nature Reviews Drug Discovery. 16, 813-815 (2017).
  13. Shortridge, M. D., Varani, G. Structure based approaches for targeting non-coding RNAs with small molecules. Current Opinion in Structural Biology. 30, 79-88 (2015).
  14. Gallego, J., Varani, G. Targeting RNA with Small-Molecule Drugs: Therapeutic Promise and Chemical Challenges. Accounts of Chemical Research. 34, 836-843 (2001).
  15. Rizvi, N. F., Smith, G. F. RNA as a small molecule druggable target. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. 27, 5083-5088 (2017).
  16. Connelly, C. M., Moon, M. H., Schneekloth, J. S. The Emerging Role of RNA as a Therapeutic Target for Small Molecules. Cell Chemical Biology. 23, 1077-1090 (2016).
  17. Palacino, J., et al. SMN2 splice modulators enhance U1-pre-mRNA association and rescue SMA mice. Nature Chemical Biology. 11, 511-517 (2015).
  18. Ratni, H., et al. Discovery of Risdiplam, a Selective Survival of Motor Neuron-2 ( SMN2 ) Gene Splicing Modifier for the Treatment of Spinal Muscular Atrophy (SMA). Journal of Medicinal Chemistry. 61, 6501-6517 (2018).
  19. Naryshkin, N., et al. SMN2 splicing modifiers improve motor function and longevity in mice with spinal muscular atrophy. Science. 345, (2014).
  20. Chiriboga, C., et al. Preliminary Evidence for Pharmacodynamics Effects of RG7916 in JEWELFISH, a Study in Patients with Spinal Muscular Atrophy who Previously Participated in a Study with Another SMN2-Splicing Targeting Therapy (S46.003). Neurology. 90, (2018).
  21. Sivaramakrishnan, M., et al. Binding to SMN2 pre-mRNA-protein complex elicits specificity for small molecule splicing modifiers. Nature Communications. 8, (2017).
  22. Lee, B., et al. Comparison of SHAPE reagents for mapping RNA structures inside living cells. RNA. 23, 169-174 (2017).
  23. Weeks, K. M., Mauger, D. M. Exploring RNA Structural Codes with SHAPE Chemistry. Accounts of Chemical Research. 44, 1280-1291 (2011).
  24. Smola, M. J., et al. SHAPE reveals transcript-wide interactions , complex structural domains , and protein interactions across the Xist lncRNA in living cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113, 10322-10327 (2016).
  25. Flynn, R. A., et al. Transcriptome-wide interrogation of RNA secondary structure in living cells with icSHAPE. Nature Protocols. 11, 273-290 (2016).
  26. Smola, M. J., Rice, G. M., Busan, S., Siegfried, N. A., Weeks, K. M. Selective 2 ′ -hydroxyl acylation analyzed by primer extension and mutational profiling (SHAPE-MaP) for direct , versatile and accurate RNA structure analysis. Nature Protocols. 10, 1643-1669 (2015).
  27. Hua, Y., et al. Antisense correction of SMN2 splicing in the CNS rescues necrosis in a type III SMA mouse model. Genes & Development. 24, 1634-1644 (2010).
  28. Hua, Y., et al. Peripheral SMN restoration is essential for long-term rescue of a severe spinal muscular atrophy mouse model. Nature. 478, 123-126 (2011).
  29. Wee, C. D., Havens, M. A., Jodelka, F. M., Hastings, M. L. Targeting SR proteins improves SMN expression in spinal muscular atrophy cells. PloS One. 9, e115205 (2014).
  30. Hammond, J. A., Rambo, R. P., Filbin, M. E., Kieft, J. S. Comparison and functional implications of the 3D architectures of viral tRNA-like structures. RNA. 15, 294-307 (2009).
  31. Singh, N. N., Singh, R. N., Androphy, E. J. Modulating role of RNA structure in alternative splicing of a critical exon in the spinal muscular atrophy genes. Nucleic Acids Research. 35, 371-389 (2007).
  32. Deigan, K. E., Li, T. W., Mathews, D. H., Weeks, K. M. Accurate SHAPE-directed RNA structure determination. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106, 97-102 (2009).
  33. Qi, H., et al. Preparation of pyridopyrimidine derivatives and related compounds for treating spinal muscular atrophy. , (2013).
  34. Lorson, C. L., Hahnen, E., Androphy, E. J., Wirth, B. A single nucleotide in the SMN gene regulates splicing and is responsible for spinal muscular atrophy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96, 6307-6311 (1999).
  35. Siegfried, N. A., Busan, S., Rice, G. M., Nelson, J. A. E., Weeks, K. M. RNA motif discovery by SHAPE and mutational profiling (SHAPE-MaP). Nature Methods. 11, 959 (2014).
  36. Milligan, J. F., Groebe, D. R., Witherell, G. W., Uhlenbeck, O. C. Oligoribonucleotide synthesis using T7 RNA polymerase and synthetic DNA templates. Nucleic Acids Research. 15, 8783-8798 (1987).
  37. Nilsen, T. W. RNase Footprinting to Map Sites of RNA-Protein Interactions. Cold Spring Harbor Protocols. , (2014).
  38. Velagapudi, S. P., et al. Design of a small molecule against an oncogenic noncoding RNA. Proceedings of the National Academy of Sciences. , 5898-5903 (2016).
  39. Barnwal, R. P., Yang, F., Varani, G. Applications of NMR to structure determination of RNAs large and small. Archives of Biochemistry and Biophysics. 628, 42-56 (2017).
  40. Scott, L. G., Hennig, M. RNA structure determination by NMR. Methods in Molecular Biology. 452, 29-61 (2008).

Tags

Deze maand in JoVE kwestie 143 klein molecuul RNA-targeting RNA structuur in vitro vorm vorm spinale musculaire atrofie RG-7916 in cel
Met behulp van In Vitro en In cel vorm te onderzoeken klein molecuul veroorzaakte structurele veranderingen van de Pre-mRNA
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wang, J., Hammond, J., Johnson, K.… More

Wang, J., Hammond, J., Johnson, K. A. Using In Vitro and In-cell SHAPE to Investigate Small Molecule Induced Pre-mRNA Structural Changes. J. Vis. Exp. (143), e59021, doi:10.3791/59021 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter