Descrevemos abordagens para a manipulação de genes no sistema modelo evolucionista Astyanax mexicanus. São descritas três técnicas diferentes: transgênese mediada por Tol2, alvo de manipulação do genoma usando CRISPR/Cas9 e nocaute de expressão usando morpholinos. Essas ferramentas devem facilitar a investigação direta de genes subjacentes a variação entre as formas de superfície - e caverna-moradia.
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Artigo de método
Manipulação de função do Gene em Cavefish mexicano
Neste artigo
Resumo
Resumo
Caverna de animais fornecem um sistema convincente para investigar os mecanismos evolucionários e bases genéticas subjacentes alterações em numerosos traços complexos, incluindo a degeneração do olho, albinismo, perda do sono, hiperfagia e processamento sensorial. Espécie de cavefish de todo o mundo exibe uma evolução convergente de características morfológicas e comportamentais devido a pressões ambientais compartilhadas entre sistemas diferentes de caverna. Caverna de diversas espécies foram estudadas na configuração de laboratório. O tetra mexicano, Astyanax mexicanus, com formas de videntes e cegas, forneceu insights exclusivas em processos biológicos e moleculares subjacentes a evolução dos traços complexos e é bem preparado como um sistema modelo emergente. Enquanto genes candidatos regulamenta a evolução de diversos processos biológicos foram identificados na. mexicanus, a capacidade de validar um papel para genes individuais tem sido limitada. A aplicação de transgênese e gene-edição tecnologia tem o potencial para superar este obstáculo significativo e investigar os mecanismos subjacentes a evolução dos traços complexos. Aqui, descrevemos uma metodologia diferente para manipular a expressão gênica na . mexicanus. Abordagens incluem o uso de morpholinos, Tol2 transgênese, e sistemas de edição de gene, comumente usados em zebrafish e outros peixes de modelos, para manipular a função do gene na . mexicanus. Estes protocolos incluem descrições detalhadas dos procedimentos de reprodução programada, a coleção de ovos fertilizados, injeções e a seleção de animais geneticamente modificados. Permitirão que estas abordagens metodológicas para a investigação dos mecanismos genéticos e neurais subjacentes a evolução dos diversos traços na . mexicanus.
Introdução
Desde a Origem das espéciesde Darwin1, cientistas ganharam profundos insights sobre como traços são dados forma evolutivamente em resposta a pressões ecológicas e ambientais definidas, graças a caverna organismos2. O tetra mexicano, a. mexicanus, consiste em olhos populações 'superfície' ancestrais que habitam rios em todo o México e sul do Texas e pelo menos 29 populações geograficamente isoladas da caverna derivada morfos que habitam a Sierra del Abra e outras áreas do México nordeste3. Foram identificados vários traços associada a caverna em a. mexicanus, incluindo o ....
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Protocolo
1. Morpholinos oligo projeto
Nota: As sequências para a. mexicanus estão disponíveis através do centro nacional de Biotechnology Information (NCBI) Gene e NCBI SRA (https://www.ncbi.nlm.nih.gov), bem como a partir do navegador de genoma de Ensembl (https://www.ensembl.org). Ao projetar um Morpholinos para uso em ambas as formas da superfície - e caverna-moradia, é crítico para identificar qualquer variação genética entre o morfos nesta fase, para que estas regiões genéticas podem ser evitadas como alvos de morpholinos. Qualquer variação polimórfica dentro de um site de destino Morpholinos pode levar a vinculação ineficaz. O projeto é....
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Resultados
Várias populações da caverna-moradia a. mexicanus mostram redução de sono e vigília/atividade aumentada em relação à sua superfície-moradia coespecíficos14. Hipocretina/Hipocretina (HCRT) é um neuropeptídeo altamente conservado, que atua para aumentar a vigília, e aberrações na via HCRT causam narcolepsia em humanos e outros mamíferos47,48. Nós demonstramos anteriormente naquela caverna a. mexicanus aumentaram a expressão.......
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Discussão
Aqui, nós fornecemos uma metodologia para manipular a função dos genes usando morpholinos, gene CRISPR/Cas9 edição e metodologia de transgênese. A riqueza da tecnologia genética e a otimização desses sistemas no zebrafish provavelmente permitirá a transferência dessas ferramentas para a. mexicanus com facilidade52. Descobertas recentes têm usado essas abordagens na . mexicanus, mas eles permanecem subutilizados na investigação de diversas características morfológicas, comportamen.......
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Divulgações
Os autores não têm nada para divulgar.
Agradecimentos
Os autores agradecer Sunishka Thakur pela sua assistência na genotipagem e imagem os peixes mutantes oca2 , representados na Figura 2. Este trabalho foi financiado pela National Science Foundation (NSF) prêmio 1656574 para A.C.K., prêmio NSF 1754321 a J.K. e A.C.K. e prêmio do National Institutes of Health (NIH) R21NS105071 para A.C.K. e E.R.D.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Criação de peixes e suprimentos para ovos | |||
| Rede de pesca de malha fina | Penn Plax | BN4 | |
| Aquecedor de tanque de peixes | Aqueon | 100106108 | |
| Armadilhas para ovos | sob medida | NA | Projete e crie uma grade de plástico para colocar no fundo do tanque para proteger |
| os ovos Pipetas de vidro | Fisher Lâmpadas de | 13-678-20C | |
| Fisher Scientific | 03-448-21 | ||
| Agarose | Fisher Scientific | BP160-500 | |
| Moldes de ovo | Ferramentas Adaptativas da Science | TU-1 | |
| Suprimentos de Morpholino | |||
| Control Morpholino | Gene Tools, LLC | Morpholino do olio | |
| , LLC | NA | ||
| Ssigma vermelho | Aldrich | P0290-100ML | |
| em>CRISPR fornece | |||
| Cas9 Plasmid | AddGene | 46757 | |
| GoTaq DNA polimerase | Promega | M3001 | |
| KOD Hot Start Taq | EMD Millipore | 71-842-3 | |
| Primers | Tecnologias de DNA Integradas | T7 Personalizado | |
| Ambion/Thermofisher | AM1333 | ||
| Kit miRNeasy | Qiagen | 217004 | |
| mMessage mMachine T3 kit | Ambion/Thermofisher | AM1348 | |
| Kit MinElute | Qiagen | 28204 | |
| Tol2 transgenesis supplies | |||
| pCS-zT2TP plasmídeo | Kawakami et al., 2004 | Solicitação do autor | |
| CutSmart Buffer | New England Biolabs | B7204 | |
| NotI-HF Restriction Enzyme | New England Biolabs | R3189 | |
| Kit de purificação de PCR | Kit Qiagen | 28104 | |
| SP6 mMessenger | Ambion/Thermofisher | AM1340 | |
| Suprimentos para microinjeção | |||
| Tubos capilares de vidro | Sutter Instruments | BF100-58-10 | |
| Extrator de pipetas | Sutter Instruments | P-97 | |
| Picoinjetor | Suporte | PLI-100A | |
| World Precision Instruments | M3301R | ||
| Base de Micmanipulador | World Precision Instruments | M10 | |
| Chapa | World | Precision Instruments, 10 lbs |
Referências
- Darwin, C. On the Origin of Species by Means of Natural Selection. , D. Appleton and Company. (1859).
- Culver, D. C., Pipan, T. The Biology of Caves and Other Subterranean Habitats. , Oxford University Press. New York, NY. (2009).
- Mitchell, R. W., Russell, W. H., Elliott, W. R.
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Reimpressões e permissões
