Summary
Målet med denne protokollen er å illustrere hvordan du bruker musen neonatale cardiomyocytes som modellsystem for å undersøke hvordan ulike faktorer kan endre oksygenforbruk i hjertet.
Abstract
Mitokondrier og oksidativt metabolisme er avgjørende for å opprettholde Hjertemuskel funksjon. Forskning har vist at mitokondrie dysfunksjon er en viktig medvirkende faktor til svekket cardiac funksjon i hjertesvikt. Derimot kan gjenopprette defekt mitokondrie funksjonen ha gunstige effekter å forbedre hjertefunksjon i sviktende hjertet. Derfor kan studere regulatoriske mekanismer og identifisere romanen regulatorer for mitokondrie funksjon gi innsikt som kan brukes til å utvikle nye terapeutisk mål for behandling av hjertesykdommer. Her, er hjerte myocyte mitokondrie åndedrett analysert ved hjelp av en unik celle kultur-systemet. Først er en protokoll optimalisert til å raskt finne og kultur høy levedyktighet neonatal musen cardiomyocytes. Deretter brukes en 96-brønns ekstracellulære flux analysator til å vurdere oksygen forbruksraten for disse cardiomyocytes. For denne protokollen, vi optimalisert seeding forhold og vist at neonatal musen cardiomyocytes oksygen forbruksraten lett kan vurderes i en ekstracellulære flux analyserer. Til slutt, vi oppmerksom på at våre protokollen kan brukes på større kultur og andre studier, som intracellulær signalering og kontraktile funksjon analyse.
Introduction
For å opprettholde en kontinuerlig kontraktile hjertefunksjon, må cardiomyocytes opprettholde en konstant tilførsel av cellular energi i form av ATP1. I hjertet genereres ca 95% av ATP mitokondriene, hovedsakelig gjennom oxidative fosforylering, viser at mitokondrier spiller en avgjørende rolle i bioenergetisk i hjertefunksjon2,3. Støtter denne forestillingen er at feilregulering mitokondrie funksjonen kan føre til kardiomyopati og hjertesvikt4,5. Omvendt, gjenopprette mitokondrie funksjonen har vist seg å forbedre hjertefunksjon av sviktende hjerte6,7. Derfor studerer mekanisme mitokondrie bioenergi og identifisere romanen regulatorer av mitokondrie funksjon i cardiomyocytes vil ikke bare avsløre mekanistisk innsikt i cardiac energiproduksjon, men også kunne gi innsikt som vil lede utviklingen av nye terapeutiske mål å behandle hjertesykdommer6,8.
Sammenlignet med hele hjerte, som inneholder en blanding av myocytter og ikke-myocytter9, cardiomyocyte kulturer er svært ren, med minimal forurensning av ikke-myocytter fra hjertet, som fibroblaster og endotelceller10. I tillegg kan isolere cardiomyocytes fra neonatal pups dyrking et stort antall celler i en liten mengde tid, i forhold til skille celler fra voksen hjerter10,11. Viktigst, primære kulturperler voksen mus cardiomyocytes har kort overlevelse ganger (f.eks 24 h) og på lengre tid poeng de skille. Neonatal musen cardiomyocytes kan overleve og manipuleres opp 7 dager i kultur, noe som gjør dem ideelle for å teste effekten av stoffet forbindelser og gene manipulasjon funksjonen av mitokondrier i cardiomyocytes10. Selvfølgelig, det er betydelige biologiske forskjeller mellom voksne og neonatal cellene, men lengre varighet tilgjengelig for kultur neonatal celler gjør dem passer for mange forskjellige typer studier, inkludert de av mitokondrie funksjon.
Hittil har primære kulturperler neonatal musen og rotten cardiomyocytes blitt brukt som modeller for å studere cardiac bioenergi12,13. De siste årene brukt studier en ekstracellulære flux analyserer å måle oksygen forbruksraten (OCR) og evaluere oksidativt kapasitet i musen og rotten neonatale cardiomyocytes14,15. Mens sammenlignet med rotter, celle levedyktigheten til musen neonatale cardiomyocytes er lavere og har større variasjon16. Også gjør muligheten til å studere celler fra genmodifiserte musen modeller mus celle modell veldig viktig. Gitt at OCR studier er så følsom for tall og seeding tetthet, er utvikling av en reproduserbare, pålitelig og enkel protokoll konsekvent celle avkastning og levedyktighet nødvendig.
Her rapporterer vi et optimalisert protokollen som er utviklet som bruker kulturperler musen neonatale cardiomyocytes sammen med en 96-brønnen-format ekstracellulære flux analysator for OCR analyse. Denne protokollen øker sterkt reproduserbarhet til analysen. I tillegg protokollen ikke bare en roman og reproduserbar metode for OCR analyse, men også kan tilpasses til en større størrelse kultur for andre eksperimentelle formål, for eksempel det som kan være nødvendig å studere myofibrillære funksjoner og intracellulær signalveier.
Spesielt beskriver denne protokollen en dag fremgangsmåte for isolasjon og kultur neonatal mus cardiomyocytes i en 96-brønns celle kultur plate. I tillegg beskriver fremgangsmåten for å måle oksygenforbruk ved hjelp av en ekstracellulære flux analyserer. Alle løsningene som brukes er sterile eller sterilt filtrert. Alle verktøyene er steriliserte med 75% etanol. Vi tilbyr en Tabell for materiale for ulike deler av prosedyren. For dyrking cardiomyocytes, utføres alle prosedyrer og trinnene i standard celle kultur hette. Denne protokollen er utviklet for isolering av neonatal musen hjerter fra ett kull (ca 8-10 pups). Protokollen kan imidlertid også være tilpasset isolere cardiomyocytes fra mangfoldig søppel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
For arbeid med neonatal mus, henvises til lokale universitet/Institutt retningslinjer satt frem av dyr pleie programmer og følge sin institusjonelle og andre aktuelle bestemmelser. Alle metodene som er beskrevet i denne protokollen er godkjent av UC San Diego institusjonelle Animal Care og bruk Committee (IACUC) og overholde føderale og statlige bestemmelser.
1. forberedelse av reagenser
- Forberede 25 mL før fordøyelsenløsning: HBSS (uten Ca2 + og Mg2 +) med trypsin (0,5 mg/mL). Sterilisere løsningen bruker filtere 0.22 µm og holde på is til bruk. Gjør før fordøyelsen løsning på dagen for eksperimentet.
Merk: Det er viktig å bruke HBSS uten Ca2 + og Mg2 +, som Ca2 + og Mg2 + vil føre myocyte sammentrekning og påfølgende celledød under isolasjon. - Forberede 30 mL collagenase fordøyelsenbufferen: collagenase (0,8 mg/mL, ca 350 U/mL) oppløst i HBSS (uten Ca2 + og Mg2 +) buffer. Sterilisere løsningen bruker filtere 0.22 µm og holde på is til bruk. Gjør collagenase fordøyelsen løsning på dagen for eksperimentet.
- Forberede 500 mL cardiomyocyte kultur medier (vekst medier): Bland 375 mL DMEM, 125 mL av M-199, 25 mL av hest serum og 12,5 mL FBS. Supplere med 1% penicillin og 1% streptomycin løsning.
- Forberede mitokondrie stresstest medium: gjøre 200 mL DMEM basert stresstest medium (DMEM uten NaHCO3, se Tabellen for materiale) med 1 mM natrium pyruvate, 2 mM L-glutamin, og 10 mM glukose og 2 mM Hepes.
Merk: Gjøre 1 L medium med DMEM uten natrium pyruvate, L-glutamine, glukose og Hepes, sterile, midlertidige filer og lagre i 4 ° C. Forberede stresstest medium ved analysen ved å legge til andre. Bruke DMEM er medium uten NaHCO3 kritiske. - Justere pH i mitokondrie stresstest media 7,4 ved bruk. Varm media 37 ° c før bruk.
- Forberede oligomycin: forberede 5 mL av en 5 mM lagerløsning i DMSO gjøre 250 µL dele og lagre på 20 ° C.
- Forberede FCCP: forberede 5 mL av en 5 mM lagerløsning i DMSO gjøre 250 µL dele og lagre på 20 ° C.
- Forberede antimycin A: forberede 5 mL av en 5 mM lagerløsning i DMSO gjøre 250 µL dele og lagre på 20 ° C.
- Forberede rotenon: forberede 5 mL av en 5 mM lagerløsning i DMSO gjøre 250 µL dele og lagre på 20 ° C.
Merk: Alle reagenser og løsningene som brukes i denne protokollen er oppført i tabell 1.
2. høsting og før fordøyelsen hjerter fra Neonatal mus (dag 1)
- Autoclave saks, pinsett, og en Moria skje å sterilisere.
- Utføre alle skritt i celle kultur panseret for sterilitet.
- Aliquot 5 mL av HBSS (uten Ca2 +, Mg2 +) hver brønn av en 6-vel celle kultur plate; Plasser på isen. Aliquot 10 mL av HBSS i en 10 cm celle kultur parabol.
- Forberede 20 mL trypsin før fordøyelsen løsning i et 50 mL steril konisk rør. Holde alle løsninger på is.
- Raskt dypp nyfødte (dag 0) mus i 70% etanol løsning for sterilisering.
- Halshugge pups med sterilt saks (rett) uten bedøvelse, og åpne deretter brystet langs sternum til brystet hulrom og hjertet. (Figur 1A)
Merk: 1) det er viktig å bruke P0 neonatal mus for å oppnå høyt levedyktighet. 2) denne euthanasia metoden er tillatt for nyfødte i henhold til NIH og amerikaneren Veterinary Legeundersøkelse Forening retningslinjer 17. - Ekstra hjerter fra kroppen med en fin saks og overføring umiddelbart til sterilt celle kultur parabol med HBSS (uten Ca2 +, Mg2 +) (figur 1B).
- Fjern alle gjenværende lungevev, større fartøy, etc. (og atria, om ønskelig). Vask hjerter i HBSS løsningen med mild agitasjon.
- Skjær hver hjerter med en fin saks i 8 biter og overføre alle hjertet vev med tang i en brønn av en 6-vel celle kultur plate med HBSS (figur 1 c og 1 D).
- Vask hjerter ved å overføre hjerter fra brønn til godt i 6-vel platen fylt med HBSS, bruke en Moria skje (figur 1 d).
Merk: Overføre hjerter fra brønn til godt er nok bleke blodet. Siden blod forstyrrer enzymatisk fordøyelsen er det viktig å vaske hjerter med HBSS og fjerne blod. - Overføre hjerter med Moria skje til en konisk rør som inneholder 20 mL av trypsin (0,5 mg/mL) og ruge med mild agitering på 4° C 4 h (figur 1E).
3. Forbered en 96-brønnen Plate (dag 1)
- Forberede 5 mL belegg løsning: PBS med 0,5% gelatin (autoklav før bruk) og 1% fibronectin løsning. (f.eks 5 mL gelatin løsning pluss 50 µL fibronectin løsning)
- Aliquot 50 µL belegg løsning i hver brønn i 96-brønnen celle kultur plate (se Tabell for materiale). Hvis er bobler, kan du fjerne dem ved hjelp av en 20 µL pipette for å suge bobler ut.
Merk: Det er viktig å dekke alle areal på hver brønn med belegg løsning. - Inkuber platen i en 37 ° C celle kultur inkubator 1 time eller mer å tillate tørking av matrix belegget.
- Sug opp alle gjenværende belegg løsning før såing cardiomyocytes.
4. enzymatisk fordøyelsen og Plating celler (dag 1)
- Forvarm collagenase fordøyelsen løsning i et 37 ° C vannbad.
Merk: Dette trinnet er viktig å oppnå effektiv enzymatisk fordøyelse. - Flytte konisk røret som inneholder hjerter og før fordøyelsen løsning fra 4 ° C til celle kultur hette. (Figur 1F)
- La hjertene synke å bunnen av røret og fjerne den før fordøyelsen løsningen ved hjelp av en 10 mL serologisk pipette (1-2 mL isolasjon mediet kan forblir i røret).
- Legge til 10 mL av HBSS inn i røret. Nytt suspendere hjerter med HBSS 2 - 3 ganger bleke trypsin bruker en 10 mL serologisk pipette. Sug opp HBSS (1-2 mL kan forblir i røret).
- Legge til 10 mL forvarmes collagenase fordøyelsen løsning inn i røret med hjerter. (Figur 1G)
- Inkuber røret med hjerter i et vannbad 37 ° C i 10 min uten agitering (1 fordøyelsen).
- Etter 1 fordøyelsen, flytte røret til celle kultur panseret. Forsiktig triturate hjerter ved å suspendere hjerter i røret forsiktig 10 ganger med en 10 mL serologisk pipette. Dette vil tillate hjerter å spre og celler frigis fra hjertet vev. (Figur 1 H)
Merk: Siden cardiomyocytes er skjøre, er mild føden viktig å oppnå høy levedyktighet. - La ufordøyd vevet synke overføre fordøyd løsning beriket i cardiomyocytes (ca 9-10 mL) til en ny konisk tube og umiddelbart legge en lik mengde celle kultur medier å stoppe collagenase fordøyelsen.
- Legge til 10 mL collagenase fordøyelsen løsning inn i røret som inneholder gjenværende ufordøyd hjertet vev.
- Inkuber røret med hjertet vev i et vannbad 37 ° C i 10 min (2 fordøyelsen).
- Gjenta 4.7 og 4.8.
Merk: Hvis det er fortsatt mye ufordøyd vev, gjenta fordøyelsen én gang. Men i de fleste tilfeller er to digestions nok til å spre de fleste cellene fra hjertet tissue. - Plass en steril celle-sil (100 µm nylon maske) i en ny sterilt 50 mL konisk tube. Pre våt celle silen med 2-3 mL celle kultur medier og passere cellene til cellen-silen. Skyll celle-silen med 2-3 mL celle kultur medier. (Figur 1I)
- Sentrifuge konisk rør som inneholder cardiomyocytes for 5 min på 180 x g (figur 1J). Sug opp nedbryting (figur 1 K), som vil inneholde celle vev rusk og re avbryte celle pellet 10 mL av celle kultur medier (figur 1 L).
- Forsiktig resuspend de cellene og plate på en 10 cm celle kultur parabol (plast uten noen form for belegg) og Inkuber 1t i en celle kultur inkubator (1 før plating) (figur 1 M). Dette før plating trinnet kan ikke-cardiomyocytes, som fibroblaster og endotelceller, overholder ubestrøket cellekultur parabolen.
Merk: Foreløpig cardiomyocytes er vanligvis en rund form og vises skinnende under mikroskopet. (Figur 1N). - Etter den 1t inkubering, forsiktig agitere platen, vaske ikke-tilhenger celler (anriket på cardiomyocytes) fra 10 cm kultur parabol, og å suspendere celler av gjentatte ganger pipettering celle kultur medium over parabolen med en 10 mL serologisk pipette. Deretter overføre ikke-tilhenger celler (anriket på cardiomyocytes) i en ny 10 cm celle kultur parabol (plast uten noen belegg) og Inkuber en ekstra 1t i en celle kultur inkubator (2 før plating).
Merk: Celler som knytte til ikke-belagt platen er nesten kun ikke-cardiomyocytes: fibroblaster og endotelceller, som kan visualiseres under et mikroskop (figur 1O). - Etter 2 før plating, forsiktig agitere platen, vask ikke-tilhenger celler (cardiomyocytes) fra 10 cm kultur fatet, deretter overføre til cardiomyocytes til en ny 50 mL konisk tube.
5. teller cellene og Plating i en 96-brønns celle kultur Plate (dag 1)
- Telle celler ved hjelp av en hemocytometer.
- Plate cellene i en ekstracellulær matrix belagt 96-brønns celle kultur plate på en tetthet mellom 10-30 x 103 celler/godt ved hjelp av en flerkanals pipette i et siste volum på 200 µL (figur 1 P). Bruke brønner A1, A12, H1 og H12 bakgrunnen: legge til 200 µL av kultur medium som andre brønner i disse brønnene (ingen celler). Inkuber platen i en 37 ° C celle kultur inkubator.
Merk: I denne studien ble oksygenforbruk testet ved hjelp av ulike celle tettheter som 10 x 103, 20 x 103eller 30 x 103 celler/godt. (Figur 2A). Også, som ovenfor, cardiomyocytes umiddelbart etter isolasjon er vanligvis en rund form og vises skinnende under mikroskopet. Levedyktige cellers vil flate ut innen 16-24 h kultur.
6. oksygen forbruk analysen ved hjelp av en 96-brønnen-ekstracellulær Flux analysator (dag 2)
Merk: Oksygen forbruk analysen kan gjennomføres én dag etter at plating cellene eller senere. Neonatal cardiomyocytes kultivert bruker denne protokollen kan overleve opp til 7 dager legge isolasjon.
- Hydrat flux analyzer sensor patron (se Tabell for materiale) i minst 3 timer, men ideelt for en hel dag, før analysen. Legge til 200 µL Calibrant løsning (se Tabell for materiale) i hver brønnen av verktøyet plate, sette sensor kassetten tilbake på verktøyet platen og ruge i en 37 ° C inkubator uten CO2 eller O2 kosttilskudd.
- Endre cellen kultur medier til mitokondrier stresstest middels en time før analysen. Cardiomyocytes er skjøre. Derfor forsiktig fjerne celle kultur medier ved hjelp av en flerkanals pipette og vask cellene med 200 µL forvarmes mitokondrie stresstest medier to ganger. Etter andre vask, legge til 175 µL forvarmes mitokondrier stresstest medier og kultur cellene i en 37 ° C inkubator uten CO2 eller O2 kosttilskudd.
- Forberede konsentrert test forbindelser. For mitokondrier stress test, forberede 3.0 mL hver 16 µM oligomycin, 9 µM FCCP og en blanding av 20 µM rotenon og 20 µM antimycin A, alle i mitokondrie stresstest medium.
Merk: Hver sammensatte på konsentrasjonen beskrevet er testet. Det er imidlertid nødvendig å titrating konsentrasjonen av hver sammensatte i eget laboratorium. - Legg 25 µL av hver sammensatte i injektor portene på sensoren kassetten med en flerkanals pipette (figur 1U). Volumet og endelige konsentrasjon er beskrevet i tabell 2.
- Definere ekstracellulære flux analysen protokollen. Programmet er beskrevet i tabell 3.
- Start programmet. Først, ta sensor kassetten inn i maskinen for kalibrering (figur 1R). Erstatte calibrant for analysen plate når kalibreringstrinnet er gjort.
Merk: Bruker programvaren levert av produsenten, angi grupper og hver sammensatte og port. - Eventuelt etter analysen, nøye Forkast alle analysen medium ved hjelp av en flerkanals pipette og lagre celle kultur microplate på 20 ° C for fremtidige celle normalisering bruke protein analysen.
- Måle proteininnhold. Legge til 50 µL av standard RIPA celle lysis løsning (se Tabell for materiale). Inkuber plate is i 30 minutter til fullt lyse cellene. Overføre alt materiale til en ny helt flat bunn 96 godt analysen plate.
- Måle protein konsentrasjon av BCA analysen i henhold til produsentens protokollen.
Merk: Belegg brønnen med ekstracellulær matrix resulterer i en høy protein konsentrasjon i hver brønn. Derfor subtrahere hvor mye bakgrunnen well(s) (ingen celler) å få selve cellen protein konsentrasjon. Protein konsentrasjonen avledet fra celler er lav i en 96-brønnen plate. I tillegg kan protein konsentrasjon variere fra godt-å-godt på grunn av ekstracellulær matrix belegg. Derfor er bruker celle nummer normalisere OCR foreslått.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ved hjelp av protokollen beskrevet, ble hjerter isolert fra dag 0 neonatal pups. 5 x 105 celler/pup ble innhentet, og cardiomyocytes ble sådd i tettheter på 10 x 103, 20 x 103eller 30 x 103 celler/Vel, i 96 bra plater (figur 2A). Etter natten kultur, cardiomyocytes fant godt festet til belagt plast overflaten og det var svært få ledige celler (fristilt cellene vil fortsatt vises som runde og skinnende, sammenlignet med sunn, tilknyttede cellene som spreadout) () Figur 2A og B). Foreløpig var spontant kontraherende cardiomyocytes lett synlige. En seeding tetthet av 30 x 103 celler/vel viste samløpet dagen etter frø som cellene spredt. Som antall runde (død) celler var svært lav, viste disse resultatene at protokollen gir høyt levedyktigheten til cardiomyocytes. Cardiomyocytes var immunostained med et antistoff mot sarcomeric α-actinin, en cardiomyocyte bestemt markør18 som bevis i denne erklæringen. Som vist i figur 2C, viste de fleste av celler positiv farging av α-actinin viser høy renhet av cardiomyocyte isolasjon.
En ordning av en typisk mitokondrie stress test vises i Figur 3. Mitokondrielt stress test starter med en opprinnelig plan måling av oksygen forbruksraten (OCR). Dette etterfølges av injeksjon av oligomycin, som hemmer ATPase. Forskjellen før og etter oligomycin injeksjon viser OCR knyttet til ATP produksjon. Deretter uncoupling agent FCCP ble injisert måle maksimalt oksygen forbruksraten. Ledig åndedretts kapasitet kan beregnes som differansen mellom basale og maksimal OCR. Til slutt, med injeksjon av to elektronet transport komplekse hemmere (antimycin A og rotenon), mitokondrie åndedrett stopper helt og OCR reduseres til sitt laveste nivå. Ved å blokkere mitokondrie aktivitet, på dette nivået, er oksygenforbruk ikke-Mitokondrielt. Basal åndedrett, proton lekkasje og maksimal åndedrett kan beregnes som differansen mellom ikke-Mitokondrielt åndedrett (OCR i nærvær av antimycin A og rotenon) og opprinnelig plan måling, OCR i nærvær av oligomycin og OCR i den tilstedeværelsen av FCCP, henholdsvis.
I denne studien ble OCR-analyse gjennomført med en 96-brønns format ekstracellulære flux analyzer system dagen etter cellen Aisolering. I tillegg for å teste effekten av serum sult på OCR, tre timer før analysen, celle kultur media ble endret til vanlig celle kultur vekst medier med serum, eller uten serum. Etter kjøre, ble OCR måledata 1 til 12 for hver Vel, eksportert til et regneark for journalføring og videre analyse. Metabolsk egenskaper ble bestemt som følger:
Non-Mitokondrielt åndedrett = gjennomsnittlig OCR (10, 11, 12)
Basal åndedrett = gjennomsnittlig OCR (1, 2, 3)-gjennomsnittlig OCR (10, 11, 12)
ATP produksjon = gjennomsnittlig OCR (1, 2, 3)-gjennomsnittlig OCR (4, 5, 6)
Proton lekkasje = gjennomsnittlig OCR (4, 5, 6) - gjennomsnittlig OCR (10, 11, 12)
Maksimal åndedrett = gjennomsnittlig OCR (7, 8, 9) - gjennomsnittlig OCR (10, 11, 12)
Som vist i figur 4A, OCR verdier ble lett analysert, og effekten av injisert forbindelser var også åpenbart. Viktigere, variasjon fra brønn til brønnen ble liten som vist av standardfeilen. Økning i celle tall resulterte i økt opprinnelig plan måling, Oligomycin og FCCP-behandlet åndedrett. Sammenlignet med serum sultet celler, var OCR høyere i celler analysert som hadde blitt ruget med vekst medier. Som vist i figur 4B, OCR vises som basale åndedrett, proton lekkasje (Oligo) og maksimal åndedrett (FCCP) per 1 x 104 celler. OCR per 10 x 103 celler var høyere i seeding tettheten av 20 K og 30 K celler/godt enn 10 K celler/godt. Som vist i figur 4C, sultet ved å uttrykke OCR i forhold til basale åndedrett, den relative OCR av Proton lekkasje (Oligo) og maksimal (FCCP) viser lignende verdier mellom vekst medier og serum grupper. Disse resultatene tyder på at seeding tetthet ikke påvirker den relative proton lekkasje og maksimal oksidativt kapasiteten.
Total, bruker denne protokollen, utmerket avkastning av musen neonatale cardiomyocytes var vellykket isolert og kulturperler. OCR kan vurderes ved hjelp av disse myocytter i en ekstracellulære flux analyserer. Resultatene viser også at seeding tetthet betydelig ikke påvirker OCR beregnet av celle nummer. Men reduserer kort sikt (3 h) serum sult OCR. Informasjonen er nyttig for testing av musen neonatale cardiomyocytes OCR med ulike eksperimentelle forhold.
Figur 1: isolasjon og kultur neonatale cardiomyocytes fra dag 0 nyfødte mus. (A) nyfødte er euthanized, og hjertet er dissekert fra thorax. (B) hjerter er vasket i HBSS (uten Ca2 +, Mg2 +). (C) hver hjerter er kuttet i 8 biter. (D) hjerter flyttes til en 6-vel plate fylt med HBSS. Hjerter er vasket med en Moria skje for å overføre dem fra brønn til godt. (E) hjerter er pre-oversikten i Trypsin-HBSS på 4 ° C med mild agitasjon. (F) Predigested hjerte vev etter 4t inkubasjon på 4 ° C. (G) hjerte vev etter 10 min collagenase fordøyelsen. (H) Collagenase fordøyd hjertet vev er triturated. (jeg) bortgjemte cardiomyocytes ble filtrert gjennom en celle sil. (J) Cardiomyocytes er pelleted med sentrifugering. (K) Collagenase og kultur medier fjernes av aspirasjon. (L) Cardiomyocytes er nytt suspendert i frisk kultur medium. (M) Cardiomyocytes er kultivert i 10 cm plast parabol for før plating. (N) A representativt bilde av cardiomyocytes (rund og blanke celler) etter 1 h før plating. (O) etter før plating og deretter fjerning av ikke-tilhenger cardiomyocytes, gjenværende celler som vanligvis fibroblaster og endotelceller vises. (P) Plating cardiomyocytes inn i en 96-brønns plate. (Q) lasting reagenser til injeksjon porter av sensoren kassetten. (R) Putting sensor kassett til en ekstracellulære flux analyzer maskin. Skala bar = 0,1 mm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: kultur for cardiomyocytes på ekstracellulære flux analyzer 96-brønns plate. (A) representant bilder av cardiomyocytes i 96-brønnen plater med angitte cellen tettheter, umiddelbart etter seeding (øvre rad) eller 18t innlegget seeding (nederste rad). (B) en høyere bilde forstørrelse av cardiomyocytes 18t innlegget seeding på en celle tetthet av 10 x 103 celler/godt. (C) Cardiomyocytes var farget med anti-sarcomeric α-actinin antistoff (grønn) og DAPI (som en kjernefysisk flekk) (blå). Skala bar = 0,1 mm. Metodene som brukes for immunostaining finnes i våre tidligere publikasjoner18. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. Skjematisk fremstilling av mitokondrie stress test. Bioenergetisk parametere, inkludert Basal, ATP-tilknyttet maksimal og ikke-Mitokondrielt åndedrett samt ekstra åndedretts kapasitet og Proton lekkasje, er beskrevet på sporet med tilsvarende mitokondrie effektor. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: mitokondrie stress analysen. (A) representant sporing av oksygen inntak priser (OCR, i pMoles/min) neonatal musen cardiomyocytes. På angitt tid, oligomycin (Oligo, 1 µM), FCCP (800 nM), og RAA (rotenon og antimycin A, 1 µM) ble injisert. For hver måling presenteres av mean og standard feil av gjsnitt (SEM) 10 individuelle brønner. (B) OCR beregnes som basale åndedrett, Oligo (Proton lekkasje) og FCCP (maksimal åndedrett) per 10 x 103 celler. (C) OCR er uttrykt i forhold til basale åndedrett. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Navnet på reagens og løsning | Forberedelse | Notater |
| Trypsin før fordøyelsen løsning | Oppløse trypsin i HBSS (uten Ca2 + og Mg2 +). Siste konsentrasjonen er 0,5 mg/mL. Sterilisere løsningen bruker filtere 0.22 µm og holde på is til bruk. | Gjør før fordøyelsen løsning på dagen for eksperimentet. |
| Collagenase fordøyelsen løsning | Oppløse trypsin i HBSS (uten Ca2 + og Mg2 +). Siste konsentrasjonen er 0,5 mg/mL. Sterilisere løsningen bruker filtere 0.22 µm og holde på is til bruk. | Gjør collagenase fordøyelsen løsning på dagen for eksperimentet. |
| Cardiomyocyte kultur medier | Bland 375 mL DMEM, 125 mL av M-199, 25 mL av hest serum og 12,5 mL FBS. Supplere med 1% penicillin og 1% streptomycin løsning. | Cardiomyocyte kultur medier kan gjøres før eksperimentet og lagret på 4 ° C for en måned. |
| Mitokondrielt stresstest medium | Først gjøre 1 L av medium med DMEM uten noen natrium pyruvate, L-glutamine, glukose og Hepes, filtrere for å sterilisere og lagre på 4 ° C. På dagen for analysen, legge natrium pyruvate, L-glutamine, glukose og Hepes. Justere pH 7,4 før bruk (sterilisering er ikke nødvendig). | Siste konsentrasjon for kosttilskudd er følgende: natrium pyruvate (1 mM), L-glutamin (2 mM), glukose (10 mM) og Hepes (2 mM) |
| Oligomycin aksje | Løs opp oligomycin i DMSO. Først forberede 5 mL lagerløsning. Når oligomycin er fullstendig oppløst i DMSO, gjøre 250 µL dele, lagre på 20 ° C. | På dagen for analysen, ta en aliquot å bruke. Unngå mange fryse-Tin sykluser. |
| FCCP aksje | Løs opp FCCP i DMSO. Først forberede 5 mL lagerløsning. Siste konsentrasjonen er 5 mM. Når FCCP er fullstendig oppløst i DMSO, gjøre 250 µL dele, lagre på 20 ° C. | På dagen for analysen, ta en aliquot å bruke. Unngå mange fryse-Tin sykluser. |
| Antimycin A lager | Oppløse antimycin A i DMSO. Først forberede 5 mL lagerløsning. Siste konsentrasjonen er 5 mM. Når antimycin A er fullstendig oppløst i DMSO gjøre 250 µL dele, lagre på 20 ° C. | På dagen for analysen, ta en aliquot å bruke. Unngå mange fryse-Tin sykluser. |
| Rotenon lager | Oppløse rotenon i DMSO. Først forberede 5 mL lagerløsning. Siste konsentrasjonen er 5 mM. Når rotenon er fullstendig oppløst i DMSO, gjøre 250 µL dele, lagre på 20 ° C. | På dagen for analysen, ta en aliquot å bruke. Unngå mange fryse-Tin sykluser. |
| Celle kultur plate belegg løsning | Først lage 200 mL 0,5% gelatin løsning. Løs opp gelatin i PBS og autoclave. På dagen for eksperimentet, kan du legge til 50 µL fibronectin løsning i 5 mL gelatin løsning for å gjøre belegg løsning. | 0,5% gelatin løsning kan lagres ved romtemperatur for opptil 2 måneder. |
Tabell 1: Reagenser og løsninger.
| Injeksjon Port | Forbindelser og konsentrasjon | Volum injisert under kjøring (µl) | Siste konsentrasjon i analysen |
| A | 16 µM oligomycin | 25 | 2 ΜM |
| B | 9 ΜM FCCP | 25 | 1 ΜM |
| C | 20 µM rotenon (Rot) og 20 µM antimycin A (AA) |
25 | 2 µM av hver |
Tabell 2: Injeksjon blandinger.
| Trinn og prosedyrer | Målinger og løkker |
| Kalibrering | - |
| Balanse | - |
| Opprinnelig plan måling | 3 ganger: Bland 3 min, vente 2 min, måler 3 min |
| Injisere Port en (Oligomycin) | - |
| Målinger | 3 ganger: Bland 3 min, vente 2 min, måler 3 min |
| Injisere Port B (FCCP) | - |
| Målinger | 3 ganger: Bland 3 min, vente 2 min, måler 3 min |
| Injisere Port C (RAA) | - |
| Målinger | 3 ganger: Bland 3 min, vente 2 min, måler 3 min |
Tabell 3: Ekstracellulære flux analyzer program.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I denne studien har vi etablert en enkel protokoll for å isolere og dyrking musen neonatale cardiomyocytes. Ved å bruke disse cardiomyocytes, optimalisert vi også betingelsene for å måle oksygen forbruksraten ved hjelp av en ekstracellulære flux analyzer system. Protokollen gjør det mulig å bruke mus neonatale cardiomyocytes som et modellsystem for å undersøke hvordan ulike faktorer kan endre oksygenforbruk i de viktigste arbeider cellene av hjertet, som det skulle måles i intakt organ. Våre protokollen er forskjellig fra tidligere publiserte protokoller16,18. Først, for å oppnå høy levedyktighet, bare pups umiddelbart ved fødselen er brukt (i.e. P0), i stedet for de dager null til tre dager gammel (P0 til P3 pups), som vanligvis brukes i andre protokoller16,19. Andre, for å minimere tiden for eksperimentet, hjerter var bare pre-fordøyd med trypsin 4 h. I tillegg å gjøre prosedyren for enkel og reproduserbar resultat, ansatt vi av trinn, som beskrevet. For eksempel våre protokollen bruker bare to typer buffere, PBS og HBSS, og bare én type celle kultur medier, og ansette ikke agitasjon under collagenase fordøyelsen.
For å oppnå høy levedyktigheten til neonatal musen cardiomyocytes, som er viktig for reproduserbarhet OCR-analysen, finnes det flere kritiske punkter. Først er bruker P0 newborn pups og utføre trypsin før fordøyelsen og collagenase fordøyelsen på samme dag avgjørende for å oppnå høy levedyktighet. Andre under collagenase fordøyelsen, er det ikke anbefalt å agitere hjertet vevet i vannbad 37 ° C. Selv om agitasjon foreslås i mange protokoller, fant vi dette ikke er nødvendig som P0 hjerter er lett å bli fordøyd av collagenase. Endelig er forsiktig triturating hjertet vev avgjørende for å oppheve tilknytningen til cardiomyocytes etter collagenase fordøyelsen.
Vi har også testet myocytter fra P1 og P2 pup hjerte vev, bruke samme protokoll. Men for disse eldre hjertet prøvene fant vi det er nødvendig å utføre trypsin før fordøyelsen over natten for å oppnå tilstrekkelig celle avkastning (data ikke vist). I tillegg var celle levedyktigheten for P1 og P2 cardiomyocytes rundt 60%, lik som i andre publiserte studier16. Disse resultatene tyder på at P0 myokard har relativt lavere mengder ekstracellulær matrix enn eldre hjerter, som gir kortere tid for trypsin før fordøyelsen, noe som resulterer i høyere celle levedyktighet og gir fra disse yngre hjerter.
Ekstracellulære flux (XF) analyse har blitt en stor og populær metode for å måle bioenergetisk funksjon i celler og isolert mitokondrier20,21. Hittil har en rekke studier brukt rotte neonatale cardiomyocytes og målt oksygenforbruk, bruker en Agilent XF24 systemet22,23,24 . Disse studier med rotte celler i motsetning til musen-avledet celler, ble sannsynligvis utført som rotte cellene generelt har høyere celle levedyktighet og analysen reproduserbarhet, sammenlignet med musen cardiac myocytter studert her. Gitt at genmodifiserte dyr har hovedsakelig blitt generert på musen linjer, gir en enkel og reproduserbar protokoll for å analysere bioenergetisk funksjon i musen neonatale cardiomyocytes, når vi diskuterer i dette manuskriptet muligheter til å studere Mitokondrielt funksjon i musen cardiac myocytter. Denne metoden kan lettere oversettes til data som kan føre til forståelse nye mekanismer for bioenergetisk regulering i hjertet, ved å bruke nye eller eksisterende genetisk manipulerte musen linjer25,26.
I denne studien testet vi effekten av celle nummer og tetthet på OCR. Som vist i figur 4B, var OCR målt i brønner med 10 x 103, 20 x 103og 30 x 103 celler/Vel, likt. Gitt at plating 30 x 103 celler/godt produsert et confluent godt i en dag etter såing, anbefaler vi dele cellene mellom 10 x 103 til 30 x 103 celler/godt i en 96-brønns plate, for OCR analysen. Interessant fant vi 3t av serum sult redusert OCR. Vekst faktorer er kjent for å aktivere Glykolysen og øke oksygen forbruk27. Det ble også rapportert at vekstfaktorer forbedre total cellular aktivitet og sammentrekning av cardiomyocytes3,28. Cardiomyocyte sammentrekning krever ATP generasjon2, som avhenger av oksygenforbruk. Derfor tyder disse data på at serum sult reduserer oksygenforbruk gjennom inaktivering av cardiomyocytes. Vi vil anbefale teste effekten av serum sult på OCR i egen eksperimentelle innstillingen.
Som nevnt, spiller mitokondrier nøkkelroller i hjertefunksjon. Derfor kunne identifisere romanen regulatorer og trasé regulere oksidativt metabolisme gi et middel til å identifisere romanen terapeutisk mål for behandling av hjertesvikt. Siden en 96 godt format gir mulighet til å teste flere tester forhold sammenlignet med et 24 godt format, kan denne protokollen også være enkelt tilpasses til en høy gjennomstrømning skjerm for å identifisere romanen bioenergetisk regulatorer i cardiomyocytes29 . Således, ved å kombinere våre Protokoll med genetisk manipulerte neonatale cardiomyocytes, for eksempel de som har mitokondrie mutasjoner30, kunne gi interessante studier til skjermen effektene av kjemiske forbindelser eller cDNA biblioteker på OCR i vill-type vs. metabolically-defekt cardiomyocytes.
Vi er klar over at neonatale og voksne cardiomyocytes har mange forskjellige egenskaper og metabolske funksjoner31, inkludert uttrykk nivåer av glukose og fettsyrer metabolsk enzym32. Derfor ideelt for å bruke i vitro kulturperler cardiomyocytes som et modellsystem hjertets intakt, vil det være viktig å videreutvikle en protokoll for å effektivt analysere OCR i voksen cardiomyocytes, slik at man kunne sammenligne deres oksidativt kapasitet og egenskaper med neonatale cardiomyocytes. Fremtidige studier må gjennomføres for å tilpasse denne metodikken reproduserbar systemet bruker voksen cardiac myocytter.
I sammendraget viser vi en enkel og reproduserbar protokoll for å analysere oksygenforbruk bruke primære kulturperler musen neonatal musen cardiomyocytes. Bruker denne protokollen, kunne vi med hell isolere og kultur musen neonatale cardiomyocytes og utføre denne OCR analysen med en 96-brønns format ekstracellulære flux analyzer system. Våre protokollen gir høy levedyktighet og viktigst, konsekvent reproduserbar resultater. Selv om denne studien er hovedsakelig fokusert på oksygenforbruk og en mitokondrie test, kan protokollen lett tilpasses analysere fettsyrer oksidering og Glykolysen i cardiomyocytes.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer at de har ingen konkurrerende økonomiske interesser.
Acknowledgments
Vi vil gjerne takke alle Ross lab og Murphy lab medlemmer. Dette arbeidet er støttet av American Heart Association (14SDG17790005) Y.C. NIH (HL115933, HL127806) og VA fortjeneste (BX003260) til R.S.R.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antimycin A | SIGMA | A8674 | Inhibits complex III of the mitochondria |
| Cell strainer 100 μm pores | FALCON | 352360 | To capture undigested tissue |
| Collagenase type II | Worthington | LS004176 | To make collagenase digestion solution |
| D-Glucose | SIGMA | 75351 | To make mitochodnrial stress test medium |
| DMEM high glucose | Life technologies | 11965-092 | To make cell culture medium |
| DMEM without NaHCO3, Glucose, pyruvate, glumanine, and Hepes | SIGMA | D5030-10X1L | To make mitochodnrial stress test medium |
| FCCP (Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone) | SIGMA | C2920 | Uncouples mitochondrial respiration |
| Fetal bovine serum (FBS) | Life technologies | 26140-079 | To make cell culture medium |
| Fibronectin from bovine plasma | SIGMA | F1141-5MG | To make coating solution for tissue culture plates |
| Fine scissors | Fine Sciences Tools | 14060-10 | For dissection of hearts |
| Gelatin from porcine skin | SIGMA | G-1890 | To make coating solution for tissue culture plates |
| HBSS (Hank's balanced salt solution, without Ca2+, Mg2+) | Cellgro | 21-022-CV | To wash hearts and make pre-digestion and collagnase digestion solution |
| HEPES (1 M) | Fisher scientific | 15630080 | To make mitochodnrial stress test medium |
| Horse serum | Life technologies | 26050-088 | To make cell culture medium |
| L-Glutamine | SIGMA | G-3126 | To make mitochodnrial stress test medium |
| M-199 | Cellgro | 10-060-CV | To make cell culture medium |
| Moria spoon | Fisher scientific | NC9190356 | To wash hearts |
| Oligomycin | SIGMA | 75351-5MG | Inhibits mitochondrial ATP synthase |
| RIPA buffer | Fisher scientific | 89900 | To lyse the cells for protein assay |
| Rotenone | SIGMA | R8875 | Inhibits complex I of the mitochondria |
| Seahorse XFe96 Extracellular Flux Analyzer |
Agilent | Device used to analyze oxygen consumption rate | |
| Seahorse XFe96 FluxPak | Agilent | 102601-100 | Package of flux analyzer culture plates, sensor cartridges, and calibrant |
| Sodium pyruvate | SIGMA | P2256 | To make mitochodnrial stress test medium |
| Straight scissors | Fine Sciences Tools | 91401-12 | For dissection of hearts |
| Syringe filter 0.2 μm size | For sterile filtration of digestion medium | ||
| Trypsin | USB Corporation | 22715 25GM | To make pre-digestion solution |
References
- Stanley, W. C., Recchia, F. A., Lopaschuk, G. D. Myocardial substrate metabolism in the normal and failing heart. Physiological Reviews. 85 (3), 1093-1129 (2005).
- Wang, K., et al. Mitochondria regulate cardiac contraction through ATP-dependent and independent mechanisms. Free Radical Research. , 1-10 (2018).
- Kolwicz, S. C. Jr, Purohit, S., Tian, R. Cardiac metabolism and its interactions with contraction, growth, and survival of cardiomyocytes. Circulation Research. 113 (5), 603-616 (2013).
- Rosca, M. G., Hoppel, C. L. Mitochondrial dysfunction in heart failure. Heart Failure Reviews. 18 (5), 607-622 (2013).
- Wai, T., et al. Imbalanced OPA1 processing and mitochondrial fragmentation cause heart failure in mice. Science. 350 (6265), aad0116 (2015).
- Bayeva, M., Gheorghiade, M., Ardehali, H. Mitochondria as a therapeutic target in heart failure. Journal of American College Cardiololgy. 61 (6), 599-610 (2013).
- Camara, A. K., Bienengraeber, M., Stowe, D. F. Mitochondrial approaches to protect against cardiac ischemia and reperfusion injury. Frontiers in Physiology. 2, 13 (2011).
- Brown, D. A., et al. Expert consensus document: Mitochondrial function as a therapeutic target in heart failure. Nature Reviews Cardiology. 14 (4), 238-250 (2017).
- Zhou, P., Pu, W. T. Recounting Cardiac Cellular Composition. Circulation Research. 118 (3), 368-370 (2016).
- Parameswaran, S., Kumar, S., Verma, R. S., Sharma, R. K. Cardiomyocyte culture - an update on the in vitro cardiovascular model and future challenges. Canadian Journal of Physiology and Pharmacology. 91 (12), 985-998 (2013).
- Judd, J., Lovas, J., Huang, G. N. Isolation, Culture and Transduction of Adult Mouse Cardiomyocytes. Journal of Vissualized Experiments. 10 (114), (2016).
- Gibbs, C. L., Loiselle, D. S. Cardiac basal metabolism. Japanese Journal of Physiology. 51 (4), 399-426 (2001).
- Mdaki, K. S., Larsen, T. D., Weaver, L. J., Baack, M. L. Age Related Bioenergetics Profiles in Isolated Rat Cardiomyocytes Using Extracellular Flux Analyses. PLoS One. 11 (2), e0149002 (2016).
- Neary, M. T., et al. Hypoxia signaling controls postnatal changes in cardiac mitochondrial morphology and function. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 74, 340-352 (2014).
- Hill, B. G., Dranka, B. P., Zou, L., Chatham, J. C., Darley-Usmar, V. M. Importance of the bioenergetic reserve capacity in response to cardiomyocyte stress induced by 4-hydroxynonenal. Biochemical Journal. 424 (1), 99-107 (2009).
- Sreejit, P., Kumar, S., Verma, R. S. An improved protocol for primary culture of cardiomyocyte from neonatal mice. In vitro Cellular & Developmental Biology - Animal. 44 (3-4), 45-50 (2008).
- AVMA Guidelines for the Euthanasia of Animals: 2013 Edition. , Available from: https://www.avma.org/KB/Policies/Documents/euthanasia.pdf (2013).
- Manso, A. M., et al. Talin1 has unique expression versus talin 2 in the heart and modifies the hypertrophic response to pressure overload. Journal of Biological Chemistry. 288 (6), 4252-4264 (2013).
- Wang, G. W., Kang, Y. J. Inhibition of doxorubicin toxicity in cultured neonatal mouse cardiomyocytes with elevated metallothionein levels. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 288 (3), 938-944 (1999).
- Divakaruni, A. S., et al. Thiazolidinediones are acute, specific inhibitors of the mitochondrial pyruvate carrier. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (14), 5422-5427 (2013).
- Rogers, G. W., et al. High throughput microplate respiratory measurements using minimal quantities of isolated mitochondria. PLoS One. 6 (7), e21746 (2011).
- Sansbury, B. E., Jones, S. P., Riggs, D. W., Darley-Usmar, V. M., Hill, B. G. Bioenergetic function in cardiovascular cells: the importance of the reserve capacity and its biological regulation. Chemico-Biological Interactions. 191 (1-3), 288-295 (2011).
- Sharp, W. W., et al. Dynamin-related protein 1 (Drp1)-mediated diastolic dysfunction in myocardial ischemia-reperfusion injury: therapeutic benefits of Drp1 inhibition to reduce mitochondrial fission. FASEB Journal. 28 (1), 316-326 (2014).
- Tigchelaar, W., et al. Hypertrophy induced KIF5B controls mitochondrial localization and function in neonatal rat cardiomyocytes. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 97, 70-81 (2016).
- Graham, B. H., et al. A mouse model for mitochondrial myopathy and cardiomyopathy resulting from a deficiency in the heart/muscle isoform of the adenine nucleotide translocator. Nature Genetics. 16 (3), 226-234 (1997).
- Zhao, Y. Y., et al. Defects in caveolin-1 cause dilated cardiomyopathy and pulmonary hypertension in knockout mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (17), 11375-11380 (2002).
- Vander Heiden, M. G., et al. Growth factors can influence cell growth and survival through effects on glucose metabolism. Molecular and Cellular Biology. 21 (17), 5899-5912 (2001).
- Detillieux, K. A., Sheikh, F., Kardami, E., Cattini, P. A. Biological activities of fibroblast growth factor-2 in the adult myocardium. Cardiovascular Research. 57 (1), 8-19 (2003).
- Wang, R., et al. The acute extracellular flux (XF) assay to assess compound effects on mitochondrial function. Journal of Biomolecular Screening. 20 (3), 422-429 (2015).
- Dai, D. F., et al. Age-dependent cardiomyopathy in mitochondrial mutator mice is attenuated by overexpression of catalase targeted to mitochondria. Aging Cell. 9 (4), 536-544 (2010).
- Ritterhoff, J., Tian, R. Metabolism in cardiomyopathy: every substrate matters. Cardiovascular Research. 113 (4), 411-421 (2017).
- Uosaki, H., Taguchi, Y. H. Comparative Gene Expression Analysis of Mouse and Human Cardiac Maturation. Genomics, Proteomics & Bioinformatics. 14 (4), 207-215 (2016).
