Medicine
A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Analysere oksygen forbruksraten i primære kulturperler musen neonatale Cardiomyocytes bruker en ekstracellulære Flux analyserer
Chapters
Summary February 13th, 2019
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Målet med denne protokollen er å illustrere hvordan du bruker musen neonatale cardiomyocytes som modellsystem for å undersøke hvordan ulike faktorer kan endre oksygenforbruk i hjertet.
Transcript
Denne protokollen tillater oss å isolere og kultur høy bi-BBT, kjent bare for mus cardiomyocytes. For å evaluere mitokondriefunksjon kan oksygenforbruket av kardiomyocytter analyseres av en faktisk sølvfluksanalysator. En av fordelene med denne teknikken er at oksygenforbruk av kardiomyocytter lett kan måles i deres tilslutninger i 96-brønnsformat, noe som muliggjør testing av flere forhold med et stort antall repliker.
Dette fartøyet gir viktig innsikt i forskningsområdet kardiologi. I tillegg til oksygenforbruk kan vi også studere andre metabolske parametere, som grågriser og peracid epoxidation. Å oppnå høy variasjon av kardiomyocytter er avgjørende for dette eksperimentet.
Dette krever effektiv fordøyelse av hjerter. Siden nyfødte kardiomyocytter er svært skjøre, er skånsom håndtering av kardiomyocytter også viktig. I cellekulturhetten, aliquot 5ml HBSS til hver brønn av en 6-brønns celle kulturplate og legg den på is.
I tillegg, aliquot 10ml hbss til en 10cm celle kultur parabolen, deretter forberede 20 ml Trypsin Predigestion løsning i en 50ml steril konisk rør. Hold alle løsningene på is. Deretter trekker du ut hjertet og overfører det umiddelbart til den sterile cellekulturfatet som inneholder HBSS.
Fjern eventuelle gjenværende lungevev og større kar. Vask hjertet i HBSS med mild omrøring. Deretter skjærer du hjertet med fin saks i 8 stykker og overfører hjertevevet med tang til en brønn av en 6-brønns cellekulturplate med HBSS.
Bruk en moria skje, vask hjertevevet ved å overføre det fra godt til godt i 6-brønnsplaten fylt med HBSS. Overfør deretter hjertevevet til et konisk rør som inneholder 20 ml Trypsin og inkubere med mild agitasjon ved 4 grader celsius i 4 timer. I denne prosedyren, prewarm collagenase fordøyelsesløsning i et vannbad på 37 grader celsius.
Overfør det koniske røret som inneholder hjertevev og predigestion løsning fra 4 grader celsius til en cellekultur hette. La hjertevevet synke til bunnen av røret og fjern predigestionløsningen ved hjelp av en 10 ml serologisk pipette. Deretter legger du til 10 ml HBSS i røret.
Resuspend hjertevevet med HBSS 2 til 3 ganger for å vaske ut Trypsin ved hjelp av en 10 ml serologisk pipette. Aspirer HBSS og tilsett 10 ml prewarmed collagenase fordøyelsesløsning i røret med hjertevev. For første fordøyelse, inkuber røret med hjertevev i et vannbad ved 37 grader celsius i 10 minutter uten agitasjon.
Etterpå overfører du røret til cellekulturhetten. Triturat vevet ved å gjenbruke det forsiktig 10 ganger ved hjelp av en 10ml serologisk pipette. Dette vil tillate hjertet å spre seg og cellene som skal frigjøres fra hjertevevet.
La det ufordøyde vevet synke. Overfør den fordøyde løsningen beriket i kardiomyocytter til et nytt konisk rør og legg umiddelbart til en lik mengde cellekulturmedium for å stoppe kollagenasefordøyelsen. Tilsett deretter 10 ml kollagnasefordøyelsesløsning i røret som inneholder det gjenværende ufordøyde hjertevevet.
For den andre fordøyelsen, inkuber røret med hjertevev i et 37 graders celsius vannbad i 10 minutter. Gjenta prosedyrene for den første fordøyelsen og overfør den fordøyde løsningen beriket i kardiomyocytter til et nytt konisk rør før du stopper kollagenasefordøyelsen. Deretter plasserer du en steril cellesil i et nytt sterilt 50 ml konisk rør.
Før våt cellesilen med 2 til 3 ml cellekulturmedium og passerer cellene gjennom cellesilen. Skyll deretter cellesilen med cellekulturmedium. Deretter sentrifugerer det koniske røret som inneholder kardiomyocytter i 5 minutter ved 180 ganger tyngdekraften.
Etter 5 minutter, aspirere det overnaturante og gjenoppusser cellepelleten i 10 ml cellekulturmedium. Plate cellene på en 10cm celle kultur rett og inkubere dem i en time. Etterpå, forsiktig agitate platen.
Vask av de ikke-tilhengerne og gjenoppliv cellene ved gjentatte ganger å pipettere cellekulturmediet over parabolen ved hjelp av en 10 ml serologisk pipette. Deretter overfører du de ikke-tilhengerne til en ny 10cm cellekulturrett og inkuberer dem i en time til. Etter en time, forsiktig røre platen og vask av de ikke-tilhengerne celler.
Overfør kardiomyocytter til et nytt 50 ml konisk rør. Deretter forbereder du en 96-brønns kulturplate ved å aliquoting 50 mikroliter belegg løsning i hver brønn av 96-brønner celle kultur plate. Hvis bobler er til stede, fjern dem ved hjelp av en 20 mikroliter pipette.
Inkuber platen ved 37 grader celsius i minst en time for å tillate tørking av matrisebelegget. Deretter teller cellene ved hjelp av et hemocytometer. Plate cellene i den ekstra cellulære matrisebelagte 96-brønns cellekulturplaten med en tetthet mellom 10 og 30 tusen celler per brønn.
Og plasser cellene i inkubateren. For å forhåndsforme oksygenforbruksanalysen, hydrere en fluxanalysatorsensorkassett i minst 3 timer, tilsett 200 mikroliter kalibrantløsning i hver brønn av nytteplaten. Plasser sensorkassetten tilbake på nytteplaten og inkuber i 37 grader celsius uten CO2- eller O2-tilskudd i minst 3 timer.
En time før analysen fjerner du forsiktig cellekulturmediet og vask cellene med 200 mikroliter med forkrigede mitokondriestresstestmedium to ganger. Etter den andre vasken, legg til 175 mikroliter med forkrigede mitokondriestresstestmedium. Deretter kultur cellene på 37 grader celsius uten karbondioksid eller oksygen tilskudd.
Forbered 3 ml av hver av testforbindelsene i mitokondriestresstestmedium. Legg 25 mikroliter av hver forbindelse i injektorportene på sensorkassetten ved hjelp av en flerkanals pipette. Tilstanden til cellene og eventuelle forbehandlinger kan påvirke maksimal restaurering fremkalt ved injeksjon av ukoupler FCCP.
Cellefølsomhet for uncoupler kan også endres, derfor er det viktig å optimalisere arbeidskonsentrasjonen av FCCP for hver enkelt behandling. Deretter setter du opp ekstra cellulær fluksanalyseprotokoll og starter programmet. Først setter du sensorkartiridge inn i maskinen for kalibrering.
Skift ut kalifaren for analyseplaten når kalibreringstrinnet er ferdig. Hvis ønskelig, etter analysen, forsiktig kaste alle analysemedier ved hjelp av en flerkanals pipette. Og lagre cellekulturen mircoplate ved negative 20 grader celsius for fremtidig celle normalisering ved hjelp av proteinanalyse.
Ved å bruke protokollen som er beskrevet, ble hjerter isolert fra dag 0 neonatalvalper og kardiomyocytter ble seeded på tettheter på 10, 20 eller 30 tusen celler per brønn i 96-brønnplater. Etter overnattingskulturen ble kardiomyocytter funnet godt festet til den belagte plastoverflaten, og det var svært få ufestede celler. På dette tidspunktet var spontant kontraherende kardiomyocytter lett synlige.
En såetetthet på 30 000 celler per brønn viste samløpet en dag etter såing da cellene spredte seg. Kardiomyocytter ble immunostained med et antistoff mot sarkomerisk alfa actinin, en kardiomyocytt spesifikk markør. Som vist her, de fleste av cellene viste positiv farging av alfa actinin indikerer den høye renheten av kardiomyocytt isolasjon.
En ordning med en typisk mitokondriestresstest er vist her. Mitokondriestresstesten starter med en baselinjemåling av oksygenforbruket, dette etterfølges av injeksjonen av Oligo myosin som hemmer ATPAs. Deretter ble frakoblingsmiddelet FCCP injisert for å måle maksimal oksygenforbrukshastighet.
Til slutt, med injeksjon av to elektron transport komplekse hemmere, mitokondrie respirasjon helt stopper og OCR reduseres til sitt laveste nivå. For å oppnå konsistente og reproduserbare resultater. Det er avgjørende å oppnå høy overlevelse.
Derfor er det viktig å bruke nyfødte nyfødte og forsiktig håndtert hjertevev i kardiomyocytter. Ved å bruke nye eller eksisterende genetisk manipulerte muselinjer, kan denne metoden enkelt oversettes til data som kan føre til forståelse av nye mekanismer for bioenergetisk regulering i hjertet. Mitokondrie spiller sentrale roller i hjertefunksjonen.
Vi forventer at denne metoden vil bidra til å identifisere nye regulatorer og veier som regulerer oksiderende metabolisme og finner nye terapeutiske mål for behandling av hjertesvikt.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
